JP6889758B2 - 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 - Google Patents
植物シスタチンに由来する足場タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6889758B2 JP6889758B2 JP2019132489A JP2019132489A JP6889758B2 JP 6889758 B2 JP6889758 B2 JP 6889758B2 JP 2019132489 A JP2019132489 A JP 2019132489A JP 2019132489 A JP2019132489 A JP 2019132489A JP 6889758 B2 JP6889758 B2 JP 6889758B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- protein
- synthetic scaffold
- scaffold protein
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Description
「好適なタンパク質足場の候補は、可変の配列及び長さの表面ループを提供できるか、又はさもなければ、それらの折りたたみ特性における有意の変更を生ずることなく、近接する表面領域(露出した疎水性残基を含む)における側鎖の交換に耐えられるコンパクト且つ構造的に堅固なコアを提示すべきである。」Skerra A:分子認識用の遺伝子組み換えタンパク質足場,J Mol Recognit2000,13:167−187。及び「用語「足場」は、タンパク質工学において使用されるように、典型的には、低減されたサイズ(<200AA)の及び挿入、欠失、又は他の置換を許容する高立体構造耐性の可変部分と関連する高度に構造化されたコアを含有する単鎖のポリペプチドフレームワークをいう。」Wurchら,Trends in Biotechnology,November,2012,30,575−582。
−変形しない堅固なフレームワークを提供するように改良された安定性;
−より小さいサイズ;
−高い品質及び複雑なライブラリーを支持する改良された能力;
−選ばれた結合タンパク質と、それらの標的との改良された親和性;及び
−利用できるN末端及びC末端による更なる操作の単純さ。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号1)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号2)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
ATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号3)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
−βシートの第1領域と第2領域との間のループ(LOOP1として知られている);及び
−βシートの第3領域と第4領域との間のループ(LOOP2として知られている)。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号1)
GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号2)
MATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号3)
下線を付した領域は、異種性のペプチドによって完全に又は部分的に交換されるか、異種性のペプチドは、ループ領域を除去することなく、下線を付した領域内に挿入される。さらに、異種性のペプチドは、配列番号1又は2のN末端に付加されてもよい。
におけるディスプレイ用に適した本発明の合成タンパク質を含んでなることができる。表面ディスプレイシステムは、好適にはファージディスプレイである。或いは、表面ディスプレイシステムは、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、CIS−ディスプレイ、又は他の非共有又は共有タンパク質ディスプレイシステム、細菌ディスプレイ又は酵母ディスプレイである。酵母二重ハイブリッドシステム又は細菌細胞又は哺乳類細胞システムにおける発現は、標的が結合するアプタマーをスクリーニングするためのインビボシステムに一般に使用される。これらのディスプレイシステムは、まとめて、しばしば、バイオパニングシステムと称される。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(Xn)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(Xn)NFKELQEFKPVGDA(配列番号4)
ここで、Xは各種のアミノ酸であり、及びnは、配列におけるアミノ酸の数であり、nは、好ましくは、3〜30、さらに好ましくは、4〜20、及びさらに好ましくは、4〜15である。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X5−13)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X5−13)NFKELQEFKPVGDA(配列番号5)
を含んでなる。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X9)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X9)NFKELQEFKPVGDA(配列番号6)
を含んでなる。
MATGVRAVPGNE(配列番号80)
のいくつか又は全部を含んでなる。或いは又は加えて、例えば、長さアミノ酸3〜20個の他の異種性のペプチド配列を含んでなることができる。
aacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号7)を含んでなる。
ggtaacgaaaactccctggaaatcgaagaactggctcgtttcgctgttgacgaacacaacaaaaaagaaaacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号8)を含んでなる。
Gctaccggtgttcgtgcagttccgggtaacgaaaactccctggaaatcgaagaactggctcgtttcgctgttgacgaacacaacaaaaaagaaaacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号9)を含んでなる。
−整列アルゴリズム:Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.1970,48:443−453
−アミノ酸の類似性に関する比較マトリックスとして、Blosum62マトリックスを使用する(Henikoff and Henikoff,supra)。
−以下のギャップスコアリングパラメーターを使用する:
−ギャップペナルティー:12
−ギャップ長さペナルティー:2
−エンドギャップについてはペナルティーなし。
−整列アルゴリズム:Needleman and Wunsch(supra)
−比較マトリックス:
−マッチ=+10、ミスマッチ=0
−ギャップペナルティー:50
−ギャップ長さペナルティー:3
Jaeckel,Bloomらによって2010年に記載された系統学的に不偏性の方法のような他のパラメーターの取り込みを含むコンセンサス安定化タンパク質を開発するアプローチも使用できる。
a)上記の1又はそれ以上の異種性のペプチドをコードする配列を含んでなる合成の足場タンパク質集団を含んでなるライブラリーを提供し;
b)前記ライブラリーを標的に曝露し;及び
c)前記標的に結合する合成の足場タンパク質を選別する
ことを含んでなる。
次に、発明の具体例を、実施例によって、添付図面を参照して記載する。
序文
タンパク質デザインに関するコンセンサスアプローチは、シングルコンセンサス配列(この配列において、各位置は、通常、最も頻繁に生ずる残基によって占められる)を誘導するために、タンパク質ファミリーのメンバーのマルチプル配列アライメントにて開始する。折りたたまれたタンパク質の構造、折りたたみ経路、及び安定性を限定する残基は保存される傾向にあるが、酵素における触媒残基のような共通の生物学的機能が要求されるもの、又は保存された標的タンパク質と相互作用する残基も保存されがちである。タンパク質は十分に安定であり、これにより、インビボにおいて、その生物学的役割を実行できように進化するのみであるため、天然のタンパク質は、通常、保存されたコンセンサス残基の全てを含有しないであろうし、多くの場合、生物学的プロセスのターンオーバー及び規制を容易なものとする不安定度を含むであろう(Steipe,Schillerら,1994)。
コンセンサスフィトシスタチン(以下、PHYTC57と称する)のデザイン
GenBankデータベースのBLASTサーチに続いて、CLUSTALW(http://clustalw.genoma.ad.jp/; BLOSUM62; ギャップ開始ペナルティー=12;ギャップ伸長ペナルティー=12)を使用して、フィトシスタチン配列のマルチプルアライメントを実施するとともに、さらに、プログラムCINEMA(http://www.bioinf.manchester.ac.uk/dbbrowser/CINEMA2.1/)(Parry−Smithら,1998;Lordら,2002)を使用するマニュアルアライメントを実施した。各位置における最も一般的に使用されるアミノ酸を決定し、長さアミノ酸95個のコンセンサス配列を与えるために、可変性のN末端及びC末端を切り詰めた。適切なコドン頻度表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)を使用することによって大腸菌での発現用に最適化したコドン使用頻度を有するコンセンサスフィトシスタチン(phytc57)をコードするように、合成コード領域をデザインした。それぞれが長さ約70nt(近接するオリゴヌクレオチドの間で少なくとも10ntの領域を含む)のオリゴヌクレオチド6個(P1−P6、図1参照)から、コード領域を構築した。隣接のオリゴヌクレオチドP1及びP6は、ベクターpDHisII(コード配列は、ベクター由来のpelBシグナル配列コード領域に融合する)にクローン化するために、それぞれ、SfiI部位及びNotI部位も含有する。PELB/PHYTC57タンパク質のN末端配列を自動シグナル配列予測プログラムSignal P(Bendtsenら,2004;http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)に供することによって、シグナルペプチダーゼ開裂部位の保持をチェックした。オリゴヌクレオチド対(P1+P2)、(P3+P4)及び(P5+P6)をアニールし、セルフプライミングによって、二本鎖フラグメントに転換させた。反応液(10μl)は、各プライマー25pモル、すなわち、各dNTP0.2mM、1×Pwo緩衝剤(10mM Tris−HCl pH8.85、25mM KCl、25mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4)及び5単位PwoDNAポリメラーゼ(Boehringer)を含有しており、95℃で2分間、25℃で4分間、ついで、72℃で5分間の1サイクルに供した。生成物(P1/P2)の生成物(P3/P4)へ、ついで、(P1/P2/P3/P4)の(P5/P6)への連続する結合を同様にして行い、全長の生成物を作成した。最終反応物のアリコート5μlを、PCR50μlにおいて、隣接のプライマーP1及びP6の各々50pモル、各dNTP0.2mM、1×Pwo緩衝剤及び5単位Pwoとともに、テンプレートとして使用した。反応を、95℃で1分間行い、ついで、95℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で30秒間のサイクル30回に供した。生成物をSfiI及びNotIで消化し、アガロースゲルから取り出し、SfiI及びNotIで制限化されたpDHisIIにクローン化した。新たに作成した遺伝子領域を配列決定して、正確なプライマー構築及び予測したDNA配列を確認した。コンセンサスコード領域の配列を図1Aに示す。
大腸菌での発現用に最適化した合成DNA配列を、同様にデザインし、作成し、及びイネ(Oryza satival;osa−IΔD86 Asp86用のコドンを欠くoc−l GenBank受入番号U54702の修飾型(Urwinら,1995))、温州ミカン(Citrus unshiu;cun,GenBank受入番号C95263)及びパパイア(Carcia papaya;cpa,GenBank受入番号X71124(Songら,1995))からのフィトシスタチンのためにクローン化した。鶏卵卵白シスタチン遺伝子(cewc)配列を、遺伝子特異性プライマー、
cewcF 5’ATTAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAGCGAGGACCGCTCCCGGC3’(配列番号10)
cewcR 5’CGCTGTACTTGCGGCCGCCCTGGCACTTGCTTTCCAGC3’(配列番号11)
(それぞれ、SfiI部位及びNotI部位(下線で示す)が挿入されている)を使用してpQE30誘導組み換えプラスミドから増幅した。
初めに、フィトシスタチンコード領域を、遺伝子III融合物として、ファージミドベクターpHEN1の修飾型(Hoogenboomら,1991)へクローン化した。NotI開裂ベクターによる連結用に好適な一本鎖エンドを有するリンカーを創製するためにリン酸化し、アニールした相補的オリゴヌクレオチドによってコードされるヘキサヒスチジン領域の添加によって、pHENベクターを修飾した。オリゴヌクレオチド配列は、
HisF: 5’−GGCCGCAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGG−3’(配列番号12)
HisR: 5’−GGCCCCGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGC−3’(配列番号13)
であり、NotI相補的末端を下線で示している。
XhoF:5’ATCACGCTCGAGCAGAACAAAAACTCATCTCAG3’(配列番号14)
XhoR:5’TGTTCTGCTCGAGCGTGATGGTGATGGTGATGGCG3’(配列番号15)
BamHIR:5’TGGCCTTGATATTCACAAACG3’(配列番号16)
M13R:5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’(配列番号17)
を使用するPCR突然変異誘発によって、遠位のNotI部位を破壊した。
初めに、C末端RGS(H)6及びmycタグを追加するベクターpDHisIIにおいて、作成物を使用して、シスタチンを発現させた。大腸菌宿主菌株HB2151における発現の研究により、シスタチン−遺伝子III融合物内におけるアンバーコドンの抑制が可能になり、その結果、周辺質にシスタチンが蓄積された。培養物(1L)を、0.1%(v/v)グルコース及びアンピシリン100μg/mlと一緒に、2xTY培地において生育し、ついで、1mMまでのIPTGによって誘導し、30℃において16時間生育した。細胞ペレットを、50mMTris(pH8)、20%(v/v)ショ糖20mlに、4℃で再懸濁させ、周辺質の調製を行った。周辺質フラクションにNi−NTA樹脂1mlを添加し、4℃において16時間混合してインキュベートした。樹脂を洗浄緩衝液(50mM NaHPO4、500mM NaCl、pH6)のアリコート1mlで8回、ついで、40mMイミダゾールを含有する洗浄緩衝液で3回洗浄した。PBSに対して透析する前に、シスタチンを、250mMイミダゾールを含有する洗浄緩衝液200μlにて、4℃において、1時間で溶離した。タンパク質を分取し、液体窒素中で凍結した。サンプルをSDS−PAGE及びエレクトロスプレイ質量分析によって分析した。
可溶性タンパク質のより効果的な発現のため、フィトシスタチン遺伝子を、pDHisIIからのC末端6−Hisタグと一緒に、方向性TOPOクローニング(Invitrogen)によってpET101にサブクローン化した。上述の条件を使用して、元のクローニングベクターpDHisIIからのフィトシスタチン遺伝子をPCR増幅するために、プライマー
cystaSDFWD 5’CACCATGAAATCACTATTGCTTACG3’(配列番号18)
cystaSDREV 5’CTACTAGTGATGGTGATGGTGATGCG3’(配列番号19)
を使用した。陽性のクローンをDNA配列分析によって確認し、BL21(DE3)Star cell(Invitrogen)に導入した。培養物を30℃において生育し、IPTGを16時間添加する(1mMまで)ことによってフィトシスタチンの発現を惹起した。遠心分離(4,000×g、10分)によって細胞を収集し、氷上で超音波処理し(3×1分)、細胞片を遠心分離(10,000×g、10分)によってペレット化した。上澄みを0.1mM NiCl2を充填した金属キレート化カラム(Pharmacia)上に負荷した。広範な洗浄の後、100mMイミダゾールにてフィトシスタチンを溶出し、広範にHBS緩衝液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005%P20)に透析し、−70℃において保存した。
システインプロテアーゼ用の合成基質(Filippovaら,1984)であるpGlu−Phe−Leu−p−NA(Sigma)を使用して、パパイン(Sigma)の阻害をアッセイした。インキュベーション緩衝液(0.15M MES/OH pH5.8、4mM NaEDTA、4mM DTT)50μl中のパパイン100ngを、シスタチンを含有しない又は既知濃度のシスタチンを含有するサンプル50μlに添加し、30分間プレインキュベートした。1mM pGlu−Phe−Leu−p−NA(インキュベーション緩衝液及び30%DMSO中)50μlを添加し、パパインの活性を、25℃において15分間にわたり、415nmにおけるODの線形増加によってモニターした。
パパインをSigmaから凍結乾燥粉末として入手した。SPR試験のために、1mM DTTを含有するHBS緩衝液に溶解することによって、1mg/mlのストック溶液を調製した。このストック溶液を、同じ緩衝液にて、所望の濃度に希釈した。全てのSPR試験を、NTAセンサーチップを使用する装置BIACORE 3000にて実施した。ランニング緩衝液はHBS−EP(10mM HEPES、0.15M NaCl、0.005% P20、pH7.4)であり、全ての試験を25℃において実施した。フィトシスタチンを、フローセル2〜4において不動化し(約400応答単位(RU))、フローセル1をブランクのままとした。パパインのフィトシスタチンへの結合をモニターするため、HBS緩衝液240μlを、全てのフローセル上に、流量80μlで注入し(会合フェーズ)、続いて、サブトラクションブランクを提供するため、普通の緩衝液を3分間注入した(解離フェーズ)。この注入をパパインとともに繰り返した。EDTAを使用してタンパク質をセンサーチップから剥がし、異なったパパイン濃度で試験を繰り返す前に、表面にニッケルを再充填した。動態解析を可能にするため、各濃度について、少なくとも5サイクルを行った。これらの結合テストからのデータを、Biaevaluation 3ソフトウエアパッケージ(BIACORE)を使用し、データをLangmuir1:1結合モデルに包括的に適合することによって分析した。
PHYTC57及びOSA−IΔD86のアリコートを、50mMリン酸塩緩衝液(pH7.4)において0.5μgタンパク質/mlで調製した。直ちに、サンプルを沸騰水浴内に置いた。各種の時間でサンプルを取り出し、−70℃において保存する前に、液体窒素に浸漬した。機能性シスタチンの残留レベルを測定するため、パパイン阻害アッセイによって、残留阻害活性を測定した。
使用直前に、上述のように、模擬胃液を調製し(Astwoodら,1996)、該胃液は、0.03M NaCl中に0.32%(w/v)ペプシンを含有し、濃HClにてpH1.2に調整されている。最終濃度0.2mg/mlでPHYTC57及びOSA−IΔD86の4個のレプリカを、SGF中、37℃においてインキュベートした。間を置いて、アリコート200μlを取り出し、直ちに0.2M Na2CO375μlと混合して消化を停止させた。各サンプルを3つのサブサンプルに分け、上述のように(Atkinsonら,2004)、SDS−PAGEゲル上で分離した。2つのゲルを、全タンパク質について、クマシーブルーで染色し、その内の1つは、PHYTC57に対する模擬胃液の効果を示すものであり、他方は、PHYTC57の消化性をOSA−IΔD86と比較するものである。第3のゲルを、マウスの抗体を使用するウエスタンブロット分析に供して、アルカリホスファターゼ活性を使用する可視化にてPHYTC57の6Hisタグ(Qiagen)を検出した。各時点からの最終サンプルを、上述する酵素アッセイによってパパインに対する残留阻害活性について分析した。
フィトシスタチン遺伝子の合成
コンセンサスフィトシスタチンコード領域のデザインのため、探索プローブとしてOSA−I(Oriza sative;U54702)、ZMA2(Zea mays;D38130)及びHAN1(Helianthus annuus;Q10993)タンパク質配列を使用して、GenbankデータベースのtBLASTN探索に着手した。コンセンサス配列を誘導するために使用した配列のリストを表1に示す。ホモロジー検索によって、データベースから配列を同定した。表は、各シスタチンについて、植物の生物名及び慣用名及びGenebank受入番号とともに、系統名を示す。プログラムCLUSRALWを使用して、コード配列を翻訳及び整列させ、プログラムCINEMA(Parry−Smithら,1998;Lordら,2002)を使用して、アライメントをディスプレイして、手動アライメントによって改善を可能にした。ついで、コンセンサス配列を、各位置における最も一般的なアミノ酸を同定することによって派生させた(図1A)。コンセンサス配列の長さを、保存されたN末端グリシン残基の前及びこのようにして第1のβストランド(β1)の前の、N末端に位置する4つの残基を有するアミノ酸95個と評価した。C末端は、保存されたPWモチーフの後及びこのようにして最後のβストランド(β5)の後の残基15個と評価された。これらの基準は、CEWC(Bodeら,1988)及びヒトステフィンB(Stubbsら,1990)のX線構造及びOSA−IのNMR構造(Nagataら,2000)に基づくものである。
初めに、pDHisIIからシスタチンを発現させ、Ni−NTA親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製したシスタチンのエレクトロスプレイイオン化質量分析による分析は、意外にも、各ケースにおいて、発現されたタンパク質のC末端欠失があることを示した。表2は、測定した分子質量とともに、全長シスタチン及びProtein Calculatorプログラム(www.scripps.edu/〜cdputnam/protcalc.html)を使用して算定した16アミノ酸C末端欠失を有する全長シスタチンの予想した質量を示す。タンパク質のC末端エンドの配列が、矢印で示される主要な欠失部位とともに示されている。CUNを除き、測定した分子質量は、C末端のアミノ酸16個を失ってはいるが、Hisタグを保持している融合タンパク質の型と良好に一致している(表2)。CUNの場合、16個未満の残基の欠失があるが、これを、更に特徴付けることはしなかった。特定されたタンパク質配列の発現を確実にするために、シスタチンコード領域+Hisタグを、PCR及びTOPO促進性クローニングによって、pET101にサブクローン化し、BL21(CE3)Star cell(Stratagene)において発現させた。IPTGを16時間で1mMまで添加することによってタンパク質の発現を惹起し、シスタチンを、それらのC末端ヘキサヒスチジンタグのため、天然の条件下において、Ni−NTA親和性クロマトグラフィーによって精製した。シスタチンをSDS−PAGEによって分離して、それらの純度(>98%と予測された)を検査したところ、それらの質量は、ESI−MSによって予測された値(データを表示していない)と良好に一致したため、これらのタンパク質を他の分析に使用した。
人工の基質p−Glu−Phe−Leu−p−ニトロアニリドを使用するパパインによる酵素アッセイにより、PHYTC57が活性なシスタチンプロテアーゼ阻害剤であることが確認された。Ki値を測定していないが、PHYTC57及びOSA−IΔD86のIC50値(それぞれ、4.6×10−8M及び1.8×10−7M)から、PHYTC57がOSA−IΔD86よりもより強力な阻害剤であることが明らかである。シスタチンとプロテアーゼとの間の相互作用を直接測定するために、発明者らは、BIAコア表面プラズモン共鳴分析を使用して、結合速度を測定した。シスタチンを、C末端Hisタグによって、ニッケル被覆センサーチップ上に不動化した。ついで、パパインを、不動化したシスタチンに結合させ、いくつかのパパイン濃度において測定を行った。OSA−IΔD86、CPA、CUN、CEWC、及びPHYTC57の結合に関するセンサーグラムを図3に示す。各濃度におけるデータを、Langmuir1:1結合モデルに適合させ、速度定数を測定した。データは、シスタチンプロテアーゼのシスタチン阻害の既知の1:1化学量論量と矛盾しないモデルへの良好な適合を示した。これらのシスタチンに関する速度定数の要約を表3に示す。PHYTC57は、テストした天然産のシスタチンに比べて、平衡定数KD6.3×10−12Mにて、より高い会合速度及びより低い解離速度を発揮する(堅固なパパインとの結合複合体を表示する)。この値は、鶏卵卵白シスタチンについて測定したKD値(3.9×10−10M)よりも2桁低く、改良されたフィトシスタチンOSA−IΔD86(4.7×10−9M)よりも3桁、及びフィトシスタチンCUN(1.4×10−8M)及びCPA(2×10−8M)よりも4桁低い。
発明者らは、PHYTC57が、良好に特徴付けられた親のフィトシスタチンOSA−IΔD86と比較する場合、より大きい安定性を発揮するかどうかを調査することに興味を持った。これらのフィトシスタチンのサンプルを、沸騰水浴内で、各種の時間インキュベートし、冷却し、ついで、パパインアッセイにおいて、残留阻害活性についてテストした(図4A)。コンセンサスタンパク質PHYTC57(t1/2=17分)は、OSA−IΔD86(t1/2=6分)よりも大きい熱安定性を発揮し、阻害活性は、OSA−IΔD86について58分であるのに対して、PHYTC57については80分でも、なお測定された。
タンパク質のデザインに関するコンセンサスアプローチは、天然には存在しない配列を作成する方法を提供するものである。このような配列は、1ファミリーの類似のタンパク質の保存された官能性配列パラメーターを最適化するであろう。ファミリーの構造及び折りたたみに関与する特に重要な残基は、高度に保存されがちである(Lehmann及びWyss 2001;Mainら,2003a;Mainら,2003b;Mainら,2005)(Forrerら,2004)(Steipe 2004)。ファミリーの個々のメンバーの生物学的役割に応じて、官能性残基は保存されるか、又は保存されないであろう。システインプロテアーゼ結合性及び阻害性の形の機能的保存を示すフィトシスタチンの場合には、システインプロテアーゼ活性部位との相互作用に関与する高度の保存された配列モチーフの強化が存在する。従って、コンセンサスアプローチは、一般的な安定性とともに、生物学的機能、システインプロテアーゼ結合性が増強された最適化されたタンパク質を生ずるであろう。
[LVI][AGT][RKE][FY][AS][VI]X[EDQV][HYFQ]N(配列番号81)
を含有する。
序文
発明者らは、上記の57個の植物由来フィトシスタチン(先に「PHYTC57」と名付けたが、以下では、「Adhiron」と称する)のコンセンサス配列に基づいて新規で人工の結合(足場)タンパク質をデザインした。この人工のタンパク質は、ペプチド提示用の良好な足場であるための要件(低分子、単量体性、高溶解性及び高安定性、及びジスルフィド結合及びグリコシル化部位の欠如)の全てを満足する。発明者らは、各ループにおける9つのランダムな位置を有する、ペプチド提示用のAdhiron足場のVVAG及びPWE領域を選択した。
Adhironライブラリーの構築
57個のフィトシスタチン配列のアライメントに由来するコンセンサス配列を上記のように同定し、大腸菌での発現用にデザインしたコドン修飾遺伝子を合成した(GenScript)。Adhiron足場コード領域及びAdhironライブラリーコード領域を、Nhel制限部位とNotI制限部位との間でクローン化して、ファージミドpBSTG1(pHEN1(Hoogenboom,Griffithsら,1991)に由来し、DsbAシグナルペプチドも含有するpDHisIIの誘導体である)において、バクテリオファージM13のジーンIIIの3’末端ハーフを有する融合コード領域を作成した(pBSTG1−DsaA−Adhiron)。2つのPCR生成物(Hortin,Caiら,1990)のスプライスオーバーラップエクステンション(SOE)によってライブラリーを構築し、全てのプライマーをElla Biotechによって合成した。
順方向プライマー 5’−TCTGGCGTTTTCTGCGTC −3’(配列番号21)、
逆方向プライマー 5’−CTGTTCTTTCGCTTTAACAAC−3’ (配列番号22)。
によって作成された。
順方向ループ
5’GTTGTTAAAGCGAAAGAACAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACCATGTACCACTTGACCCTG−3’(配列番号23)、
逆方向ループ
5’CTGCGGAACTCCTGCAGTTCTTTGAAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAACCCAAACTTTCGCTTCG−3’(配列番号24)。
下記のプロトコルは酵母SUMOについて記載したものであるが、同じプロトコルを他の標的のスクリーニングに使用した。IPTG誘導を使用して、酵母SUMO(ySUMO)タンパク質をBL21(DE3)細胞において発現し、製造者の説明によるNi−NTA樹脂(Qiagen)親和性クロマトグラフィーによって精製した。SDS−PAGEによって純度を確認した。製造者の説明に従って、EZリンクNHS−SS−ビオチン(Pierce)を使用して、酵母SUMOをビオチン化した。免疫96Microwell(商標)Nunc MaxiSorp(商標)(Nunc)プレートに吸収されたySUMO上のビオチンを検出するために、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)に抱合したストレプトアビジンを使用して、ビオチン化を確認した。ファージディスプレイライブラリーのバイオパニングを下記のようにして実施した。
最終パニングからの個々のER2738コロニーを採取し、96ディープウェルプレートにおいて、カルベニシリン100μg/mlを含む2TY100μl中、37℃(900rpm)で6時間生育した。培養物25μlを、カルベニシリンを含有する2TY200μlに1時間で添加した。M13K07ヘルパーファージ(1011/ml)10μlを添加し、続いて、カナマイシン25μg/mlを添加し、細菌を25℃(450rpm)で一夜生育した。ストレプトアビジン被覆プレート(Pierce)を、2×カゼインブロッキング緩衝液(Sigma)にて、37℃で一夜ブロックした。翌日、プレートをビオチン化ySUMO0.4nMにて1時間ラベル化し、3000rpm、5分間の遠心分離によって細菌を集め、ビオチン化酵母SUMOを収容するウェル及びビオチン化リンカーを収容するウェルに、ファージを含有する成長培地45μlを添加し、1時間インキュベートした。Tecan Hydroflexプレート洗浄機を使用して、PBST300μl中で3回ウェルを洗浄し、HRP−抱合抗−ファージ抗体(Seramun)の1:1000希釈液を1時間で添加した。ウェルをPBST300μl中で10回洗浄し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質(Seramun)にて結合を可視化し、560nmにて測定した。
酵母SUMOに結合したAdhironのDNAコード配列をPCRによって増幅し、生成物をNheI及びPstIにて制限消化し、Adhiron足場を含有するpET11aにクローン化し、同じ制限部位で消化した。コロニーを採取し、LB培地5ml中、37℃、225rpmで一夜生育し、プラスミドDNAをミニプレップとして精製し(Qiagen)、正しい挿入物が存在することを確認するため配列決定した。熱ショックによって、プラスミドをBL21(DE3)細胞に形質転換し、コロニーを37℃において一夜生育した。翌日、培養物をLB培地400mlに添加し、250rpm、37℃においてOD6000.6まで生育し、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1mMまで添加した。細胞を、さらに6時間生育し、3000gでの遠心分離によって採取し、1×Bugbuster(Novagen)25ml中に再懸濁した。製造者の説明に従って、Benzonaseを添加し、懸濁液を室温において20分間混合し、50℃に20分間加熱し、9400gで20分間遠心分離した。透明な上澄みを、Ni−NTA樹脂のスラリー500μlと1時間混合し、洗浄緩衝液(50mM PBS、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)30ml中で3回洗浄し、溶離緩衝液(50mM PBS、500mM NaCl、300mMイミダゾール、pH7.4)1ml中で溶離し、ELISA及びウエスタンブロットでの使用のため、製造者の説明に従って、NHS SS−ビオチン(Pierce)を使用して、SUMO結合Adhiron(Ad−ySUMO)100μgをビオチン化した。
PBST中の標的タンパク質5ng(他の表示しない限り)を、免疫96Microwell(商標)Nunc MaxiSorp(商標)(Nunc)プレートのウェルに、4℃において一夜吸収させた。翌日、3×ブロッキング緩衝液200μlをウェルに添加し、振動させることなく37℃において4時間インキュベートした。100μg/mlのビオチン化酵母SUMOを、2×ブロッキング緩衝液を含有するPBST中で1:1000希釈し、アリコート50μlを、標的ウェルにおいて、振動しながら、1時間インキュベートした。ウェルを、PBST300μl中で3回洗浄し、PBST50μl中で1:1000希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)に抱合したストレプトアビジンをウェルに1時間で添加した。ウェルをPBST300μl中で6回洗浄し、TBM液体基質50μlにて結合を可視化し、吸光度を560nmで測定した。
標的タンパク質又はHEK293細胞可溶化物と混合した標的タンパク質(20μg)を、添加緩衝液(Laemmi,60mM Tris−Cl pH6.8、2%SDS、10%グリセリン、5%β−メルカプトエタノール、0.01%ブロモフェノールブルー)と混合し、3分間沸騰させ、15,000×gで1分間遠心分離し、ついで、15%SDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。タンパク質を、PVDF膜(Amersham Biosciences)に、4ワットにおいて45分間で転写し、ブロッキング緩衝液(PBS中5%BSA 0.1%Tween)中で1時間インキュベートし、続いて、ySUMO(100μg/ml、希釈1:1000PBST)との1時間のインキュベーションに供した。ストレプトアビジン抱合HRP及び蛍光発光法を使用して、結合したAd−ySUMOを検出した。
製造者の説明に従って、ビオチン化Ad−ySUMOバインダーの結合の親和性を見積もるために、BLitz(商標)(ForteBio)ディップ及び解読ストレプトアビジンバイオセンサーを使用した。要するに、異なったySUMO濃度における少なくとも4つの読み使用して、各Ad−ySUMOの親和性を測定した。各Ad−ySUMOの親和性を算定するために、包括的なフィットを使用した。これらの読みは、Biacore表面プラズモン共鳴装置を使用して行った親和性の測定値に匹敵するものであった。
Adhironのデザイン及びファージディスプレイ
本来、Adhiron遺伝子は、より強力なプロテアーゼ阻害剤を創成するようにデザインされたが、その分子認識用の拘束されたペプチド領域を提供するための足場タンパク質としての可能性のため(図6A)、発明者らは、足場のようなその用途を調査することを決定した。遺伝子配列は、大腸菌発現システムにおける発現を増強するように最適化したコドンであった(図6B)。アンバー停止コドンのトランスレーショナルなリードスルーにより、ER2738細胞のような非サプレッサー細胞において発現される際に、Adhiron−切り詰めpIII融合タンパク質が生産されるようにするが、JM83のようなサプレッサー細胞中でのみAdhironの生産が可能になるように、遺伝子のpBSTG1へのクローニングを容易にするために制限部位を導入した。Adhiron pIII融合タンパク質はファージミドベクターpBSTG1から発現されるが、一方、ファージミドDNAのM13ファージ粒子への複製及びパッケージングを可能にする他の成分を、M13KO7ヘルパーファージを使用して導入した。Adhiron−pIII融合タンパク質の発現を、抗−pIII抗体を使用するウエスタンブロットによって確認した。Adhiron足場の熱安定性を示差走査熱量測定によってテストしたところ、融解温度101℃を示した(図7A)。円二色法を使用して、コンセンサス配列の構造統合性を試験したところ、高いβシート/αへリックスの比及びランダムコイルを示した(図7B)
分子認識に適するペプチドコード配列の導入は、Adhironの構造内における予測したループの位置(図6)によって案内される。ループ1は、第1及び第2のβストランドの間に位置し、ループ2は、第3及び第4のβストランドの間に位置する。6個のランダムアミノ酸(システインを除く)を含んでなる配列を両ループの位置に導入して、それぞれ、ループ1及びループ2における4個及び3個のアミノ酸を置き換える。これらループ領域の伸展がAdhironの構造を破壊するかどうかを測定するため、ループ挿入物を有する3個の個々のAdhironを単離し、発現させ、円二色法によって検討した(図7B)。3個のクローンの全てがβ構造の高割合を維持しており、1個のクローンは、おそらく新規なループ領域へのβストランドの伸展を表示するβ構造含量の増加を示した。これは、ループの挿入が足場の構造に影響を及ぼさないことを証明するものでる。発明者らは、複雑度約3×1010のファージディスプレイライブラリーを作成した。アミノ酸組成をチェックするため、ライブラリーを感染させたER2738細胞から96個のクローンを単離した。発明者らは、アミノ酸組成におけるいかなるバイアス又はファージの産生の間に導入された他の望ましくないコンセンサスを測定するために、ファージクローンの配列を検討した(図7C)。アミノ酸の分布にはバイアスは観察されなかった。86.5%のクローンは全長の変異体であり、クローンの3.1%は、挿入物を持たないAdhiron足場であり、クローンの10.4%はフレームのシフトを示し、おそらくライブラリーにおいては価値のないものであろう。ファージゲノムのレベルにおける全長コード配列のこの非常に高い割合は、作成されたライブラリーが高品質であることを証明している。
標的として酵母SUMOを使用して、初めにライブラリーのスクリーニングを実施した。アビジン結合タンパクを介するタンパク質の不動化を可能にし、標的がプラスチック表面又は粒子表面に直接吸着される(時には、標的タンパク質の変性につながることがある)ことがないようにするために、酵母SUMOをビオチン化した。これは、標的タンパク質が、線形又は立体構造のいずれかのエピトープを認識する結合タンパク質の選択を可能にする三次元構造を維持することを保証する。パニングラウンド3によるサンプルコントロールと比べて、コロニーの回復において1000倍を超える増幅が観察された。24個のクローンを単離し、それらのSUMO標的への結合能力を、ファージELISAによって確認した(図9)。テストした全てのクローンが、酵母SUMOへの強い結合を示したが、Adhironの特異性を示すコントロールウェルへの結合は、ほとんど認められないか、全く認められなかった。クローンを配列決定したところ、22個の別個のAdhironが同定され、これらクローンにおけるループ領域の配列を表4に示す。
Adhiron足場の高い熱安定性のため(図7A)、発明者らは、精製を援助するためには、発現されたAdhironの完全性に影響を及ぼすことなく、大腸菌タンパク質の大部分を熱変性し且つ沈殿させることができなければならないと予測した。これをテストするため、発明者らは、可溶化物を、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃及び100℃において20分間加熱し、遠心分離して、変性したタンパク質をペレット化し、上澄みをSDS−PAGEによって分析した(図10A)。可溶化物の加熱は、上澄みにおける細菌タンパク質の量を劇的に低減させたが、Adhironのレベルを有意に低減させなかった。細菌タンパク質の大部分を沈殿させるには温度50℃が適しており、特性研究ではこれを採用した。図9Bは、精製したAd−ySUMOが、バッチ式金属親和性精製法を使用することにより、高い純度を示すこと、及びクローン10のようないくつかのケースでは、潜在的には、この精製の間に使用される樹脂の限られた量のために、タンパク質の大部分は単離されないことを示す。発現されたタンパク質の見積もりレベルは約100mg/Lであった。BLitz(商標)(ForteBio)Dip及びReadバイオセンサーを使用することによって、Adhironの親和性を推定した。親和性は、Ad−ySUMO10、15、20及び22について、それぞれ、11.5、2.4、14.2及び9.0nMであった。これらの値は、良好な抗体についてふつうにみられる親和性と一致している。
一定範囲の標的に結合できる特殊な試薬を同定するAdhironライブラリーの能力をさらに評価するため、発明者らは、成長因子(FGF1)、レセプター(CD31)、及びペプチド配列に対してスクリーニングした。興味深いことには、FGF1及びCD31についてテストしたクローンの大部分は特殊な結合を示し、一方、ペプチドのスクリーニングからは、わずかに3つのクローンが特殊な結合を示した。挿入されたペプチドに対する更なるパニングラウンドは、バックグラウンドに対するヒットの割合を増大させ、これにより、選んだクローンの80%が標的への結合を示した。この結果は、タンパク質のより大きい、及び従って潜在的に多数のエピトープ部位と比べて、ペプチドの適切なエピトープ提示の小さいサイズ及び限られた見込みのため、予期しないものである。
図17は、FcgRIIIaレセプタードメインと複合したAdhironの結晶構造を示す。これは、4つのβストランド及びαへリックスの重要な構造的要素を示すAdhironの3D構造を表している。構造は、他のシスタチン(例えば、ステフィンAを含む)のX線構造について見られるよりも、よりコンパクトな性質及び見かけ上少ないねじれ構造の点で、予期しないものである。β構造がループ領域内に変動する度合いまで進展することは興味深い。
発明者らは、植物シスタチンタンパク質(Adhironと名付けられている)のコンセンサスデザインに基づき、Tm101℃を有する極めて高い熱安定性をディスプレイする新規の足場タンパク質を開発した。この足場を使用して、2つの9アミノ酸の可変性領域の導入によってライブラリーを作成した。これらの可変性の配列はオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドにおいて、可変性の位置は、各アミノ酸(システインを除く)用のシングルコドンを含んでなるトリマーのサブセットである)によってコードされる。この結果、各アミノ酸は、ライブラリー内において、非常に類似して分散している。ライブラリーは、クローンの86.5%が全長の変異体クローンであり、非常に高い品質である。
Adhiron足場の変異体を作成した。配列番号1及び図6に示された配列は、調査した最短バージョンのAdhiron用であり、リンカー及びHisのような更なる機能性配列又は他の配列の付加以前に、長さ内に81個の残基を含んでなる。しかし、2つのより長い足場タンパク質(配列番号2及び3)も生成されたが、それぞれは、特定の環境では望ましいであろう。足場からの更なる欠失も可能であるが、配列番号1又はその変異体は、足場タンパク質の安定性が過度に損なわれることなく、最適な最小長さに近いものであると考えられる。
ATGVRAVPGN ENSLEIEELA RFAVDEHNKK ENALLEFVRV VKAKEQVVAG TMYYLTLEAK DGGKKKLYEA KVWVKPWENF KELQEFKPVG DA AAAHHHHHH(配列番号74)
短い「Adhiron84(84aa)」は、下記の配列(足場配列(配列番号2)+リンカー及びHisタグ(下線で示す)からなる)を有する。
GNENSLEIEE LARFAVDEHN KKENALLEFV RVVKAKEQVV AGTMYYLTLE AKDGGKKKLY EAKVWVKPWE NFKELQEFKP VGDA AAAHHHHHH(配列番号75)
最短の「Adhiron81(81aa)」(図6に示している)は、下記の配列(足場配列(配列番号1)+リンカー及びHisタグ(下線で示す)からなる)を有する。
NSLEIEELAR FAVDEHNKKE NALLEFVRVV KAKEQVVAGT MYYLTLEAKD GGKKKLYEAK VWVKPWENFK ELQEFKPVGD A AAAHHHHHH(配列番号76)
下線を付した配列は、追加の3Alaリンカー及び6His検出/精製タグを含んでなる。このタグは、足場自体の部分ではなく、明白な理由よるタンパク質への有用な付加である。
足場タンパク質ライブラリー、すなわち、各種のペプチドが足場に挿入されているライブラリーの調製に有用であるAdhiron配列の例は以下のとおりである。
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−アミノ酸残基2〜4(太字のイタリック書体で示す)にN末端が配置され、好適にはこれらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。
−LOOP1は、アミノ酸残基47〜50(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基76〜78(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−AdhironのN末端(すなわち、上に示すように、メチオニン残基と第1のグリシンとの間)に、N末端ペプチド配列が付加されることができ、この付加物は、代表的には3〜約20個のアミノ酸である。
−LOOP1は、アミノ酸残基39〜42(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基68〜70(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−AdhironのN末端にN末端ループが付加されることができ、この付加物は、代表的には3〜約20個のアミノ酸である。
−LOOP1は、アミノ酸残基36〜39(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基65〜67(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
一般に、LOOP1及びLOOP2は、結晶構造(図17)によって支持されるように、標的結合において最も重要である。本発明の特定の具体例では、LOOP1及びLOOP2の一方のみがペプチド配列によって置き換えられるが、一般的には、両方が置き換えられることが好ましい。N末端は、LOOP1及びLOOP2ほど重要ではないため、調査されていないが、多くの状況では、N末端において好適なペプチドを挿入することにより、結合親和性及び特異性が改善される。
免疫蛍光法:
実施例−ウイルスタンパク質を検出するための試薬
多年にわたる繰り返された試みにもかかわらず、ヒトパピローマウイルスE5タンパク質を同定する抗体を産生することが可能であることは証明されていない(質量分析による上皮細胞株におけるヒトパピローマウイルスタイプ16E5腫瘍性タンパク質レベルの定量測定,Sahabら,J Virol.2012 Sep;86(17):9465−73;Werherill,LF, Ross,R及びMacdonald,A (2012),HPV E5:謎の腫瘍性タンパク質,小さいDNA腫瘍ウイルス,K.Gaston編,Caister Academic Press,pp55−70)。
実施例1(SUMOへの結合を阻害する試薬)
ヒトSUMO2(hSUMO2)に特異的且つ差次的に結合できる抗体は存在しなかった。hSUMO2に対してAdhironが産生され、ヒトSUMO1よりもむしろSUMO2に特異的に結合する複数のAdhironが同定された。図13は、hSUMO2 Adhironが、hSUMO2に結合し及びRNF4(ポリSUMO特異性E3ユビキチンリガーゼ)がhSUMO2と結合することを阻害することによるタンパク質−タンパク質相互作用についての機能的効果を有することを証明するものである。hSUMO2 Adhironは、他のタンパク質のユビキチン化に影響を及ぼすことなく、前記の効果を有する。ATPの存在下では、通常、hSUMO2は、標的タンパク質のユビキチンを生ずるRNF4と結合する(レーン2におけるゲルの頂部における黒のスメア)。増大された濃度のAdhironの存在下では(レーン3〜9)、ユビキチンのレベルは減少する。
血栓の形成を変化させ、溶解させることができるAdhironを同定するためにフィブリノーゲンをスクリーニングした。血漿サンプルにおいてこのプロセスを変性する多数のAdhironが同定された。図14のグラフは、血栓の形成及び溶解濁度アッセイを表す。黒のラインは、血栓の形成及び溶解の正常な経時経過を示す。グレーのラインは、このプロセスに対する異なった5種類のAdhironの効果を表す。コントロールの非フィブリノーゲン結合Adhironは、このアッセイにおいて効果を示さない。Adhironの効果としては、減少された血栓の形成、増大された溶解時間、及び増大された凝固時間が含まれる。これは、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害することによってタンパク質の機能を調節するAdhironの能力を証明するものである。図15は、フィブリノーゲン結合Adhiron及びコントロールAdhironの存在下における血栓の形成後のFITC蛍光ラベル化フィブリノーゲンの共焦点像を示す。
実施例1に記載のように、ヒトSUMO2に対してAdhironを産生し、pcDNA3.1哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類HEK293細胞において発現させた。Adhironを、FLAGタグ及び核移行シグナルと融合させた。コントロール細胞(Adhironを発現しない)及びヒトSUMO2特異性Adhironを発現する細胞をヒ素(As)にて2時間処理し、ついで、洗浄し、12時間及び24時間回復させた。ヒ素は前骨髄球性白血病(PML)タンパク粒を増大させるが、SUMOはこれらの粒の分解を制御する。Adhironを同定するため、及びPML(核内構造体の形成体)のために、抗−FLAG抗体を使用して、細胞を染色した。ヒトSUMO2 Adhironは、PMLの分解を変化させ、結果として、これらの粒を増大させる。これは、哺乳類の細胞において機能性Adhironを発現させる能力を証明するものである。結果を図16に示す。
図17は、FcgRIIIa(グレー)及び結合したAdhiron(白)の共結晶構造を示す。FcgRIIIaに結合したAdhironを同定し、ついで、IgG結合を阻害することを示すために、細胞−及びSPR−系アッセイを含む一定範囲のアッセイにおいて使用した。ついで、Adhironを共結晶化し、構造を解明した(上の図)。これは、FcgRIIIaにおける新薬の開発につながるような部位(アロステリック部位を含む)を同定するものであった。AdhironはNMR研究にも適するものであり、一例として、図18は、抗−酵母SUMO Adhiron及びAdhiron−酵母SUMO複合体の1H−15N HSQCスペクトルを示す。Adhironについての構造データを迅速に集めることができることは、潜在的な医薬結合部位を同定することを含む多くの用途を有するであろう。
ヒトSUMO2 Adhiron(実施例1に記載)のコード配列の部位特異的変異誘発は、オリゴヒスチジンタグのC末端におけるシステインの導入を許容する。これにより、Adhironの電子装置への方向性の不動化が可能になり、その結果、分子認識ループが分析物へアクセス可能になる。標的タンパク質が、装置上において、Adhironに結合する際、インピーダンスにおける変化を測定できる。変化は濃度依存性であり(図19に示すように)、Adhironの効果的な表示及びバイオセンサーの用途ためのプラットフォームとして電子デバイスに生産的に組み込まれるAdhironの能力を証明している。
Adhironライブラリーを使用して、この明細書に記載するディスプレイ方法論を使用することによる一定範囲の標的分子に対してスクリーニングした。表5は、Adhironが産生された標的の例を示す。これらは、タンパク質及び小分子を含む。これら標的に対して産生されたAdhironは高い親和性及び特異性を示す。これは、Adhironが多用途の足場分子を提供すること及びこの足場を使用して構築されるライブラリーが、広範囲の標的分子に結合できる人工の結合分子を同定することにおいて有効であることを証明している。いくつかの標的に対するスクリーニングから単離された配列のいくつかの例を図20〜24に示す。発明者らは、最近、マグネトトロピック(magnetotropic)細菌によって生産された磁性粒子に対してもスクリーニングを行い、これらの多成分性のバイオ−無機複合体においてエピトープに結合するAdhironを同定した。
Astwood, J. D., J. N. Leach, ら (1996). "インビトロ消化に対する食物アレルゲンの安定性" Nature Biotechnology 14(10): 1269-1273.
Atkinson, H. J., K. A. Johnston, ら (2004). "線虫に対するトランスジェニック植物用のフィトシスタチンがヒト食物における毒性危険物ではないとの一応の証拠" Journal of Nutrition 134(2): 431 -434.
Bendtsen, J. D., H. Nielsen, ら (2004). "シグナルペプチドの改良された予測:SignalP 3.0." Journal of Molecular Biology 340(4): 783-795.
Binz, H. K., M. T. Stumpp, ら (2003). "反復タンパク質の設計:コンセンサスアンキリン反復タンパク質の組み合わせライブラリーからの良好に発現される、可溶性で及び安定なタンパク質" Journal of Molecular Biology 332(2): 489-503.
Bode, W., R. Engh, ら (1988). "鶏卵卵白システインの2.0aX線結晶構造及びシステインプロテアーゼとの相互作用のその可能なモード" Embo Journal 7(8): 2593-2599.
Carter, P. J. (2011). "現在及び将来のタンパク質治療への案内:タンパク質工学の展望" Experimental Cell Research 317(9): 1261-1269.
Dai, M. H. , H. E. Fisher, ら (2007). "案内されたコンセンサス工学による新規な蛍光タンパク質の創成" Protein Engineering Design & Selection 20(2): 69-79.
Deboer, H. A., L. J. Comstock, ら (1983). "TCAプロモーター−TRPプロモーター及びLACに由来の機能性ハイブリッド" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 80(1): 21 -25.
Filippova, I. Y. , E. N. Lysogorskaya, ら (1984). "L−ピログルタミル−L−フェニルアラニル−L−ロイシン−p−ニトロアニリド−チオールプロテアーゼアッセイ用の発色性基質" Analytical Biochemistry 143(2): 293-297.
FitzGerald, K. (2000). "インビトロディスプレイ技術−医薬発見のための新規な手段" Drug Discovery Today 5(6): 253-258.
Forrer, P., H. K. Binz, ら (2004). "反復タンパク質のコンセンサスデザイン" ChemBioChem 5: 183-189.
Forrer, P., H. K. Binz, ら (2004). "反復タンパク質のコンセンサスデザイン" ChemBioChem 5(2): 183-189.
Gebauer, M. 及びA. Skerra (2009). "次世代の抗体治療としての遺伝子操作タンパク質足場" Current Opinion in Chemical Biology 13(3): 245-255.
Grebien, F., O. Hantschel, ら (2011). "Bcr−AbIにおけるSH2−キナーゼインターフェースを標的指向化することは白血病誘発を阻害する" Cell 147(2): 306-319.
Ho, M.及びI. Pastan (2009). 抗体工学用の哺乳類細胞ディスプレイ, Methods in Molecular Biology. A. S. Dimitrov. 525: 337-352.
Hoffmann, T., L. K. Stadler, ら (2010). "ステフィンA.I由来の遺伝子操作足場タンパク質の構造−機能の研究:SQM変異体の開発" Protein Eng Pes Sel 23(5): 403-413.
Hoogenboom, H. R., A. D. Griffiths, ら (1991 ). "繊維状ファージの表面上のマルチサブユニットタンパク質−抗体(Fab)重質及び軽質鎖をディスプレイするための方法論" Nucleic Acids Research 19(15): 4133-4137.
Horton, R., Z. Cai, ら (1990). "オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング:ポリメラーゼ連鎖反応を使用する個別化遺伝子" Biotechniques 8: 528-535.
Hutchison, C. A., S. Phillips, ら (1978). "DNA配列における特殊な位置での突然変異誘発" Journal of Biological Chemistry 253(18): 6551 -6560.
Jacobs, S. A., M. D. Diem, ら (2012). "コンセンサス配列アプローチによる高い安定性を有する新規なFN3ドメインのデザイン" Protein Engineering Design & Selection 25(3): 107-1 17.
Jacobs, S. A., M. D. Diem, ら (2012). "コンセンサス配列アプローチによる高い安定性を有する新規なFN3ドメインのデザイン" Protein Eng Pes Sel 25(3): 107-117.
Jaeckel, C, J. D. Bloom, ら (2010). "系統学的バイアスのないコンセンサスタンパク質のデザイン" Journal of Molecular Biology 399(4): 541-546.
Karatan, E. , M. Merguerian, ら (2004). "Src SH3ドメインを結合するFN3モノボディの分子認識特性" Chemistry & Biology 11 (6): 835-844.
Kayushin, A., M. Korosteleva, ら (1996). "オリゴヌクレオチド/ペプチドライブラリーの作成のためのトリヌクレオチドホスホラミダイト−シントンの合成への簡便なアプローチ" Nucleic Acids Res 24: 3748 - 3755.
Knappik, A., L. Ge, ら (2000). "分子コンセンサスフレームワーク及びトリヌクレオチドでランダム化したCDRに基づく完全合成のヒト組み換え抗体ライブラリー(HuCAL)" Journal of Molecular Biology 296(1): 57-86.
Kohler, G.及びC. Milstein (1975). "予め定義された特異性の抗体をスクリーニングする融合細胞の連続培養" Nature 256(5517): 495-497.
Koide, A. , C. W. Bailey, et al. (1998). "新規な結合タンパク用の足場としてのフィブロネクチンタイプIIドメイン" Journal of Molecular Biology 284(4): 1141-1151.
Koide, A. , C. W. Bailey, ら (1998). "新規な結合タンパク用の足場としてのフィブロネクチンタイプIIドメイン" Journal of Molecular Biology 284(4): 1141-1151.
Koide, A., R. N. Gilbreth, ら (2007). "バイナリ−コードインターフェースを有する高親和性シングルドメイン結合タンパク質" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(16): 6632-6637.
Koiwa, H., M. P. D'Urzo, ら (2001). "システインプロテアーセの高親和性阻害を仲介するヘアピンループ大豆シスタチンのファージディスプレイ選択" Plant Journal 27(5): 383-391.
Komor, R. S., P. A. Romero, ら (2012). "予測手法を使用して遺伝子操作した高熱安定性の真菌セロビオヒドロラーゼI(Cel7A)" Protein engineering, design & selection : PEPS 25(12): 827-833.
Komor, R. S., P. A. Romero, ら (2012). "予測手法を使用して遺伝子操作した高熱安定性の真菌セロビオヒドロラーゼI(Cel7A)" Protein Engineering Design and Selection 25(12): 827-833.
Kondo, H., K. Abe, ら (1991). "オリザシスタチン−Ii(植物起源の新規なシスタチンスーパーファミリーのメンバー)の遺伝子機構は、オリザシスタチン−Iの遺伝子機構に緊密に関連するが、動物性シスタチンとは異なる" Febs Letters 278(1): 87-90.
Kordis, D.及びV. Turk (2009). "真核生物及び原核生物におけるシステインスーパーファミリーのフィロゲノミック分析" Bmc Evolutionary Biology 9.
Krumpe, L , K. Schumacher, ら (2007). "トリヌクレオチドカッセットは、T7ファージ−ディスプレイペプチドライブラリーの多様性を増大する" BMC Biotechnology 7(1): 65.
Lee, S.-C., K. Park, ら (2012). "モジュールエンジニアリングによる無顎脊椎動物の各種のリンパ球受容体に基づく結合足場のデザイン" Proceedings of the National Academy of Sciences 109(9): 3299-3304.
Lehmann, M., C. Loch, ら (2002). タンパク質の熱安定性に関するコンセンサスコンセプト:コンセプトの更なる証拠" Protein Engineering 15(5): 403-41 1.
Lehmann, M., R. Lopez-Ulibarri, ら (2000). "酵素の機能特性を変更するためのフィターゼ間における活性部位の交換" 9(10): 1866-1872.
Lehmann, M.及びM. Wyss, (2001). "熱安定性のためのタンパク質の遺伝子操作:合理的なデザイン及び定向進化に対する配列アライメントの使用" Current Opinion in Biotechnology 12(4): 371-375.
Lilley, C. J., P. E. Urwin, ら (2004). "線虫の採餌場における植物性シスタチンの優先発現は、サツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita)及びグロボデラ・パリダ(Globodera pallida)に対する抵抗性を付与する" Plant Biotechnology Journal 2(1): 3-12.
Lofblom, J. (2011). "組み合わせタンパク質工学における細菌ディスプレイ" Biotechnology Journal 6(9): 1 115-1 129.
Lord, P. W., J. N. Selley, ら (2002). "CI NEMA−MX:モジュラーマルチプルアライメントエディター" Bioinformatics 18(10): 1402-1403.
Main, E. R. G., S. E. Jackson, ら (2003). "反復タンパク質の折りたたみ及びデザイン:合意形成" Current Opinion in Structural Biology 13(4): 482-489.
Main, E. R. G., A. R. Lowe, ら (2005). "タンパク質工学における再発するテーマ:反復タンパク質のデザイン、安定性及び折りたたみ" Current Opinion in Structural Biology 15(4): 464-471.
Main, E. R. G., Y. Xiong, ら (2003). "理想的なTPRモチーフからの安定なアルファへリックスアレイのデザイン" Structure 11 (5): 497-508.
Makela, A. R.及びC. Oker-Blom, (2008). "バキュロウイルスディスプレイ技術−分子スクリーニング及び薬物送達のための進化する機器" Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 11 (2): 86-98.
Margis, R., E. M. Reis, ら (1998). "植物性及び動物性シスタチンにおける構造上の及び系統学的関係" Archives of Biochemistry and Biophysics 359(1): 24-30.
McPherson, M. J., P. E. Urwin, ら (1997). 摂食抑制物質アプローチによる遺伝子操作植物線虫抵抗性, Cellular and Molecular Basis for Plant-Nematode Interactions. C. Fenoll, S. Ohl及びF. Grundler. The Netherlands, Kluwer: 237-249.
Melo, F. R., M. O. Mello, ら (2003). "アカントスセリデス・オブテクタス(Acanthoscelides obtectus)システインプロテアーゼに対して特異的な新規のシステインを選択するためのファージディスプレイの使用" Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1651 (1-2): 146-152.
Mosavi, L. K., T. J. Cammett, ら(2004). "タンパク質認識のための分子構造としてのアンキリン反復" Protein Science 13(6): 1435-1448.
Mosavi, L. K., D. L. Minor, ら (2002). "アンキリン反復モチーフのコンセンサス由来の構造決定因子" Proceedings of the National Academy of Sciences 99(25): 16029-16034.
Mullis, K., F. Faloona, ら (1986). "インビトロにおけるDNAの特異的酵素増幅:ポリメラーゼ連鎖反応" Cold Spring Harb Svmp Quant Biol 51 Pt 1 : 263-273.
Nagata, K., N. Kudo, ら (2000). "イネ(オリザ・サティバ・L.・ジャポニカ(Oryza sativa L. japonica)のシステインプロテアーゼであるオリザシステイン−1の三次元解析構造" Biochemistry 39(48): 14753-14760.
Nixon AE, W. C. (2006). "プロテアーゼの遺伝子操作タンパク質阻害剤" Curr Opin Drug Discov Devel 9(2): 261 -268.
Nord, K., J. Nilsson, ら (1995). "αへリックスの細菌性レセプタードメインの組み合わせライブラリー" Protein Engineering 8(6): 601 -608.
Odegrip, R., D. Coomber, ら (2004). "CISディスプレイ:タンパク質−DNA複合体のライブラリーからのペプチドのインビトロ選択" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (9): 2806-2810.
Parizek, P., L. Kummer, ら. (2012). "c−Jun N末端キナーゼの新規なアイソフォーム特異性細胞間阻害剤としてデザインされたアンキリン反復タンパク質(DARPins)" ACS Chemical Biology 7(8): 1356-1366.
Parmeggiani, F., R. Pellarin, ら (2008). "一般的なペプチド結合足場としてデザインされたアルマジロ反復タンパク質:疎水性コアのコンセンサスデザイン及び計算的な最適化" Journal of Molecular Biology 376(5): 1282-1304.
Parry-Smith, D. J., A. W. R. Payne, ら (1998). "CINEMA−マルチプルアライメント用の新規なカラーインタラクティブエディター(Gene, vol 221 , pg GC57-GC63, 1998からの再版)" Gene 221 (1): GC57-GC63.
Polizzi, K. M., J. F. Chaparro-Riggers, ら (2006). "より熱安定性のペニシリンGアシラーゼを創成するための構造情報に基づくコンセンサスアプローチ" Biotechnology Journal 1(5): 531- 536.
Reichert, J. M. (2010). "2010年において注目される抗体" MAbs. 2(1): 84-100.
Saiki RK, S. S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (1985). "鎌状赤血球貧血の診断のためのβ−グロブリン遺伝子配列の酵素的増幅及び制限部位の分析" Science 230(4732): 1350-1354.
Schlehuber, S.及びA. Skerra (2005). "抗体技術の代替手段としてのAnticalins" Expert Opinion on Biological Therapy 5(1 1): 1453-1462.
Skerra, A. (2007). "分子認識用の別の非−抗体足場" Current Opinion in Biotechnology 18: 295-304.
Smith, G. (1985). "繊維状融合ファージ:ウイルス粒子表面でクローン化抗原をディスプレイする新規な発現ベクター" Science 228(4705): 1315-1317.
Song, I., M. Taylor, ら (1995). "大腸菌において生産されたパパイヤシステインによるシステインプロテアーゼの阻害" Gene 162(2): 221-224.
Song, J., L. K. Durrin, ら (2004). "SUMO修飾タンパク質を認識するSUMO結合モチーフの同定" Proc Natl Acad Sci U S A 101 (40): 14373-14378.
Song, J., Z. Zhang, ら (2005). "SUMO結合モチーフの低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)認識:結合配向の逆転" J Biol Chem 280(48): 40122-40129.
Stadler, L. K., T. Hoffmann, ら (201 1). "ステフィンAIIに由来の遺伝子操作足場タンパク質の構造−作用に関する研究:SQT変異体の開発及び用途" Protein Eng Pes Sel 24(9): 751 -763.
Steipe, B. (2004). "タンパク質の安定性のコンセンサスに基づくエンジニアリング:細胞内抗体から熱安定性酵素まで" Protein Engineering 388: 176-186.
Steipe, B., B. Schiller, ら (1994). "タンパク質ドメインにおける配列統計学的信頼性予測に基づく安定化突然変異" Journal of Molecular Biology 240(3): 188-192.
Steipe, B, B. Schiller, et al. (1994). "タンパク質ドメインにおける配列統計学的信頼性予測に基づく安定化突然変異" Journal of Molecular Biology 240(3): 188-192.
Stubbs, M. T., B. Laber, ら (1990). "システインプロテアーゼパパインとの複合体における組み換えヒトステフィン−Bの精密な2.4aX線結晶構造−新たなタイプのプロテイナーゼ−阻害剤相互作用" Embo Journal 9(6): 1939-1947.
Studier, F. W.及びB. A. Moffatt (1986). "クローン化遺伝子の選択的高レベル発現を導くためのバクテリオファージP7 RNAポリメラーゼの使用" J Mol Biol 189(1): 113-130.
Theurillat, J. -P., B. Dreier, ら (2010). "デザインされたアンキリン反復タンパク質:乳癌における上皮増殖因子レセプター2発現をテストするための新規な手段" Mod Pathol 23(9): 1289-1297.
Traxlmayr, M. W.及びC. Obinger (2012). "酵母ディスプレイを使用する増大された安定性及び発現のためのタンパク質の定向進化" Archives of Biochemistry and Biophysics 526(2): 174-180.
Urwin, P. E., H. J. Atkinson, ら (1995). "トランスジェニック毛状根において発現された遺伝子操作オリザシステイン−Iは、ジャガイモシロシストセンチュウ(Globodera-Pallida)に対する抵抗性を付与する" Plant Journal 8(1): 121 -131.
Urwin, P. E., J. Green, ら (2003). "植物性シスタチンの発現は線虫に対する部分的な抵抗性を付与する。完全抵抗性は、シスタチンに自然抵抗性を積み上げることによって達成される。" Molecular Breeding 12(3): 263-269.
Urwin, P. E., A. Levesley, ら (2000). "プロテアーゼ阻害剤を発現するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)植物によって付与された線虫ロチレンクルス・レニフォルミス(Rotylenchulus reniformis)に対するトランスジェニック抵抗性" Molecular Breeding 6(3): 257-264.
Urwin, P. E., C. J. Lilley, ら (1997). “修飾植物性シスタチンを発現するトランスジェニックアラビドプシス(Arabidopsis)によって付与されたシスト線虫及び根瘤線虫の両方に対する抵抗性” Plant Journal 12(2): 455-461.
Urwin, P. E., M. J. McPherson, ら (1998)."二重プロテアーゼ阻害剤コンストラクトによる線虫に対する増強されたトランスジェニック植物の抵抗性" Planta 204(4): 472-479.
Urwin, P. E., K. M. Troth, ら (2001). "ジャガイモ畑での実験におけるジャガイモシロシストセンチュウ(Globodera Pallida)に対する有効なトランスジェニック抵抗性" Molecular Breeding 8(1): 95-101.
Virnekas, B., L. Ge, ら (1994). "トリヌクレオチドホスホラミダイド:ランダム突然変異誘発のための混合オリゴヌクレオチドの合成用の理想的な試薬" Nucleic Acids Res 22: 5600 - 5607.
Von Behring, E., Kitasato, S., (1890). "動物におけるジフテリア免疫と破傷風免疫の発生について" Deutsche edizinische Wochenzeitschrift 16: 11 13-1114.
Wojcik, J., O. Hantschel, ら (2010). "AblSH2ドメインの強力且つ高度に特異的なFN3モノボディ阻害剤" Nat Struct Mol Biol 17(4): 519-527.
Woodman, R., J. T. H. Yeh, ら (2005). "ペプチドアプタマーの提示のための中性タンパク質足場のデザイン及び検証" Journal of Molecular Biology 352(5): 11 18- 1133.
Wurch, T., A. Pierre, ら (2012). "治療タンパク質を出現させるような新規のタンパク質足場:発見から臨床上の概念証明まで" Trends in Biotechnology 30(1 1 ): 575- 582.
Claims (43)
- 配列:
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(VVAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(PWE)NFKELQEFKPVGDA(配列番号1)
における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列Xn(ここで、Xは各種のアミノ酸であり、及びnは配列におけるアミノ酸の数であり、3〜30である)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列であって、前記配列番号1の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウレンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする合成足場タンパク質。 - 配列が5個以下の置換を含む請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- 配列が3個以下の置換を含む請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- nが3〜20である請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- nが4〜15である請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- アミノ酸配列X n を有するペプチドが、ループ領域の両方の位置に、挿入されている、 ないし、完全又は部分的に交換されている請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- 配列:
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X n )T MYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X n )NFKELQEFKPVG DA(配列番号4)
(ここで、X n は、請求項1において定義するとおりである)を有する請求項6に記載の 合成足場タンパク質。 - 配列:
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X 5−1 3 )TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X 5−13 )NFKELQ EFKPVGDA(配列番号5)(ここで、Xは、請求項1において定義するとおりであ る)を有する請求項7に記載の合成足場タンパク質。 - 配列:
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X 9 )T MYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X 9 )NFKELQEFKPVG DA(配列番号6)(ここで、Xは、請求項1において定義するとおりである)を有する 請求項7又は8に記載の合成足場タンパク質。 - タンパク質のN末端又はN末端からアミノ酸4個内に挿入された追加のアミノ酸配列を 含んでなる請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- N末端に、追加のアミノ酸配列を含んでなる請求項10に記載の合成足場タンパク質。
- N末端における追加のアミノ酸配列が、配列:
MATGVRAVPGNE(配列番号80)
のいくつか又は全部である請求項10に記載の合成タンパク質。 - 配列:
GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(V VAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(PWE)NFKELQ EFKPVGDA(配列番号2)
における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X n (ここで、X n は、請求項1 において定義するとおりである)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列で あって、前記配列番号2の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する 場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウ レンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物 性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする請求項12に記載の 合成足場タンパク質。 - 配列:
M(ATG)VRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEF VRVVKAKEQ(VVAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK (PWE)NFKELQEFKPVGDA(配列番号3)
における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X n (ここで、X n は、請求項1 において定義するとおりである)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列で あって、前記配列番号3の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する 場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウ レンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物 性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする請求項13に記載の 合成足場タンパク質。 - さらに、N末端における追加のアミノ酸配列における(ATG)のループ領域に、挿入 された、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X n (ここで、X n は、請 求項1において定義したとおりである)を有するペプチドを含んでなる請求項14に記載 の合成足場タンパク質。
- 70℃以上の融解温度(Tm)を有する請求項1に記載の合成足場タンパク質。
- 80℃以上の融解温度(Tm)を有する請求項16に記載の合成足場タンパク質。
- リンカー又はタグを含んでなる請求項1〜17のいずれかに記載の合成足場タンパク質 。
- 基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質に結合されている請求項1〜17のいず れかに記載の合成足場タンパク質。
- リンカー又はタグ、又は基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質が、C末端及び N末端の一方又は両方に結合されている請求項18又は19に記載の合成足場タンパク質 。
- 融合タンパク質である請求項1〜20のいずれかに記載の合成足場タンパク質。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質の集団を含んでなるライブラリ ー。
- 10 8 以上の複雑度を有する請求項22に記載のライブラリー。
- 複雑度が10 9 以上である請求項23に記載のライブラリー。
- 複雑度が10 10 以上である請求項24に記載のライブラリー。
- 合成足場タンパク質の集団が、バイオパニングに適したディスプレイシステムにおける ディスプレイ用に適するものである請求項22〜25のいずれかに記載のライブラリー。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質をコードするポリヌクレオチド 。
- 配列番号4、5、又は6のアミノ酸配列を有する合成足場タンパク質をコードする請求 項27に記載のポリヌクレオチド。
- 合成足場タンパク質用のコード配列に加えて、更なるコード配列又は非コード配列を含 んでなる請求項27又は28に記載のポリヌクレオチド。
- 更なるコード配列又は非コード配列が、ランダム化したアミノ酸配列をコードする配列 、リーダー配列をコードする配列、融合タンパク質部分をコードする配列、リンカーをコ ードする配列、マーカーをコードする配列、精製用タグをコードする配列、プロモーター 配列、又はエンハンサー配列である請求項29に記載のポリヌクレオチド。
- 宿主細胞における発現用に適応されている請求項27〜30のいずれかに記載のポリヌ クレオチドを含んでなる組換ベクター。
- 合成足場タンパク質の発現を制御するように、合成足場タンパク質をコードする核酸配 列に結合されている発現制御配列を含んでなる請求項31に記載の組換ベクター。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質を発現する細胞であって、請求 項27〜30のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項31又は32に記載の組換 ベクターを含んでなる細胞。
- 請求項33に記載の細胞を含んでなる細胞培養液。
- 標的に結合する合成足場タンパク質をスクリーニングする方法であって、
a)請求項22〜26のいずれかに記載のライブラリーを提供し;
b)前記ライブラリーを標的に曝露し;及び
c)前記標的に結合する合成足場タンパク質を選別する
ことを含んでなる方法。 - 標的が、タンパク質/ペプチド、核酸又は小分子である請求項35に記載の方法。
- ディスプレイシステムを用いる請求項35又は36に記載の方法。
- ファージディスプレイ法である請求項35〜37のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質を、バクテリオファージのコー トタンパク質と融合させて、前記合成足場タンパク質がウイルス粒子の表面にディスプレ イされるようにすることを含んでなる請求項38に記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、研究における使用。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、合成生物学における使用。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、標的検出における使用。
- 請求項35〜39のいずれかに記載の方法によってスクリーニングされた、疾病に関連 する標的に特異的に結合する請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質及び 、任意に、薬学上許容されるキャリヤー又は添加剤を含んでなる医薬品。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1302597.8A GB201302597D0 (en) | 2013-02-14 | 2013-02-14 | Novel Synthetic Proteins |
GB1302597.8 | 2013-02-14 | ||
JP2015557514A JP6794111B2 (ja) | 2013-02-14 | 2014-02-14 | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015557514A Division JP6794111B2 (ja) | 2013-02-14 | 2014-02-14 | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019205450A JP2019205450A (ja) | 2019-12-05 |
JP6889758B2 true JP6889758B2 (ja) | 2021-06-18 |
Family
ID=48048387
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015557514A Active JP6794111B2 (ja) | 2013-02-14 | 2014-02-14 | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 |
JP2019132489A Active JP6889758B2 (ja) | 2013-02-14 | 2019-07-18 | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015557514A Active JP6794111B2 (ja) | 2013-02-14 | 2014-02-14 | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9932575B2 (ja) |
EP (2) | EP3693003A1 (ja) |
JP (2) | JP6794111B2 (ja) |
CN (2) | CN105120885B (ja) |
AU (2) | AU2014217628B2 (ja) |
CA (1) | CA2900745C (ja) |
ES (1) | ES2784211T3 (ja) |
GB (1) | GB201302597D0 (ja) |
HK (1) | HK1217915A1 (ja) |
WO (1) | WO2014125290A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201302597D0 (en) * | 2013-02-14 | 2013-04-03 | Univ Leeds | Novel Synthetic Proteins |
GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
KR20180100132A (ko) | 2016-01-08 | 2018-09-07 | 이온타스 엘티디 | 변형된 다양성 스캐폴드 도메인을 갖는 결합 멤버 |
EP3405579A1 (en) | 2016-01-22 | 2018-11-28 | Modernatx, Inc. | Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof |
KR102582297B1 (ko) | 2017-05-19 | 2023-09-25 | 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. | 대상체의 흡연 상태를 구별하기 위한 진단 테스트 |
GB201710973D0 (en) | 2017-07-07 | 2017-08-23 | Avacta Life Sciences Ltd | Scaffold proteins |
WO2019012015A1 (en) | 2017-07-12 | 2019-01-17 | Iontas Limited | POTASIC CHANNEL INHIBITORS |
GB201711208D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Iontas Ltd | Ion channel inhibitors |
EP3932934A4 (en) | 2019-02-27 | 2023-09-20 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | FUSION PROTEIN OF AN ANTIGEN-BINDING PROTEIN AND FLUORESCENT PROTEIN OR FLUORESCENCE-LABELED PROTEIN |
GB202101299D0 (en) | 2020-06-09 | 2021-03-17 | Avacta Life Sciences Ltd | Diagnostic polypetides and methods |
GB202019607D0 (en) | 2020-12-11 | 2021-01-27 | Univ Sheffield | Purification of proteins |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
KR20080039550A (ko) | 1999-05-07 | 2008-05-07 | 제넨테크, 인크. | B 세포 표면 마커에 결합하는 길항물질을 이용한 자가면역질환의 치료 |
CA2529659A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-29 | Ulrich Haupts | Engineered proteolytic enzyme with altered specificity determining regions |
AU2006256530B2 (en) * | 2005-06-10 | 2012-12-20 | United Kingdom Research And Innovation | Scaffold |
US20070162998A1 (en) * | 2006-01-10 | 2007-07-12 | Kai-Wun Yeh | CeCPI: taro cysteine protease inhibitor |
AR059448A1 (es) | 2006-02-13 | 2008-04-09 | Divergence Inc | Polipeptidos quimericos vegetales de union para el reconocimiento molecular universal |
US20130305398A1 (en) * | 2012-02-16 | 2013-11-14 | Marie Coffin | Genes and uses for plant enhacement |
GB0807065D0 (en) | 2008-04-18 | 2008-05-21 | Univ Leeds | Novel scaffolds |
WO2010015024A1 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Hexima Limited | Plant anti-pathogen systems |
UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
HUE029622T2 (en) * | 2010-04-30 | 2017-03-28 | Janssen Biotech Inc | Stabilized fibronectin preparations, processes and applications |
AU2011293253B2 (en) | 2010-08-26 | 2014-12-11 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
WO2012082069A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Agency For Science, Technology And Research | Protein aptamers based on unstructured scaffold proteins |
GB201302597D0 (en) * | 2013-02-14 | 2013-04-03 | Univ Leeds | Novel Synthetic Proteins |
-
2013
- 2013-02-14 GB GBGB1302597.8A patent/GB201302597D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-02-14 CN CN201480022070.5A patent/CN105120885B/zh active Active
- 2014-02-14 EP EP20163413.6A patent/EP3693003A1/en not_active Withdrawn
- 2014-02-14 CN CN202110414366.3A patent/CN113150095A/zh active Pending
- 2014-02-14 US US14/768,032 patent/US9932575B2/en active Active
- 2014-02-14 WO PCT/GB2014/050435 patent/WO2014125290A1/en active Application Filing
- 2014-02-14 CA CA2900745A patent/CA2900745C/en active Active
- 2014-02-14 JP JP2015557514A patent/JP6794111B2/ja active Active
- 2014-02-14 AU AU2014217628A patent/AU2014217628B2/en active Active
- 2014-02-14 EP EP14705565.1A patent/EP2956156B1/en active Active
- 2014-02-14 ES ES14705565T patent/ES2784211T3/es active Active
-
2016
- 2016-05-25 HK HK16105949.3A patent/HK1217915A1/zh unknown
-
2017
- 2017-07-20 AU AU2017206237A patent/AU2017206237B2/en active Active
-
2018
- 2018-02-23 US US15/904,069 patent/US10844370B2/en active Active
-
2019
- 2019-07-18 JP JP2019132489A patent/JP6889758B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105120885A (zh) | 2015-12-02 |
CA2900745C (en) | 2023-01-24 |
AU2017206237A1 (en) | 2017-08-10 |
US10844370B2 (en) | 2020-11-24 |
CN113150095A (zh) | 2021-07-23 |
CA2900745A1 (en) | 2014-08-21 |
GB201302597D0 (en) | 2013-04-03 |
US20160032278A1 (en) | 2016-02-04 |
AU2014217628B2 (en) | 2017-04-27 |
WO2014125290A1 (en) | 2014-08-21 |
HK1217915A1 (zh) | 2017-01-27 |
US9932575B2 (en) | 2018-04-03 |
CN105120885B (zh) | 2021-05-07 |
US20180245067A1 (en) | 2018-08-30 |
EP3693003A1 (en) | 2020-08-12 |
JP2019205450A (ja) | 2019-12-05 |
EP2956156A1 (en) | 2015-12-23 |
JP2016510219A (ja) | 2016-04-07 |
JP6794111B2 (ja) | 2020-12-02 |
EP2956156B1 (en) | 2020-03-18 |
AU2017206237B2 (en) | 2019-09-12 |
AU2014217628A1 (en) | 2015-08-06 |
ES2784211T3 (es) | 2020-09-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6889758B2 (ja) | 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 | |
Moussu et al. | Structural basis for recognition of RALF peptides by LRX proteins during pollen tube growth | |
Tiede et al. | Adhiron: a stable and versatile peptide display scaffold for molecular recognition applications | |
EP2917388B1 (en) | Nucleic acids encoding chimeric polypeptides for library screening | |
Binz et al. | Engineered proteins as specific binding reagents | |
JP6092773B2 (ja) | フィブロネクチンクレードル分子及びそのライブラリ | |
Casado-Vela et al. | Analysis of root plasma membrane aquaporins from Brassica oleracea: post-translational modifications, de novo sequencing and detection of isoforms by high resolution mass spectrometry | |
JP2019535321A (ja) | タンパク質ライゲーションの方法及びその使用 | |
Huang et al. | Isolation of monobodies that bind specifically to the SH3 domain of the Fyn tyrosine protein kinase | |
Steemson et al. | Tracking molecular recognition at the atomic level with a new protein scaffold based on the OB-fold | |
Patel et al. | Selection of a high-affinity WW domain against the extracellular region of VEGF receptor isoform-2 from a combinatorial library using CIS display | |
Yasui et al. | A sweet protein monellin as a non-antibody scaffold for synthetic binding proteins | |
Bekesi et al. | Challenges in the Structural–Functional Characterization of Multidomain, Partially Disordered Proteins CBP and p300: Preparing Native Proteins and Developing Nanobody Tools | |
US9097721B2 (en) | Compositions comprising engineered phosphothreonine affinity reagents, methods of making, and methods of use | |
WO2020241876A1 (ja) | 効率的なpprタンパク質の作製方法及びその利用 | |
Kim et al. | Designed leucine‐rich repeat proteins bind two muramyl dipeptide ligands | |
Class et al. | Patent application title: SCAFFOLD PROTEINS DERIVED FROM PLANT CYSTATINS Inventors: Michael Mcpherson (Leeds, GB) Darren Tomlinson (Leeds, GB) | |
Jacquot et al. | NRT2. 1 phosphorylation prevents root high affinity nitrate uptake activity in Arabidopsis thaliana | |
JP7491515B2 (ja) | 効率的なpprタンパク質の作製方法及びその利用 | |
KR100832773B1 (ko) | 기능성 Fv 항체 절편 제조 방법 | |
Rai et al. | A study of recombinant human sestrin 1 and sestrin 2 proteins produced in a prokaryotic system | |
Sjøgaard et al. | The Arabidopsis autophagy cargo receptors ATI1 and ATI2 bind to ATG8 via intrinsically disordered regions and are post-translationally modified upon ATG8 interaction | |
Devan et al. | Deciphering the RNA-binding protein network during endosomal mRNA transport | |
Yakir et al. | Post-translational regulation of CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) in the circadian oscillator of Arabidopsis thaliana |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190809 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200630 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200928 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201119 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210427 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210521 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6889758 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |