JP6876455B2

JP6876455B2 - 観察方法および試料作製方法

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Publication number: JP6876455B2
Application number: JP2017020376A
Authority: JP
Inventors: 祐治小入羽; 知洋春田
Original assignee: Jeol Ltd
Current assignee: Jeol Ltd
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: JP2018128307A

Description

本発明は、観察方法および試料作製方法に関する。

ＳＥＭ連続断面観察法は、ＴＥＭ連続切片観察法に代わる三次元再構成法であり、細胞や組織の構造を正確に把握することができる方法として注目されている（例えば特許文献１参照）。

現在、ＳＥＭ連続断面観察法として、ＡｒｒａｙＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法、ＡＴＵＭ（ＡｕｔｏｍａｔｉｃＴａｐｅ−ＣｏｌｌｅｃｔｉｎｇＵｌｔｒａ−Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）法、ＳＢＦ−ＳＥＭ（ＳｅｒｉａｌＢｌｏｃｋＦａｃｅ−ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）法、ＦＩＢ／ＳＥＭＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦｏｃｕｓｅｄＩｏｎｂｅａｍＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ）法などが知られている。

ＡｒｒａｙＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法は、電子顕微鏡用の超薄切片作製機で作製された試料をシリコン基板やガラスなどの平らな面に貼り付け、これを走査電子顕微鏡で観察し、得られたＳＥＭ像から三次元再構成を行う手法である。ＡｒｒａｙＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法では、試料（切片）が残るため、再度、観察を行うことが可能である。

ＡＴＵＭ法は、テープ上に自動で連続切片を回収する装置（ＡＴＵＭ）を用いて連続切片を取得し、これを走査電子顕微鏡で観察し、得られたＳＥＭ像から三次元再構成を行う手法である。ＡＴＵＭ法では、切片の作製が自動化されたことで、高精度な連続像を取得することができる。また、ＡＴＵＭ法では、ＡｒｒａｙＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法と同様に、試料（切片）が残るため、再度、観察を行うことが可能である。

ＳＢＦ−ＳＥＭ法は、ＳＥＭチャンバー内に高精度なミクロトームを導入し、試料表面をミクロトームで連続的に切削し、その表面を走査電子顕微鏡で観察し、得られたＳＥＭ像から三次元再構成を行う手法である。ＳＢＦ−ＳＥＭ法では、ミクロトームで切削された試料ブロックの表面を観察するため、歪みの少ない高精度な三次元再構成が可能である。

ＦＩＢ／ＳＥＭＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法は、真空チャンバー内において集束イオンビームによる試料表面の切削と、走査電子顕微鏡による観察と、を繰り返し行い、得られたＳＥＭ像から三次元再構成を行う手法である。試料表面の切削は数ｎｍずつ行うことが可能であり、ＦＩＢ／ＳＥＭＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法では、高い空間分解能が得られる。また、集束イオンビームを用いて試料表面の切削を行うため、任意の部位の三次元再構成が可能である。

特開平１１−３３７４６４号公報

ここで、ミクロトームにより作製された連続切片（試料から連続して切り出された複数の切片）を基板に貼り付ける際には、ガラスナイフで切り出された切片をボート（水受け
）に張られた水面上から回収しなければならない。そのため、切片を切り出された順序に整列させることは極めて困難である。

図２９は、シリコン基板に貼り付けられた連続切片の光学顕微鏡像である。図２９には、複数の切片が連続して繋がっている状態のものや、不連続な状態の切片（単独で存在する切片）が見られる。切片が連続して繋がっている場合には切り出された順序の特定は容易であるが、不連続な切片については切り出された順序の特定は困難である。

切片の回収時に切片が切り出された順序が特定できない場合には、切片のＳＥＭ像から切片が切り出された順序を特定しなければならないが、この作業は極めて煩雑である。

ＡｒｒａｙＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法のように、超薄切片作製機（例えばミクロトーム）を用いて試料から複数の切片（連続切片）を切り出して三次元再構成を行う場合、切片が切り出された順序を特定できなければ、撮影された多数のＳＥＭ像の試料深さ方向の位置関係を特定できず、三次元再構成を行うことができない。

また、上記のＳＢＦ−ＳＥＭ法やＦＩＢ／ＳＥＭＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ法のように、試料断面の加工と当該試料断面の観察とを繰り返して三次元再構成を行う場合、断面が加工された順序、すなわち、撮影された複数の試料断面のＳＥＭ像の深さ方向の位置関係を特定できなければ、同様に、三次元再構成を行うことができない。

本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、試料から複数の切片を切り出して観察を行う観察方法であって、容易に、複数の観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる観察方法を提供することにある。

また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、試料断面を加工と当該試料断面の観察を繰り返す観察方法であって、容易に、複数の観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる観察方法を提供することにある。

また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、試料から複数の切片を切り出す試料作製方法であって、容易に、切片が切り出された順序を特定することができる試料作製方法を提供することにある。

（１）本発明に係る観察方法は、
試料に、当該試料の深さ方向に大きさおよび形状の少なくとも一方が変化するマーカーを形成する工程と、
前記試料から複数の切片を切り出す工程と、
複数の前記切片の観察を行い、複数の前記切片の観察画像を取得する工程と、
を含み、
前記切片を切り出す工程では、前記切片の厚さ方向が前記深さ方向となるように、前記切片が形成され、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に圧子を押しつけて圧痕を形成することで、前記試料に前記深さ方向に大きさが変化する孔を形成する。

このような観察方法では、各観察画像中のマーカーから、切片が切り出された順序、すなわち、各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる。したがって、このような観察方法では、容易に、各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる。また、このような観察方法では、各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定するためのマーカー（圧痕）を容易に形成することができる。

（２）本発明に係る観察方法において、
前記マーカーから、前記切片が切り出された順序を特定する工程を含んでいてもよい。

このような観察方法では、容易に、各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる。

（３）本発明に係る観察方法において、
前記マーカーから、前記切片の厚さを算出する工程を含んでいてもよい。

このような観察方法では、より精度よく三次元再構成を行うことができる。

（４）本発明に係る観察方法において、
複数の前記切片の観察画像から、三次元再構成を行ってもよい。

このような観察方法では、容易に各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができるため、容易に三次元再構成を行うことができる。

（５）本発明に係る観察方法において、
前記圧子の先端の形状は、多角錘または円錐であってもよい。

このような観察方法では、圧痕から容易に各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定することができる。

（６）本発明に係る観察方法において、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に複数の前記マーカーを形成し、
前記切片を切り出す工程では、複数の前記マーカーを含む前記切片を切り出してもよい。

このような観察方法では、複数のマーカーを、観察視野を特定するための目印および観察画像のアライメント調整のための目印として用いることができる。

（７）本発明に係る観察方法において、
前記マーカーを用いて、前記観察画像のアライメント調整を行ってもよい。

このような観察方法では、マーカーを用いて観察画像のアライメント調整を行うことができる。

（８）本発明に係る試料作製方法は、
試料に、当該試料の深さ方向に大きさおよび形状の少なくとも一方が変化するマーカー
を形成する工程と、
前記試料から複数の切片を切り出す工程と、
を含み、
前記切片を切り出す工程では、前記切片の厚さ方向が前記深さ方向となるように、前記切片が形成され、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に圧子を押しつけて圧痕を形成することで、前記試料に前記深さ方向に大きさが変化する孔を形成する。

このような試料作製方法では、切片の観察画像中のマーカーから、切片が切り出された順序を特定することができる。したがって、このような試料作製方法では、容易に、切片が切り出された順序を特定することができる。また、このような試料作製方法では、各観察画像の試料深さ方向の位置関係を特定するためのマーカー（圧痕）を容易に形成することができる。

本実施形態に係る試料作製方法の一例を示すフローチャート。圧子の先端を模式的に示す図。試料に圧子を押し込むことで形成された圧痕を模式的に示す図。試料から切片を切り出している様子を模式的に示す図。ｎ番目に切り出された切片を模式的に示す平面図。ｎ＋１番目に切り出された切片を模式的に示す平面図。本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャート。走査電子顕微鏡での切片の観察において、圧痕を用いて観察視野の角度を補正する様子を説明するための図。複数の観察画像を切片が切り出された順序に並べた様子を示す図ｎ番目に切り出された切片の画像を模式的に示す図。ｎ＋１番目に切り出された切片の画像を模式的に示す図。圧子先端の走査電子顕微鏡像。実施例に係る試料の光学顕微鏡像。実施例に係る試料の光学顕微鏡像。実施例に係る試料の光学顕微鏡像。実施例に係る試料の光学顕微鏡像。シリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像。シリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像。シリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像。シリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像。シリコン基板に載せられた１６〜１８枚目の超薄切片の走査電子顕微鏡像。１枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片の走査電子顕微鏡像。２枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片の走査電子顕微鏡像。三次元再構成を行った結果を示す画像。集束イオンビーム装置で形成された孔を模式的に示す断面図。第３変形例に係る観察方法を説明するための図。マーカーが深さ方向に形状が変化している様子を示す模式図マーカーが深さ方向に形状が変化している様子を示す模式図シリコン基板に貼り付けられた連続切片の光学顕微鏡像。

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

１．試料作製方法
まず、本実施形態に係る試料作製方法について、図面を参照しながら説明する。本実施形態に係る試料作製方法では、試料を電子顕微鏡用の超薄切片作製機（ミクロトーム等）で切り出して複数の切片（連続切片）を作製する。

本実施形態に係る試料作製方法が適用可能な試料としては、細胞や組織などの生体材料、高分子、液晶、生体膜、生体分子などのソフトマテリアル、ＡＢＳ樹脂などの樹脂材料などが挙げられる。なお、本実施形態に係る試料作製方法が適用可能な試料は特に限定されない。

図１は、本実施形態に係る試料作製方法の一例を示すフローチャートである。

まず、試料を樹脂包埋する（ステップＳ１０）。

樹脂包埋に用いられる包埋剤は、例えば、エポキシ樹脂である。なお、包埋剤は特に限定されず、試料に応じて様々は包埋剤を用いることができる。

なお、樹脂包埋された試料をミクロトームで切削しやすいように、所定の形状にトリミングしてもよい。

次に、樹脂包埋された試料に圧痕（マーカーの一例）を形成する（ステップＳ１２）。

図２は、圧子２の先端を模式的に示す図である。図３は、試料Ｓに圧子２を押し込むことで形成された圧痕４を模式的に示す図（平面図および断面図）である。

圧痕４は、圧子２を試料Ｓに押し込むことで形成される。圧痕４は、圧子２を試料Ｓに押し込むことで形成される窪み（孔）である。圧痕４は、１つ形成されてもよいし、複数形成されてもよい。圧痕４を観察視野を特定するための目印や観察画像のアライメント調整のための目印とする場合には、圧痕４の数を増やすことで、観察視野の特定および観察画像のアライメント調整をより正確に行うことができる。

圧痕４は、例えば、硬さ試験機などを用いて形成される。圧痕４を形成する際には、圧痕形成時の位置や荷重を制御して、圧痕形成の再現性を図ることが望ましい。圧子２は、試料Ｓに対して十分に固い材料で形成される。

圧子２は、図２に示すように、四角錐の形状を有している。圧子２は、先端部に向かうに従ってその大きさ（面積）が小さくなる形状を有している。そのため、試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさ（面積）が変化する圧痕４を形成することができる。より具体的には、図２に示す圧子２を用いることで、試料Ｓの表面から深さ方向Ｄに向かうに従って、大きさ（面積）が小さくなる四角錐状の圧痕４を形成することができる。

例えば、圧子２として、頭頂角度Ｐが１３６°のビッカース圧子を用いた場合、圧痕４の一辺の長さ（ＡＢまたはＡＣ、図示の例ではＡＢ＝ＡＣ）から、圧痕４の深さｄを求めることができる。

なお、ここでは、圧子２がビッカース圧子である例を説明したが、圧子２はビッカース圧子に限定されず、先端部が多角錘や円錐など様々な形状の圧子を用いることができる。圧子２の形状および大きさが既知であれば、上述したビッカース圧子と同様に、圧痕４の形状および大きさから圧痕４の深さｄを求めることができる。

次に、試料Ｓを染色する（ステップＳ１４）。

染色は、四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）や酢酸ウラニルなどの重金属を用いて行われる。試料Ｓを染色することで、走査電子顕微鏡で観察する際の帯電を防止することができる。また、試料Ｓを染色することで、試料Ｓを固くすることができ、切片６を切り出しやすくすることができる。なお、染色に用いる染色剤は特に限定されず、試料Ｓに応じて様々な染色剤を用いることができる。

次に、試料Ｓから複数の切片を切り出す（連続切片作製）（ステップＳ１６）。

図４は、試料Ｓから切片６を切り出している様子を模式的に示す図である。

切片６の切り出しは、例えば、ミクロトームを用いて行われる。試料Ｓから切片６を連続して切り出すことにより、複数の切片６（連続切片）が得られる。本工程では、図４に示すように、各切片６の厚さ方向が試料Ｓの深さ方向Ｄとなるように、切片６が形成される。切片６は、圧痕４が含まれるように試料Ｓから切り出される。圧痕４は深さ方向Ｄに大きさが変化するため、各切片６の厚さ方向が試料Ｓの深さ方向Ｄとなるように切片６が形成されることにより、各切片６に含まれる圧痕４の大きさが変化する。図示の例では、圧痕４は深さ方向Ｄに向かうに従って大きさが小さくなるため（深くなるほど大きさが小さくなるため）、後から切り出される切片６ほど、切片６に含まれる圧痕４の大きさが小さくなる。

図５は、ｎ番目に切り出された切片６を模式的に示す平面図（切片６の厚さ方向から見た図）である。図６は、ｎ＋１番目に切り出された切片６を模式的に示す平面図である。

図５および図６に示すように、ｎ＋１番目に切り出された切片６の圧痕４の一辺の長さＬｎ＋１は、ｎ番目に切り出された切片６の圧痕４の一辺の長さＬｎよりも小さくなる（Ｌｎ＋１＜Ｌｎ）。そのため、各切片６の圧痕４の一辺の長さから、各切片６の切り出された順序を特定することができる。なお、各切片６の圧痕４の面積から各切片６が切り出された順序を特定してもよいし、各切片６の圧痕４の対角線の長さから各切片６が切り出された順序を特定してもよい。

また、例えば、圧子２が上記のビッカース圧子である場合、ｎ番目に切り出された切片６の圧痕４の一辺の長さＬｎと、ｎ＋１番目に切り出された切片６の圧痕４の一辺の長さ
Ｌｎ＋１から、ｎ番目に切り出された切片６の厚さを算出することができる。

なお、圧子２の形状および大きさが既知であれば、ビッカース圧子の場合と同様に、ｎ番目の切片６の圧痕４の大きさと、ｎ＋１番目の切片６の圧痕４の大きさと、から、ｎ番目に切り出された切片６の厚さを算出することができる。圧痕４の大きさは、圧痕４の一辺の長さや、圧痕４の面積、圧痕４の対角線の長さなどである。

作製された切片６は、例えば、シリコン基板やガラスなどの上に置かれる。

以上の工程により、試料Ｓの深さ方向Ｄの連続切片（複数の切片６）を作製することができる。

なお、上記では、試料Ｓを染色する工程（ステップＳ１４）を試料Ｓから切片６を切り出す工程（ステップＳ１６）の前に行う場合について説明したが、試料Ｓから切片６を切り出す工程の後に試料Ｓ（切片６）を染色する工程を行ってもよい。

２．観察方法
次に、本実施形態に係る観察方法について説明する。本実施形態に係る観察方法は、本実施形態に係る試料作製方法を含む。本実施形態に係る観察方法では、上述した試料作製方法で形成された連続切片の観察を行い、得られた複数の観察画像から三次元再構成を行う。

図７は、本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。

まず、試料Ｓの深さ方向Ｄの連続切片を作製する（ステップＳ２０）。本工程は、上述した本実施形態に係る試料作製方法で行われる。

次に、各切片６の観察を行い、連続切片の観察画像（複数の切片６の観察画像）を取得する（ステップＳ２２）。

各切片６の観察は、走査電子顕微鏡を用いて行われる。走査電子顕微鏡で各切片６の観察を行うことで、各切片６の観察画像、すなわち、各切片６のＳＥＭ像を得ることができる。

走査電子顕微鏡で切片６を観察する際には、圧痕４を目印として観察視野を特定することができる。図８は、走査電子顕微鏡での切片６の観察において、圧痕４を用いて観察視野の角度を補正する様子を説明するための図である。

図８に示すように、試料Ｓに圧痕４を複数形成することにより、観察視野の角度を補正することができる。図８に示す例では、２つの圧痕４を結ぶ仮想直線（図８に示す一点鎖線）が、ＳＥＭ像のＸ軸方向と平行になるように（例えばＳＥＭ像のフレームが長方形である場合、その一辺と平行になるように）、観察視野の角度を補正して撮影を行う。これにより、後述する三次元再構成の際に、各観察画像のアライメント調整（回転の補正）を容易化できる。

さらに、圧痕４を目印として、試料Ｓの撮影領域を特定することができる。圧痕４を目印として撮影領域を特定することにより、各切片６の観察画像の視野を揃えることができる。

このように、圧痕４を目印として観察視野を特定する場合、圧痕４の数を多くすること
で、より正確に観察視野を特定することができる。この結果、後述する三次元再構成の際に、各観察画像のアライメント調整（位置の調整）を容易化できる。

次に、各切片６の観察画像から、複数の切片６が切り出された順序、すなわち複数の観察画像の深さ方向Ｄの位置関係を特定する（ステップＳ２４）。

図９は、複数の観察画像を切片６が切り出された順序に並べた様子を示す図である。なお、図９において、画像Ｉ１は１番目に切り出された切片６の観察画像である。また、画像Ｉ２は２番目に切り出された切片６の観察画像である。また、画像Ｉｎはｎ番目に切り出された切片６の観察画像である。画像Ｉｎ＋１はｎ＋１番目に切り出された切片６の観察画像である。また、図９のＺ方向は、試料Ｓの深さ方向Ｄに対応する。

図１０は、ｎ番目に切り出された切片６の画像Ｉｎを模式的に示す図であり、図１１は、ｎ＋１番目に切り出された切片６の画像Ｉｎ＋１を模式的に示す図である。

上述した切片６を切り出す工程では、ミクロトームを用いて試料Ｓから切片６を切り出す。この工程では、ガラスナイフで切り出された複数の切片６はボート（水受け）に張られた水面上から回収される。そのため、回収時にこれらの切片６が切り出された順序を特定することは困難である。

本実施形態では、上述したように、圧痕４の大きさが試料Ｓの深さ方向Ｄに変化するため（具体的には深さが深いほど圧痕４の大きさが小さくなるため）、各画像Ｉ１，Ｉ２，・・・，Ｉｎ，Ｉｎ＋１，・・・の圧痕４の大きさ（例えば一辺の長さ）から切片６が切り出された順序を特定することができる。

具体的には、画像Ｉｎ中の圧痕４の一辺の長さＬｎは、画像Ｉｎ＋１中の圧痕４の一辺の長さＬｎ＋１よりも大きい。したがって、図９に示すように、各観察画像を切片６が切り出された順序を特定することができる。この結果、複数の観察画像をＺ方向に並べることができる。

次に、各切片６の厚さを算出して、各観察画像間の距離ａを求める（ステップＳ２６）。

上述したように、圧子２の形状および大きさが既知であれば、画像Ｉｎ中の圧痕４の大きさおよび画像Ｉｎ＋１中の圧痕４の大きさから、ｎ番目に切り出された切片６の厚さを算出することができる。すなわち、ｎ番目に切り出された切片６の画像Ｉｎとｎ＋１番目に切り出された切片６の画像Ｉｎ＋１との間のＺ方向の距離ａ（試料Ｓの深さ方向Ｄの距離）を算出することができる。

本実施形態では、三次元再構成の際に、本工程で算出された各観察画像間の距離ａを用いることができるため、例えば、各観察画像間の距離ａをミクロトームで切片を切り出す際の試料の送りから特定する場合と比べて、試料Ｓの深さ方向Ｄ（Ｚ方向）の正確な情報を取得することができる。したがって、より精度よく三次元再構成を行うことができる。

次に、各切片６の観察画像のアライメント調整を行う（ステップＳ２８）。

図１０および図１１に示すように、各観察画像中の圧痕４からアライメント調整用の点を作製し、各観察画像のアライメント調整用の点をリンクさせることで、観察画像間の位置合わせ（アライメント調整）が可能である。以下では、図１０および図１１に示す画像Ｉｎと画像Ｉｎ＋１との間のアライメント調整を行う場合について説明する。

図１０および図１１に示す例では、アライメント調整用の点を、圧痕４の対角線の交点としている。図１０では、２つの圧痕４の対角線の交点の座標をそれぞれ（Ｘ１_ｎ，Ｙ１_ｎ）、（Ｘ２_ｎ，Ｘ２_ｎ）とし、図１１では、２つの圧痕４の対角線の交点の座標をそれぞれ（Ｘ１_ｎ＋１，Ｙ１_ｎ＋１）、（Ｘ２_ｎ＋１，Ｘ２_ｎ＋１）としている。なお、座標（Ｘ１_ｎ，Ｙ１_ｎ）を付した圧痕４と座標（Ｘ１_ｎ＋１，Ｙ１_ｎ＋１）を付した圧痕４は同じ圧痕であり、座標（Ｘ２_ｎ，Ｙ２_ｎ）を付した圧痕４と座標（Ｘ２_ｎ＋１，Ｙ２_ｎ＋１）を付した圧痕４は同じ圧痕である。

アライメント調整は、画像Ｉｎの座標（Ｘ１_ｎ，Ｙ１_ｎ）と画像Ｉｎ＋１の座標（Ｘ１_ｎ＋１，Ｙ１_ｎ＋１）とをリンクさせ、画像Ｉｎの座標（Ｘ２_ｎ，Ｘ２_ｎ）と画像Ｉｎ＋１の座標（Ｘ２_ｎ＋１，Ｘ２_ｎ＋１）とをリンクさせることで行われる。このように、観察画像中の対応する点をリンクさせることで、観察画像間のアライメント調整（位置合わせ）を行うことができる。このとき、画像上に圧痕４が多いほど、アライメントの精度を向上できる。

なお、上記では、切片６の切り出し順序を特定する工程（ステップＳ２４）の後に、切片６の厚さを算出する工程（ステップＳ２６）を行い、その後、各観察画像のアライメント調整を行う工程（ステップＳ２８）を行う場合について説明したが、各観察画像のアライメント調整を行う工程（ステップＳ２８）の後に、切片６の切り出し順序を特定する工程（ステップＳ２４）、および切片６の厚さを算出する工程（ステップＳ２６）を行ってもよい。

次に、アライメント調整が行われた複数の観察画像から、三次元再構成を行う（ステップＳ３０）。

三次元再構成の手法は特に限定されず、公知の手法で三次元再構成を行うことができる。上述したように、三次元再構成の際に、各切片６の厚さを算出して得られた各観察画像間の距離ａを用いることで、より精度よく三次元再構成を行うことができる。

なお、上記では、各切片６の厚さを算出して、各観察画像間の距離ａを求める工程（ステップＳ２６）を行ったが、この工程（ステップＳ２６）を行わずに、各観察画像間の距離ａをミクロトームで切片を切り出す際の試料の送りから特定してもよい。

本実施形態に係る観察方法は、例えば、以下の特徴を有する。

本実施形態に係る観察方法では、試料Ｓに深さ方向Ｄに大きさが変化する圧痕４（マーカー）を形成する工程と、試料Ｓから複数の切片６を切り出す工程と、複数の切片６の観察を行い複数の切片６の観察画像を取得する工程とを含み、切片６を切り出す工程では、切片６の厚さ方向が深さ方向Ｄとなるように切片６が形成される。そのため、各切片６に含まれる圧痕４の大きさは、試料Ｓの深さ方向Ｄに応じて、すなわち、複数の切片６が切り出された順序で変化する。したがって、本実施形態に係る観察方法では、各切片６の圧痕４から複数の切片６が切り出された順序、すなわち、各観察画像の試料Ｓの深さ方向Ｄの位置関係を特定することができる。よって、本実施形態に係る観察方法では、容易に、各観察画像の試料Ｓの深さ方向Ｄの位置関係を特定することができる。

また、本実施形態に係る観察方法では、切片６の観察を行う際の観察視野の特定（視野探し）を、圧痕４を目印として行うことができるため、視野の特定にかかる時間を短縮することができる。さらに、圧痕４を目印として観察視野の角度の調整を行うことができるため、観察画像間のアライメント調整時に、画像の回転を大きく変更しなくてもよい（ま
たは画像の回転の調整を行わなくてもよい）。したがって、本実施形態に係る観察方法では、切片６の観察画像間のアライメント調整を、容易に、かつ、精度よく行うことができる。

また、本実施形態に係る観察方法では、観察画像間のアライメント調整の際に、各画像の圧痕４から座標を算出し、当該座標をリンクさせることで、アライメント調整が可能であるため、アライメント精度を向上できる。

また、本実施形態に係る観察方法では、圧痕４から切片６の厚さを算出することができるため、例えば、各観察画像間の距離ａをミクロトームで切片を切り出す際の試料の送りから特定する場合と比べて、より精度よく三次元再構成を行うことができる。

本実施形態に係る観察方法では、試料Ｓに圧子２を押しつけて圧痕４を形成することで、試料Ｓの厚さ方向に大きさが変化する孔（圧痕４）を形成する。そのため、本実施形態に係る観察方法では、容易に、各観察画像の深さ方向Ｄの位置関係を特定するための目印を形成することができる。

本実施形態に係る観察方法では、圧痕４を形成する工程では、試料Ｓに複数の圧痕４を形成し、切片６を切り出す工程では、複数の圧痕４を含む切片６を切り出す。そのため、複数の圧痕４を、観察視野を特定するための目印および観察画像のアライメント調整のための目印として用いることができる。したがって、より精度よく観察画像のアライメント調整を行うことができる。

３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。

３．１．実験条件
＜試料＞
本実施例では、試料として、ＡＢＳ樹脂を用いた。

＜試料前処理＞
ＡＢＳ樹脂は、エポン樹脂で包埋し、四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）を用いて染色した。この染色によって、ＡＢＳ樹脂に含まれるブタジエンを染色した。

＜圧痕形成＞
圧痕は、微小硬さ試験機（株式会社ミツトヨ社製ＨＭ−２２１）を用いて形成した。圧子の材質は、単結晶ダイヤモンドとした。また、圧子は、頭頂角度４４°（稜線角度６０°）とした。図１２は、圧子先端のＳＥＭ像である。圧痕形成時の加重は９．８０７ｍＮとした。

＜超薄切片作製＞
切片の作製は、ウルトラミクロトームを用いた。超薄切片の狙い厚みは８０ｎｍとした。

＜走査電子顕微鏡像の取得＞
走査電子顕微鏡は、日本電子株式会社製ＪＳＭ−７１００Ｆを用いた。この走査電子顕微鏡像を用いて、染色されたブタジエンについて反射電子像を取得した。

＜三次元再構成＞
切片の画像から三次元再構成を行うためのソフトウェアとして、ＴＥＭｏｇｒａｐｈｙ（株式会社システムインフロンティア社製）を用いた。

３．２．結果
図１３〜図１６は、試料の光学顕微鏡像である。なお、図１３は、樹脂包埋された試料の全体の光学顕微鏡像であり、図１４〜図１６は、試料の先端部の光学顕微鏡像である。図１６に示すように、試料には、１０μｍ間隔で形成された２つの圧痕の対を、５箇所形成した（すなわち１０個の圧痕を形成した）。

図１７〜図２０は、シリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像である。図１７は１枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像であり、図１８は図１７を拡大したものである。図１９は２枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片の光学顕微鏡像であり、図２０は図１９を拡大したものである。なお、図１８および図２０の矢印は、切片が切り出された順序を示している。図２１は、シリコン基板に載せられた１６〜１８枚目の超薄切片のＳＥＭ像である。

図１７および図１８に示す１枚目のシリコン基板には２６枚の超薄切片が載せられており、図１９および図２０に示す２枚目のシリコン基板には３１枚の超薄切片が載せられている。ＳＥＭ像から圧痕の大きさを確認し、超薄切片が切り出された順序を特定した。

図２２は、１枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片のＳＥＭ像（２６枚）である。図２３は、２枚目のシリコン基板に載せられた連続超薄切片のＳＥＭ像（１６枚）である。

超薄切片に形成した圧痕により、視野探しの作業性が向上した。また、ＳＥＭ像の撮像の際には、２つの圧痕を用いて観察視野の角度を補正した後、圧痕を視野の上方中央に据えて撮像範囲を設定した。この結果、図２２および図２３に示すように、各切片のほぼ同一の範囲を撮像できた。

図２４は、三次元再構成を行った結果を示す図である。図２４は、４２枚の超薄切片の走査電子顕微鏡像から、三次元再構成を行った結果である。

図２４に示すように、ＡＢＳ樹脂に含まれるブタジエンの三次元情報を取得することができた。

４．変形例
なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。

４．１．第１変形例
上述した実施形態では、図２および図３に示すように、試料Ｓに圧子２を押しつけることで、試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさが変化する圧痕４（マーカー）を形成したが、マーカーの形成方法はこれに限定されない。例えば、集束イオンビーム（ＦＩＢ）装置で、図２５に示すように、試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさが変化する（深くなるほど大きさが小さくなる）孔８を形成してマーカーとしてもよい。なお、図２５に示すように、マーカーとなる孔８の一部に、試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさが変化しない部分があってもよい。

本変形例では、試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさが変化するマーカーを形成する工程では、試料Ｓを集束イオンビームで加工することで、孔８を形成する。したがって、本変形例によれば、上述した実施形態と同様の作用効果を奏することができる。

なお、マーカーの形状は深さ方向Ｄに大きさが変化していればその形状は特に限定されない。

４．２．第２変形例
上述した実施形態では、切片６の観察を走査電子顕微鏡を用いて行ったが、切片６の観察をその他の観察装置で行ってもよい。例えば、切片６の観察を光学顕微鏡を用いて行ってもよい。すなわち、切片６の光学顕微鏡像を用いて、三次元再構成を行ってもよい。

本変形例によれば、上述した実施形態と同様の作用効果を奏することができる。

４．３．第３変形例
上述した実施形態では、ミクロトームを用いて圧痕４が形成された試料Ｓから連続切片を切り出し、走査電子顕微鏡を用いて連続切片の観察を行い、得られた連続切片の観察画像から三次元再構成を行った。本変形例では、集束イオンビーム装置を用いた試料の深さ方向の断面の形成と、走査電子顕微鏡を用いた試料断面の観察と、を繰り返して、複数の試料断面の観察画像を得て、当該観察画像から三次元再構成を行う。

図２６は、第３変形例に係る観察方法を説明するための図である。

本変形例では、図２６に示すように、真空チャンバー内において集束イオンビームＩＢによる試料Ｓ表面の切削による断面加工と、当該断面を電子線ＥＢで走査することによる試料Ｓの断面のＳＥＭ像の取得と、を繰り返し行い、得られた各断面のＳＥＭ像から三次元再構成を行う。

具体的には、集束イオンビームＩＢで試料Ｓを加工し、露出した断面を電子線ＥＢで走査することで観察を行い、断面のＳＥＭ像を取得する。このようにして試料Ｓの断面の観察画像を取得すると、次に深さ方向Ｄに所定の距離だけ進んだ試料Ｓの断面が露出するように集束イオンビームＩＢで試料Ｓを加工し、露出した断面のＳＥＭ像を取得する。これを繰り返して、複数の断面の観察画像を取得する。そして、取得した複数の断面の観察画像から三次元再構成を行う。

本変形例においても、試料Ｓに深さ方向Ｄに大きさが変化する圧痕４が形成される。そのため、上述した実施形態と同様に、圧痕４から断面が加工された順序、すなわち、各観察画像の試料Ｓの深さ方向Ｄの位置関係を特定することができる。

本変形例に係る観察方法では、試料Ｓに、当該試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさが変化する圧痕４を形成する工程と、試料Ｓの深さ方向Ｄの断面の形成と当該断面の観察とを繰り返して、複数の試料Ｓの断面の観察画像を取得する工程と、を含む。そのため、本変形例に係る観察方法では、上述した実施形態と同様に、容易に、断面が加工された順序、すなわち、各観察画像の試料Ｓの深さ方向Ｄの位置関係を特定することができる。

さらに、本変形例に係る走査電子顕微鏡では、圧痕４を、切片６の観察を行う際の観察視野の特定のためのマーカー、およびアライメント調整のためのマーカーとして用いることができる。

なお、ここでは、試料Ｓの断面の加工を集束イオンビーム装置で行う場合について説明したが、試料Ｓの断面の加工は集束イオンビーム装置に限定されず様々な断面加工装置を用いることができる。例えば、断面加工装置として、ミクロトームを用いてもよい。具体的には、ＳＥＭチャンバー内に高精度なミクロトームを導入し、試料表面をミクロトーム
で連続的に切削し、その表面（断面）を走査電子顕微鏡で観察し、得られたＳＥＭ像から三次元再構成を行ってもよい。

４．４．第４変形例
上述した実施形態では、図３に示すように、各観察画像の深さ方向Ｄの位置関係を特定するためのマーカー（圧痕４）は試料Ｓの深さ方向Ｄに大きさ（面積）が変化したが、マーカーは深さ方向Ｄに大きさおよび形状の少なくとも一方が変化すればよい。マーカーが深さ方向Ｄに大きさおよび形状の少なくとも一方が変化すれば、各観察画像の深さ方向Ｄの位置関係を特定することが可能である。

図２７および図２８は、マーカー４が深さ方向Ｄに形状が変化している様子を示す模式図である。図２７および図２８は、マーカー４を平面視した図（厚さ方向Ｄから見た図）である。なお、図２７および図２８では、マーカー４の大きさ（面積）は変化していないものとする。

図２７に示す例では、マーカー４の形状は長方形であり、深さが深くなるに従って（深さ方向Ｄに向かうに従って）、長辺と短辺との比が大きくなるように形状が変化している。図２８に示す例では、マーカー４の形状は楕円状であり、深さが深くなるに従って長軸と短軸との比が大きくなるように形状が変化している。

図２７および図２８に示すように、マーカー４の面積が深さ方向Ｄに変化しない場合であっても、マーカー４の形状が深さ方向Ｄに変化すれば、マーカー４の大きさが変化する場合と同様に、切片６が切り出された順序、および断面が加工された順序を特定することができる。

なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、適宜組み合わせることが可能である。

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

２…圧子、４…圧痕、６…切片、８…孔

Claims

試料に、当該試料の深さ方向に大きさおよび形状の少なくとも一方が変化するマーカーを形成する工程と、
前記試料から複数の切片を切り出す工程と、
複数の前記切片の観察を行い、複数の前記切片の観察画像を取得する工程と、
を含み、
前記切片を切り出す工程では、前記切片の厚さ方向が前記深さ方向となるように、前記切片が形成され、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に圧子を押しつけて圧痕を形成することで、前記試料に前記深さ方向に大きさが変化する孔を形成する、観察方法。
請求項１において、
前記マーカーから、前記切片が切り出された順序を特定する工程を含む、観察方法。
請求項１または２において、
前記マーカーから、前記切片の厚さを算出する工程を含む、観察方法。
請求項１ないし３のいずれか１項において、
複数の前記切片の観察画像から、三次元再構成を行う、観察方法。
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記圧子の先端の形状は、多角錘または円錐である、観察方法。
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に複数の前記マーカーを形成し、
前記切片を切り出す工程では、複数の前記マーカーを含む前記切片を切り出す、観察方法。
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記マーカーを用いて、複数の前記観察画像のアライメント調整を行う工程を含む、観察方法。
試料に、当該試料の深さ方向に大きさおよび形状の少なくとも一方が変化するマーカーを形成する工程と、
前記試料から複数の切片を切り出す工程と、
を含み、
前記切片を切り出す工程では、前記切片の厚さ方向が前記深さ方向となるように、前記切片が形成され、
前記マーカーを形成する工程では、前記試料に圧子を押しつけて圧痕を形成することで、前記試料に前記深さ方向に大きさが変化する孔を形成する、試料作製方法。