JP6889758B2 - 植物シスタチンに由来する足場タンパク質 - Google Patents

植物シスタチンに由来する足場タンパク質 Download PDF

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Description

本発明は、新規のタンパク質、これらをコードする核酸に係り、及びそれらを使用する方法に係る。特に、本発明は、ペプチド配列をディスプレイするための足場としての用途を有するタンパク質、及び治療、診断、環境及びセキュリティーモニタリング、合成生物学及び研究のような領域におけるこれら足場の使用に係る。
いわゆる「タンパク質足場」の使用は、生化学において、研究及び医薬における使用のための新規なリガンド結合タンパク質を生成するための可能性のあるルートとして注目を集めている。1以上のペプチド配列をディスプレイするために使用されるこのような足場タンパク質は、潜在的に、抗体又は抗体フラグメントの代替を提供できる。
用語「タンパク質足場」は、異なる状況で及び独特の生化学的機能をもって観察されるある種のポリペプチドの構造を記述するために使用される。それらの固有の立体配座安定性のため、このような足場はタンパク質工学に受け入れられるであろうと考えられている。
免疫グロブリン(抗体)は、保存されたフレームワーク領域及び高頻度可変性のペプチドセグメント製の空間的に良好に限定された抗原−結合部位の構成に対する機能を有すると慣習的に考えられており、これらのセグメントは、配列及び立体配座の両方において可変である。ライブラリー技術を伴う抗体工学法が、機能性の抗体フラグメントの選択において成功した後は、有用な結合タンパク質を合成するために、他のタンパク質構築を使用することに興味が膨らみ始めている。
好適なタンパク質足場の所望の特性に関する記載としては、下記のものが含まれる:
「好適なタンパク質足場の候補は、可変の配列及び長さの表面ループを提供できるか、又はさもなければ、それらの折りたたみ特性における有意の変更を生ずることなく、近接する表面領域(露出した疎水性残基を含む)における側鎖の交換に耐えられるコンパクト且つ構造的に堅固なコアを提示すべきである。」Skerra A:分子認識用の遺伝子組み換えタンパク質足場,J Mol Recognit2000,13:167−187。及び「用語「足場」は、タンパク質工学において使用されるように、典型的には、低減されたサイズ(<200AA)の及び挿入、欠失、又は他の置換を許容する高立体構造耐性の可変部分と関連する高度に構造化されたコアを含有する単鎖のポリペプチドフレームワークをいう。」Wurchら,Trends in Biotechnology,November,2012,30,575−582。
しかし、一見、ループ領域のエンジニアリングにとって魅力的とみられるポリペプチドの折りたたみ構造の必ずしも全ての種類が、実際に、高い親和性及び特異性を有する独立したリガンド結合部位の構築を可能にするわけではない。
従来技術の足場には、ブドウ球菌タンパク質AのZドメイン,「Affibodies」、Anticafins、及びアンキリンリピート、その他のような単離されたタンパク質折りたたみ構造と同様に、不活性化されたブドウ球菌ヌクレアーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びチオレドキシンA(TrxA)、フィブロネクチンタイプIIIドメイン(「Fn3」)、リポカリン系タンパク質、ビリン結合タンパク質(BBP)が含まれる。
国際特許出願公開WO2006/131749号は、足場として改良するために、ステフィンAにおいて作成された、いくつかの合理的な突然変異を開示している。変性されたステフィンA足場は、次の3つの部位、すなわち、Lys71−Leu73、V48D及びG4Wにおける突然変異を含んでなり、STMと称される(Stefin A Triple Mutant)。
国際特許出願公開WO2009/136182号は、さらに、STM足場の緻密化を開示している。
改良された足場タンパク質についても、なお要求がある。特に、従来技術の足場は、しばしば、ペプチドアプタマーを充分には安定化させることができず、足場におけるアプタマーの存在は、実際には、足場を顕著に変形させる。例えば、Woodmanら,「ペプチドアプタマーの提示のための天然のタンパク質足場のデザイン及び検証」,J.Mol.Biol.(2005)352,1118−1133参照。
理想的に改良された足場タンパク質は、下記の利益の1以上を提供できるはずである:
−変形しない堅固なフレームワークを提供するように改良された安定性;
−より小さいサイズ;
−高い品質及び複雑なライブラリーを支持する改良された能力;
−選ばれた結合タンパク質と、それらの標的との改良された親和性;及び
−利用できるN末端及びC末端による更なる操作の単純さ。
本発明によれば、植物シスタチンに由来する又は関連する配列を有する合成タンパク質が提供される。
好適な合成タンパク質は、いくつかの(例えば、10以上、20以上、又は50以上)植物シスタチンタンパク質の共通配列を含んでなる。
好適な合成タンパク質は、異種性のペプチド配列の挿入のために採用される又は適した足場タンパク質である。
このように、本発明の足場タンパク質は、好ましくは、単一の天然タンパク質配列に基づくものではなく、天然には存在しない新規なタンパク質であり、共通配列の注意深いデザインを介して、植物シスタチンクラスの代表的なものに由来する。
1具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列:
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号1)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
このような配列を含んでなる合成タンパク質は、高度に安定で及び有用な足場タンパク質を提供するとの知見を得た。
他の具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列:
GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号2)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
さらに他の具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列:
ATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号3)、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも50%、より好ましくは70%同一である配列を有する。
より好ましくは、本発明の合成タンパク質は、上記配列番号1、2、又は3と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一般に、より高い同一性レベルが好ましい。
いくつかのケースでは、合成タンパク質は、配列番号1、2、又は3と同一、又は実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなるか、又はアミノ酸配列からなる。
本発明の好適な具体例では、上記の合成タンパク質は、挿入された少なくとも1つの異種性のペプチド配列を含んでなる。本発明の合成タンパク質は、ペプチド配列の構築及びディスプレイするために使用される足場タンパク質として特に有用である。このように、本発明は、「空の」足場タンパク質(すなわち、異種性のペプチド配列が存在しない)及び1以上の挿入された異種性の配列を有する足場タンパク質の両方に係る。
従って、本発明の好適な具体例は、ここに記載する配列を有する合成の足場タンパク質であり、該足場タンパク質は、足場において、好適な部位に挿入された1以上の異種性のペプチドをディスプレイする。「ディスプレイする」とは、ペプチド配列が、適切な条件下、例えば、インビボ又はインビトロアッセイのような非変性条件下において、ペプチドが足場の表面上に露出されることを可能にする位置で、ペプチド配列が足場タンパク質に挿入されることを意味する。1以上の異種性のペプチドをディスプレイするこのような足場タンパク質は、しばしば、ペプチドアプタマー又はマルチプルペプチドアプタマーと称されるが、用語「アプタマー」は、当分野では、ペプチド自体又は完全なタンパク質を参照するために多少一貫することなく使用されることに注意しなければならない。
好ましくは、異種性のペプチド配列は、アミノ酸3〜30個、より好ましくはアミノ酸4〜20個、さらに好ましくはアミノ酸4〜16個の長さである。本発明の合成タンパク質は、長さアミノ酸5〜13個の異種性の配列をディスプレイすることに特に適していることが知見された。
好ましくは、異種性のペプチド配列は、合成タンパク質のループ領域に又はタンパク質のN末端に挿入される。ループ領域は、一般的な条件下では、タンパク質の整列された二次又は三次構造には関わらない(すなわち、タンパク質は、正しく折りたたまれており、)変性条件下にはない)が、タンパク質における機能及び/又は二次構造要素の正確な空間的組織化に寄与できる領域と定義される。足場タンパク質内におけるループ領域の位置は、もちろん、異なるタンパク質変種間で変動できる。合成タンパク質のループ領域は、タンパク質の二次及び三次構造を調査することによって決定され、これを達成する方法は、当分野ではよく知られており、X線結晶構造解析、NMR、及びインシリコ法が含まれる。
本発明では、異種性のペプチドは、タンパク質において、下記の位置の少なくとも一つに挿入されることが好ましい:
−βシートの第1領域と第2領域との間のループ(LOOP1として知られている);及び
−βシートの第3領域と第4領域との間のループ(LOOP2として知られている)。
第1、第2、第3及び第4は、もちろん、タンパク質配列に関連するもの、すなわち、タンパク質のN末端又はC末端からのものとして解釈されることを意図するものである。
好ましくは、異種性のペプチドは、これらの位置の両方、すなわち、LOOP1及びLOOP2に挿入される。
βシートの近接する領域間のループの長さは、アミノ酸3〜20個の長さであることが好ましく、さらに好ましくはアミノ酸5〜13個の長さであり、アミノ酸約9個の長さのループ長が最適であると考えられる。
LOOP1及びLOOP2への挿入用の異種性のペプチドの模範的なペアを、表2、すなわち、配列番号25〜72に提示する。これらの例は、本発明の好適な具体例を構成する。
さらに、異種性のペプチド用の他の挿入ポイントは、タンパク質のN末端又はその近傍(例えば、アミノ酸4個内)である。このポイントにおけるペプチド配列は、上記の他の2つの位置における挿入よりも、標的を結合することについてより危険が少ないと考えられるが、それにもかかわらず、結合において役割を有することが明らかであろう。
このように、本発明の1具体例では、合成足場タンパク質は、上述の位置の各々に1個ずつ、異種性のペプチド3個を含んでなる。
上述の特定の配列の場合、タンパク質配列内の好適なループ領域は、下線を付した部分のように位置する。
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号1)

GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号2)

ATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(配列番号3)
下線を付した領域は、異種性のペプチドによって完全に又は部分的に交換されるか、異種性のペプチドは、ループ領域を除去することなく、下線を付した領域内に挿入される。さらに、異種性のペプチドは、配列番号1又は2のN末端に付加されてもよい。
しかし、異種性のペプチドは、他のループ領域、例えば、αヘリックスと第1のβシートとの間及び/又はβシートの第2領域と第3領域との間の領域(それぞれ、便宜上、LOOP3及びLOOP4と称される)に挿入され得ることも注目されなければならない。足場タンパク質が正しく折りたたまれる場合、これらのループ領域は、上述のもの(LOOP1及びLOOP2)とは足場の反対の側に位置する。足場の両側に異種性のペプチドのループ領域を挿入することによって、二価の部分(足場の一方の側で第1の標的を及び他の側(一般に反対側)で第2の標的を結合できる)を生成することができ、これは、特定の状況では望ましい具体例である。
合成タンパク質が上述のアミノ酸配列を含んでなる場合、配列は、連続性又は非連続性である。例えば、異種性のペプチドが、合成タンパク質内に、例えば、上述のループ領域の1において挿入される場合、配列は非連続性であり、このようにして、異種性のペプチドは、上述の配列の部分を分離することになる。
配列同一性の算定は、本発明にとって、一般に、異種性のペプチドが合成タンパク質に挿入される状況を考慮するように修正されるべきであろう。このような挿入が生じた場合、挿入されたペプチド配列は、配列同一性を算定する場合、一般的に、無視されるであろう。これは、本発明の合成タンパク質が足場として機能し、この場合、挿入されたペプチドは、合成タンパク質において、これらがタンパク質の表面でディスプレイされるポイントで挿入されるためである。挿入されるペプチド配列は、それらの正に高度に可変性の本質及び目的による。このようなケースでは、それは、故意に高度に可変性の挿入されるペプチド配列よりもむしろ、ペプチドのディスプレイのための好適な骨組みを提供するため、重要なタンパク質の足場部分の配列である。
異種性のペプチドは、合成たんぱく質内において通常認められるアミノ酸の除去を伴って又は伴うことなく、合成タンパク質に挿入される。すなわち、異種性のペプチドは、合成タンパク質の末端で又は合成タンパク質内の2つのアミノ酸の間で、合成タンパク質の正常なアミノ酸がいずれも除去されることなく挿入される。或いは、ペプチドが合成タンパク質に挿入される際、合成の足場タンパク質内に正常に存在する1又はそれ以上のアミノ酸が除去/交換される。例えば、「ループ」アミノ酸VVAG、PWE、及びATG(存在する場合)は、上記の配列1、2及び3、又は配列変異体における対応するループ配列において除去される。
本発明による特に好適な足場タンパク質は、後述の配列番号74〜79、及び足場に対する潜在的な変更の関連する記載に提示される。
タンパク質配列に関する用語「同一性」とは、アミノ酸における差異の見地から(ただし、サイズ、親油性、酸性度等を考慮する)タンパク質間の類似度をいう。同一性割合(%)は、Henikoff S.及びHenikoff J.G.,P.N.A.A. USA 1992,89:10915−10919に記載されたBlosum62類似性マトリックスのような類似性スコアー化マトリックスを使用する配列の最適な配列比較によって算定される。同一性割合の算定及びBlosum62類似性マトリックスを使用する2つの配列の最適な配列比較及びNeedleman及びWunschのアルゴリズム(J. Mol. Biol. 1970,48: 443−453)は、プログラムのデフォルトパラメーターを使用するGenetics Computer Group(GCG,マディソン、ウィスコンシン州,米国)のGAPプログラムを使用して行われる。本発明に関して、タンパク質配列及び核酸配列についての同一性割合を算定するための特殊なパラメーターについては後述する。
本発明の一部を形成するタンパク質の変異体は、前記配列における1又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、転化又は付加による、又はタンパク質に科学的に結合する部分に対する変更によるアミノ酸配列における変異を含有できる。例えば、タンパク質変異体は、タンパク質に付着した炭水化物又はPEG構造を含んでなることができる。本発明のタンパク質は、変異体が所望の機能を保持する限り、N末端又はC末端からの1又はそれ以上のアミノ酸、例えば、アミノ酸1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、又は10個のアミノ酸の欠失を含んでもよい。
タンパク質の置換変異体は、アミノ酸配列における少なくとも1個の残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。本発明のタンパク質は、保存的又は非保存的置換を含有できる。
用語「保存的置換」は、類似の生化学的性質を有するアミノ酸残基に代わる1又はそれ以上のアミノ酸置換基の置換に係る。代表的には、保存的置換は、結果として生じたタンパク質の活性に対して少ない衝撃を有するか、又は衝撃を持たない。例えば、タンパク質における保存的置換は、タンパク質の正確に折りたたまれる能力に実質的に影響を及ぼさず、さもなければ、通常の生物学的機能を果たすアミノ酸置換であってもよい。本発明のタンパク質の変異体のスクリーニングは、いずれのアミノ酸残基がアミノ酸置換に耐えられるかを同定するために使用される。1実施例では、1又はそれ以上の保存的アミノ酸置換が行われる場合、修飾されたタンパク質の関連する融解温度又はαへリックス又はβシートの量は、25%以上は低減されず、好ましくは20%以下、特に10%以下である。
1又はそれ以上の保存的置換は、本発明のタンパク質に含まれる。好適な実施例では、10又はそれ以下の保存的置換がタンパク質に含まれる。従って、本発明のタンパク質は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、又は10個以下の保存的置換を含むことができる。1又はそれ以上の保存的置換を含有するポリペプチドを、例えば、部位特異的変異誘発又はPCRのような標準操作法を使用して、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって生成することができる。或いは、当分野において知られているように、ペプチド合成法を使用することによって、1又はそれ以上の保存的置換を含有するようにポリペプチドを生成できる。
タンパク質において本来のアミノ酸に代わって置換される及び保存的置換とみなされるアミノ酸の例としては、Alaに代わるSer;Argに代わるLys;Asnに代わるGln又はHis;Aspに代わるGlu;Glnに代わるAsn;Gluに代わるAsp;Glyに代わるPro;Hisに代わるAsn又はGln;Ileに代わるLeu又はVal;Leuに代わるIle又はVal;Lysに代わるArg又はGln;Metに代わるLeu又はIle;Pheに代わるMet、Leu又はTyr;Serに代わるThr;Thrに代わるSer;Trpに代わるTyr;Tyrに代わるTrp又はPhe;及びValに代わるIle又はLeuが含まれる。1具体例では、置換は、Ala、Val、Leu、及びIleの間;Ser及びThrの間、Asp及びGluの間;Asn及びGlnの間;Lys及びArgの間;及び/又はPhe及びTyrの間である。さらに、保存的置換に関する情報は、中でも、Ben−Bassatら,(J.Bacteriol. 169:751−7,1987)、O‘Reganら,(Gene 77:237−51,1989)、Sahin−Tothら,(Protein Sci.3:240−7,1994)、Hochuliら,(Bio/Technlogy 6:1321−5,1988)、国際特許出願公開00/67796(Curdら)に及び遺伝学及び分子生物学の標準的な教科書に認められる。
他の変異体は、例えば、塩、アミド、エステル、及び特にC末端エステル、及びN−アシル誘導体のような機能的変異体である。例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によって、インビボ又はインビトロで修飾されるペプチドも含まれる。
本発明によるタンパク質は、各種の化学的技術によって修飾されて、未修飾ペプチドと本質的に同じ活性を有し、及び任意に他の所望の特性を有する誘導体を生成できる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端又は側鎖にかかわらず、薬学上許容される注意を要する塩の形で提供され、又はエステル化されて、例えば、C1〜C6アルキルエステルを形成するか、又は例えば、式CONR(ここで、R及びRは、それぞれ独立して、H又はC1〜C6アルキル基であるか、又は一緒になって、5又は6員環のような複素環を形成する)のアミドに転化される。ペプチドのアミノ基は、アミノ酸末端又は側鎖にかかわらず、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸又は他の有機酸塩のような薬学上許容される酸付加塩の形であるか、又はC1〜C6アルキル又はジアルキルアミノに修飾されるか、又はさらにアミドに転化される。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、良好に認識された技術を使用して、アルコキシ基又はエステル基、例えば、C1〜C6アルコキシ又はC1〜C6アルキルエステルに転化される。ペプチド側鎖のフェニル環及びフェノール環は、F、Cl、Br、又はIのような1以上のハロゲン原子により、又はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、カルボン酸及びそのエステル、又はそのようなカルボン酸のアミドによって置換される。ペプチド側鎖のメチレン基は、類似のC2〜C4アルキレンに伸展される。チオールは、アセトアミドのような良好に認識された多数の保護基のいずれか1つによって保護される。当業者は、立体構造的制約を選択及び提供して、結果として安定性が増強された構造とするために、ここに開示するペプチドに環構造を導入する方法も良好に認識しているであろう。
本発明の好適な具体例によれば、合成タンパク質は、融解温度(Tm)少なくとも90℃、より好ましくは、少なくとも95℃、最も好ましくは、少なくとも100℃を有する。タンパク質の場合のTmは、50%に変性が起こる温度(denaturation midpoint)として知られており、折りたたみ状態と非折りたたみ状態とが等しく存在する温度として定義される。Tmは、一般に、異種性のペプチド配列が挿入されていない合成タンパク質について測定される。異種性の配列の挿入は、Tmを低下させ可能性がある又はしばしば低下させるため、最も有意の値は、空の足場タンパク質が比較される場合に得られ、これは、上記のTm値に基づく。このように高度に安定なタンパク質が得られたことは、本発明の驚くべき利点である。融解温度は、タンパク質の安定性の特に有効な指標である。折りたたみタンパク質及び非折りたたみタンパク質の相対割合は、当業者に知られた多数の技術(示差走査熱量測定、UV差分光法、蛍光法、円二色法(CD)、及びNMRを含む(Pace,C.Nick,及びJ.Martin Scholtz,タンパク質の立体配座安定性の測定,299−321参照))によって測定される。
本発明の合成タンパク質の極めて高い温度安定性は、普通の温度(例えば、インビトロにおいて約25℃及びインビボにおいて約37℃)における場合のタンパク質の非常に高い構造安定性の指標である。これは、本発明の合成タンパク質が、異種性のペプチドをディスプレイするための足場として機能することに非常に良好に適していることを意味している。構造安定性とは、このような異種性のペプチドが、足場タンパク質の構造の崩壊を生ずることなく、一貫して及び正確にディスプレイされることを意味する。本発明の合成タンパク質はこのように安定であるため、これらは、同じ安定性レベルを有していない公知の足場よりも良好に機能するとの表示である。
このような低分子の足場タンパク質が、そのデザインの基礎として使用された陸生植物の親のタンパク質配列の源に基づき、例えば、101℃の熱転移温度を有することは驚くべきことである。陸生植物の親は、一般に周囲の外部温度で生育し、イネのようないくつかの作物のみが熱帯温度において生育することが予期され、一方、大部分は、温和〜冷たい北部の気候で生育する。
上述のように、異種性のペプチドの付加は、本発明の合成の足場タンパク質の安定性を低下させる可能性があり、及び典型的には低下させる。しかし、本発明の足場の安定性は、従来技術による足場よりも高いままであることが見出された。従って、好適な具体例では、挿入された少なくとも1つの異種性のペプチドを有する合成の足場タンパク質は、60℃又はそれ以上、より好ましくは、70℃又はそれ以上、特に、80℃又はそれ以上のTmを有する。これは、挿入された少なくとも1つの異種性のペプチドを有する足場タンパク質は高度に安定であることを表示している。
好ましくは、本発明の合成タンパク質は、リンカー又はタグを含んでなる。リンカー又はタグは、アミノ酸リンカー又はタグであり、又は他の種のリンカー又はタグである。タグは、合成タンパク質に所望の機能性を提供する各種のタグ、例えば、タンパク質の容易な単離又は精製を許容するタグである。模範的なタグは、ポリヒスチジンタグ(Hisタグとして知られている)、及び他の公知のタグとしては、Mycタグ、SBPタグ、Sタグ、カルモジュリンタグ等が含まれる。
本発明の他の具体例では、基材又は部分に結合した上述の合成タンパク質が提供される。部分は、ラベル、キャリヤー、タンパク質等である。合成タンパク質は、基材に直接結合でき、又はリンカーを介して結合される。合成タンパク質は、共有結合又は非共有結合によって基材又は部分に結合される。タンパク質を基材又は部分に結合するための非共有結合システムは、ビオチン−アビジン系を含むが、これに限定されない。
部分がラベルである場合、ラベルは、蛍光ラベル、放射性ラベル、酵素系ラベル、又は当業者に知られた各種の他のラベルである。
蛍光ラベルの例としては、有機染料(例えば、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、Alexa Fluors、Dylight fluors、ATTO Dyes、BODIPY Dyes等)、生物学的フルオロフォア(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、R−フィコエリトリン等)、及び量子ドットが含まれるが、これらに限定されない。
酵素系ラベルの例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、グルコースオキシダーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
他の公知のラベルはビオチンラベルである。ビオチンラベルは、代表的には、ビオチニル基、スペーサーアーム、及びタンパク質の標的官能性基への付着を担当する反応性基を含んでなる。ビオチンは、ラベル化タンパク質のアビジン部分を含んでなる他の部分への付着にとって有用である。
タンパク質をラベル化する各種の方法は当業者によく知られており、これらは、本発明の合成タンパク質に容易に適用される。
タンパク質が結合する基材は、各種の好適な表面、例えば、96ウェルプレートのような容器の表面である。
部分がキャリヤーである場合、キャリヤーは、例えば、ビーズ(例えば、磁気ビーズ)又は他の粒子である。
代表的には、ラベル、リンカー又はタグは、タンパク質のC末端及び/又はN末端に付加される。しかし、標的の結合を妨げないように、異種性のペプチドが挿入されるループから十分に空間をあけたタンパク質の各種領域を介して、最も好ましくは、挿入を持つループとは反対の側において付加される。
本発明の1具体例では、第2のタンパク質に結合した上述の合成タンパク質を含んでなる融合タンパク質が提供される。第2のタンパク質は、所望の活性を有するタンパク質である。本発明の一定の具体例では、第2のタンパク質は、ファージコートタンパク質又は表面ディスプレイシステムにおいて有用な他のタンパク質であり、このような融合タンパク質に関する走査法における用途を以下に記載する。勿論、第2のタンパク質は他の合成タンパク質でもよく、この場合には、ホモ−又はヘテロマルチマーの足場タンパク質が提供される。
本発明の他の態様では、上述のように、合成タンパク質集団からなるライブラリーが提供され、ここで、集団の各種のメンバーは、異なった配列を有する各種の異種性のペプチドを含んでなる。異種性のペプチドの好適なライブラリーは、当業者に知られたコンビナトリアル技術を使用して創製され、好適な異種性のペプチド配列のセットをコードする核酸配列は、多数の市販の源を介して得られる。このようなライブラリーは、好ましくは、10又はそれ以上、より好ましくは、10又はそれ以上、及び最も好ましくは、1010又はそれ以上の複雑度を有する。
このようなライブラリーは、標的実体に結合する特別な合成足場タンパク質を選択することにおいて有用性を有する。標的実体は、タンパクを特異的に結合することが望ましい各種の実体である。標的の例としては、タンパク質/ペプチド(例えば、レセプター又はリガンド)、小分子(例えば、医薬分子)、核酸(例えば、DNA又はRNA)、及び無機化合物が含まれるが、これらに限定されない。
ライブラリーは、好適なディスプレイシステム、例えば、表面ディスプレイシステム
におけるディスプレイ用に適した本発明の合成タンパク質を含んでなることができる。表面ディスプレイシステムは、好適にはファージディスプレイである。或いは、表面ディスプレイシステムは、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、CIS−ディスプレイ、又は他の非共有又は共有タンパク質ディスプレイシステム、細菌ディスプレイ又は酵母ディスプレイである。酵母二重ハイブリッドシステム又は細菌細胞又は哺乳類細胞システムにおける発現は、標的が結合するアプタマーをスクリーニングするためのインビボシステムに一般に使用される。これらのディスプレイシステムは、まとめて、しばしば、バイオパニングシステムと称される。
例えば、ファージディスプレイは、繊維状ファージ(例えば、M13)ディスプレイシステムである。それ故、合成タンパク質は、pIII、pVIII、pVI、pVII又はpIXタンパク質と融合される。本発明において使用される他のファージディスプレイシステムとしては、T4、T7及びλ−ファージディスプレイが含まれる。本発明の合成タンパク質は多様性であり、各種の好適なディスプレイと一緒に使用され、各種の好適なシステムは当業者にとって公知であることは注目されなければならない。一般に、ファージディスプレイは抗体の選別において使用されるが、該技術は本発明のタンパク質に直接適用可能である。ファージディスプレイシステムの概要は、例えば、Lowman H.B.,Clackson T.(2004)ファージディスプレイ:実用的アプローチ,Oxford University Press,pp10−11に見られる。
本発明の特に好適な具体例では、本発明の合成タンパク質は、特にライブラリーの構築に使用される場合、配列
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X)NFKELQEFKPVGDA(配列番号4)
ここで、Xは各種のアミノ酸であり、及びnは、配列におけるアミノ酸の数であり、nは、好ましくは、3〜30、さらに好ましくは、4〜20、及びさらに好ましくは、4〜15である。
好ましくは、合成タンパク質は、配列
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X5−13)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X5−13)NFKELQEFKPVGDA(配列番号5)
を含んでなる。
さらに好ましくは、合成タンパク質は、配列
NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X)NFKELQEFKPVGDA(配列番号6)
を含んでなる。
上述のように、その50%、より好ましくは70%が、配列番号4、5又は6と同一である配列を含んでなるタンパク質は、本発明の範囲内にある。さらに好ましくは、本発明の合成タンパク質は、その少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又は99%が、配列番号4、5又は6と同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一般に、より高いレベルの同一性が好ましい。
上記具体例のいずれにおいても、タンパク質はN末端に、追加のアミノ酸配列を含有できる。これは、配列
MATGVRAVPGNE(配列番号80)
のいくつか又は全部を含んでなる。或いは又は加えて、例えば、長さアミノ酸3〜20個の他の異種性のペプチド配列を含んでなることができる。
本発明の具体例では、N末端アミノ酸がメチオニンであることが好ましい。これは、例えば、追加のメチオニンを添加するか又は通常のN末端アミノ酸をメチオニンに置き換えることによって達成される。
本発明の特に好ましい足場タンパク質は、配列番号74〜79に提示される。上述の判断基準に従うこれらのタンパク質の変異体も、本発明の具体例である。
他の態様では、本発明は、本発明による合成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはDNA又はRNAである。ポリヌクレオチドがDNAである場合、一本鎖型又は二本鎖型である。一本鎖は、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖である。
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号1、2、3、4、5、又は6による配列を有するタンパク質をコードする配列、配列番号74〜79のいずれか1つ、又は上述のその変異体を含んでなることができる。
1具体例では、ヌクレオチドは、配列番号1に提示されたアミノ酸をコードする、配列
aacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号7)を含んでなる。
他の具体例では、ヌクレオチドは、配列番号2に提示されたアミノ酸をコードする、配列
ggtaacgaaaactccctggaaatcgaagaactggctcgtttcgctgttgacgaacacaacaaaaaagaaaacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号8)を含んでなる。
他の具体例では、ヌクレオチドは、配列番号3に提示されたアミノ酸をコードする、配列
Gctaccggtgttcgtgcagttccgggtaacgaaaactccctggaaatcgaagaactggctcgtttcgctgttgacgaacacaacaaaaaagaaaacgctctgctggaattcgttcgtgttgttaaagctaaagaacaggttgttgctggtaccatgtactacctgaccctggaagctaaagacggtggtaaaaagaaactgtacgaagctaaagtttgggttaaaccgtgggaaaacttcaaagaactgcaggagttcaaaccggttggtgacgct
(配列番号9)を含んでなる。
同定された核酸配列の変異体である核酸配列を有するポリヌクレオチドは、a)目的の核酸に対してストリンジェントな条件下、配列番号7、8、又は9のいずれか1に示す同定された配列の全て又は一部を含んでなるDNAをハイブリダイズする工程、及びb)前記核酸を当業者に知られた方法によって単離する工程を含んでなる方法によって単離できる。ハイブリダイゼーションの条件は、好ましくは、高度にストリンジェントである。
本発明によれば、用語「ストリンジェント」は、温度65℃における1×SSC,0.1%SDSの洗浄条件を意味し、「高度にストリンジェント」な条件とは、SSCにおける0.3×SSC、より好ましくは、0.1×SSCへの低減を言う。好ましくは、最初の2つの洗浄は、引き続いて、それぞれ、15〜30分間で2回行われる。高度にストリンジェントな条件下で洗浄する必要がある場合には、0.1×SSCによる追加の洗浄が15分間で1回行われる。ハイブリダイゼーションは、pH7.5の0.5Mリン酸塩緩衝液中、65℃において、7%SDSにて夜通し行われる。このようなハイブリダイゼーションは、分子クローニングに関する標準的な各種の教本、例えば、Molecular Cloning:a laboratory manual,3版;編集者:Sambrookら,CSHL press,2001に開示されている。
配列番号7、8、又は9に示された配列の変異体も、インシリコの配列を、コンピューターデータベースに含まれる他の配列と比較することによって同定される。配列は、BLASTプログラム(BLADTF 2.1.2(2000年10月19日)(Altschul,SF,TL Madden,AA Schffer,J Zhang,Z Zhang,W Miller,及びDJ Lipman,ギャップBLAST及びPSI−BLAST:タンパク質データベースサーチプログラムの新たな創成,Nucleic Acid Res. 1997,25:3389−3402)を使用して、データベース中の配列と比較される。
本発明の好適な具体例は、配列番号1〜6との、少なくとも50%、より好ましくは70%、さらに好ましくは80%、さらに好ましくは96%の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号1、2、3、4、5、又は6又は配列番号74〜79のいずれか1つとの、少なくとも97%の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、少なくとも98又は99%の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがより好ましい。配列番号1、2、3、4、5、又は6又は配列番号74〜79のいずれか1つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
遺伝子暗号の縮重のため、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、異なった特定のコドンを利用できる。上述のように定義されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの全てが本発明の一部であると考えられる。
この点について、大腸菌(Escherichia coli)は、簡便な系であり、ファージディスプレイのような技術に関して及び続く選択された結合タンパク質の生産に関して一般的に使用されるため、上述の配列は、細菌宿主である大腸菌における発現用に最適化されていることが注意されなければならない。しかし、当業者であれば、他の宿主系においてタンパク質を発現させることもでき、この場合、選択したタンパク質をコードするヌクレオチド配列における変更(すなわち、コドン最適化)は有益であり、このように、本発明の一部である。特別な宿主についての最適化コドンの使用は、当業者にとっては通例のことである。
特に好適な具体例では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号7、8、又は9の核酸配列(関連性があれば、異種性のペプチドをコードする配列を除く)と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。
本発明によるポリヌクレオチドは、もちろん、異種性のペプチドをコードする配列、発現制御配列、又は他のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードする配列のような追加の配列を含有できる。
配列番号7、8、又は9の全配列(関連性があれば、異種性のペプチドをコードする配列を除く)と少なくとも90%、好ましくは95%、さらに好ましくは99%、最も好ましくは100%の同一性を有する配列を含んでなるポリヌクレオチドが、より好ましい。
ポリヌクレオチドの定義内には、修飾されたRNA又はDNAも含まれる。核酸の塩基における修飾は実施可能であり、イノシンのような塩基が組み入れられる。他の修飾としては、例えば、主鎖の修飾が含まれる。
「%同一性」は、2つ又はそれ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の、それらの整列された配列の間の比較に基づく関係を定義するものである。
同一性は既知の方法によって算定される。本発明についてここに示す同一性、又は相同性、%は、GCG(Genetics Computor Group Inc.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)のもとで作動するGAPプログラムのよって算定されるものである。
ポリヌクレオチド配列の比較について:
−整列アルゴリズム:Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.1970,48:443−453
−アミノ酸の類似性に関する比較マトリックスとして、Blosum62マトリックスを使用する(Henikoff and Henikoff,supra)。
−以下のギャップスコアリングパラメーターを使用する:
−ギャップペナルティー:12
−ギャップ長さペナルティー:2
−エンドギャップについてはペナルティーなし。
ヌクレオチド配列の比較について:
−整列アルゴリズム:Needleman and Wunsch(supra)
−比較マトリックス:
−マッチ=+10、ミスマッチ=0
−ギャップペナルティー:50
−ギャップ長さペナルティー:3
Jaeckel,Bloomらによって2010年に記載された系統学的に不偏性の方法のような他のパラメーターの取り込みを含むコンセンサス安定化タンパク質を開発するアプローチも使用できる。
しかし、上述したように、各種の配列の同一性を算定する方法は、1又はそれ以上の異種性のペプチドが任意に挿入される状況を考慮するために補正されなければならないこと注目される。このような挿入が生ずる場合、ペプチドをコードする挿入された配列は、一般に、上述の理由によって、配列の同一性を算定する際には無視されるであろう。
本発明による核酸、特にDNAは、コードされたタンパク質のインビボ又はインビトロにおける発現には有用であろう。本発明によるポリヌクレオチドがコードされたタンパク質の発現に使用される場合、ポリヌクレオチドは、タンパク質用のコード配列に加えて、他のコード又は非コード配列、例えば、リーダー配列又は融合部分、リンカー配列、マーカー配列、プロモーター、エンハンサー等を含むことができる。
本発明によるポリヌクレオチドは、本発明による組み換えタンパク質の生産において使用される。これは、好適な宿主細胞又は多細胞生物におけるタンパク質の発現を介して達成される。コードされたポリペプチドの発現のために使用される場合、ポリヌクレオチドは、有利には、ポリペプチド用のコード配列に加えて、他のコード配列、例えば、シグナル配列、リーダー配列、ターゲティング配列、融合部分、マーカー配列、精製を援助するための配列等を含むことができる。
クローニング及び発現のために、幅広い種類の宿主細胞及びクローニングベクターの組み合わせが使用される。本発明のポリヌクレオチドは、各種の好適な発現系にクローン化される。好適な発現系としては、細菌発現系(例えば、大腸菌DH5α及びBL21(DE3))、ウイルス発現系(例えば、バキュロウイルス(Baculovirus))、酵母系(例えば、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae))又は真核細胞系(例えば、COS−7、CHO、BHK、HeLa、HD11、DT40、CEF、又はHEK−293T細胞)が含まれる。代表的には、ポリヌクレオチドは、好適な構成型又は誘導性プロモーターの制御下、好適なベクター内にクローン化され、ついで、発現用の宿主細胞に導入される。
本発明の他の態様では、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる組み換えベクターが提供される。好適なベクターとしては、細菌又は酵母のプラスミド、コスミド、ファージミド、フォスミド、広い宿主範囲のプラスミド、及びプラスミド及びファージの組み合わせ又はウイルスDNAに由来するベクターが含まれる。複製の源及び/又優性の選択マーカーは、適宜、ベクター中に存在する。
本発明によるベクターは、宿主細胞を形質転換することについて好適である。好適なクローニングベクターの例は、pBR322、各種のpUC、pET、pEMBL及びBluescriptプラスミドのようなプラスミドベクター、又はレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスのようなウイルスのベクターである。
足場タンパク質のライブラリーのクローニング及び発現については、M13又はfdのような繊維状ファージ又はバクテリオファージT7のようなカプシドファージに由来するもののようなファージ又はファージミドベクターが、特に有用である。
本発明のタンパク質の発現に使用される場合、本発明によるベクターは、代表的には、関連するポリヌクレオチドの発現を制御するために、タンパク質をコードする核酸配列に任意に結合された発現制御配列を含んでなる。このような発現制御配列は、一般に、プロモーター配列及び転写及び翻訳を調整する及び/又は発現レベルを増強する追加の配列を含んでなる。好適な発現制御配列は、当分野では知られており、真核生物、原核生物、又はウイルスのプロモーター又はポリアデニル化シグナルが含まれる。発現制御及び他の配列は、もちろん、選択される宿主細胞に応じて大いに変動し、誘導性とされる。有用なプロモーターの例は、tacプロモーター(Deboer,Comstockら,1983)、T7プロモーター(Studier及びMoffatt 1986)、SV−40プロモーター(Science 1983,222:524−527)、メタロチオネインプロモーター(Nature 1982,296:39−42)、熱ショックプロモーター(Voellmyら,P.N.A.S. USA 1985,82:4949−4953)、PRV gXプロモーター(Mettenleiter及びRauh,J.Virol.Methods 1990,30:55−56)、ヒトCMV IEプロモーター(米国特許第5,168,062号)、Rous SacomaウイルスLTRプロモーター(Gormanら,P.N.A.S. USA 1982,79:6777−6781)、又はヒト伸長因子1α又はユビキチンプロモーターである。原核生物制御配列としては、例えば、lac、tacT7、ara、及び他の公知のプロモーターが含まれる。本発明において使用される原核生物プロモーターは、Goldstein MA,Doi RH,「バイオテクノロジーにおける原核生物プロモーター」,Biotechnol Annu Rev.1995;1:105−28において論じられている。当分野では、他の好適な制御配列も知られており、使用される発現系について好適な配列を選択することは、当業者にとってはルーチンであろう。
ポリヌクレオチドが適切なベクターにクローン化された後、電気穿孔、CaCl形質移入、又はリポフェクチンのような適切な手段によって、コンストラクトを細胞(例えば、細菌又は酵母)に移す。バキュロウイルス発現系を使用する場合には、ポリヌクレオチドを含有する導入ベクターは、完全バキュロウイルスゲノムと一緒に形質導入される。
これらの技術は当分野において公知であり、分子生物学的物質の製造者(例えば、Clontech、Agilent、Promega、及び/又はInvitrogen Life Technologies)は、好適な試薬及びそれらの使用法に関する指示を提供している。さらに、これに関する他の情報を提供する多数の基準の参考書、例えば、Rodriguez,R.L.及びD.T.Denhart編,「ベクター:分子クローニングベクターの調査及びそれらの使用」,Butterworths,1988;「分子生物学における最新のプロトコル」,編者:F.M.Ausbleら編,Wiley N.Y.,1995;分子クローニング:実験室マニュアル,上記;及びDNAクローニング,Vol.1−4,2版 1995,編者:Glover及びHames,Oxford University Press)が存在する。
さらに他の態様では、本発明は、組み換えタンパク質を発現できる細胞であって、発現されるべき組み換えタンパク質をコードする本発明によるポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする細胞も提供する。好適には、細胞は、上述のようにポリヌクレオチド又はベクターにて形質転換された宿主細胞である。本発明によるポリヌクレオチド又はベクターは、細胞のゲノム物質に好適に一体化されるか、又は自動的に複製するベクターの部分である。この明細書では、「組み換え体」とは、天然の細胞では発現されないタンパク質を意味する。
宿主細胞は、例えば、適切な選択、増幅、又は転写の誘導のために、このようにして、組み換えタンパク質の発現のために変更される一般的な栄養培地において培養される。宿主細胞は原核生物性又は真核生物性である。特に、発現されるタンパク質が、ヒト又は哺乳類の対象でのインビボ使用を目的とするものである場合には、哺乳類、例えば、ヒトの株化細胞が好ましい。好適な株化細胞の例としては上述のものであり、各種の好適な細胞型についての適切な培養条件は、当業者には公知である。
さらに他の態様では、本発明は、本発明による細胞を含んでなる細胞培養物を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、標的に結合する合成タンパク質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
a)上記の1又はそれ以上の異種性のペプチドをコードする配列を含んでなる合成の足場タンパク質集団を含んでなるライブラリーを提供し;
b)前記ライブラリーを標的に曝露し;及び
c)前記標的に結合する合成の足場タンパク質を選別する
ことを含んでなる。
標的は、好適には、タンパク質/ペプチド、核酸、又は小分子又は興味ある各種の他の標的である。標的は、好適には、基材に、例えば、マイクロタイタープレートのウェルに又は磁気ビーズ又は他の適切な粒子上に不動化される。
スクリーニング法は、好適にはディスプレイシステム、例えば、表面ディスプレイシステムである。例えば、好適な表面ディスプレイシステムは、ファージディスプレイ、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、CIS(Odegrip,Coomberら,2004)又は他の非共有結合又は共有結合タンパク質ディスプレイ(FitzGerald 2000)、細菌性ディスプレイ(Lofblom 2011)及び酵母ディスプレイ(Traxlmayr及びObinger 2012)又は他の真核生物細胞におけるディスプレイ(Makela及びOker−Blom 2008)(Ho及びPastan 2009)である。
本発明の特定の具体例では、スクリーニング法において使用されるタンパク質は、足場タンパク質がウイルス粒子の表面でディスプレイされるように、バクテリオファージのコートタンパク質との足場タンパク質の融合物である。このように、ウイルス粒子上でディスプレイされるタンパク質は、ファージ粒子内の遺伝子配列に対応する。もちろん、表面ディスプレイシステムがファージディスプレイシステム以外のものである場合には、他の好適な融合タンパク質が提供される。
標的が基材上に不動化される場合には、表面ディスプレイ化ライブラリーは、その上に不動化された標的を有する基材に曝露され、ファージが標的に結合することを可能にする好適な期間の後、基材をすすぐ。標的に結合するタンパク質は基材に付着したままであり、他のものは洗い落とされる。
好適には、標的に結合するタンパク質は、その後、溶離されるか、又は標的から関連するファージを分裂し、ファージディスプレイの場合には、好適な細菌性宿主の感染によって、より多くのファージを創製するために使用する。この結果、増強された混合物を含んでなる新規のライブラリーが生成し、このライブラリーは、元のライブラリーよりもかなり少ない不適切なファージ(すなわち、非結合足場タンパク質を含有するファージ)を含有する。
ライブラリーを標的に曝露する工程、すすぎ工程、溶離工程及び感染工程は、任意に、1又はそれ以上繰り返して行われ、さらに結合するタンパク質においてファージライブラリーを増強する。これは、一般に、パニングと称される。このように、方法は、複数回のパニング工程を含むことができる。
一旦所望の回数のパニング工程が実施されると、表面ディスプレイ化されたタンパク質に結合する核酸は、標的に結合する足場タンパク質を同定するために配列決定される。
高い親和性及び高い特異性をもって標的に結合する本発明による足場タンパク質が得られることが知見された。例えば、親和性1×10−9Mをもって結合する足場タンパク質が得られた。意外なことには、本発明による足場タンパク質から形成されたライブラリーは、タンパク質(これに対しては、抗体又は所望の特異性を有する抗体を産生することは不可能であることが証明されている)に結合する足場タンパク質を示した。例えば、足場に基づく人工の結合タンパク質として、特異的にヒトパピローマウイルス(HPV)16E5に結合するタンパク質が選択されるが、代わりのタンパク質は、度重なる選択する能力の欠如のため、この標的に対する好適な抗体を欠いている。HPVは、子宮頸癌の病原体である。ヒト低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)の2つの型、hSUMO1とhSUMO2とを識別する人工の結合タンパク質も選択されるが、一方、既に選択された抗体は、このような識別をできないことが証明されている。抗体系の技術が好適な解決策を提供できないような他の標的に対して、他の有用な結合タンパク質が産生されることを予測することは妥当である。
他の態様では、本発明は、上記のスクリーニング法によって得られた合成の足場タンパク質を提供する。
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の研究における使用を提供する。例えば、このようタンパク質は、一般的に、抗体又は抗体フラグメントが使用される各種の研究分野において使用される。このような方法は、タンパク質/タンパク質相互作用、ラベル化標的(例えば、蛍光性)等の妨害を含むことができる。
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の環境及びセキュリティーモニター、又は合成生物学における使用を提供する。
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の標的探知における使用を提供する。
他の態様では、本発明は、上述の合成足場タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の治療又は診断における使用を提供する。例えば、このようなタンパク質は、抗体又は抗体フラグメントが一般的に使用される診断又は治療の分野で使用される。
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質及び薬学上許容されるキャリヤー又は医薬品添加剤を含んでなる医薬品を提供する。
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質を使用して、薬物標的を確認し、及び標的タンパク質について新薬の開発につながるようなドメインを同定する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、有機化合物を含む及び薬剤化合物を含む小分子に結合する合成タンパク質を好適に選択する方法を提供する。
本発明の合成タンパク質は、好適には、適切な治療薬に結合される。このような状況では、合成タンパク質は、治療用「ペイロード」を所望の標的に送達するためにターゲティング機能を提供する。
本発明による医薬品の調製は、当業者にとって一般的な手段によって実施される。投与可能な(静脈内又は皮下投与、又は他の投与法による)組成物を調製する方法は、当業者には公知又は明らかであるし、Remington:科学及び薬学の実践,Lippincott Williams及びWikins;21改定版(2005年5月1日)のような刊行物により詳細に記載されている。
「合成タンパク質」とは、自然の中では見出せず、組み換え技術を介して形成されたタンパク質を言う。
用語「タンパク質」は、一般に、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって結合された少なくとも2個の共有結合的に付着するアミノ酸を意味する。用語「タンパク質」は、精製された天然生成物、又は組み換え又は合成技術を使用して、部分的又は全体的に生成される生成物を含む。用語「タンパク質」は、二量体又は多量体のようなタンパク質の凝集体、融合タンパク質、タンパク質変異体、又はその誘導体も意味する。用語は、変性タンパク質、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化等によって修飾されたタンパク質も含む。
タンパク質は、核酸コドンによってコードされていないアミノ酸を含むことができる。非天然のアミノ酸は、翻訳後修飾によって、例えば、特殊な位置におけるシステイン又は他の適切な残基の導入、ついで、タンパク質の生成に続くデヒドロアラニンへの転化、及び続く、好適に修飾した非天然のアミノ酸との反応を介して導入される。或いは、非天然のアミノ酸は、インビトロ又はインビボでの翻訳の間に、適切な異種性のtRNA/tRNAシンテターゼカップル(抑制tRNAに非天然のアミノ酸を充填し、ついで、該アミノ酸をUAGコドンの位置でタンパク質に組み入れる)を介する停止コドン、すなわち、UAGの抑制を通して配列に組み入れられる。
本発明の合成タンパク質は、単一サブユニット又は多サブユニットタンパク質でも良い(ここで、少なくとも1つのサブユニットは前記配列を含んでなる)。
特定の具体例では、タンパク質は、2又はそれ以上の上述のタンパク質を、例えば、融合タンパク質の形で含んでなる。このような場合、合成タンパク質の各々は、同じ標的に結合でき、又は異なった標的に結合することができる。同じ標的に結合することは、結合活性及び見かけ上の結合親和性を増強し、一方、異なった標的に結合することは、架橋モジュール又は二重認識モジュールの開発に有用である。
本発明の明細書における「異種性のペプチド」又は「異種性のペプチド配列」とは、適切な位置において、すなわち、足場タンパク質のループ領域において、普通には見出されないペプチド配列を言う。代表的には、このようなペプチドは、相対的に短く、すなわち、30個未満のアミノ酸、代表的には20個又はそれ以下を含有する。このようなペプチドは、本質的に、各種の配列を有することができる。実際、膨大な数の異種性のペプチド配列を含有するライブラリーは、足場タンパク質においてディスプレイされることが望ましい。
特別な態様、本発明の具体例又は例と合わせて記載する特徴、整数、特性、化合物、化学部分又は基は、矛盾しない限り、ここに記載の各種の他の態様、具体例又は例にも適用されるものと理解されなければならない。この明細書(特許請求の範囲、要約及び図面を含む)に開示する特徴の全て、及び/又はここに開示する各種方法の又はプロセスの工程の全ては、このような特徴及び/又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、各種の組み合わせで組み合わされる。本発明は、上述の各種具体例に詳細に限定されない。本発明は、この明細書(特許請求の範囲、要約及び図面を含む)に開示する特徴のいずれかの新規な1つ又は各種の新規な組み合わせ、又はここに開示する各種の方法又はプロセスの工程のいずれかの新規な1つ又は各種の新規な組み合わせに及ぶ。
本明細書の読み手の注目は、この出願に含まれ、公衆の調査のために公開される全ての書類及び文献に向けられ、及びこのような全ての書類及び文献の内容は、参照することによってここに組み込まれる。
本発明の特定の具体例
次に、発明の具体例を、実施例によって、添付図面を参照して記載する。
57フィトシスタチンアミノ酸配列に由来するコンセンサスフィトシスタチンPHYTC57を示す。(A)再帰的PCRによって遺伝子を生成するために使用されたオーバーラップオリゴヌクレオチド(P1〜P6)とともに二本鎖配列として示されたPHYTC57合成遺伝子。コード配列も、アミノ酸1文字表記として示されている。2つの制限部位StiI及びNotIの位置が示されている。(B)pHENIに基づくpDHisIIのクローニング領域の略図。pelBシグナル配列、ヘキサヒスチジンタグ、及びM13ファージPIIIタンパク質のN末端配列をコードする適切な領域の位置が示されている。M13R及びP10のための標準的なM13プライマー結合部位の位置も、ユニークなSfiI及びNotI制限部位であるため表示されている。 各種のフィトシスタチン濃度における修飾オリザシスタチン欠損体Asp86(OSA−IΔD86)及びPHYTC57に関するパパイン阻害アッセイの結果のグラフであり、PHYTC57の増強された効力を示す。 NTAセンサーチップ上に不動化したシスタチンとパパインとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴測定を示す。いくつかのパパイン濃度において実験を行い、Biaevalution 3ソフトウエアパッケージ(BIACORE)を使用し、データのLangmuir1:1結合モデルへの包括的適合によって、データを分析した。OSA−IΔD86:修飾イネシスタチンI、CPA:パパイヤシスタチン、CUN:オレンジシスタチン、CEWC:鶏卵卵白シスタチン、PHYTC57:コンセンサスシスタチン。 100℃における表示する各時間でのインキュベーションに続いて、25℃においてアッセイした、残留酵素活性として示すOSA−IΔD86の熱安定性(灰色の□)及びPHYTC57の熱安定性(黒色の△)。PHYTC57は、OSA−IΔD86よりも大きい熱安定性を発揮する。(B)OSA−IΔD86及びPHYTC57の抑制特性についての模擬胃液処理の影響を示す。PHYTC57がOSA−IΔD86よりも長い期間にわたって活性を保持することを示している。(C)模擬胃液によるインキュベーションに対するPHYTC57及びOSA−IΔD86の安定性のSDS−PAGE分析。インキュベーションの時間を秒として示し、マーカータンパク質(M)の位置を、示されたアッセイからのペプシン及びシスタチンの位置とともに、左にkDaで示す。(D)抗−Hisタグ抗体を使用して、表示した時間(秒)での模擬胃液処理に続くPHYTC57のウエスタンブロット分析。マーカータンパク質(M)の位置をkDaで示す。 タンパク質PHYTC57及びOSA−IΔD86の間のアミノ酸の差異を示すPHYTC57及びOSA−IΔD86の対比。(A)タンパク質の配列のアラインメント。(B)OSAIの3D構造における(A)からのアミノ酸の変更の位置を、ラベル化した残基の変更とともに示す。結合領域も、ラベル化したN末端、QVVAG及びPWループとともに示す。 PHYTC57に由来するAdhiron足場のライブラリー及び配列から単離した結晶構造。(A)Adhiron足場が示されており、挿入されたループが示されている。(B)Adhironアミノ酸足場のためのコドン最適化核酸配列及びアミノ酸配列。αへリックス、βシート及びループ1及びループ2のための挿入領域が強調されている。 Adhiron足場の生物化学的特徴付け及びライブラリーの配列決定を示す。(A)Adhiron足場の融解温度(Tm101℃)を測定するために、示差走査熱量測定を行った。(B)Adhiron足場及びループ挿入を含有する3つの選ばれたAdhironタンパク質の構造を検討するために円二色法を使用し、及びすべてが非常に高いβ構造を示した。(C)大腸菌ER2738細胞に感染させるためAdhironファージライブラリーを使用した。96個のランダムクローンを単離し、配列決定した。グラフは、ループ領域内の各アミノ酸の割合(%)を示す。理想的なライブラリーは各アミノ酸5.26%を含有するが、ライブラリーには、システインは含まれなかった。 良好に特徴付けられた代表的な低分子の可溶性タンパク質であるリゾチーム(B)と比較するAdhiron足場(A)の安定性の対比を示す。(C)は、myc抗体に結合するように選ばれたAdhironのため、足場へのループの付加がTmを85℃に低下させるが、これは、なお、大部分の足場タンパク質よりも高い融解温度を示している。このAdhironタンパク質は、一連のスキャンによって示されるように、変性及び復元の繰り返しのサイクルを受けることができる。 酵母SUMO(ySUMO)に関するファージELISAの結果を示す。(A)第3のpanラウンドから単離されたクローン24個を使用したファージELISA。各クローンによって生産されたファージを、ySUMO又はコントロールを収容するウェルにおいてインキュベートした。画像は、基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)の添加後3分の時点で記録したものである。(B)ySUMO(ハッチング)及びコントロール(ハッチングなし)に関するファージELISAの560nmにおける吸収を示すグラフ。 酵母SUMOに特異的なAdhiron(Ad−ySUMO)の精製及び特徴付けを示す。(A)Ad−ySUMOをBL21細胞において発現させ、細胞可溶化物を、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃及び100℃に20分間加熱し、15,000×gにおける遠心分離によって沈殿物を除去した。各温度について、浄化した可溶化物のアリコート5μlを15%SDS−PAGEゲル上で分離し、タンパク質を可視化するためクマシーで染色した。(B)可溶化物をNi−NTAビーズとともに1時間インキュベートした。インキュベートした後の可溶化物(5μl)及び精製したAd−ySUMO(10μl)を、15%SDS−PAGEゲルに展開し、可視化のためクマシーで染色した。(C)ySUMO(ハッチングバー)を検出するために、ビオチン標識されたAd−ySUMOを使用したが、ビオチン標識されたAd−ySUMOは、ELISAによっては、ヒトSUMO(ハッチングなし)を検出しなかった。(D)酵母SUMO0.5μg(上方パネル)及びHEK293細胞可溶化物20μgと混合した酵母SUMO0.5μg(下方パネル)に対してAd−ySUMOをクローン10個、15個、20個、及び22個を使用したウエスタンブロット。 一連の標的、すなわち、成長因子タンパク質FGF1(A)、細胞表面レセプターCD31(B)、及びペプチド(C)に対するスクリーニングにおいて同定されたAdhironに関するファージELISAの結果を示す。グラフは、TMBの添加後の各ウェルの吸光度を示す。標的を収容するウェルをハッチングして示し、一方、コントロールのウェルをハッチングなしで示す。 HPV16E5GFP(標的)及びAdhiron用のエピトープなしのHPV16E5GFP(コントロール)の免疫蛍光像を示す。AdhironE5を量子ドットに抱合させ、哺乳類の細胞におけるE5タンパク質の検出に使用した。細胞を、DAPI(DNA染色)、GPF、及びE5(Adhiron−量子ドットを有する)にて染色した。 Adhiron標的hSUMO2を示す。(A)ELISAによって、hSUMO1及びhSUMO2に対する特異性を測定するために、hSUMO2に対して産生されたABPをテストした。hSUMO2ABPは、hSUMO2に特異的に結合し、これは、結合親和性に反映された。(B)RNF4’s SUMO−標的化ユビキチンリガーゼ活性を阻害するhSUMO2ABPの能力を示すブロット。(C)細胞においてコントロールベクター又はhSUMO2バインダーを発現させ、抗−FLAG抗体を使用して分析し、核内構造体PML(グリーン)を誘導するためにヒ素とともに培養した。RNF4は、PMLの分解を促進する。hSUMO2とRNF4との間の相互作用を阻止することはPMLの分解を変更する。これは、hSUMO2に特異的に結合し、hSUMO1と相互作用することなくhSUMO2を阻害するhSUMO2結合タンパク質についての最初の記載である。hSUMO2 Adhironも、(C)において証明されるように、hSUMO2と相互作用し、hSUMO2の他の機能に影響を及ぼさないドメインを特異的に妨げる。 血栓形成及び溶解濁度アッセイを表すグラフを示す。実線は正常な形成及び溶解を示す。点線は、このプロセスに対する5個の異なったAdhironの影響を示す。5個の異なったAdhironは異なったエピトープを含有し、血栓形成及び溶解に異なった影響を及ぼす。いくつかは凝固時間を延長させ、いくつかは溶解時間を延長させ、いくつかは凝固時間及び溶解時間を延長させる。Adhironの1つは、血栓形成の阻害を完結する。これは、異なったAdhironがフィブリノーゲンの異なった領域に結合し、これを阻害することを証明するものであり、従って、タンパク質の機能の研究のまさに新規な路を示すものである。 フィブリノーゲン結合Adhiron及びフィブリノーゲンと結合しないコントロールAdhironによる血栓形成後のFITCラベル化フィブリノーゲンの共焦点像を示す。これは、正常な凝固応答を変更するAdhironの能力を証明する。 哺乳類の細胞における機能性Adhironの発現を証明する蛍光透視画像を示す。ヒトSUMO2結合Adhironが核リンタンパク質PMLの分解(これらPML核内構造体の増大につながる)を変更することが理解される。 FcyRIIIa及び結合したAdhironの共結晶構造を示す。(A)Adhironは、IgGに結合するレセプターに影響を及ぼすアロステリック部位に結合する。この部位も、小分子薬剤デザインに関する標的として同定されており、Adhironが新薬の開発につながるような部位についての重要な情報を提供するとの証拠を提供する。(B)Adhironは、FcyRIIIaにおけるIgGの直接結合部位を標的とすることも見出されている。Adhironは、2つのループ及び4アミノ酸の不定形N末端配列を含有する。N末端ペプチドも、Adhiron及びFcyRIIIaの間の相互作用に寄与している。AdhironとFcyRIIIaとの間の結合作用を理解することによって得られる情報は、インシリコスクリーニングを介する小分子の同定に役立つであろう。これは、将来の創薬方法論についての興味をそそる新規なアプローチを提供する。さらに、結晶構造は、コア足場のβシートのいずれか一方を伸展できるループ又は代わりの立体構造的相互作用表面を創造する、より柔軟なループを提示する足場の能力を証明する。これは、足場の固有のコア安定性によって容易になり、潜在的に、このコアをユニークなものとする。 NMRスペクトル。(A)ABP足場(薄い灰色)及び酵母SUMO Adhiron15(濃い灰色)に関する1H−15N HSQ指紋スペクトルのオーバーレイ。(B)酵母SUMO Adhiron15(濃い灰色)に関する1H−15N HSQ指紋スペクトル及び酵母SUMOタンパク質及び酵母SUMO−Adhiron15複合体(薄い灰色)に関する1H−15 TROSY NHSQスペクトルのオーバーレイ。 SUMO結合Adhironのインピーダンス変化対濃度のグラフを示す。これは、インピーダンス系バイオセンサー装置におけるAdhironの潜在的な使用の例を提供し、表面に結合するAdhironが、抗体に比べて、より広いダイナミックレンジを有することを示す。 図20〜24は、広範な標的に対して選ばれたAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。この分析より、所定の標的に対するバインダーの範囲の特定が可能になり、いくつかのケースでは、可能なコンセンサス結合領域の開発が容易になる。図20は、レクチン様酸化LDLレセプター−1(LOX1)に結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 ヒト成長ホルモン(HGH)に結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 酵母低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)に結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 ペニシリン結合タンパク質2a(PBP2a)に結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 ペプチド標的に結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 有機化合物ポサコナゾールに対するスクリーニングにおいて同定されたAdhironに関するファージELISAの結果を示す。グラフは、TMBの添加後の各ウェルの吸光度を示す。標的を収容するウェルをハッチングして示し、一方、コントロールのウェルをハッチングなしで示す。 フィブリノーゲン結合Adhironによるマイクロモル濃度からアトモル濃度までのフィブリノーゲンの各種濃度のインピーダンス変化による検出のグラフ。これは、インピーダンス系バイオセンサー装置におけるAdhironの潜在的な使用の例を提供し、表面に結合するAdhironが、15分間のインキュベーションで、低濃度の標的タンパク質を検出でき、広い線形のダイナミックレンジをディスプレイすることを示している。3×10−12μMにおける2つのデータポイントは、分析物の添加直後(下方データポイント)及び15分間のインキュベーション直後(情報データポイント)に測定したものである。 成長因子レセプター結合タンパク質2(Grb2)Srcホモロジー2ドメインに結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。 シグナル伝達性転写因子3(STAT3)Srcホモロジー2ドメインに結合するいくつかのAdhironのLOOP1及びLOOP2領域の配列アライメントを示す。
「特別なタンパク質足場についてのより広い興味を促進するためには、異なった種類の関連するリガンドについての特異性が発生されること、誘導された結合タンパク質が特に有用であること、及びそれらが、一般的な抗体フラグメントをしのぐ少なくともいくつかの利益を提供することを証明する必要がある。これらの基準は、これまでに提案されたタンパク質足場の多くによっては満足されておらず、これらの多くについて、単に初期のエンジニアリングの努力が記載されているに過ぎない。」と述べられている(Skerra 2007)。従って、本発明は、以下において証明するように、有用で、多目的で、及び魅力的であるタンパク質足場を提供することにおいて価値がある。
新規なAdhiron足場及び由来のライブラリーに寄与する重要な生理活性の結合タンパク質を同定するとの意味で高レベルの成功は、大部分は、高度に堅固なフレームワーク(ここで可変性のループ領域がディスプレイされる)を提供するコア足場の非常に高い安定性によるものである。これらのループ領域は、十分な柔軟性を有していて、広範囲の立体構造を採用することができ、このように、広範囲の分子標的(注目すべき低分子の有機分子を含む)に対する結合する試薬の選択を許容する標的分子についての広範囲の立体構造的特徴と相互作用できる。このユニークな足場のこれらの構造的態様は、他の足場タンパク質では達成されていなかった機能的帰結をもたらす。
植物タンパク質を多くの用途、特にヒトに関与する用途で使用することには、タンパク質がヒトタンパク質に由来せず、従って、ヒトタンパク質との天然の相互作用に関与しないため、利益がある。潜在的な相互作用はシステインプロテアーゼに対するもののみであるが、このようなタンパク質と相互作用できる活性な結合領域は、一般的には、Adhiron足場においては交換又は除去される。しかし、ヒトは、絶えず、例えば、食物、化粧品、及び医薬品を介して、植物由来のタンパク質と接触し、耐用性を示している。
代表的な足場タンパク質(PHYTC57と名付ける)の創造
序文
タンパク質デザインに関するコンセンサスアプローチは、シングルコンセンサス配列(この配列において、各位置は、通常、最も頻繁に生ずる残基によって占められる)を誘導するために、タンパク質ファミリーのメンバーのマルチプル配列アライメントにて開始する。折りたたまれたタンパク質の構造、折りたたみ経路、及び安定性を限定する残基は保存される傾向にあるが、酵素における触媒残基のような共通の生物学的機能が要求されるもの、又は保存された標的タンパク質と相互作用する残基も保存されがちである。タンパク質は十分に安定であり、これにより、インビボにおいて、その生物学的役割を実行できように進化するのみであるため、天然のタンパク質は、通常、保存されたコンセンサス残基の全てを含有しないであろうし、多くの場合、生物学的プロセスのターンオーバー及び規制を容易なものとする不安定度を含むであろう(Steipe,Schillerら,1994)。
発明者らは、コンセンサスアプローチが、フィトシスタチンの抑制特性及び安定性の増強のために適用可能であるかどうかを探求することに関心を持った。フィトシスタチンは、システインプロテアーゼの低分子(〜100aa)の強力な阻害剤である(Kondoら,1991)。シスタチンスーパーファミリーの詳細な系統樹推定分析は、シスタチンの異なったクラス間の関係を明らかにした(Kordis及びTurk 2009)。フィトシスタチンは、システインプロテアーゼへの結合に関与する3つの領域、すなわち、N末端領域、QVVAGループ、及びPWループを含んでなる(Margisら,1998)。発明者らは、構造モデル及び配列アライメントに基づき、既に、保存されたPWループの近くにあり、OSA−IΔD86と名付けられた残基Asp86を欠くイネシスタチンの変異体であるオリザシスタチン(OSA−I又はOI)を生成した。この変異体は、パパイン及び線虫(Caenorhabditis elegans)腸特異的システインプロテアーゼGCP−1の両方に対して、Kにおける13倍の改善を示した(Urwinら,1995;McPhersonら,1997;Urwinら,1997;Urwinら,1998;Urwinら,2000;Urwinら,2001;Urwinら,2003;Lilleyら,2004)。ついで、発明者らは、線虫が寄生した植物内で発生する特殊化した摂食細胞において発現される際に、OSA−IΔD86及び他のシスタチンによって与えられる、植物線虫に対する良好なレベルのトランスジェニック耐性を証明した(Urwinら,1995;McPhersonら,1997;Urwinら,1997;Urwinら,1998;Urwinら,2000;Urwinら,2001;Urwinら,2003;Lilleyら,2004)。
ここに、発明者らは、57個のフィトシスタチンのアミノ酸のマルチプル配列アライメントに基づくコンセンサスフィトシスタチンのデザイン、構成及び特徴付けについて記載する。発明者らは、このコンセンサスフィトシスタチンが、システインプロテアーゼであるパパインの効果的な阻害及び熱安定性及び消化性アッセイにおける増強された安定性をディスプレイすることを示す。
材料及び方法
コンセンサスフィトシスタチン(以下、PHYTC57と称する)のデザイン
GenBankデータベースのBLASTサーチに続いて、CLUSTALW(http://clustalw.genoma.ad.jp/; BLOSUM62; ギャップ開始ペナルティー=12;ギャップ伸長ペナルティー=12)を使用して、フィトシスタチン配列のマルチプルアライメントを実施するとともに、さらに、プログラムCINEMA(http://www.bioinf.manchester.ac.uk/dbbrowser/CINEMA2.1/)(Parry−Smithら,1998;Lordら,2002)を使用するマニュアルアライメントを実施した。各位置における最も一般的に使用されるアミノ酸を決定し、長さアミノ酸95個のコンセンサス配列を与えるために、可変性のN末端及びC末端を切り詰めた。適切なコドン頻度表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)を使用することによって大腸菌での発現用に最適化したコドン使用頻度を有するコンセンサスフィトシスタチン(phytc57)をコードするように、合成コード領域をデザインした。それぞれが長さ約70nt(近接するオリゴヌクレオチドの間で少なくとも10ntの領域を含む)のオリゴヌクレオチド6個(P1−P6、図1参照)から、コード領域を構築した。隣接のオリゴヌクレオチドP1及びP6は、ベクターpDHisII(コード配列は、ベクター由来のpelBシグナル配列コード領域に融合する)にクローン化するために、それぞれ、SfiI部位及びNotI部位も含有する。PELB/PHYTC57タンパク質のN末端配列を自動シグナル配列予測プログラムSignal P(Bendtsenら,2004;http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)に供することによって、シグナルペプチダーゼ開裂部位の保持をチェックした。オリゴヌクレオチド対(P1+P2)、(P3+P4)及び(P5+P6)をアニールし、セルフプライミングによって、二本鎖フラグメントに転換させた。反応液(10μl)は、各プライマー25pモル、すなわち、各dNTP0.2mM、1×Pwo緩衝剤(10mM Tris−HCl pH8.85、25mM KCl、25mM (NHSO、2mM MgSO)及び5単位PwoDNAポリメラーゼ(Boehringer)を含有しており、95℃で2分間、25℃で4分間、ついで、72℃で5分間の1サイクルに供した。生成物(P1/P2)の生成物(P3/P4)へ、ついで、(P1/P2/P3/P4)の(P5/P6)への連続する結合を同様にして行い、全長の生成物を作成した。最終反応物のアリコート5μlを、PCR50μlにおいて、隣接のプライマーP1及びP6の各々50pモル、各dNTP0.2mM、1×Pwo緩衝剤及び5単位Pwoとともに、テンプレートとして使用した。反応を、95℃で1分間行い、ついで、95℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で30秒間のサイクル30回に供した。生成物をSfiI及びNotIで消化し、アガロースゲルから取り出し、SfiI及びNotIで制限化されたpDHisIIにクローン化した。新たに作成した遺伝子領域を配列決定して、正確なプライマー構築及び予測したDNA配列を確認した。コンセンサスコード領域の配列を図1Aに示す。
他のフィトシスタチン遺伝子の合成
大腸菌での発現用に最適化した合成DNA配列を、同様にデザインし、作成し、及びイネ(Oryza satival;osa−IΔD86 Asp86用のコドンを欠くoc−l GenBank受入番号U54702の修飾型(Urwinら,1995))、温州ミカン(Citrus unshiu;cun,GenBank受入番号C95263)及びパパイア(Carcia papaya;cpa,GenBank受入番号X71124(Songら,1995))からのフィトシスタチンのためにクローン化した。鶏卵卵白シスタチン遺伝子(cewc)配列を、遺伝子特異性プライマー、
cewcF 5’ATTAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAGCGAGGACCGCTCCCGGC3’(配列番号10)
cewcR 5’CGCTGTACTTGCGGCCGCCCTGGCACTTGCTTTCCAGC3’(配列番号11)
(それぞれ、SfiI部位及びNotI部位(下線で示す)が挿入されている)を使用してpQE30誘導組み換えプラスミドから増幅した。
1×SuperTaq緩衝剤(10mM Tris-HCl pH9.0、1.5mM MgCl2、0.1%(v/v)Triton X−100)を含有する容積50μlにおいて、各プライマー50pモル、最終濃度0.2mMの各dNTP(Promega)、及びテンプレート約10ngを使用してPCR反応を行った。PCRの間に高い忠実度増幅を確保するために、SuperTaq(HT Biotechnology):Pfu(Boehringer Mannheim)DNAポリメラーゼの10:1ミックスを、反応当たりポリメラーゼ1単位の量で使用した。反応を、95℃で1分間の1サイクル、ついで、95℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で30秒間のサイクル20回に供した。全ての生成物が全長であることを確保するように、72℃で30秒間の最終工程を使用した。
pDHisIIの作成
初めに、フィトシスタチンコード領域を、遺伝子III融合物として、ファージミドベクターpHEN1の修飾型(Hoogenboomら,1991)へクローン化した。NotI開裂ベクターによる連結用に好適な一本鎖エンドを有するリンカーを創製するためにリン酸化し、アニールした相補的オリゴヌクレオチドによってコードされるヘキサヒスチジン領域の添加によって、pHENベクターを修飾した。オリゴヌクレオチド配列は、
HisF: 5’−GGCCGCAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGG−3’(配列番号12)
HisR: 5’−GGCCCCGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGC−3’(配列番号13)
であり、NotI相補的末端を下線で示している。
pHEN1ベクターをNotIで消化し、100mM NaCl、50mM Tris−HCl(pH7.9)、10mM MgCl及び1mM DTTを含有する反応50μlにおいて、エビアルカリホスファターゼ(NEB)5単位を使用して、65℃で15分間加熱する前に、37℃において30分間で脱リン酸化した。プライマー
XhoF:5’ATCACGCTCGAGCAGAACAAAAACTCATCTCAG3’(配列番号14)
XhoR:5’TGTTCTGCTCGAGCGTGATGGTGATGGTGATGGCG3’(配列番号15)
BamHIR:5’TGGCCTTGATATTCACAAACG3’(配列番号16)
M13R:5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’(配列番号17)
を使用するPCR突然変異誘発によって、遠位のNotI部位を破壊した。
XhoFプライマーをBamHIRプライマーと一緒に使用し、及びXhoRプライマーをM13Rプライマーと一緒に使用して、2つのフラグメントを作成し、2つのフラグメントを、プライマーM13R及びBamHIRを含む第2のPCRにおいてアニールし及び増幅した。導入されたXhoI制限部位に下線を付している。得られた生成物を、SfiI/BamHIフラグメントとして、同様にデザインしたpHEN1ベクターにクローン化した。XhoI部位の存在を、単離したファージミドDNAの制限分析によってスクリーニングし、陽性クローンにおける挿入物pDHisII(図1B)を、DNA配列分析によって確認した。
pDHisIIにおけるシスタチンの発現
初めに、C末端RGS(H)及びmycタグを追加するベクターpDHisIIにおいて、作成物を使用して、シスタチンを発現させた。大腸菌宿主菌株HB2151における発現の研究により、シスタチン−遺伝子III融合物内におけるアンバーコドンの抑制が可能になり、その結果、周辺質にシスタチンが蓄積された。培養物(1L)を、0.1%(v/v)グルコース及びアンピシリン100μg/mlと一緒に、2xTY培地において生育し、ついで、1mMまでのIPTGによって誘導し、30℃において16時間生育した。細胞ペレットを、50mMTris(pH8)、20%(v/v)ショ糖20mlに、4℃で再懸濁させ、周辺質の調製を行った。周辺質フラクションにNi−NTA樹脂1mlを添加し、4℃において16時間混合してインキュベートした。樹脂を洗浄緩衝液(50mM NaHPO、500mM NaCl、pH6)のアリコート1mlで8回、ついで、40mMイミダゾールを含有する洗浄緩衝液で3回洗浄した。PBSに対して透析する前に、シスタチンを、250mMイミダゾールを含有する洗浄緩衝液200μlにて、4℃において、1時間で溶離した。タンパク質を分取し、液体窒素中で凍結した。サンプルをSDS−PAGE及びエレクトロスプレイ質量分析によって分析した。
pET101におけるシスタチンの発現
可溶性タンパク質のより効果的な発現のため、フィトシスタチン遺伝子を、pDHisIIからのC末端6−Hisタグと一緒に、方向性TOPOクローニング(Invitrogen)によってpET101にサブクローン化した。上述の条件を使用して、元のクローニングベクターpDHisIIからのフィトシスタチン遺伝子をPCR増幅するために、プライマー
cystaSDFWD 5’CACCATGAAATCACTATTGCTTACG3’(配列番号18)
cystaSDREV 5’CTACTAGTGATGGTGATGGTGATGCG3’(配列番号19)
を使用した。陽性のクローンをDNA配列分析によって確認し、BL21(DE3)Star cell(Invitrogen)に導入した。培養物を30℃において生育し、IPTGを16時間添加する(1mMまで)ことによってフィトシスタチンの発現を惹起した。遠心分離(4,000×g、10分)によって細胞を収集し、氷上で超音波処理し(3×1分)、細胞片を遠心分離(10,000×g、10分)によってペレット化した。上澄みを0.1mM NiClを充填した金属キレート化カラム(Pharmacia)上に負荷した。広範な洗浄の後、100mMイミダゾールにてフィトシスタチンを溶出し、広範にHBS緩衝液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005%P20)に透析し、−70℃において保存した。
パパインアッセイ
システインプロテアーゼ用の合成基質(Filippovaら,1984)であるpGlu−Phe−Leu−p−NA(Sigma)を使用して、パパイン(Sigma)の阻害をアッセイした。インキュベーション緩衝液(0.15M MES/OH pH5.8、4mM NaEDTA、4mM DTT)50μl中のパパイン100ngを、シスタチンを含有しない又は既知濃度のシスタチンを含有するサンプル50μlに添加し、30分間プレインキュベートした。1mM pGlu−Phe−Leu−p−NA(インキュベーション緩衝液及び30%DMSO中)50μlを添加し、パパインの活性を、25℃において15分間にわたり、415nmにおけるODの線形増加によってモニターした。
表面プラズモン共鳴(SPR)試験
パパインをSigmaから凍結乾燥粉末として入手した。SPR試験のために、1mM DTTを含有するHBS緩衝液に溶解することによって、1mg/mlのストック溶液を調製した。このストック溶液を、同じ緩衝液にて、所望の濃度に希釈した。全てのSPR試験を、NTAセンサーチップを使用する装置BIACORE 3000にて実施した。ランニング緩衝液はHBS−EP(10mM HEPES、0.15M NaCl、0.005% P20、pH7.4)であり、全ての試験を25℃において実施した。フィトシスタチンを、フローセル2〜4において不動化し(約400応答単位(RU))、フローセル1をブランクのままとした。パパインのフィトシスタチンへの結合をモニターするため、HBS緩衝液240μlを、全てのフローセル上に、流量80μlで注入し(会合フェーズ)、続いて、サブトラクションブランクを提供するため、普通の緩衝液を3分間注入した(解離フェーズ)。この注入をパパインとともに繰り返した。EDTAを使用してタンパク質をセンサーチップから剥がし、異なったパパイン濃度で試験を繰り返す前に、表面にニッケルを再充填した。動態解析を可能にするため、各濃度について、少なくとも5サイクルを行った。これらの結合テストからのデータを、Biaevaluation 3ソフトウエアパッケージ(BIACORE)を使用し、データをLangmuir1:1結合モデルに包括的に適合することによって分析した。
フィトシスタチンの熱安定性
PHYTC57及びOSA−IΔD86のアリコートを、50mMリン酸塩緩衝液(pH7.4)において0.5μgタンパク質/mlで調製した。直ちに、サンプルを沸騰水浴内に置いた。各種の時間でサンプルを取り出し、−70℃において保存する前に、液体窒素に浸漬した。機能性シスタチンの残留レベルを測定するため、パパイン阻害アッセイによって、残留阻害活性を測定した。
消化性アッセイ
使用直前に、上述のように、模擬胃液を調製し(Astwoodら,1996)、該胃液は、0.03M NaCl中に0.32%(w/v)ペプシンを含有し、濃HClにてpH1.2に調整されている。最終濃度0.2mg/mlでPHYTC57及びOSA−IΔD86の4個のレプリカを、SGF中、37℃においてインキュベートした。間を置いて、アリコート200μlを取り出し、直ちに0.2M NaCO75μlと混合して消化を停止させた。各サンプルを3つのサブサンプルに分け、上述のように(Atkinsonら,2004)、SDS−PAGEゲル上で分離した。2つのゲルを、全タンパク質について、クマシーブルーで染色し、その内の1つは、PHYTC57に対する模擬胃液の効果を示すものであり、他方は、PHYTC57の消化性をOSA−IΔD86と比較するものである。第3のゲルを、マウスの抗体を使用するウエスタンブロット分析に供して、アルカリホスファターゼ活性を使用する可視化にてPHYTC57の6Hisタグ(Qiagen)を検出した。各時点からの最終サンプルを、上述する酵素アッセイによってパパインに対する残留阻害活性について分析した。
結果
フィトシスタチン遺伝子の合成
コンセンサスフィトシスタチンコード領域のデザインのため、探索プローブとしてOSA−I(Oriza sative;U54702)、ZMA2(Zea mays;D38130)及びHAN1(Helianthus annuus;Q10993)タンパク質配列を使用して、GenbankデータベースのtBLASTN探索に着手した。コンセンサス配列を誘導するために使用した配列のリストを表1に示す。ホモロジー検索によって、データベースから配列を同定した。表は、各シスタチンについて、植物の生物名及び慣用名及びGenebank受入番号とともに、系統名を示す。プログラムCLUSRALWを使用して、コード配列を翻訳及び整列させ、プログラムCINEMA(Parry−Smithら,1998;Lordら,2002)を使用して、アライメントをディスプレイして、手動アライメントによって改善を可能にした。ついで、コンセンサス配列を、各位置における最も一般的なアミノ酸を同定することによって派生させた(図1A)。コンセンサス配列の長さを、保存されたN末端グリシン残基の前及びこのようにして第1のβストランド(β1)の前の、N末端に位置する4つの残基を有するアミノ酸95個と評価した。C末端は、保存されたPWモチーフの後及びこのようにして最後のβストランド(β5)の後の残基15個と評価された。これらの基準は、CEWC(Bodeら,1988)及びヒトステフィンB(Stubbsら,1990)のX線構造及びOSA−IのNMR構造(Nagataら,2000)に基づくものである。
Figure 0006889758


Figure 0006889758


Figure 0006889758


Figure 0006889758

PHYTC57をコードする合成遺伝子を、上記「材料及び方法」において記載したように、近接するオリゴヌクレオチド間において少なくとも10ntのオーバーラップの領域を含むようにデザインされた6個のオリゴヌクレオチド(P1〜P6)(それぞれ、約70nt)から作成した。天然に産生するフィトシスタチンの比較研究のため、発明者らは、大腸菌コドン使用頻度を反映するためにコドン変更を有する好適なタンパク質のユニーク配列からデザインされた、OSA−IΔD86、cun(Citrus unshiu;Satsuma)及びcpa(Carcia papaya;Papaya)フィトシスタチンコード領域を使用する同様の合成遺伝子アプローチを採用した。鶏卵卵白シスタチン(cewc)コード領域は、pQE−由来プラスミドから増幅されたPCRであった。初めに、SfiI及びNotI部位を活用することによって、遺伝子を、ファージディスプレイベクターpDHisIIにクローン化した(図1B)。
シスタチンの発現
初めに、pDHisIIからシスタチンを発現させ、Ni−NTA親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製したシスタチンのエレクトロスプレイイオン化質量分析による分析は、意外にも、各ケースにおいて、発現されたタンパク質のC末端欠失があることを示した。表2は、測定した分子質量とともに、全長シスタチン及びProtein Calculatorプログラム(www.scripps.edu/〜cdputnam/protcalc.html)を使用して算定した16アミノ酸C末端欠失を有する全長シスタチンの予想した質量を示す。タンパク質のC末端エンドの配列が、矢印で示される主要な欠失部位とともに示されている。CUNを除き、測定した分子質量は、C末端のアミノ酸16個を失ってはいるが、Hisタグを保持している融合タンパク質の型と良好に一致している(表2)。CUNの場合、16個未満の残基の欠失があるが、これを、更に特徴付けることはしなかった。特定されたタンパク質配列の発現を確実にするために、シスタチンコード領域+Hisタグを、PCR及びTOPO促進性クローニングによって、pET101にサブクローン化し、BL21(CE3)Star cell(Stratagene)において発現させた。IPTGを16時間で1mMまで添加することによってタンパク質の発現を惹起し、シスタチンを、それらのC末端ヘキサヒスチジンタグのため、天然の条件下において、Ni−NTA親和性クロマトグラフィーによって精製した。シスタチンをSDS−PAGEによって分離して、それらの純度(>98%と予測された)を検査したところ、それらの質量は、ESI−MSによって予測された値(データを表示していない)と良好に一致したため、これらのタンパク質を他の分析に使用した。
Figure 0006889758

シスタチンの結合活性
人工の基質p−Glu−Phe−Leu−p−ニトロアニリドを使用するパパインによる酵素アッセイにより、PHYTC57が活性なシスタチンプロテアーゼ阻害剤であることが確認された。Ki値を測定していないが、PHYTC57及びOSA−IΔD86のIC50値(それぞれ、4.6×10−8M及び1.8×10−7M)から、PHYTC57がOSA−IΔD86よりもより強力な阻害剤であることが明らかである。シスタチンとプロテアーゼとの間の相互作用を直接測定するために、発明者らは、BIAコア表面プラズモン共鳴分析を使用して、結合速度を測定した。シスタチンを、C末端Hisタグによって、ニッケル被覆センサーチップ上に不動化した。ついで、パパインを、不動化したシスタチンに結合させ、いくつかのパパイン濃度において測定を行った。OSA−IΔD86、CPA、CUN、CEWC、及びPHYTC57の結合に関するセンサーグラムを図3に示す。各濃度におけるデータを、Langmuir1:1結合モデルに適合させ、速度定数を測定した。データは、シスタチンプロテアーゼのシスタチン阻害の既知の1:1化学量論量と矛盾しないモデルへの良好な適合を示した。これらのシスタチンに関する速度定数の要約を表3に示す。PHYTC57は、テストした天然産のシスタチンに比べて、平衡定数K6.3×10−12Mにて、より高い会合速度及びより低い解離速度を発揮する(堅固なパパインとの結合複合体を表示する)。この値は、鶏卵卵白シスタチンについて測定したK値(3.9×10−10M)よりも2桁低く、改良されたフィトシスタチンOSA−IΔD86(4.7×10−9M)よりも3桁、及びフィトシスタチンCUN(1.4×10−8M)及びCPA(2×10−8M)よりも4桁低い。
Figure 0006889758

フィトシスタチンの安定性
発明者らは、PHYTC57が、良好に特徴付けられた親のフィトシスタチンOSA−IΔD86と比較する場合、より大きい安定性を発揮するかどうかを調査することに興味を持った。これらのフィトシスタチンのサンプルを、沸騰水浴内で、各種の時間インキュベートし、冷却し、ついで、パパインアッセイにおいて、残留阻害活性についてテストした(図4A)。コンセンサスタンパク質PHYTC57(t1/2=17分)は、OSA−IΔD86(t1/2=6分)よりも大きい熱安定性を発揮し、阻害活性は、OSA−IΔD86について58分であるのに対して、PHYTC57については80分でも、なお測定された。
発明者らは、模擬胃液(SGF)消化性アッセイを使用して、OSA−IΔD86及びPHYTC57の安定性をテストした。反応を無効にする前に、新たに調製したSGFにおいて、タンパク質を各種の時間でインキュベートした。ついで、サンプルを2つの方法、すなわち、残留阻害活性を測定するための酵素アッセイ(図4B)及びタンパク質が消化されたかどうかを測定するためのSDS−PAGE(図4C)によって分析した。消化研究ではPHYTC57の増強された安定性が観察されるとともに、酵素アッセイでは、PHYTC57及びOSA−IΔD86は、それぞれ、260秒及び30秒のt1/2値を示した。これらのアッセイデータは、OSA−IΔD86の99%が、インキュベーション後30〜60秒で、模擬胃液中で破壊されたことを示している。PHYTC57については、このレベルの不活性化は2〜5分までには生ぜず、これは、PHYTC57消化条件に耐えられることを証明している。クマシー染色したSDS−PAGEの結果(図4C)(全長のタンパク質を同定する)は、30秒では、極微量のOSA−IΔD86が存在し、一方、PHYTC57については、120秒では、いくらかのタンパク質がなお存在するとのデータを支持している。PHYTC57についてのこれらの結果を確認するため、発明者らは、抗−6Hisタグ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、SGF消化生成物を分析した。図4Dに示されているように、300秒及び420秒間のSGF処理でも、極微量の未変化のPHYTC57が残留するが、タンパク質に大部分は、300秒間のSGF処理によって実際に破壊されたことが明確にされた。仮にPHYTC57をトランスジェニック植物の発現に使用されたとしても、全長のPHYTC57タンパク質の大部分及び全ての阻害活性が、SGF中での10分間のインキュベーション後には失われたとの事実は、PHYTC57は、いかなる偶発的な宿主の消化後であっても、消化プロセスの間に容易に破壊されることを意味している。
考察
タンパク質のデザインに関するコンセンサスアプローチは、天然には存在しない配列を作成する方法を提供するものである。このような配列は、1ファミリーの類似のタンパク質の保存された官能性配列パラメーターを最適化するであろう。ファミリーの構造及び折りたたみに関与する特に重要な残基は、高度に保存されがちである(Lehmann及びWyss 2001;Mainら,2003a;Mainら,2003b;Mainら,2005)(Forrerら,2004)(Steipe 2004)。ファミリーの個々のメンバーの生物学的役割に応じて、官能性残基は保存されるか、又は保存されないであろう。システインプロテアーゼ結合性及び阻害性の形の機能的保存を示すフィトシスタチンの場合には、システインプロテアーゼ活性部位との相互作用に関与する高度の保存された配列モチーフの強化が存在する。従って、コンセンサスアプローチは、一般的な安定性とともに、生物学的機能、システインプロテアーゼ結合性が増強された最適化されたタンパク質を生ずるであろう。
植物は、動物性シスタチン及びステフィンとは異なった特有の特性を有するシスタチンを含有する。特に動物性のシスタチン及びステフィンについては、N末端Gly配列がシステインプロテアーゼの阻害に関して重要であるが、植物性シスタチンについては当てはまらない(Abe,K.ら,(1988) J.Biol.Chem. 263,7655−7659)。さらに、植物性シスタチンは、他のシスタチン又はステフィンには見られない特有の配列
[LVI][AGT][RKE][FY][AS][VI]X[EDQV][HYFQ]N(配列番号81)
を含有する。
パパインによる不動化シスタチンのSPR分析では、PHYTC57が、テストした3つの親のフィトシスタチンよりも、パパインとのタンパク質:タンパク質相互複合体を形成及び維持する点でより効果的であることが明らかにされた。特に、解離速度定数は低減されるが、これは、一旦結合すると、PHYTC57:パパイン複合体は、テストした他のシスタチンによって形成されるものよりも安定であることを示している。動物に由来するシスタチン(ジスルフィド結合を含有する)は、特徴付けられたシスタチン(その効力は、パパインに対して、OSA−Iについて約10nM(Urwinら,1995)から大豆シスタチンについてpM(Koiwaら,2001)までの範囲である)よりも効果的なシスタチンであることが報告されている。発明者らの研究では、PHYTC57が、動物性シスタチンである鶏卵卵白シスタチンよりも、パパインを結合する点でより効果的であることが観察された。さらに、PHYTC57は、模擬消化性アッセイにおけるより大きい安定性とともに、増強された熱安定性を発揮する。
PHYTC57が増強された特性を発揮するとの事実は、PHYTC57がさらに増強されないことを意味するものではない。結合領域を含んでなる保存されたモチーフの強化は、生物学的に最適な結合配列を提供できるが、恐らく、最も効果的であるわけではない。例えば、Koiwaは、大豆シスタチンにおける第3のループ領域の変更は、生成する変異体の効力を増強することを証明している(Koiwaら,2001)。QVVAG領域内の新規な配列が増強された阻害活性を付与するとのレポートがある(Meloら,2003)。トランジェニック植物系における可能性のある用途に関して、更なる安定性の増強が、トランスジェニック生成物が環境内に蓄積されないことを確保する必要性のために有益であるとは考え難い。
発明者らは、ここで、OSA−IΔD86と対比してPHYTC57の相対的な結合効力に焦点を当てた。このイネシスタチン変異体は、作成された第1の増強されたフィトシスタチンであり、トランスジェニック植物の発現及び線虫抵抗性トライアルに至る広範囲の研究に供した(Urwinら,1995;McPhersonら,1997;Urwinら,1997;Urwinら,1998;Urwinら,2000;Urwinら,2001;Urwinら,2003;Lilleyら,2004)。PHYTC57は、OSA−IΔD86から34個のアミノ酸の相違を示した。OSA−IΔD86とPHYTC57との間のこれらアミノ酸の相違の位置の対比を図5(図において、置換は、色分けされており、OSA−Iについての構造モデル(pdbコード1EQK)(Nagataら,2000)上に表されている)に示す。相違は構造足場の全体にわたって分散しており、保存的変化及び非保存的変化の両方を含む。変化の内の6個は負の電荷を持つアミノ酸の導入を伴うことは興味深い。増強された特性に至る最も重大な「コンセンサス」置換を定義し、このようにして、タンパク質の構造−作用の関係についての理解を深めるために、コンセンサスタンパク質を有する個々の親のシスタチン分子の詳細な比較生化学的配列分析及び変異誘発研究を企てた。
PHYTC57の驚くほど顕著な増強された安定性のため、発明者らは、この低分子のコンセンサスタンパク質を新規な足場と考えた。新規な結合作用の選択のためのタンパク質足場は、医療用を含む(Wurch,Pierreら,2012)抗体の代用物としての幅広い用途(Skerra 2007)において有用であることが証明されている。有望な足場として提案される15個のフィブロネクチン又はテネイシンFn3様ドメイン配列からのFn3様コンセンサスタンパク質の開発に関する最近のレポートがある(Jacobs,Diemら,2012)。天然産のFn3ドメイン10は、Koideらによって開発されたよく研究された足場である(Koide,Baileyら,1998;Karatan,Merguerianら,2004;Koide,Gilbrethら,2007)。その増強された熱安定性、低分子であること及びシスタチンの欠如のため、発明者らは、コンセンサスPHYTC57が、新規な人工の結合タンパク質を同定するために標的分子群に対するスクリーニング用の各種のペプチドループライブラリーをディスプレイするための結合タンパク質足場として有用であろうと予測した。
それ故、PHYTC57は、植物線虫のような病原体を標的とする改良されたシステインプロテアーゼ阻害剤として、トランスジェニック植物防御スキームについて、及び新規な結合作用を選択するための足場タンパク質としての開発について有望な利益を提供する。
足場タンパク質ライブラリーの創成、「Adhiron」の機能のスクリーニング及びテスト
序文
発明者らは、上記の57個の植物由来フィトシスタチン(先に「PHYTC57」と名付けたが、以下では、「Adhiron」と称する)のコンセンサス配列に基づいて新規で人工の結合(足場)タンパク質をデザインした。この人工のタンパク質は、ペプチド提示用の良好な足場であるための要件(低分子、単量体性、高溶解性及び高安定性、及びジスルフィド結合及びグリコシル化部位の欠如)の全てを満足する。発明者らは、各ループにおける9つのランダムな位置を有する、ペプチド提示用のAdhiron足場のVVAG及びPWE領域を選択した。
大腸菌において発現されたAdhiron足場の高収率に基づき、発明者らは、2つのループ内のペプチドの変更が、足場のタンパク質発現レベル及び安定性に対して容認できる効力を有すると仮定した。それ故、発明者らの足場は、ファージディスプレイ技術(Smith,1985)によるスクリーニング用の組み換えライブラリーの作成において使用されるものと考えられる。ファージディスプレイの成功は、初期のDNAライブラリーの質(主に、その多様に由来する)に左右される。改良されたライブラリーの多様性は、停止コドン及びシステインの回避とともに、理論的に同レベルの異なったアミノ酸の導入を提供する(Virnekas,Geら,1994;Schumacherら,2007)トリヌクレオチド(トリマー)−合成オリゴ(Kayashin,Korostelevaら,1996)を使用することによって達成される。さらに、トリマー挿入又は欠失は、解読枠突然変異におけるシフトには至らず、これによって、なお機能性タンパク質を潜在的に生成するであろう。従って、発明者らは、ループ−ランダム化オリゴ用に、システインを除く19個の天然産アミノ酸をコードするトリマー混合物を選択した。
発明者らの研究により、Adhironが、治療剤とともに、研究用試薬、診断試薬の作成において重要な役割を果たす高い能力を有することが証明された(創薬)。
Adhiron足場は、いかなる他の非反復足場タンパク質について報告されているものを上回る明らかに高い熱安定性(Tm ca.101℃)を示し、再現性良く組み換えタンパク質を生成するために、原核生物性の発現システムにおいて、高いレベルで発現される。発明者らは、Adhiron内の2つのループ領域で残基を交換するために、ランダム化したアミノ酸配列の挿入に基づきファージディスプレイライブラリーを構築した。ライブラリーは、ファージ生産後全長クローン86%より大とともに、複雑度約3×1010を有しており、ライブラリーの品質が高いことを示す。ライブラリーの効力の証明として、この標的タンパク質に結合できる人工の結合タンパク質(Adhiron)試薬を同定するために、酵母低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)をスクリーニングした。ファージ酵素結合免疫吸収アッセイ(ELISA)によって評価されるように、酵母SUMO(ySUMO)へ結合する20個以上の各Adhironを同定した。DNA配列決定は、大部分が、2つの領域の一方内で、既知のSUMO相互作用的モチーフ(Val/Ile−X−Val/Ile−Val/Ile;ここで、Xは各種のアミノ酸である)との部分的な配列相同性を示すことを指摘した。4つのAdhironコード領域をベクターpET11にサブクローン化し、組み換えタンパク質を発現し、精製し、ELISAでテストし、ウエスタンブロット分析した。4つのAdhironは、ySUMOについて低ナノモル親和性を有しており、低レベルのヒトSUMO1への結合性とともに、ySUMOに対する高い特異性を示した。さらに、発明者らは、多数の他の標的、すなわち、繊維芽細胞増殖因子(FGF1)、血小板内皮細胞接着分子(PECAM−1)(表面抗原分類31(CD31)としても知られている)、及びビオチンヘのチオール結合用のN末端にシステインを有するアミノ酸10個のペプチド(Cys−Thr−His−Asp−Leu−Tyr−Met−Ile−Met−Arg−Glu)に対するAdhironライブラリーをスクリーニングし、ファージELISAによって確認されるように、これらの標的に対してAdhironを同定した。従って、発明者らは、ランダム化ペプチドループをディスプレイできる、多様性で、高度に安定性で且つ良好に発現される足場タンパク質(Adhironと名付けた)を開発し、多岐の分野における用途のために一定範囲の標的に対するAdhironライブラリーから高度に特異的で、高度に親和結合性の試薬を選択する可能性を証明した。
材料及び方法
Adhironライブラリーの構築
57個のフィトシスタチン配列のアライメントに由来するコンセンサス配列を上記のように同定し、大腸菌での発現用にデザインしたコドン修飾遺伝子を合成した(GenScript)。Adhiron足場コード領域及びAdhironライブラリーコード領域を、Nhel制限部位とNotI制限部位との間でクローン化して、ファージミドpBSTG1(pHEN1(Hoogenboom,Griffithsら,1991)に由来し、DsbAシグナルペプチドも含有するpDHisIIの誘導体である)において、バクテリオファージM13のジーンIIIの3’末端ハーフを有する融合コード領域を作成した(pBSTG1−DsaA−Adhiron)。2つのPCR生成物(Hortin,Caiら,1990)のスプライスオーバーラップエクステンション(SOE)によってライブラリーを構築し、全てのプライマーをElla Biotechによって合成した。
第1のPCR生成物は、DsbAコード配列から第1の挿入されたループまで伸びており、プライマー:
順方向プライマー 5’−TCTGGCGTTTTCTGCGTC −3’(配列番号21)、
逆方向プライマー 5’−CTGTTCTTTCGCTTTAACAAC−3’ (配列番号22)。
によって作成された。
第2のPCR生成物は、下記のプライマーを使用することによって、ループ1及びループ2において、足場タンパク質にアミノ酸9個の領域2個を導入した。クローニングに使用したPstI部位に下線を付している。
順方向ループ
5’GTTGTTAAAGCGAAAGAACAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACCATGTACCACTTGACCCTG−3’(配列番号23)、
逆方向ループ
5’CTGCGGAACTCCTGCAGTTCTTTGAAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAACCCAAACTTTCGCTTCG−3’(配列番号24)。
変性位置(NNN)を、システインを除く19個のアミノ酸の各々のシングルコドンを表すトリマーとして導入し、停止コドンはない。移行性のリードスルーがAdhiron−切り詰めpIII融合タンパク質を創成するために、インフレームアンバー停止コドンを含有するファージミドベクターpBSTG1へのクローニングを容易にするためにNheI(前方)制限部位及びPstI制限部位(後方)を導入するように、プライマーをデザインした。
Phusionハイフィデリティーポリメラーゼ(NEB)を使用して、98℃において5分間、続いて、98℃に10秒間、56℃に15秒間、72℃に15秒間のサイクル20回、続いて、さらに72℃に5分間に供してPCRを行った。PCR生成物を、ゲル抽出(Qiagen)によって精製し、上述のプロトコルを使用する10サイクルでのSOEingのために使用した。PCR生成物をNheI及びPstIによって消化し、ゲル抽出し、ついで、NheI及びPstIにて消化してAdhironのDsbAシグナル配列及びC末端コード領域を残したpBSTG1−Adhironファージミドにクローン化して、DNA系Adhironライブラリーを作成した。連結したライブラリー生成物を大腸菌ER2738エレクトロコンピテント細胞(Lucigen)に導入するために、電気穿孔を使用した。ER2738の合計20mlを、ライブラリーDNA50ng/ER2738細胞50μlで電気穿孔した。細胞を2TY培地において1時間回復させ、ついで、2TY培地2lにおいて、37℃、225rpmで、OD6000.6まで生育した。1M13KO7ヘルパーファージ(NEB)1μl(1014/ml)を添加し、90rpmで震盪しながら、1時間、感染させ、ついで、培養物を、カナマイシン(50μg/ml)の存在下で、25℃において一夜でファージ粒子を生成した。ファージを6%ポリエチレングリコール8000及び0.3M NaClにて沈殿させ、保存のため、50%グリセリンに懸濁化させた。ライブラリーのサイズは、最小ベクターオンリーバックグラウンドにて、〜3×1010であることが測定された。
標的の調製及びファージディスプレイ
下記のプロトコルは酵母SUMOについて記載したものであるが、同じプロトコルを他の標的のスクリーニングに使用した。IPTG誘導を使用して、酵母SUMO(ySUMO)タンパク質をBL21(DE3)細胞において発現し、製造者の説明によるNi−NTA樹脂(Qiagen)親和性クロマトグラフィーによって精製した。SDS−PAGEによって純度を確認した。製造者の説明に従って、EZリンクNHS−SS−ビオチン(Pierce)を使用して、酵母SUMOをビオチン化した。免疫96Microwell(商標)Nunc MaxiSorp(商標)(Nunc)プレートに吸収されたySUMO上のビオチンを検出するために、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)に抱合したストレプトアビジンを使用して、ビオチン化を確認した。ファージディスプレイライブラリーのバイオパニングを下記のようにして実施した。
ファージミドライブラリー(1012ファージミド粒子を含有する)5μlを、リン酸塩緩衝食塩水95μl、0.1%Tween−20(PBST)と混合し、高結合容量ストレプトアビジン被覆細胞(Pierce)において、計1時間で、3回プレ−パニングした。プレ−パニングしたファージを、振動するプラットフォームにおいて、2.5時間で添加する前に、速度を3に設定したHeidolph VIBRAMAX 100上で振動しながら、100nMビオチン化ySUMO100μlをパニングウェルに1時間で添加した。パニングウェルを、プレート洗浄機(Tecan Hydrofix)を使用して、PBST300μl中で10回洗浄し、50mMグリシン−HCl(pH2.2)100μlで10分間溶離し、1M Tris−HCl(pH9.1)で中和し、さらに、100mMトリエチルアミン100μlで6分間溶離し、1M Tris−HCl(pH7)50μlで中和した。溶離されたファージを、指数増殖期のER2738細胞(OD600=0.6)とともに、37℃及び90rpmにおいて1時間インキュベートした。カルベニシリン100μg/mlを補足したLysogeny Broth寒天プレート上に細胞を置き、室温において一夜生育させた。翌日、コロニーを2TY培地5mlにスクレープし、カルベニシリン(100μg/ml)を補足した2TY培地25mlに接種してOD6000.2とし、37℃、225rpmで1時間インキュベートし、ca.1×10 M13KOヘルパーファージを感染させた。90rpmでの1時間のインキュベーションの後、カナマイシン25μg/mlを添加し、25℃、170rpmで細胞を一夜インキュベートし、6%ポリエチレングリコール8000、0.3M NaClにてファージを沈殿させ、10mM Tris,pH8.0,1mM EDTA(TE緩衝液)1ml中に再懸濁した。このファージ懸濁液2μlを、選択の第2ラウンドに使用した。ストレプトアビジン磁気ビーズ(Invitrogen)を使用して、この回のファージディスプレイを行った。固定速度ローテーターStuart SB2上で、洗浄したビーズ10μlとともにファージを1時間プレ−パニングし、同じローテーター上において、ビーズ10μlを、100nMビオチン化ySUMO100μlにて4時間ラベル化した。プレ−パニングしたファージを1時間で添加する前に、酵母SUMOにてラベル化したベースを、PBST中で3回洗浄した。各洗浄後に溶液からビーズを分離するために磁石を使用して、ビーズをPBST中で5回洗浄し、ついで、上記のようにして、溶離し及び増幅した。第1のパニングラウンドについて既に記載したようにして、ニュートラビジン高結合容量プレート(Pierce)を使用して、最後のパニングを行い、ただし、この回では、ER2738細胞の感染前に、100mMジチオトレイトール(DTT)100μlを使用して、振動プラットフォーム上で、ファージを20分間溶離した。標的ウェルにおける増幅のレベルを測定するために、標的タンパク質を含有するウェル及びコントロールウェルからファージを回収した。
ファージELISA
最終パニングからの個々のER2738コロニーを採取し、96ディープウェルプレートにおいて、カルベニシリン100μg/mlを含む2TY100μl中、37℃(900rpm)で6時間生育した。培養物25μlを、カルベニシリンを含有する2TY200μlに1時間で添加した。M13K07ヘルパーファージ(1011/ml)10μlを添加し、続いて、カナマイシン25μg/mlを添加し、細菌を25℃(450rpm)で一夜生育した。ストレプトアビジン被覆プレート(Pierce)を、2×カゼインブロッキング緩衝液(Sigma)にて、37℃で一夜ブロックした。翌日、プレートをビオチン化ySUMO0.4nMにて1時間ラベル化し、3000rpm、5分間の遠心分離によって細菌を集め、ビオチン化酵母SUMOを収容するウェル及びビオチン化リンカーを収容するウェルに、ファージを含有する成長培地45μlを添加し、1時間インキュベートした。Tecan Hydroflexプレート洗浄機を使用して、PBST300μl中で3回ウェルを洗浄し、HRP−抱合抗−ファージ抗体(Seramun)の1:1000希釈液を1時間で添加した。ウェルをPBST300μl中で10回洗浄し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質(Seramun)にて結合を可視化し、560nmにて測定した。
Adhironタンパク質の生産
酵母SUMOに結合したAdhironのDNAコード配列をPCRによって増幅し、生成物をNheI及びPstIにて制限消化し、Adhiron足場を含有するpET11aにクローン化し、同じ制限部位で消化した。コロニーを採取し、LB培地5ml中、37℃、225rpmで一夜生育し、プラスミドDNAをミニプレップとして精製し(Qiagen)、正しい挿入物が存在することを確認するため配列決定した。熱ショックによって、プラスミドをBL21(DE3)細胞に形質転換し、コロニーを37℃において一夜生育した。翌日、培養物をLB培地400mlに添加し、250rpm、37℃においてOD6000.6まで生育し、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1mMまで添加した。細胞を、さらに6時間生育し、3000gでの遠心分離によって採取し、1×Bugbuster(Novagen)25ml中に再懸濁した。製造者の説明に従って、Benzonaseを添加し、懸濁液を室温において20分間混合し、50℃に20分間加熱し、9400gで20分間遠心分離した。透明な上澄みを、Ni−NTA樹脂のスラリー500μlと1時間混合し、洗浄緩衝液(50mM PBS、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)30ml中で3回洗浄し、溶離緩衝液(50mM PBS、500mM NaCl、300mMイミダゾール、pH7.4)1ml中で溶離し、ELISA及びウエスタンブロットでの使用のため、製造者の説明に従って、NHS SS−ビオチン(Pierce)を使用して、SUMO結合Adhiron(Ad−ySUMO)100μgをビオチン化した。
ELISA分析
PBST中の標的タンパク質5ng(他の表示しない限り)を、免疫96Microwell(商標)Nunc MaxiSorp(商標)(Nunc)プレートのウェルに、4℃において一夜吸収させた。翌日、3×ブロッキング緩衝液200μlをウェルに添加し、振動させることなく37℃において4時間インキュベートした。100μg/mlのビオチン化酵母SUMOを、2×ブロッキング緩衝液を含有するPBST中で1:1000希釈し、アリコート50μlを、標的ウェルにおいて、振動しながら、1時間インキュベートした。ウェルを、PBST300μl中で3回洗浄し、PBST50μl中で1:1000希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)に抱合したストレプトアビジンをウェルに1時間で添加した。ウェルをPBST300μl中で6回洗浄し、TBM液体基質50μlにて結合を可視化し、吸光度を560nmで測定した。
ウエスタンブロット分析
標的タンパク質又はHEK293細胞可溶化物と混合した標的タンパク質(20μg)を、添加緩衝液(Laemmi,60mM Tris−Cl pH6.8、2%SDS、10%グリセリン、5%β−メルカプトエタノール、0.01%ブロモフェノールブルー)と混合し、3分間沸騰させ、15,000×gで1分間遠心分離し、ついで、15%SDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。タンパク質を、PVDF膜(Amersham Biosciences)に、4ワットにおいて45分間で転写し、ブロッキング緩衝液(PBS中5%BSA 0.1%Tween)中で1時間インキュベートし、続いて、ySUMO(100μg/ml、希釈1:1000PBST)との1時間のインキュベーションに供した。ストレプトアビジン抱合HRP及び蛍光発光法を使用して、結合したAd−ySUMOを検出した。
タンパク質−タンパク質相互作用親和性の測定
製造者の説明に従って、ビオチン化Ad−ySUMOバインダーの結合の親和性を見積もるために、BLitz(商標)(ForteBio)ディップ及び解読ストレプトアビジンバイオセンサーを使用した。要するに、異なったySUMO濃度における少なくとも4つの読み使用して、各Ad−ySUMOの親和性を測定した。各Ad−ySUMOの親和性を算定するために、包括的なフィットを使用した。これらの読みは、Biacore表面プラズモン共鳴装置を使用して行った親和性の測定値に匹敵するものであった。
結果
Adhironのデザイン及びファージディスプレイ
本来、Adhiron遺伝子は、より強力なプロテアーゼ阻害剤を創成するようにデザインされたが、その分子認識用の拘束されたペプチド領域を提供するための足場タンパク質としての可能性のため(図6A)、発明者らは、足場のようなその用途を調査することを決定した。遺伝子配列は、大腸菌発現システムにおける発現を増強するように最適化したコドンであった(図6B)。アンバー停止コドンのトランスレーショナルなリードスルーにより、ER2738細胞のような非サプレッサー細胞において発現される際に、Adhiron−切り詰めpIII融合タンパク質が生産されるようにするが、JM83のようなサプレッサー細胞中でのみAdhironの生産が可能になるように、遺伝子のpBSTG1へのクローニングを容易にするために制限部位を導入した。Adhiron pIII融合タンパク質はファージミドベクターpBSTG1から発現されるが、一方、ファージミドDNAのM13ファージ粒子への複製及びパッケージングを可能にする他の成分を、M13KO7ヘルパーファージを使用して導入した。Adhiron−pIII融合タンパク質の発現を、抗−pIII抗体を使用するウエスタンブロットによって確認した。Adhiron足場の熱安定性を示差走査熱量測定によってテストしたところ、融解温度101℃を示した(図7A)。円二色法を使用して、コンセンサス配列の構造統合性を試験したところ、高いβシート/αへリックスの比及びランダムコイルを示した(図7B)
ついで、発明者らは、示差走査熱量測定によるAdhiron足場の熱安定性(図8A)を、代表的な、低分子で、可溶性の良好に特徴付けられたタンパク質であるリゾチーム(図8B)と比較したところ、リゾチームがAdhironよりも有意に安定性が劣る(Tm ca.65℃)ことを示した。ついで、発明者らは、myc抗体に結合するように選択したAdhironをテストしたところ、ループの足場への付加は、Tmを85℃に低下させるが、これは、たいていの足場タンパク質よりもなお高い融解温度を表している。このAdhiron足場が、一連のスキャンによって示されるように(図8C)、変性及び復元の繰り返しのサイクルを受けることができる。
ライブラリーのデザイン
分子認識に適するペプチドコード配列の導入は、Adhironの構造内における予測したループの位置(図6)によって案内される。ループ1は、第1及び第2のβストランドの間に位置し、ループ2は、第3及び第4のβストランドの間に位置する。6個のランダムアミノ酸(システインを除く)を含んでなる配列を両ループの位置に導入して、それぞれ、ループ1及びループ2における4個及び3個のアミノ酸を置き換える。これらループ領域の伸展がAdhironの構造を破壊するかどうかを測定するため、ループ挿入物を有する3個の個々のAdhironを単離し、発現させ、円二色法によって検討した(図7B)。3個のクローンの全てがβ構造の高割合を維持しており、1個のクローンは、おそらく新規なループ領域へのβストランドの伸展を表示するβ構造含量の増加を示した。これは、ループの挿入が足場の構造に影響を及ぼさないことを証明するものでる。発明者らは、複雑度約3×1010のファージディスプレイライブラリーを作成した。アミノ酸組成をチェックするため、ライブラリーを感染させたER2738細胞から96個のクローンを単離した。発明者らは、アミノ酸組成におけるいかなるバイアス又はファージの産生の間に導入された他の望ましくないコンセンサスを測定するために、ファージクローンの配列を検討した(図7C)。アミノ酸の分布にはバイアスは観察されなかった。86.5%のクローンは全長の変異体であり、クローンの3.1%は、挿入物を持たないAdhiron足場であり、クローンの10.4%はフレームのシフトを示し、おそらくライブラリーにおいては価値のないものであろう。ファージゲノムのレベルにおける全長コード配列のこの非常に高い割合は、作成されたライブラリーが高品質であることを証明している。
ライブラリーのスクリーニング
標的として酵母SUMOを使用して、初めにライブラリーのスクリーニングを実施した。アビジン結合タンパクを介するタンパク質の不動化を可能にし、標的がプラスチック表面又は粒子表面に直接吸着される(時には、標的タンパク質の変性につながることがある)ことがないようにするために、酵母SUMOをビオチン化した。これは、標的タンパク質が、線形又は立体構造のいずれかのエピトープを認識する結合タンパク質の選択を可能にする三次元構造を維持することを保証する。パニングラウンド3によるサンプルコントロールと比べて、コロニーの回復において1000倍を超える増幅が観察された。24個のクローンを単離し、それらのSUMO標的への結合能力を、ファージELISAによって確認した(図9)。テストした全てのクローンが、酵母SUMOへの強い結合を示したが、Adhironの特異性を示すコントロールウェルへの結合は、ほとんど認められないか、全く認められなかった。クローンを配列決定したところ、22個の別個のAdhironが同定され、これらクローンにおけるループ領域の配列を表4に示す。
Figure 0006889758

クローン4及び5は同一であり、クローン16及び22も同一である。興味深いことには、クローン21及び22とともに、クローン15及び23は、ループ1において同じアミノ酸配列を含有するが、ループ2では、異なった配列を含有する。この配列の変化は、さらに、ライブラリーの複雑な性質を支持する。配列の分析により、クローンの12におけるLOOP1の位置1〜4におけるIDLTの一般的に生ずる配列が同定されたが、この配列が、ySUMO上の少なくとも1つのエピトープへの結合において重要なモチーフであることを示している。また、9個の別個のクローンにおける第2ループの位置1にはP又はGが生じ、他の6個のクローンにおける残基2〜6内の位置でP又はGが生じているが、これは、結合には、いくつかの構造的特徴が重要であることを示している。興味深いことには、IDLTモチーフは、MEF2 E3リガーゼ PIASx(VDVIDLT(配列番号73)のヒトSUMO1結合部位(Song,Durrinら,2004;Song,Zhngら,2005)に類似している。さらに特徴付けるために、4つのクローンを選択した(クローン15及び22(このループ1配列が1回以上生じているため)、クローン20(IDLTモチーフを含有するため)及びクローン10(ループ1に別個のモチーフを含有するため))。
Adhiron−ySUMO(Ad−ySUMO)タンパク質の特徴付け
Adhiron足場の高い熱安定性のため(図7A)、発明者らは、精製を援助するためには、発現されたAdhironの完全性に影響を及ぼすことなく、大腸菌タンパク質の大部分を熱変性し且つ沈殿させることができなければならないと予測した。これをテストするため、発明者らは、可溶化物を、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃及び100℃において20分間加熱し、遠心分離して、変性したタンパク質をペレット化し、上澄みをSDS−PAGEによって分析した(図10A)。可溶化物の加熱は、上澄みにおける細菌タンパク質の量を劇的に低減させたが、Adhironのレベルを有意に低減させなかった。細菌タンパク質の大部分を沈殿させるには温度50℃が適しており、特性研究ではこれを採用した。図9Bは、精製したAd−ySUMOが、バッチ式金属親和性精製法を使用することにより、高い純度を示すこと、及びクローン10のようないくつかのケースでは、潜在的には、この精製の間に使用される樹脂の限られた量のために、タンパク質の大部分は単離されないことを示す。発現されたタンパク質の見積もりレベルは約100mg/Lであった。BLitz(商標)(ForteBio)Dip及びReadバイオセンサーを使用することによって、Adhironの親和性を推定した。親和性は、Ad−ySUMO10、15、20及び22について、それぞれ、11.5、2.4、14.2及び9.0nMであった。これらの値は、良好な抗体についてふつうにみられる親和性と一致している。
さらに、研究試薬としてのAdhironの使用を評価するため、Ad−ySUMOをビオチン化し、ELISA(図10C)及びウエスタンブロット分析(図10D)において使用した。Ad−ySUMOは酵母SUMOに結合するが、ヒトSUMO1には結合しなかった(SUMO1ウエスタンブロットに関しては、データは示されていない)(n=3)。試薬との特異性を測定するため、酵母SUMOをHEK293細胞可溶化物と混合した。興味深いことには、ウエスタンブロット(n=3)によれば、Ad−ySUMO10及び15は、酵母SUMOへの特別な結合を示したが、他のタンパク質へは結合せず、Ad−ySUMO20及び22は、可溶化物中の多くのタンパク質と結合した。
スクリーニングのさらに他の具体例
一定範囲の標的に結合できる特殊な試薬を同定するAdhironライブラリーの能力をさらに評価するため、発明者らは、成長因子(FGF1)、レセプター(CD31)、及びペプチド配列に対してスクリーニングした。興味深いことには、FGF1及びCD31についてテストしたクローンの大部分は特殊な結合を示し、一方、ペプチドのスクリーニングからは、わずかに3つのクローンが特殊な結合を示した。挿入されたペプチドに対する更なるパニングラウンドは、バックグラウンドに対するヒットの割合を増大させ、これにより、選んだクローンの80%が標的への結合を示した。この結果は、タンパク質のより大きい、及び従って潜在的に多数のエピトープ部位と比べて、ペプチドの適切なエピトープ提示の小さいサイズ及び限られた見込みのため、予期しないものである。
発現されたAdhironがそれらの標的に結合することを確認するため、発明者らは、Bitz(商標)を使用して、CD31及びペプチド標的の両方について、3つの別個の組み換えAdhironを分析した。Adhironを発現させ、可溶性タンパク質として精製した。CD31Adhironに関するK値は、8.5×10−8〜6.8×10−9Mであり、一方、ペプチドに関するK値は、3.3×10−8〜3.5×10−8であった。
さらに、図25に示すように、発明者らは、有機分子であるポサコナゾールに結合するAdhironを同定した。
Adhironの結晶構造
図17は、FcgRIIIaレセプタードメインと複合したAdhironの結晶構造を示す。これは、4つのβストランド及びαへリックスの重要な構造的要素を示すAdhironの3D構造を表している。構造は、他のシスタチン(例えば、ステフィンAを含む)のX線構造について見られるよりも、よりコンパクトな性質及び見かけ上少ないねじれ構造の点で、予期しないものである。β構造がループ領域内に変動する度合いまで進展することは興味深い。
少なくともいくつかの標的のための結合分子の選択について2つのランダム化されたループをディスプレイすることが重要であることは、この構造において、両ループとレセプタータンパク質との密接な相互作用によって強調される。これらのループは、下記に詳述するLOOP1及びLOOP2に相当する。
考察
発明者らは、植物シスタチンタンパク質(Adhironと名付けられている)のコンセンサスデザインに基づき、Tm101℃を有する極めて高い熱安定性をディスプレイする新規の足場タンパク質を開発した。この足場を使用して、2つの9アミノ酸の可変性領域の導入によってライブラリーを作成した。これらの可変性の配列はオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドにおいて、可変性の位置は、各アミノ酸(システインを除く)用のシングルコドンを含んでなるトリマーのサブセットである)によってコードされる。この結果、各アミノ酸は、ライブラリー内において、非常に類似して分散している。ライブラリーは、クローンの86.5%が全長の変異体クローンであり、非常に高い品質である。
ライブラリーを、繊維状ファージ表示フォーマットにおいて、切り詰めgp3融合物として形成し、各種の標的タンパク質に対してスクリーニングした。酵母SUMOに対するスクリーニングによって同定されたAdhironの分析により、それらの可変の領域に別個の配列を有する多数のタンパク質が明らかにされた。いくつかのケースでは、SUMOの同じ位置への結合を意味する類似があり、一方、他のクローンは配列保存を示さない。全てのクローンがySUMOに結合し、一定範囲のコントロールタンパク質(特異性を示す)には結合しない。発明者らは、また、成長因子(ヒトFGF1)、CD31からのヒトレセプタータンパク質ドメイン、ペプチド及び有機化合物に特異的に結合するAdhironを同定した。広範囲のタンパク質とともに、有機化合物に対するバインダーを選択する能力は、多数の足場が、特別なクラスの標的分子を好む構造的特徴を有するため、重要な知見である。
内在性の大腸菌宿主タンパク質の多くを変性し、このようにして、Adhironの親和性精製の効力を増強する、50℃における温度工程を含めることによって、従来法でAdhironを精製した。ヒトFcgRIIIレセプターに結合するAdhironの複合体のX線構造は、複合体についてだけでなく、Adhironタンパク質についての有用な情報を提供し、CDデータを支持するよりコンパクトで且つ大きいβ構造を明らかにする。足場のコンパクトな性質(他の構造のステフィン又はシスタチンにおいて見られるものよりもさらに明白である)は、その高い熱安定性に寄与するものと思われる。X線構造によって明らかにされた相互作用の界面は、両ループ領域がレセプタードメインとの相互作用に関与することを示している。
一定範囲のタンパク質に対するスクリーニングに関する発明者らの頑強で且つ効果的な戦略と組み合わされた、この高度に安定であり、低分子であり、且つ容易に精製される足場に基づく良好且つ高品質のライブラリーの実証は、発明者らのAdhironライブラリーを、広い範囲の科学、医薬及び商業的用途のための試薬の開発のための貴重で且つ新規な資源にする。
Adhironの変異体
Adhiron足場の変異体を作成した。配列番号1及び図6に示された配列は、調査した最短バージョンのAdhiron用であり、リンカー及びHisのような更なる機能性配列又は他の配列の付加以前に、長さ内に81個の残基を含んでなる。しかし、2つのより長い足場タンパク質(配列番号2及び3)も生成されたが、それぞれは、特定の環境では望ましいであろう。足場からの更なる欠失も可能であるが、配列番号1又はその変異体は、足場タンパク質の安定性が過度に損なわれることなく、最適な最小長さに近いものであると考えられる。
全長「Adhiron92(92aa)」は、下記の配列(足場配列(配列番号3)+リンカー及びHisタグ(下線で示す)からなる)を有する。
ATGVRAVPGN ENSLEIEELA RFAVDEHNKK ENALLEFVRV VKAKEQVVAG TMYYLTLEAK DGGKKKLYEA KVWVKPWENF KELQEFKPVG DA AAAHHHHHH(配列番号74)
短い「Adhiron84(84aa)」は、下記の配列(足場配列(配列番号2)+リンカー及びHisタグ(下線で示す)からなる)を有する。
GNENSLEIEE LARFAVDEHN KKENALLEFV RVVKAKEQVV AGTMYYLTLE AKDGGKKKLY EAKVWVKPWE NFKELQEFKP VGDA AAAHHHHHH(配列番号75)
最短の「Adhiron81(81aa)」(図6に示している)は、下記の配列(足場配列(配列番号1)+リンカー及びHisタグ(下線で示す)からなる)を有する。
NSLEIEELAR FAVDEHNKKE NALLEFVRVV KAKEQVVAGT MYYLTLEAKD GGKKKLYEAK VWVKPWENFK ELQEFKPVGD A AAAHHHHHH(配列番号76)
下線を付した配列は、追加の3Alaリンカー及び6His検出/精製タグを含んでなる。このタグは、足場自体の部分ではなく、明白な理由よるタンパク質への有用な付加である。
ライブラリー用のAdhironの特殊な具体例
足場タンパク質ライブラリー、すなわち、各種のペプチドが足場に挿入されているライブラリーの調製に有用であるAdhiron配列の例は以下のとおりである。
Adhiron92(示された配列は、追加のMet、リンカー及びタグを含む)
Figure 0006889758
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−アミノ酸残基2〜4(太字のイタリック書体で示す)にN末端が配置され、好適にはこれらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。
−LOOP1は、アミノ酸残基47〜50(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基76〜78(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
Adhiron84(示された配列は、追加のMet、リンカー及びタグを含む)
Figure 0006889758
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−AdhironのN末端(すなわち、上に示すように、メチオニン残基と第1のグリシンとの間)に、N末端ペプチド配列が付加されることができ、この付加物は、代表的には3〜約20個のアミノ酸である。
−LOOP1は、アミノ酸残基39〜42(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基68〜70(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
Adhiron81(Metを除く)
Figure 0006889758
下記の修飾の1又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基(太字で示す)がN末端に付加されている。
−AdhironのN末端にN末端ループが付加されることができ、この付加物は、代表的には3〜約20個のアミノ酸である。
−LOOP1は、アミノ酸残基36〜39(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの4個のアミノ酸は、代表的には4〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−LOOP2は、アミノ酸残基65〜67(N末端metを除くように番号が付けられている)に配置されており(太字のイタリック書体で示す)、好適には、これらの3個のアミノ酸は、代表的には3〜約20個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸5〜13個のループ長が好ましく、アミノ酸9個のループ長が最適と考えられる。
−C末端リンカー及びHisタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
このように、Adhiron92を例にとれば、ディスプレイシステムでの使用に特に好適な足場タンパク質は、下記の型を取ることができる。
Figure 0006889758

一般に、LOOP1及びLOOP2は、結晶構造(図17)によって支持されるように、標的結合において最も重要である。本発明の特定の具体例では、LOOP1及びLOOP2の一方のみがペプチド配列によって置き換えられるが、一般的には、両方が置き換えられることが好ましい。N末端は、LOOP1及びLOOP2ほど重要ではないため、調査されていないが、多くの状況では、N末端において好適なペプチドを挿入することにより、結合親和性及び特異性が改善される。
図20〜24は、それぞれ、LOX1、HGH、酵母SUMO、PBP2及びペプチドに結合するいくつかのAdhironのLOOP1領域及びLOOP2領域を示している。
さらに、図27及び28は、Grb2及びSTAT3に結合するいくつかのAdhironのLOOP1領域及びLOOP2領域を示している。
存在するアミノ酸を除去することなく、任意に、ペプチドをループ領域に挿入ができることも注目されなければならないが、これは一般的にはあまり好ましくない。
Adhironの広い有用性の他の例
免疫蛍光法:
実施例−ウイルスタンパク質を検出するための試薬
多年にわたる繰り返された試みにもかかわらず、ヒトパピローマウイルスE5タンパク質を同定する抗体を産生することが可能であることは証明されていない(質量分析による上皮細胞株におけるヒトパピローマウイルスタイプ16E5腫瘍性タンパク質レベルの定量測定,Sahabら,J Virol.2012 Sep;86(17):9465−73;Werherill,LF, Ross,R及びMacdonald,A (2012),HPV E5:謎の腫瘍性タンパク質,小さいDNA腫瘍ウイルス,K.Gaston編,Caister Academic Press,pp55−70)。
Adhironシステムの有用性が、標的として、E5タンパク質の領域と同一性を有するペプチドを使用することによって、HPV16E5ウイルスタンパク質に対してAdhironが産生されるとの実施例によって証明された。E5 Adhironをビオチン化し、過剰発現された細胞におけるE5タンパク質を検出するために、免疫蛍光法において使用した。Adhironは、他のHPV血清型とは交差反応しない。さらに、E5 AdhironをQuantum Dotsに抱合させ、ヒトサンプルにおけるE5タンパク質を検出するために使用した。Quantum Dotsへの抱合は、試薬の感度を増大させた。図12参照。HPV16E5GFP(標的)及びAdhironのためのエピトープなしのHPV16E5GFP(コントロール)を、哺乳類の細胞において発現させた。Adhiron E5をQuantum Dotsに抱合させ、哺乳類の細胞中のE5タンパク質を検出するために使用した。細胞を、DAPI(DNA染料)、GFP、及びE5(Adhiron−Quantum Dotsとともに)にて染色した。Adhironのみが、E5タンパク質に対する当異性を示す標的に結合した。
タンパク質の阻害及び修飾−タンパク質の相互作用
実施例1(SUMOへの結合を阻害する試薬)
ヒトSUMO2(hSUMO2)に特異的且つ差次的に結合できる抗体は存在しなかった。hSUMO2に対してAdhironが産生され、ヒトSUMO1よりもむしろSUMO2に特異的に結合する複数のAdhironが同定された。図13は、hSUMO2 Adhironが、hSUMO2に結合し及びRNF4(ポリSUMO特異性E3ユビキチンリガーゼ)がhSUMO2と結合することを阻害することによるタンパク質−タンパク質相互作用についての機能的効果を有することを証明するものである。hSUMO2 Adhironは、他のタンパク質のユビキチン化に影響を及ぼすことなく、前記の効果を有する。ATPの存在下では、通常、hSUMO2は、標的タンパク質のユビキチンを生ずるRNF4と結合する(レーン2におけるゲルの頂部における黒のスメア)。増大された濃度のAdhironの存在下では(レーン3〜9)、ユビキチンのレベルは減少する。
実施例2(フィブリン血栓を変化させ、溶解する試薬)
血栓の形成を変化させ、溶解させることができるAdhironを同定するためにフィブリノーゲンをスクリーニングした。血漿サンプルにおいてこのプロセスを変性する多数のAdhironが同定された。図14のグラフは、血栓の形成及び溶解濁度アッセイを表す。黒のラインは、血栓の形成及び溶解の正常な経時経過を示す。グレーのラインは、このプロセスに対する異なった5種類のAdhironの効果を表す。コントロールの非フィブリノーゲン結合Adhironは、このアッセイにおいて効果を示さない。Adhironの効果としては、減少された血栓の形成、増大された溶解時間、及び増大された凝固時間が含まれる。これは、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害することによってタンパク質の機能を調節するAdhironの能力を証明するものである。図15は、フィブリノーゲン結合Adhiron及びコントロールAdhironの存在下における血栓の形成後のFITC蛍光ラベル化フィブリノーゲンの共焦点像を示す。
哺乳類の細胞におけるAdhironの発現:
実施例1に記載のように、ヒトSUMO2に対してAdhironを産生し、pcDNA3.1哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類HEK293細胞において発現させた。Adhironを、FLAGタグ及び核移行シグナルと融合させた。コントロール細胞(Adhironを発現しない)及びヒトSUMO2特異性Adhironを発現する細胞をヒ素(As)にて2時間処理し、ついで、洗浄し、12時間及び24時間回復させた。ヒ素は前骨髄球性白血病(PML)タンパク粒を増大させるが、SUMOはこれらの粒の分解を制御する。Adhironを同定するため、及びPML(核内構造体の形成体)のために、抗−FLAG抗体を使用して、細胞を染色した。ヒトSUMO2 Adhironは、PMLの分解を変化させ、結果として、これらの粒を増大させる。これは、哺乳類の細胞において機能性Adhironを発現させる能力を証明するものである。結果を図16に示す。
タンパク質における新薬の開発につながるような部位を同定するための共結晶化法及び他の構造生物学的方法:
図17は、FcgRIIIa(グレー)及び結合したAdhiron(白)の共結晶構造を示す。FcgRIIIaに結合したAdhironを同定し、ついで、IgG結合を阻害することを示すために、細胞−及びSPR−系アッセイを含む一定範囲のアッセイにおいて使用した。ついで、Adhironを共結晶化し、構造を解明した(上の図)。これは、FcgRIIIaにおける新薬の開発につながるような部位(アロステリック部位を含む)を同定するものであった。AdhironはNMR研究にも適するものであり、一例として、図18は、抗−酵母SUMO Adhiron及びAdhiron−酵母SUMO複合体の1H−15N HSQCスペクトルを示す。Adhironについての構造データを迅速に集めることができることは、潜在的な医薬結合部位を同定することを含む多くの用途を有するであろう。
ポイントオブケア装置の開発のための電子デバイスへの組み込み:
ヒトSUMO2 Adhiron(実施例1に記載)のコード配列の部位特異的変異誘発は、オリゴヒスチジンタグのC末端におけるシステインの導入を許容する。これにより、Adhironの電子装置への方向性の不動化が可能になり、その結果、分子認識ループが分析物へアクセス可能になる。標的タンパク質が、装置上において、Adhironに結合する際、インピーダンスにおける変化を測定できる。変化は濃度依存性であり(図19に示すように)、Adhironの効果的な表示及びバイオセンサーの用途ためのプラットフォームとして電子デバイスに生産的に組み込まれるAdhironの能力を証明している。
このプロトコルを、他のAdhiron(このケースでは、ヒトフィブリノーゲンAdhiron)についても実施した。この試験の結果を図26に示す。この場合にも、濃度依存性の変化が観察され、これは、アトモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲にわたって証明された。
一定範囲の標的に結合するAdhironが同定された:
Adhironライブラリーを使用して、この明細書に記載するディスプレイ方法論を使用することによる一定範囲の標的分子に対してスクリーニングした。表5は、Adhironが産生された標的の例を示す。これらは、タンパク質及び小分子を含む。これら標的に対して産生されたAdhironは高い親和性及び特異性を示す。これは、Adhironが多用途の足場分子を提供すること及びこの足場を使用して構築されるライブラリーが、広範囲の標的分子に結合できる人工の結合分子を同定することにおいて有効であることを証明している。いくつかの標的に対するスクリーニングから単離された配列のいくつかの例を図20〜24に示す。発明者らは、最近、マグネトトロピック(magnetotropic)細菌によって生産された磁性粒子に対してもスクリーニングを行い、これらの多成分性のバイオ−無機複合体においてエピトープに結合するAdhironを同定した。
Figure 0006889758


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Claims (43)

  1. 配列:
    NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(VVAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(PWE)NFKELQEFKPVGDA(配列番号1)
    における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X(ここで、Xは各種のアミノ酸であり、及びnは配列におけるアミノ酸の数であり、3〜30である)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列であって、前記配列番号1の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウレンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする合成足場タンパク質。
  2. 配列が5個以下の置換を含む請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  3. 配列が3個以下の置換を含む請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  4. nが3〜20である請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  5. nが4〜15である請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  6. アミノ酸配列X を有するペプチドが、ループ領域の両方の位置に、挿入されている、 ないし、完全又は部分的に交換されている請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  7. 配列:
    NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X )T MYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X )NFKELQEFKPVG DA(配列番号4)
    (ここで、X は、請求項1において定義するとおりである)を有する請求項6に記載の 合成足場タンパク質。
  8. 配列:
    NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X 5−1 )TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X 5−13 )NFKELQ EFKPVGDA(配列番号5)(ここで、Xは、請求項1において定義するとおりであ る)を有する請求項7に記載の合成足場タンパク質。
  9. 配列:
    NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(X )T MYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(X )NFKELQEFKPVG DA(配列番号6)(ここで、Xは、請求項1において定義するとおりである)を有する 請求項7又は8に記載の合成足場タンパク質。
  10. タンパク質のN末端又はN末端からアミノ酸4個内に挿入された追加のアミノ酸配列を 含んでなる請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  11. N末端に、追加のアミノ酸配列を含んでなる請求項10に記載の合成足場タンパク質。
  12. N末端における追加のアミノ酸配列が、配列:
    MATGVRAVPGNE(配列番号80)
    のいくつか又は全部である請求項10に記載の合成タンパク質。
  13. 配列:
    GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(V VAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(PWE)NFKELQ EFKPVGDA(配列番号2)
    における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X (ここで、X は、請求項1 において定義するとおりである)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列で あって、前記配列番号2の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する 場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウ レンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物 性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする請求項12に記載の 合成足場タンパク質。
  14. 配列:
    M(ATG)VRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEF VRVVKAKEQ(VVAG)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK (PWE)NFKELQEFKPVGDA(配列番号3)
    における(VVAG)及び(PWE)でなるループ領域の少なくとも1つに、挿入された 、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X (ここで、X は、請求項1 において定義するとおりである)を有する少なくとも1つのペプチドを含んでなる配列で あって、前記配列番号3の配列と少なくとも90%の配列同一性(配列同一性を算定する 場合、挿入された少なくとも1つのペプチドは無視される)を有する配列(ただし、ホウ レンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びNicotiana alata由来の植物 性シスタチンの配列と同一の配列を除く)を有することを特徴とする請求項13に記載の 合成足場タンパク質。
  15. さらに、N末端における追加のアミノ酸配列における(ATG)のループ領域に、挿入 された、ないし、完全に又は部分的に交換されたアミノ酸配列X (ここで、X は、請 求項1において定義したとおりである)を有するペプチドを含んでなる請求項14に記載 の合成足場タンパク質。
  16. 70℃以上の融解温度(Tm)を有する請求項1に記載の合成足場タンパク質。
  17. 80℃以上の融解温度(Tm)を有する請求項16に記載の合成足場タンパク質。
  18. リンカー又はタグを含んでなる請求項1〜17のいずれかに記載の合成足場タンパク質
  19. 基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質に結合されている請求項1〜17のいず れかに記載の合成足場タンパク質。
  20. リンカー又はタグ、又は基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質が、C末端及び N末端の一方又は両方に結合されている請求項18又は19に記載の合成足場タンパク質
  21. 融合タンパク質である請求項1〜20のいずれかに記載の合成足場タンパク質。
  22. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質の集団を含んでなるライブラリ ー。
  23. 10 以上の複雑度を有する請求項22に記載のライブラリー。
  24. 複雑度が10 以上である請求項23に記載のライブラリー。
  25. 複雑度が10 10 以上である請求項24に記載のライブラリー。
  26. 合成足場タンパク質の集団が、バイオパニングに適したディスプレイシステムにおける ディスプレイ用に適するものである請求項22〜25のいずれかに記載のライブラリー。
  27. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質をコードするポリヌクレオチド
  28. 配列番号4、5、又は6のアミノ酸配列を有する合成足場タンパク質をコードする請求 項27に記載のポリヌクレオチド。
  29. 合成足場タンパク質用のコード配列に加えて、更なるコード配列又は非コード配列を含 んでなる請求項27又は28に記載のポリヌクレオチド。
  30. 更なるコード配列又は非コード配列が、ランダム化したアミノ酸配列をコードする配列 、リーダー配列をコードする配列、融合タンパク質部分をコードする配列、リンカーをコ ードする配列、マーカーをコードする配列、精製用タグをコードする配列、プロモーター 配列、又はエンハンサー配列である請求項29に記載のポリヌクレオチド。
  31. 宿主細胞における発現用に適応されている請求項27〜30のいずれかに記載のポリヌ クレオチドを含んでなる組換ベクター。
  32. 合成足場タンパク質の発現を制御するように、合成足場タンパク質をコードする核酸配 列に結合されている発現制御配列を含んでなる請求項31に記載の組換ベクター。
  33. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質を発現する細胞であって、請求 項27〜30のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項31又は32に記載の組換 ベクターを含んでなる細胞。
  34. 請求項33に記載の細胞を含んでなる細胞培養液。
  35. 標的に結合する合成足場タンパク質をスクリーニングする方法であって、
    a)請求項22〜26のいずれかに記載のライブラリーを提供し;
    b)前記ライブラリーを標的に曝露し;及び
    c)前記標的に結合する合成足場タンパク質を選別する
    ことを含んでなる方法。
  36. 標的が、タンパク質/ペプチド、核酸又は小分子である請求項35に記載の方法。
  37. ディスプレイシステムを用いる請求項35又は36に記載の方法。
  38. ファージディスプレイ法である請求項35〜37のいずれかに記載の方法。
  39. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質を、バクテリオファージのコー トタンパク質と融合させて、前記合成足場タンパク質がウイルス粒子の表面にディスプレ イされるようにすることを含んでなる請求項38に記載の方法。
  40. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、研究における使用。
  41. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、合成生物学における使用。
  42. 請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タン パク質をコードする核酸の、標的検出における使用。
  43. 請求項35〜39のいずれかに記載の方法によってスクリーニングされた、疾病に関連 する標的に特異的に結合する請求項1〜21のいずれかに記載の合成足場タンパク質及び 、任意に、薬学上許容されるキャリヤー又は添加剤を含んでなる医薬品。
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