CN105586290A - 一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株及其应用，所述菌株为卓贝尔氏菌(Zobellella？taiwanensis)DN-7，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC？NO：M2015648，该菌株能够耐受浓度高达2000ppm的氨氮废水；本发明还公开了利用该菌株处理氨氮废水的方法，具体为取OD600大于2.0的菌液，接种至待处理的氨氮浓度不高于2000ppm的氨氮废水中，维持溶氧在2.0ppm以上发酵即可处理氨氮废水，并且氨氮和总氮去除效果明显，亚硝态氮和硝态氮没有增加，本发明方法简单，在污水处理工程中有很好的应用价值。

Description

一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株，还涉该菌株的应用。
背景技术
在当今世纪，环境问题是威胁人类生存的一个重大问题，在发展中国家尤为突出。最近的研究报告表明，人类工业生产、农业化肥施用和化石燃料燃烧等活动向环境中排放的氮素含量正在显著的增加，这些过度排放的氮素会造成极大的环境问题，如N2O会导致全球变暖，水体中氮素水平的增加会导致水体富营养化，威胁人类健康。氨氮作为氮循环过程中一种重要的无机物，是导致水体富营养化的罪魁祸首之一。我国由于经济的迅速发展，工农业生产活动加剧，向环境中排放的氨氮也是增长迅速，2013年，我国一年内排放的氨氮量达到了245万吨。严重威胁水体健康。为了控制水体污染，我国颁布了非常严格的污染物控制标准，其中氨氮的一级标准为1.0mg/L。
目前，去除氨氮最经济有效的方法是生物法，主要过程是通过一系列微生物作用将氨氮转化为氮气后予以排放，而这一过程在绝大多数的污水处理设施中是由硝化细菌和反硝化细菌共同完成的，即先由自养硝化细菌将氨氮氧化为亚硝酸盐和硝酸盐，再由异养反硝化细菌还原亚硝酸盐和硝酸盐为氮气。随着科学的发展，新的研究已经发现有一些特殊的异养硝化菌只靠自身的作用便可将氨氮直接降解为氮气。这些异养硝化细菌，生长速度远大于自养硝化细菌，能耐受较高浓度的氨氮，应对环境的冲击能力更强。
欧洲、日本等是比较早对异养硝化微生物进行研究的地区和国家，相较于国外，我国起步较晚，但近来来也取得了很大的进展。也出现了大量的关于异养硝化微生物的专利，如汪苹等人的具有异养硝化－好氧反硝化性能的蜡状芽孢杆菌专利；北京大学的在高盐度条件下作用的异养硝化菌，小短杆菌(Brachybacterium)；哈工大的低温条件下作用的异养硝化菌，哈工大异养硝化不动细菌L7。但是目前还缺少高效去除高浓度氨氮的异养硝化菌，因此筛选高效去除高浓度氨氮的微生物仍是异养硝化微生物的重要研究内容，而且目前还未见到关于卓贝尔氏菌作为异养硝化微生物的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株；本发明的目的之二在于提供具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株在处理氨氮废水中的应用；本发明的目的之三在于提供利用具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株处理氨氮废水的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
1、一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株，其特征在于：所述菌株为卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)DN-7，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2015648。该菌株能够高效去除浓度高达2000ppm的氨氮废水。
2、所述具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株在处理氨氮废水中的应用。
优选的，所述氨氮废水为氨氮浓度不高于2000ppm的废水。
3、利用所述具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株处理氨氮废水的方法，包括如下步骤：取OD600大于2.0的卓贝尔氏菌DN-7菌液，接种至待处理的氨氮浓度不高于2000ppm的氨氮废水中，维持溶氧在2.0ppm以上发酵即可。
本发明中，所述卓贝尔氏菌DN-7的接种量优选为10％。
本发明中，所述发酵使用的培养基为C/N为8～10的培养基，在此范围内氨氮去除率能达到80％以上，考虑成本影响，更优选的，使用C/N为8的培养基。
本发明中，所述发酵使用的培养基是以柠檬酸钠为碳源的培养基。
本发明中，所述发酵的pH值为8～10。
本发明中，所述发酵的盐度为质量分数不高于3％。
本发明中，所述发酵使用的培养基各组分浓度如下：柠檬酸钠9.1g/L；(NH4)2SO41.0g/L；K2HPO45.0g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4·7H2O0.2g/L；微量元素溶液2mL/L；余量为水，pH＝8.0；
所述微量元素溶液各组分浓度如下：EDTA·2Na57.1g/L；ZnSO4·7H2O3.9g/L；CaCl2·2H2O7.0g/L；MnCl2·4H2O5.1g/L；FeSO4·7H2O5.0g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O1.1g/L；CuSO4·5H2O1.6g/L；CoCl2·6H2O1.6g/L；余量为水，pH＝6.0。
本发明的有益效果在于：本发明经过筛选获得高效去除氨氮的优良菌株，不但能够耐受高浓度氨氮的废水，而且去除氨氮效果好，1000ppm氨氮在5天之内大部分被去除，去除率达90％以上，2000ppm氨氮在9天之内去除效率最大化，去除率为80％以上；同时亚硝态氮和硝态氮没有增加，本发明还公开了利用该菌株处理氨氮废水的方法，方法简单，在污水处理工程中有很好的应用价值。
菌种保藏
本发明的卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)DN-7活性污泥、垃圾渗滤液中筛选获得，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2015648，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年10月28日，分类命名为卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)DN-7。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1不同碳源对DN-7去除氨氮的影响。
图2不同C/N对DN-7去除氨氮的影响。
图3不同pH值对DN-7去除氨氮的影响。
图4不同温度对DN-7去除氨氮的影响。
图5不同转速对DN-7去除氨氮的影响。
图6不同盐度对DN-7去除氨氮的影响。
图7利用DN-7实际处理高浓度氨氮废水的作用图(符号：总氮(TN，□，■)；铵态氮(NH4 +-N，◇，◆)；亚硝态氮(NO2 --N，△，▲)；硝态氮(NO3 --N，○，●)。白色和黑色符号分别代表1000mg/L和2000mg/L初始NH4 +-N的废水处理实验组)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所使用的培养基配方如下：
(1)LB固体平板培养基：胰蛋白胨10.0g；酵母粉5.0g；NaCl10.0g；琼脂粉20.0g；蒸馏水1L。
(2)LB培养基：胰蛋白胨10.0g；酵母粉5.0g；NaCl10.0g；蒸馏水1L。
(3)硝化培养基：柠檬酸钠9.1g；(NH4)2SO41.0g；K2HPO45.0g；KH2PO42.0g；MgSO4·7H2O0.2g；微量元素溶液2mL；蒸馏水1LpH＝8.0。其中微量元素溶液组成如下：EDTA·2Na57.1g；ZnSO4·7H2O3.9g；CaCl2·2H2O7.0g；MnCl2·4H2O5.1g；FeSO4·7H2O5.0g；(NH4)6MO7O24·4H2O1.1g；CuSO4·5H2O1.6g；CoCl2·6H2O1.6g；蒸馏水1L，pH＝6.0。
本发明的培养和发酵条件：
LB固体平板培养基培养条件：30℃培养1天，培养成熟后放在4℃冰箱中保存。
LB培养基培养条件：LB培养基在121℃灭菌20min，灭菌后接入固体平板培养基菌种，30℃震荡培养24h左右。
硝化培养基培养条件：硝化培养基在121℃灭菌20min，灭菌后按接种量为1％接入LB液体培养基培养的菌种，30℃震荡培养36h左右。
实施例1、高效去除氨氮菌的筛选与鉴定
高效去除氨氮菌从活性污泥、垃圾渗滤液中筛选，将分离获得的各菌株分别接入装有100ml硝化培养基的250ml广口三角瓶中，置于摇床中于30℃、150rpm培养36h，取出培养液接种到LB培养基中，在温度为30℃条件下震荡培养至菌浓度为OD600＝2.0后，以1％的接种量接入含待处理的氨氮浓度小于2000ppm高氨氮废水的硝化培养基中，维持溶氧在2.0ppm以上。3天之后连续取废水离心测上清氨氮浓度，结果获得氨氮去除效率最高的菌株。
其中氨氮去除效率测定方法如下：取出培养液10000g离心2min以上去除菌体，对上清液中的氨氮进行测量并计算氨氮去除效率。氨氮测定方法采用纳氏试剂分光光度法参考国家标准方法HJ535-2009。
氨氮去除效率(removalefficiency，RE)计算公式为：
RE＝(A－B)/A×100％
式中：A为初始氨氮浓度；B为最终氨氮浓度。
将筛选获得菌株通过16SrRNA测序并在NCBI中比对，结果显示分离获得的菌种属于卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)，菌株命名为卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)DN-7。
实施例2、应用卓贝尔氏菌DN-7处理含氨氮废水
卓贝尔氏菌DN-7处理含氨氮废水的方法，具体步骤如下：
将卓贝尔氏菌DN-7菌种接种到LB培养基中，在温度为30℃条件下震荡培养至菌浓度为OD600＝2.0后，以1％的接种量接入含待处理的氨氮浓度小于2000ppm高氨氮废水的硝化培养基中，维持溶氧在2.0ppm以上。3天之后连续取废水离心测上清氨氮浓度。
结果显示，本发明获得的卓贝尔氏菌DN-7氨氮和总氮去除效果明显，亚硝态氮和硝态氮没有增加。本发明工艺简单，可耐受并快速降解高浓度废水、维持水系pH稳定、无二次污染，该菌在污水处理工程中有很好的应用价值。
实施例3、卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响因子
1、碳源对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
各选取甲醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠，作为硝化培养基的唯一碳源，各碳源质量皆使培养基中C/N＝12，硝化培养基的其他成分为：(NH4)2SO4，1.0g；K2HPO4，5.0g；KH2PO4，2.0g；MgSO4·7H2O，0.2g；微量元素溶液，2mL；蒸馏水1L，pH＝8.0。将卓贝尔氏菌DN-7接种至含待处理的氨氮浓度小于2000ppm高氨氮废水的硝化培养基中，震荡培养36h后，按实施案例1进行测算，结果如图1所示。结果显示，说明卓贝尔氏菌DN-7利用蔗糖、丁二酸钠和柠檬酸钠的氨氮去除率都能达到60％以上，柠檬酸钠的氨氮去除最高达到80.4％，所以选择柠檬酸钠作为后续实验培养基的碳源。
2、C/N对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
将培养好的LB种子液分别接入C/N为2、4、6、8、10、12、16、20的硝化培养基，加入氨氮废水至氨氮浓度小于2000ppm，震荡培养36h后，按实施案例1进行测算。结果如图2所示。结果显示，卓贝尔氏菌DN-7在C/N＝8和10时氨氮去除率都能达到80％以上，所以考虑成本影响，选择C/N＝8作为后续实验培养基的碳源。
3、pH值对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
将培养好的LB种子液分别接入pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的硝化培养基，加入氨氮废水至氨氮浓度小于2000ppm，震荡培养36h后，按实施案例1进行测算。结果如图3所示，结果显示卓贝尔氏菌DN-7在pH＝8、9、10时氨氮去除率都能达到90％以上，因此DN-7作用于废水的最佳pH值范围在8～10。
4、温度对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
将培养好的LB种子液接入硝化培养基，加入氨氮废水至氨氮浓度小于2000ppm，分别在20℃、25℃、30℃、37℃、42℃等不同温度下震荡培养36h后，按实施案例1进行测算。结果如图4所示，结果显示卓贝尔氏菌DN-7在30℃时，氨氮去除率最高。
5、溶氧对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
将培养好的LB种子液接入硝化培养基，加入氨氮废水至氨氮浓度小于2000ppm，在0、50、100、150、200rpm不同的摇床转速下，30℃培养36h后，按实施案例1进行测算。结果如图5所示，结果显示摇床转速大于150rpm(对应溶解氧为3.2ppm左右)时，卓贝尔氏菌DN-7氨氮去除率已达到最高，再升高转速也不会提高氨氮去除率。
6、盐度对卓贝尔氏菌DN-7去除氨氮的影响
将培养好的LB种子液分别接入盐度为0％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％的硝化培养基，加入氨氮废水至氨氮浓度小于2000ppm，震荡培养36h后，按实施案例1进行测算。结果如图6所示，结果显示当盐度大于3％时，卓贝尔氏菌DN-7的氨氮去除效率会明显降低，表明盐度的多少并不会对卓贝尔氏菌DN-7的氨氮去除效率产生有益影响。因此卓贝尔氏菌DN-7适用于盐度不超过3％的废水。
实施例4、卓贝尔氏菌DN-7的应用
取生活污水分别配制出1000ppm和2000ppm高浓度氨氮的废水，加入含柠檬酸钠(C/N＝8)的硝化培养基，pH初始值为8.4，各取500mL废水加入2L烧杯中，加入1％已培养好的卓贝尔氏菌DN-7菌液，置于室温(18～25℃)之下，利用曝气装置维持溶氧在2.0ppm以上，同时以不加卓贝尔氏菌DN-7菌液的废水为对照，连续观察处理效果。取样离心去沉淀，检测上清液的氨氮、总氮、亚硝态氮和硝态氮含量，检测结果如图7所示。
结果显示，1000ppm氨氮在5天之内大部分被去除，去除率达90％以上，2000ppm氨氮在9天之内去除效率最大化，去除率为80％以上。随着氨氮的去除同时，总氮也随之下降，下降趋势与氨氮的下降趋势呈正相关性，总氮最终降解效果在80％以上。试验过程中亚硝态氮有少量的产生，但随着时间的推移逐步消失，而硝态氮基本没有积累。整个试验体系的pH值稳定在9.2左右。因此可以看出卓贝尔氏菌DN-7不仅可以耐受高浓度氨氮的废水，并且可以对其进行有效的处理，是一株在污水处理中具有良好应用前景的微生物。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株，其特征在于：所述菌株为卓贝尔氏菌(Zobellellataiwanensis)DN-7，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2015648。
2.权利要求1所述具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株在处理氨氮废水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述氨氮废水为氨氮浓度不高于2000ppm的废水。
4.利用权利要求1所述具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株处理氨氮废水的方法，其特征在于，包括如下步骤：取OD600大于2.0的卓贝尔氏菌DN-7菌液，接种至待处理的氨氮浓度不高于2000ppm的氨氮废水中，维持溶氧在2.0ppm以上发酵即可。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述卓贝尔氏菌DN-7的接种量为10％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵使用的培养基为C/N为8～10的培养基。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵使用的培养基为以柠檬酸钠为碳源的培养基。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵的pH值为8～10。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵的盐度为质量分数不高于3％。
10.根据权利要求4～9任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵使用的培养基各组分浓度如下：柠檬酸钠9.1g/L；(NH4)2SO41.0g/L；K2HPO45.0g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4·7H2O0.2g/L；微量元素溶液2mL/L；余量为水，pH＝8.0；
所述微量元素溶液各组分浓度如下：EDTA·2Na57.1g/L；ZnSO4·7H2O3.9g/L；CaCl2·2H2O7.0g/L；MnCl2·4H2O5.1g/L；FeSO4·7H2O5.0g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O1.1g/L；CuSO4·5H2O1.6g/L；CoCl2·6H2O1.6g/L；余量为水，pH＝6.0。
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