JP6875174B2

JP6875174B2 - 酵母培養用培地ならびにそれを用いた酵母の培養方法

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Publication number: JP6875174B2
Application number: JP2017071417A
Authority: JP
Inventors: 平野　達也; 達也平野; 伊藤　亮; 亮伊藤
Original assignee: CCI Holdings Inc
Current assignee: CCI Holdings Inc
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2021-05-19
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: JP2018171003A

Description

本発明は、酵母培養用培地ならびにそれを用いた酵母の培養方法に関する。

酵母は、発酵食品、アルコール、有機酸などの製造に利用されている。さらに、油脂分解能を有する酵母は、グリーストラップなどにおいて、排水中の油脂を分解するために利用されている。

厨房や食品工場からの排水には、多くの油分が含まれており、これらの油分を集積し上層部に浮上した油分を分離して破棄するためにグリーストラップが設けられている。しかしながら、グリーストラップ内で集積した油分が固形化し、グリーストラップの水面にスカム（油の塊）として残留したり、グリーストラップの内壁面や配管内部に集積・付着して配管を閉塞したりすることがある。このとき、集積した油分は、酸化・腐敗して、悪臭・害虫の発生原因となることがある。また、集積した油分を放置すると、グリーストラップの油分除去能力が低下し、下水や河川に油分を流出させてしまう。そのため、グリーストラップ内で油分が集積した場合、専門の業者に依頼してバキューム処理や高圧洗浄処理などで油分の除去を行う必要があるためコストがかかってしまう。

そこで、グリーストラップにおいて、効率よく油分を低減するため、油脂分解能を有する酵母を用いる方法が検討されている。例えば、特許文献１には、グリーストラップ内における油分の低減効果に優れたヤロウィア・リポリティカが開示されている。

特開２０１５−１９２６１１号公報

酵母の培養では、栄養が豊富な培地であるＹＭ培地やＹＰＤ培地などが通常使用されている。ここで、本発明者らの検討によれば、特許文献１に記載の酵母をＹＭ培地やＹＰＤ培地を用いて培養した場合には、培地の単位容積あたりの集菌量が小さいという問題があることが判明した。例えば、ＹＭ培地を用いてジャーファーメンター中で特許文献１に記載の酵母を培養すると、７２時間培養しても得られる菌体重量は４０ｇ／Ｌに満たないことが判明したのである。このように培地の単位容積あたりの集菌量が小さいと、目的の菌量を得るために多量の培地が必要となり、きわめて効率が悪い。そのため、より培養効率を高める（すなわち、培地の単位容積あたりの集菌量を多くする）技術の開発が望まれていた。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容積あたりの集菌量を高めることが可能な技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、炭素源としてグリセロールを用いてその濃度をある値よりも大きくするとともに、ある値以上の量の微量元素（鉄、カルシウム、銅、ホウ素、およびマンガンからなる）を含有させることによって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明によれば、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容積あたりの集菌量を高めることが可能となる。

以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味し、「重量」と「質量」、「重量％」と「質量％」及び「重量部」と「質量部」は同義語として扱う。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。

＜酵母培養用培地＞
本発明の一形態によれば、炭素源と、窒素源と、リン源と、マグネシウム源と、溶媒と、を含有する酵母培養用培地であって、前記炭素源が１００ｇ／Ｌ超のグリセロールを含み、かつ、鉄、カルシウム、銅、ホウ素、およびマンガンからなる微量元素をこれらの元素換算の合計量で０．０００８ｇ／Ｌ以上含有することを特徴とする、酵母培養用培地が提供される。かかる構成を備えた培地を用いて酵母を培養することにより、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容積あたりの集菌量を高めることが可能となる。以下、形態に係る酵母培養用培地について、より詳細に説明する。

まず、本形態に係る酵母培養用培地は、基本構成として、炭素源と、窒素源と、リン源と、マグネシウム源と、溶媒と、を含有するものである。溶媒を含有することから、本形態に係る酵母培養用培地は、液体培地である。

（炭素源）
本形態に係る酵母培養用培地は、炭素源としてグリセロールを必須に含有する。そして、グリセロールの含有量は、１００ｇ／Ｌ超である点に特徴がある。グリセロール（Ｃ_３Ｈ_８Ｏ_３）は、グルコース（Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６）と比較して化学的により還元された物質であり、酵母の代謝過程上でより向上した還元力を提供することができる。そして、酵母の代謝過程では還元力が要求される場合が多いことから、グリセロールを１００ｇ／Ｌ超の量で含有することにより、培養効率の向上が図られているものと考えられる。なお、本形態に係る酵母培養用培地におけるグリセロールの含有量は、好ましくは１１０ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは１２０ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは１３０ｇ／Ｌ以上であり、特に好ましくは１４０ｇ／Ｌ以上であり、最も好ましくは１５０ｇ／Ｌ以上である。一方、グリセロールの含有量の上限値について特に制限はないが、通常は２５０ｇ／Ｌ以下程度であればよい。

また、本形態に係る酵母培養用培地は、炭素源としてグリセロール以外の物質をさらに含有してもよい。グリセロール以外の炭素源としては、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、メタノール、エタノール等のアルコール類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられる。これらの炭素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記グリセロール以外の炭素源を１種または２種以上選択して使用することができる。

（窒素源）
本形態に係る酵母培養用培地は、窒素源として無機窒素源を含有することが好ましい。一般的に、酵母の培養に使用される培地としては、ＹＭ培地、ＹＰＤ培地などが挙げられる。酵母培養用培地の窒素源として無機窒素源を用いると、酵母の増殖を促進させることができる。これは、酵母が窒素源として利用しやすい無機窒素源を優先的に取り込むことにより、その増殖が促進されるものと考えられる。

無機窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムなどの硝酸塩；亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩；アンモニア；尿素などが例示できる。無機窒素源としては、１種または２種以上選択して使用することができる。これらのうち、無機窒素源は、酵母の増殖を促進できるとの観点から、好ましくは塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム、および硫酸アンモニウムからなる群から選択され、より好ましくは塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムおよび硝酸アンモニウムからなる群から選択され、さらに好ましくは塩化アンモニウムまたは硝酸ナトリウムであり、特に好ましくは塩化アンモニウムである。無機窒素源として塩化アンモニウムを用いることにより、他の無機窒素源よりも培養効率（培地の単位容積あたりの菌体重量）を高めることができる。

また、本形態に係る酵母培養用培地は、窒素源として有機窒素源をさらに含有してもよい。有機窒素源としては、酵母エキス、麦エキス、肉エキス、魚エキス、ペプトン、ポリペプトン、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などが挙げられる。これらの有機窒素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記有機炭素源を１種または２種以上選択して使用することができる。

窒素源の配合量は、酵母培養用培地全量に対して、例えば１．０〜５．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは２．０〜４．０ｗ／ｖ％である。これらのうち、無機窒素源の配合量は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．５〜３．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは１．０〜２．０ｗ／ｖ％である。

（リン源）
リン源としては、リン酸塩が好適に用いられうる。リン源としてのリン酸塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸アンモニウムなどが挙げられ、なかでもリン酸二水素カリウムが好ましく用いられうる。

リン源の配合量は、酵母培養用培地全量に対するリン源化合物の重量換算で、例えば０．１〜０．５ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．２〜０．４ｗ／ｖ％である。

（マグネシウム源）
マグネシウム源としては、マグネシウム塩が好適に用いられうる。マグネシウム源としてのマグネシウム塩としては、硝酸塩、塩化物などが挙げられ、硫酸マグネシウムやその水和物（例えば硫酸マグネシウム七水和物）が好ましく用いられうる。

マグネシウム源の配合量は、酵母培養用培地全量に対するマグネシウム源化合物の重量換算で、例えば０．０５〜０．３ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜０．３ｗ／ｖ％である。

（溶媒）
溶媒としては、通常、水が用いられる。水は、純水、蒸留水、脱イオン水、ＲＯ水、などが挙げられるが、特に制限はない。

（微量元素）
さらに、本形態に係る酵母培養用培地は、鉄、カルシウム、銅、ホウ素、およびマンガンからなる５種の微量元素を必須に含有するものであり、かつ、これらの元素換算の合計含有量が０．０００８ｇ／Ｌ以上である点にも特徴を有している。このように、所定の微量元素をある程度の含有量で含有しつつ、上述したようにグリセロールの含有量についても所定の値を超えるように設定することで、酵母の培養効率を相乗的に向上させることが可能となり、培地の単位容積あたりの菌体重量を飛躍的に増加させることが可能となったものである。なお、このような効果が奏されるメカニズムについては完全には明らかとはなっていないが、これらの所定の微量元素が酵母の代謝過程に介在する酵素に対して触媒的に作用することで酵母の代謝過程が菌体の増殖の方向に促進されることによるものと考えられる。なお、上記所定の（５種の）微量元素の含有量（元素換算の合計含有量）は、好ましくは０．０００９ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．００１０ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは０．００１１ｇ／Ｌ以上である。また、上記所定の（５種の）微量元素の含有量（元素換算の合計含有量）は、好ましくは０．０００８〜０．００１２ｇ／Ｌである。なお、これらの（５種の）微量元素のそれぞれの含有量（元素換算）の割合について特に制限はないが、本発明の効果をよりいっそう発揮させるという観点から、ホウ素原子の含有量を１質量部としたときに、鉄原子が５〜９質量部、カルシウム原子が５〜９質量部、銅原子が４〜８質量部、マンガン原子が３〜７質量部である。また、より好ましくは、ホウ素原子の含有量を１質量部としたときに、鉄原子が６〜８質量部、カルシウム原子が６〜８質量部、銅原子が５〜７質量部、マンガン原子が４〜６質量部である。

なお、上記所定の微量元素が培地中に含有される形態について特に制限はなく、鉄源としては２価または３価の鉄の塩化物、硫酸塩、臭化塩、硝酸塩など（例えば、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、これらの水和物など）が挙げられる。カルシウム源としてはカルシウムの塩化物、炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩など（例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、これらの水和物など）が挙げられる。銅源としては、銅の硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、臭化塩、など（例えば、硫酸銅、リン酸銅、酢酸銅、臭化銅、これらの水和物など）が挙げられる。ホウ素源としては、ホウ酸などが挙げられる。マンガン源としては、マンガンの硫酸塩、硝酸塩など（例えば、硫酸マンガン、硝酸マンガン、これらの水和物など）が挙げられる。

また、本形態に係る酵母培養用培地は、上記所定の（５種の）微量元素以外の微量元素をさらに含有してもよい。上記所定の微量元素以外の微量元素としては、例えば、ナトリウム、コバルト、亜鉛、硫黄、ニッケルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

（ｐＨ）
本形態に係る酵母培養用培地のｐＨに特に制限はないが、一般的に酵母の培養は弱酸性条件下において行うことが好ましいことから、好ましくは５．０〜７．０であり、より好ましくは５．５〜６．５である。特に、後述する実施例において用いられている酵母であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等のヤロウィア属の培養に好適である。ここで、酵母培養用培地のｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定することができる。なお、培地のｐＨは、硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、クエン酸等の酸；または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、等の塩基をｐＨ調整剤として用いることにより調整することができる。

（酵母）
本形態に係る酵母培養用培地で培養される酵母としては、特に制限されないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の酵母が好ましく用いられる。

本発明の酵母培養用培地では、これらの酵母のうち、油分分解活性の高いヤロウィア属の酵母の培養効率をより向上させることができる。ヤロウィア属の酵母としては、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ４８４３６、ヤロウィア・リポリティカＮＢＲＣ１５４８、ヤロウィア・リポリティカＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８１３）、ヤロウィア・リポリティカＮＢＲＣ０７４６、ヤロウィア・リポリティカＮＢＲＣ１２０９のようなヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ヤロウィアＹＨ−０１のようなヤロウィアスピーシーズ（Ｙａｒｒｏｗｉａｓｐ．）等が例示できるが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がより好ましく、ヤロウィア・リポリティカＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８１３）がさらに好ましい。なお、上述の酵母は、ＡＴＣＣ、ＮＢＲＣ、ＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。

（酵母培養用培地の調製方法）
上述したように、本形態に係る酵母培養用培地は、液体培地である。本形態に係る培地の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、炭素源（グリセロールを必須に含む）、窒素源、リン源、マグネシウム源、および上記所定の微量元素を水に代表される溶媒に溶解することで調製することができる。酵母培養用培地のｐＨを調製する必要がある場合、ｐＨ調整剤として、上述した酸やアルカリを用いればよい。また、必要に応じて消泡剤を添加してもよい。

＜酵母の培養方法＞
本発明の一形態によれば、上記酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法が提供される。

本発明に係る酵母の培養は、通常の方法によって行うことができる。酵母の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で培養する。前者の場合には、酵母の培養は、振とうあるいは通気撹拌などによって行われる。また、酵母を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、適宜選択され、本発明に係る酵母が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する酵母の種類に応じて適宜選択されうる。また、酵母培養培地に添加する菌体量についても、特に制限されず、適宜調整することができる。

培養温度は、通常１５〜５０℃であり、好ましくは２５〜４０℃である。

培養時間は、特に制限されず、培養条件、培養後の酵母の使用形態などによって異なる。

本発明に係る酵母培養用培地を用いることにより、酵母の培養効率を高め、培地の単位容積あたりの菌体重量を増加させることができる。例えば、後述する実施例に記載の方法で培養した場合、従来使用されているＹＭ培地を含むジャーファーメンター中でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を培養すると、７２時間培養しても得られる菌体重量は４０ｇ／Ｌに満たない。これに対し、本発明に係る酵母培養用培地を用いることで、同じ培養条件下において得られる菌体重量を７倍以上に増加させることができる。

上述のとおり、本発明に係る酵母培養用培地は、従来の培地に比べて、酵母を高い培養効率で増殖させることができる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

≪酵母培養用培地の調製≫
（実施例１）
下記表１の組成となるように、各成分を蒸留水に溶解し、実施例１の酵母培養用培地を調製した。なお、微量元素（Ｆｅ、Ｃａ、Ｃｕ、Ｂ、Ｍｎ）については、水１００ｍＬに対してＦｅ０．０３ｗ／ｖ％、Ｃａ０．０２ｗ／ｖ％、Ｃｕ０．０２ｗ／ｖ％、Ｂ０．００５ｗ／ｖ％、Ｍｎ０．０２ｗ／ｖ％の濃度となるように下記表１に記載の成分を溶解させた濃縮溶液を予め調製しておき、これを下記表１に記載の濃度となるように添加することにより培地を調製した。

（比較例１）
下記表２の組成となるように、各成分を蒸留水に溶解し、比較例１の酵母培養用培地（ＹＭ培地）を調製した。

（比較例２）
微量元素を配合しなかったこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、比較例２の酵母培養用培地を調製した。

（比較例３）
微量元素の配合量を半量としたこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、比較例３の酵母培養用培地を調製した。

（比較例４）
グリセロールの濃度を１／３量（５０ｇ／Ｌ（＝５ｗ／ｖ％））としたこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、比較例４の酵母培養用培地を調製した。

（比較例５）
グリセロールの濃度を１／３量（５０ｇ／Ｌ（＝５ｗ／ｖ％））としたこと以外は、上述した比較例２と同様の手法により、比較例５の酵母培養用培地を調製した。

（比較例６）
グリセロールの濃度を１／３量（５０ｇ／Ｌ（＝５ｗ／ｖ％））としたこと以外は、上述した比較例３と同様の手法により、比較例６の酵母培養用培地を調製した。

≪種培養≫
坂口フラスコ４本に上記で調整した実施例および各比較例の培地を各１００ｍＬ入れ、滅菌した。

次いで、各フラスコに酵母（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））を一白金耳ずつ植菌し、３０℃にて７２時間振とう培養した。

≪ジャーファーメンターでの培養≫
上記で調整した実施例および各比較例の培地のそれぞれについて、以下の手法によりジャーファーメンターを用いた培養を行った。

まず、ジャーファーメンターに培地を５Ｌ入れ、滅菌した。次いで、上記で種培養を行った培養液を４００ｍＬ添加し、３０℃にて７２時間培養した。この際、ｐＨ６±０．１となるように、水酸化ナトリウムおよび硫酸を用いてｐＨを調整した。

≪集菌≫
ジャーファーメンターでの培養物について、遠心分離機を用いて菌を沈殿させた後、上清を捨てて菌体重量を測定した。結果を下記の表３に示す。

表３に示す結果からわかるように、実施例１では比較例１〜６のそれぞれと比較して培養効率（菌体重量）が大幅に増加した。特に、酵母の培養用培地として従来汎用されてきたＹＭ培地を用いた場合と比較すると、７倍以上と飛躍的に培養効率（菌体重量）が増加したことがわかる。

Claims

炭素源と、窒素源と、リン源と、マグネシウム源と、溶媒と、を含有する酵母培養用培地であって、
前記炭素源が１００ｇ／Ｌ超のグリセロールを含み、
鉄、カルシウム、銅、ホウ素、およびマンガンからなる微量元素をこれらの元素換算の合計量で０．０００８ｇ／Ｌ以上含有し、かつ、
前記微量元素の含有量が、０．０００８〜０．００１２ｇ／Ｌであることを特徴とする、酵母培養用培地。
前記グリセロールの含有量が、１５０〜２５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の酵母培養用培地。
前記微量元素の含有量（元素換算）が、ホウ素原子の含有量を１質量部としたときに、鉄原子が６〜８質量部、カルシウム原子が６〜８質量部、銅原子が５〜７質量部、マンガン原子が４〜６質量部である、請求項１または２に記載の酵母培養用培地。
前記窒素源が無機窒素源である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
前記無機窒素源が、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニアおよび尿素からなる群から選択される、請求項４に記載の酵母培養用培地。
前記酵母が、ヤロウィア属、キャンディダ属、ピキア属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、およびトリコスポロン属からなる群から選択される酵母である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
前記酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項６に記載の酵母培養用培地。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法。