KR101751928B1 - 유류 제거용 조성물 및 이를 이용한 유류 제거 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유류 제거용 조성물 및 이를 이용한 유류 제거 방법을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모 배양시에 콜라겐 또는 콜라겐과 가바를 첨가하여 얻어진 이들 미생물 배양액을 이용한 유류 제거용 조성물 및 이를 이용한 유류 제거 방법을 개시한다.

Description

유류 제거용 조성물 및 이를 이용한 유류 제거 방법 {Composition for Eliminating Petroleum Hydrocarbons and a Method for Purifying Petroleum Hydrocarbons Using the Same}
본 발명은 유류 제거용 조성물 및 이를 이용한 유류 제거 방법에 관한 것이다.
오늘날의 산업은 기계공업을 근간으로 하고 있는데, 거의 모든 기계는 윤활유나 연료와 같은 유류를 직접적으로 필요로 한다. 특히 차량의 수요가 높은 현대 생활에 있어서 각종 차량에 의해 소비되는 유류는 그 양을 측정할 수 없을 만큼 대량이며, 유류의 운송과 저장 그리고 사용 중에 필연적으로 상당량의 유류가 외부로 유출되어 토양, 해양 등을 오염시킬 수밖에 없다.
유류 제거 방법은 크게 물리적 방법과 화학적 방법 그리고 생물학적 방법으로 대별하여 볼 수 있다.
물리적 방법은 토양 세척, 소각 등을 들 수 있으나, 토양 세척의 경우 오염된 땅을 굴착한 후 굴착된 토양을 세척하기 때문에 세척 설비가 있는 곳으로 굴착된 토양을 이송하여야 하는 불편이 있으며, 세척에 따른 슬러지와 오수의 발생 등 이차적인 환경 오염을 야기할 수 있다.
화학적 방법으로는 고형화, 안정화 및 용매 추출, 산화처리 등의 방법이 있으며, 비교적 처리기간이 짧지만 처리 비용이 고가인 단점이 있다.
상기 화학적 방법 중 산화처리는 일반 산화제보다 훨씬 강력한 산화력을 가진 OH-를 생성시켜 각종 오염물을 최종적으로 CO2와 H2O로 산화분해시키거나 난분해성 유기 성분을 생물 분해 가능한 유기물질로 전환시키는 기술로서, 이용되는 산화제로서는 Cl2, Ca(OCl), NaOCl, KMnO4, O3, H2O2 등을 들 수 있다. 상기와 같은 산화처리 방법 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 것은 펜톤(Fenton) 반응을 이용한 방법인데, 펜톤 반응은 산성 용액 중에서 H2O2가 Fe+2 와 반응하여 OH-를 생성시키는 고도산화반응의 한 방법으로서 무수한 부반응을 수반하나, 유기물 제거의 주요 반응은 상기 OH-를 생성시키는 것이며, 이 OH-가 유기물과 반응하여 유기성 래디컬(radical)를 생성시키고, 유기성 래디컬은 Fe+3이 Fe+2로 환원되면서 산화분해된다.
그에 따라, 최근에는 오존 주입에 의한 산화처리나, 과산화수소의 산화 반응시 철 이온의 촉매작용에 의해 보다 효과적인 화학적 산화를 일으키게 되는 상기 펜톤 반응의 원리를 이용하여 오염 토양 내에 과산화수소 또는 과산화수소와 철염을 주입하여 오염 토양 내 유기오염물과의 산화반응을 통하여 오염물을 제거하는 방법 등이 주목을 받고 있으며, 토양에 함유된 철광석 성분을 과산화수소의 활성화 촉매로 사용한 펜톤 유사반응에 의해 디젤 오염토양을 화학적으로 산화 처리하는 방법 등도 제시되고 있다.
그러나, 상기와 같은 산화처리에 관한 연구들은 대부분은 지중 처리(In-situ)기술로서, 오염토양에 대한 균일한 반응시약 주입 조건 설정과 과량 주입에 따른 시약 비용의 증가 등에 대한 어려움 특히, 고농도의 유류에 의해 오염된 토양의 경우 그 처리 효율과 경제성 측면에서 아직 해결되어야 할 과제들이 많다.
상기의 물리적 또는 화학적 방법 외에 생물학적인 방법으로는 토양 경작, 콤포스팅(composting), 바이오벤팅(bioventing), 식물 복원 등의 방법이 있는 바, 생물학적 방법은 복원 기간이 긴 반면 처리 비용이 상기의 두 방법에 비하여 저렴한 동시에 2차적인 환경 오염을 발생시키지 않는다는 장점이 있다.
특히, 토양을 치명적으로 오염시키는 유류는 그 분해에 비록 시간이 걸리기는 하지만 미생물에 의해 완전히 분해된다는 사실에 의거하여 근래에는 생물학적인 방법으로서 미생물학적 처리법이 개발됨으로써 더욱더 안전하고 경제적으로 유류 오염 토양을 회복시킬 수 있게 되었다.
본 발명은 생물학적 방법의 하나로서 유류 분해 활성이 뛰어난 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모의 결합체 배양물을 이용한 유류 제거 기술을 개시한다.
본 발명의 목적은 유류 제거용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유류 제거 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모의 배양시에 콜라겐을 첨가할 경우 이들 미생물 결합체가 형성되고, 특히 콜라겐 입자와 더불어 가바(GABA)를 첨가한 경우는 결합체가 장기간 유지되며 결합체의 크기가 커지는 것을 확인할 수 있었는데, 본 발명자들은 이들 미생물 결합체의 배양액이 디젤을 탄소원으로 이용하여 높은 효율로 디젤을 분해·제거함을 시험관 시험으로 확인하였으며, 나아가 유류 오염 지역의 토양 시료를 이용한 총 12주간의 현장 적용 평가 실험에서도 이들 미생물 결합체 배양액이 토양 시료 중의 석유계 총탄화수소(TPH)의 농도를 현저하게 떨어뜨리고(하절기:최초 3680 mg/kg에서 최종 1516 mg/kg로, 동절기: 최초 1077 mg/kg에서 최종 579 mg/kg로), 또한 철도 레일 주변에서 총 6주간 실시한 윤활유 분해·제거 활성에 대한 현장 평가 실험에 있어서도 석유계 총탄화수소의 농도를 현저하게 떨어뜨림을 확인할 수 있었다(실험군 1(경춘선 금곡역 부근)의 경우 최초 4081.30 mg/kg에서 최종 725.91 mg/kg로, 실험군 2(지하철 1호선 성북역 부근)의 경우 최초 2246.05에서 최종 242.24 mg/kg).
한편 본 발명자들은 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모의 배양시에 콜라겐이나 가바를 첨가하지 않고 얻은 배양액을 대조군으로 설정하고, 시험관 시험으로 디젤 분해·제거 활성을 평가하였을 때는 그 디젤 분해·제거 활성이 콜라겐 또는 콜라겐 및 가바가 첨가되었을 얻어진 미생물 결합체 배양액의 디젤 분해·제거 활성에 비해서 대략 40~50%의 수준이 그침을 확인할 수 있었다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 완성된 것이다.
일 측면에 있어서 본 발명은 유류 분해 제거용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유류 분해 제거용 조성물은 아래의 (a) 단계 내지 (c) 단계를 포함하는 미생물 배양물의 제조 방법에 의하여 얻어진 미생물 배양물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다:
(a) 광합성세균, 젖산균 및 효모 중 2종 이상의 미생물을 배양하기 위한 배지를 조제하는 단계,
(b) 상기 배지에 광합성세균, 젖산균 및 효모 중 2종 이상의 미생물을 접종하여 배양하는 단계, 및
(c) 상기 (a) 단계의 배지 조제시에 또는 (b) 단계의 배양 중에 콜라겐 입자를 첨가하는 단계
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성인 유류 분해 제거 활성을 나타내거나 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 사용되었을 때가 단독으로 사용된 경우에 비하여 더 높은 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유류"란 원유(석유) 또는 이로부터 유래되고 분리·정제된 모든 것을 포함하는 의미이다. 예컨대 휘발유, 등유, 경유, 디젤유, 벙커C유, 제트유, 항공유의 연료유와 엔진오일, 기어오일, 솔벤트, 그리스, 브레이크유 등의 윤활유를 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, 상기 "미생물 배양물"이란 배양 원액 자체뿐만 아니라 배양 원액을 농축한 액상의 농축물(즉 농축액) 및 그 분말상의 농축물을 포함하는 의미이다.
한편 광합성세균이란 일반적으로 고등식물과 같이 빛 에너지를 이용하여 탄소 동화작용을 행하는 세균을 말한다. 이러한 광합성세균은 클로로비움속 세균(Chlorobium sp .), 크로마튬속 세균(Chromatium sp .), 로도스피릴륨속 세균(Rhodospirillum sp .), 로돕센도모나스속 세균(Rhodopsendomonas sp .), 로도박터속 세균(Rhodobacter sp .), 로돕슈도모나스속 세균(Rhodopseudomonas sp .) 등이 있으며, 본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 있어서는 이들 모든 광합성 세균이 사용될 수 있으나, 아래의 실시예를 고려할 때 사용될 수 있는 광합성세균으로서는 로돕슈도모나스속 세균(Rhodopseudomonas sp .), 특히 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)가 바람직하다.
젖산균이란 포도당 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 미생물을 의미하는데, 본 명세서에서 젖산균은 락토바실루스속 젖산균(Lactobacillus sp .), 스트렙토코쿠스속 젖산균(Streptococcus sp .), 페디오코쿠스속 젖산균(Pediococcus sp .), 류코노스톡속 젖산균(Leuconostoc sp .) 및 비피도박테리움속 젖산균(Bifidobacterium sp .)을 포함하는 의미이며, 구체적으로는 락토바실루스 엑시도파일러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 등을 포함하는 의미이다. 본 발명의 방법에는 이러한 젖산균 모두를 사용할 수 있다. 그러나 하기 <실시예>에서 락토바실루스 엑시도파일러스나 락토바실루스 플란타룸이 사용되었다는 점에서, 바람직하게는 락토바실루스속 젖산균을 사용하는 경우이며, 특히 락토바실루스 엑시도파일러스나 락토바실루스 플란타룸을 사용하는 경우이다.
또한 본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 사용될 수 있는 효모도 사카로마이세스속 효모라면 어떠한 것이든 사용될 수 있다. 따라서 사카로마이세스 루시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cereviciae), 사카로마이세스 오비폴미스(Saccharomyces oviformis), 사카로마이세스 스테이네리(Saccharomyces steineri) 등이 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 하기 실시예에서 사용된 사카로마이세스 세레비시에를 사용하는 경우이다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 사용되는 젖산균, 효모 및 광합성세균은 생명공학 관련 회사에서 판매하는 것을 구입하여 사용하거나 국내외 미생물 기탁기관(생명공학연구원 유전자은행, 한국미생물보존센타, 한국농용미생물보존센터, ATCC(American Type Culture CollectionAsociacin))으로부터 분양받아 사용할 수 있다. 필요에 따라서 직접 균주를 분리하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에서 사용되는 콜라겐은 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모가 결합체를 형성함에 있어서 매개체의 역할을 하며, 그 결과 콜라겐이 매개체가 되어 얻어진 미생물 결합체의 배양물은 콜라겐이 첨가되지 않고 얻어진 미생물 배양물에 비하여 현저히 높은 유류 분해 활성을 가진다.
콜라겐은 포유동물의 몸에서 연골(Cartilage), 힘줄(Tendeon) 등을 구성하는 단백질이며 또 세포 간 결합에 관여하는 단백질이다. 본 발명자들은 콜라겐의 이러한 특성에 착안하여 미생물 결합체의 형성에 있어 콜라겐을 매개체로 사용한 것이다. 콜라겐이 배지에 첨가되지 않을 경우 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모가 공동으로 배양될 수 있다고 하더라도(즉 공생 관계를 형성한다고 하더라도) 결합체는 얻어지지 않으며, 아래의 실험예에서 확인할 수 있듯이 결합체가 얻어지지 않음으로써 유류 분해 활성이 현저히 낮아지게 된다. 따라서 본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 있어서 콜라겐의 사용은 미생물 결합체를 얻고 또 결과적으로 유류 분해 활성을 높이기 위하여 반드시 첨가되어야 하는 첨가제라고 할 수 있다. 이러한 콜라겐은 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모를 배지에 접종하여 배양을 시킨 후에 배지에 첨가하여 사용하거나, 배지 조제 시에 첨가하여 사용할 수 있다. 배양시킨 후 첨가하는 경우 배양 시작 후 12시간 전후로 첨가하는 것이 바람직하다. 콜라겐의 첨가량은 어떤 경우든 배지 100 중량부 기준 0.3 중량부 내지 2.0 중량부의 범위로 첨가될 수 있다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 사용하기 위한 콜라겐은 분말 형태로 사용할 수 있으며, 또 콜라겐의 입자 크기(입도)는 배지에 균일하고 용이하게 혼합되도록 하기 위해서 작을수록 바람직하겠지만, 콜라겐의 입자 크기가 크더라도 미생물 결합체의 형성에는 무방하다. 통상은 평균입도가 0.001㎛ 내지 0.0005mm의 범위의 콜라겐 분말을 사용하게 될 것이다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 있어서, 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모를 배양하기 위한 배지는 위 미생물들의 배양에 적합한 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등을 포함하여 조제될 수 있다. 위 미생물들의 배양에 적합한 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등은 당업계에 공지되어 있는데, 구체적으로는 대한민국 특허출원 제19950031490호, 대한민국 특허출원 제1019910018012호, 대한민국 특허출원 제1019940001029호, 대한민국 특허출원 제019990050363호, 대한민국 특허출원 제1020060049936호, 문헌(김재범, 산업용 배지를 이용한 고핵산 효모의 고농도 세포 유가배양, 2001, 동의대 석사학위 논문) 등에 개시된 바를 참조할 수 있다. 이러한 배지는 우유, 감자, 혈액, 토마토 분쇄액, 쌀겨 분쇄물, 두유, 당밀 등 천연물을 사용한 자연배지이거나, 영양 성분을 인위적으로 조성한 합성배지일 수 있으며, 고체배지이거나 액체배지일 수 있다. 바람직하게는 대량 배양을 위해서 그리고 경제적인 측면에서 자연배지를 사용하는 경우이며 또한 액체배지를 사용하는 경우이다.
한편 배양 조건의 경우 혐기적 조건이든 호기적 조건이든 무방하고, 암 배양 조건이든, 광 배양 조건이든 무방하다. 광합성세균, 젖산균 및 효모 모두 혐기적 조건과 호기적 조건 모두에서 배양이 가능하다. 광합성세균의 경우 암 배양 조건에서는 종속영양을 한다는 것이 당업계에 알려져 있다. 배양 온도의 경우 20℃ 내지 45℃ 범위 내에서 배양이 가능하며, 배지의 pH의 경우 4.0 내지 7.5 범위, 특히 6.0 내지 7.5의 범위로 조절되는 것이 바람직하다. 다만 젖산균의 증식 특성을 고려할 때 혐기적 조건이 바람직할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 있어서, 배양 방법은 회분식 배양이든, 연속식 배양이든 무방하다.
멸균 방법도 당업계에 공지된 임의의 멸균 방법을 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 실시예에서 사용한 고압 증기 멸균, 자외선을 이용한 멸균 방법 등이 적합하다.
본 발명의 유효성분인 미생물 배양물의 제조에 있어서, 가바(GABA, Gamma-amino butyris acid)를 배지에 첨가하여 배양하는 것이 바람직하다.
가바는 포유류의 뇌속에 존재하는 아미노산으로서 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 글루타메이트로부터 생성되는 신경전달물질을 말한다. 가바는 혈관의 운동을 활성화시켜 혈압을 저하시키고(Kayahara H. and Sgiura D., Food & Development., 36(6):4-6, 2001), 뇌기능 개선작용을 하여 정신안정 및 학습능력을 증가시킨다고 알려져 있다(Ishikawa K. and Saito S., Psychopharmacology, 56:127-131, 1978; Akaga T., Food & development, 36(6):7-9, 2001).
가바가 첨가될 경우 미생물 결합체의 결합 상태가 첨가되지 않을 경우에 비하여 장기간 유지시키고, 미생물 결합체의 크기를 크게 하는 효과가 있으며, 미생물 결합체는 자연적인 상태에서 형성되지 않는 인위적인 것이므로 결합에 따른 스트레스가 미생물 상호 간에 작용하여 자연 상태(결합된 상태가 아닌 독립된 상태)로 되돌아가려는 경향을 띠게 된다. 본 발명자들은 가바의 첨가가 상기와 같은 효과를 갖는 이유를 결합체에서의 미생물 상호 간의 스트레스를 감소시켜 결합체의 유지를 지속시키는 것으로 보고 있다.
가바가 첨가되어 미생물 결합체가 커지게 되면 아래의 실험예에서 확인할 수 있듯이 결과적으로 유류 분해 활성이 높아진다.
가바의 첨가는 배지의 조제 시에 이루어지거나 배양 후에 이루어질 수 있다. 배양 후에 이루어질 경우 광합성세균, 젖산균 및/또는 효모를 배지에 접종하여 배양을 시작시킨 후 96시간 전후로 첨가하는 것이 바람직하다. 가바의 첨가량은 배지 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 1.5 중량부의 범위로 첨가될 수 있다.
한편 아래의 실시예 및 실험예로 제시되어 있지 않지만, 본 발명의 조성물의 유효성분인 미생물 배양물 더 정확히는 그 배양물 속에 포함된 미생물 결합체는 혐기적 조건에서도 그 유류 분해 활성이 호기적 조건에 비해서 특별히 낮아지지 않는다. 따라서 본 발명의 유류 제거용 조성물은 산소가 희박한 토양에(즉 지하로) 주입되더라도 보다 효과적으로 유류 분해 효과를 거둘 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 본 발명의 유류 제거용 조성물을 이용한 유류로 오염된 곳의 유류 제거 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유류 제거 방법은 전술한 바의 본 발명의 유류 제거용 조성물을 준비하는 단계 및 그 유류 제거용 조성물을 유류로 오염된 곳의 유류와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 유류로 오염된 곳은 유류로 오염된 토양, 유류로 오염된 강 또는 유류로 오염된 해양을 말한다. 유류로 오염된 토양은 예컨대 주유소의 토양과 그 주변 지역의 토양, 유류 저장 창고의 토양과 그 주변 지역의 토양, 윤활유의 사용이 잦은 철도 레일의 토양과 그 주변 지역의 토양, 자동차 정비소의 토양과 와 그 주변 지역 등을 들 수 있으며, 또 유류로 오염된 강 또는 해양은 예컨대 유조선으로부터 유류의 유출에 따라 오염된 강 또는 해양을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 유류 제거용 조성물을 유류와 접촉시키는 단계는 유류로 오염된 곳에 살포하거나 토양의 경우는 살포 이외에 토양과의 혼합, 토양에의 주입 등에 의해 이루어질 수 있다.
또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계 전후에 그 유류 제거용 조성물의 유류 제거 활성을 증진시키기 위하여(즉 그 배양액 중의 미생물의 유류 분해 활성을 증진시키기 위하여), 상기 유류 제거용 조성물과 함께 미생물의 증식·배양에 유용한 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등이 첨가되어 사용될 수 있다. 이들 성분들은 인위적으로 조성된 것이거나 우유, 감자, 혈액, 토마토 분쇄액, 쌀겨 분쇄물, 두유, 당밀 등 천연물일 수 있으며, 인위적 조성물과 천연물의 혼합물일 있다.
전술한 바와 같이 본 발명에 따르면 유류 제거용 조성물과 그 조성물을 이용한 유류 오염 토양의 유류 제거 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모의 결합체 배양액을 이용하는 생물학적 방법의 하나로서 물리적·화학적 방법에 가지는 부작용이 없이 안전한 방법이 될 수 있다.
도 1은 젖산균 Lactobacillus plantarum 및 광합성세균 Rhodopsuedomonas palustris 결합체의 현미경 사진이다.
도 2는 젖산균 Lactobacillus acidophilus 및 광합성세균 Rhodopsedomonas palustris 결합체의 현미경 사진이다.
도 3은 젖산균 Lactobacillus acidophilus , 효모 Saccaromyces cerevisiae 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 결합체의 현미경 사진이다.
도 4는 젖산균 Lactobacillus acidophilus , 효모 Saccaromyces cerevisiae 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 거대 결합체의 현미경 사진이다.
도 5는 토양 시료의 채취의 심도를 도시한 것이다.
도 6은 하절기의 오염 토양 시료에 유류 분해 활성이 가장 우수한 본 발명의 미생물 배양액을 처리하였을 때의 유류 분해 결과를 1주일 간격으로 나타낸 것이다.
도 7은 동절기의 오염 토양 시료에 유류 분해 활성이 가장 우수한 본 발명의 미생물 배양액을 처리하였을 때의 유류 분해 결과를 1주일 간격으로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 유류 제거용 미생물 제제로 사용할 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모 결합체 배양액의 제조
<실시예 1> 젖산균 Lactobacillus plantarum 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 의 결합체 배양액의 제조
상기 젖산균 및 상기 광합성세균의 결합체를 제작하기 위해서, 먼저 젖산균 및 광합성세균을 함께 배양시킬 수 있는 배지를 제조하였는데, 배지는 물 95ℓ, 게껍질 분쇄물 0.05kg, 다시마 분말 0.07kg, 생선 내장즙(생선 내장의 내용물을 제거하고 그 생선 내장을 열탕하여(물과 생선 내장의 중량비 2:1임) 얻은 것임) 0.1kg, 유박 분쇄물 0.02kg, 쌀겨 분쇄물 0.02kg, 당밀 3.24ℓ, 우유 1.5ℓ 및 콜라겐 분말 0.5kg 을 균일하게 혼합하여 제조하였다.
다음으로 상기 제조한 배지를 멸균 온도 121℃에서 20분 정도 멸균한 다음에, 그 배지를 약 15ℓ 용량의 발효용기에 넣고 종배양한 광합성세균 배양액 및 젖산균 배양액을 모두 5%(v/v)가 되게 접종하고 배양 온도 30℃, pH 6.5 조건 및 혐기적 조건으로 회분 배양하였다.
배양 시작 후 약 16일 정도가 지났을 때 배양액을 분리하여 배양된 미생물을 전자현미경으로 촬영하였다.
그 전자현미경 사진 3가지를 <도 1>에 나타내었다. <도 1>의 경과를 참조하여 보면 젖산균과 광합성세균이 서로 엉겨붙어 결합 관계를 이룸을 알 수 있다. <도 1>에서 검거나 하얀 작은 점 형태가 광합성세균이며 얇고 각진 막대 모양이 젖산균이다.
<실시예 2> 젖산균 Lactobacillus acidophilus 및 광합성세균 Rhodopsedomonas palustris 의 결합체 배양액의 제조
상기 <실시예 1>과 동일한 배지(콜라겐을 상기 <실시예 1>과 동일 양으로 포험하고 있음), 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 광합성세균을 약 16일 동안 배양하여 상기 젖산균과 상기 광합성세균의 결합체를 얻었다.
결과는 <도 2>에 나타내었는데, <도 2>에서 길고 굵은 막대 모양이 젖산균이고 검거나 하얀 작은 점 형태가 광합성세균이다.
<실시예 3> 젖산균 Lactobacillus acidophilus , 효모 Saccaromyces cerevisiae 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 의 결합체 배양액의 제조
상기 <실시예 1>과 동일한 배지(콜라겐을 상기 <실시예 1>과 동일한 양으로 포함하고 있음), 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 효모 그리고 상기 광합성세균을 약 16일 동안 배양하여 상기 젖산균과 효모 그리고 광합성세균의 결합체를 얻었다.
얻어진 결합체는 <도 3>에서 확인할 수 있는데, 길고 굵은 막대 모양이 젖산균이고, 타원형의 모양이 효모이며, 검거나 하얀 작은 점 형태가 광합성세균이다.
<실시예 4> 젖산균 Lactobacillus plantarum , 효모 Saccaromyces cerevisiae 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 의 결합체 배양액의 제조
상기 <실시예 1>과 동일한 배지(콜라겐을 상기 <실시예 1>과 동일 양으로 포함하고 있음), 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 효모 그리고 상기 광합성세균을 약 16일 동안 배양하여 상기 젖산균과 효모 그리고 광합성세균의 결합체를 얻었다. 다만 배양을 시작한 후 4일이 지났을 때 가바(GABA, Gamma Amino Butyric Acid)를 0.3kg 첨가하고 배양하였다.
결과를 <도 4>에 나타내었는데, 이 경우 가바의 첨가 효과로 거대 미생물 결합체가 형성되었다. <도 4>에서도 길고 굵은 막대 모양이 젖산균이고, 타원형의 모양이 효모이며, 검거나 하얀 작은 점 형태가 광합성세균이다.
< 비교예 > 젖산균, 광합성 세균 및/또는 효모 배양액의 제조
<비교예 1> 젖산균 Lactobacillus plantarum 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 의 배양액의 제조
콜라겐이 사용되지 않은 점을 제외하고는, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 상기 젖산균과 광합성 세균의 배양액을 제조하였다. 즉 동일한 배지, 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 광합성세균을 약 16일 동안 배양하여 미생물 배양액을 얻었다.
<비교예 2> 젖산균 Lactobacillus acidophilus 및 광합성세균 Rhodopsedomonas palustris 의 배양액의 제조
콜라겐이 사용되지 않은 점을 제외하고는, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 상기 젖산균과 광합성 세균의 배양액을 제조하였다. 즉 동일한 배지, 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 광합성세균을 약 16일 동안 배양하여 미생물 배양액을 얻었다.
<비교예 3> 젖산균 Lactobacillus acidophilus , 효모 Saccaromyces cerevisiae 및 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris 의 배양액의 제조
콜라겐이 사용되지 않은 점을 제외하고는, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 상기 젖산균과 광합성 세균 그리고 효모의 배양액을 제조하였다. 즉 동일한 배지, 동일 용량의 발효 용기 등을 사용하고, 동일한 용량으로 종균 배양액을 접종하고 동일한 발효 조건에서 동일한 공정으로 상기 젖산균과 상기 광합성세균 그리고 효모를 약 16일 동안 배양하여 미생물 배양액을 얻었다.
< 실험예 > 유류 제거 활성 시험관내 실험과 토양 유류 제거 활성 실험
< 실험예 1> 유류 제거 활성 시험관내 실험
유류 분해능 실험은 최소영양배지(증류수 1ℓ에 (NH4)2SO4 3g, Na2HPO4 2g, KH2PO4 4g, NaCl 1.5g, MgSO4ㆍ7H2O 0.7g, CaCl2 0.5g, FeCl3ㆍ6H2O 8.3mg 및 MnCl2ㆍ4H2O 1.4mg을 녹이고 pH 7.0으로 조정한 배지)에 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 디젤 2%(v/v) 디젤을 첨가하고 유류 분해 미생물 제제(상기 각 실시예 및 비교예의 미생물 배양액)를 2%(v/v)가 되도록 접종하고 30℃에서 5일간 진탕 배양한 후에 잔류한 디젤을 측정함으로써 이루어졌다.
배양액에 잔류한 디젤은 종래의 방법(EPA 3510C)에 따라 헥산으로 추출한 후, 모세관 컬럼(capillary aolumn; hp-5, 전장 30m, 직경 0.53mm, Hewlette Packard Co., U.S.A.) 및 FID(flame ionization detector) 검출기를 탑재한 기체크로마토그래피(GC-HP 6890, Hewlette Packard Co., U.S.A)를 사용하여 분석하였다. 디텍터와 인젝터의 운전 온도는 각각 250℃ 및 200℃ 이었다. 컬럼(오븐)온도는 처음 3분 동안은 45℃로 고정시킨 후 12℃/min의 속도로 275℃까지 증가시켰다. 운반기체(carrier gas)는 헬륨을 사용하였으며, 상기 기체의 유속은 5 mL/min이었다. 디젤의 양은 총석유탄화수소(TPH)의 정량분석법(EPA i8015B)에 따라 각 피크 면적의 합을 계산함으로써 결정하였다.
결과를 아래의 <표 1>에 나타내었다.
디젤 분해율(%)
구분 디젤 분해율(%)
<실시예 1>의 배양액 82.01
<실시예 2>의 배양액 79.07
<실시예 3>의 배양액 93.67
<실시예 4>의 배양액 98.24
<비교예 1>의 배양액 37.72
<비교예 2>의 배양액 32.64
<비교예 3>의 배양액 38.95
상기 [표 1]의 결과는 상기 실시예에서 얻어진 미생물 배양액이 비교예의 미생물 배양액에 비하여 유류 분해 효과가 월등히 뛰어남을 보여준다. 특히 <실시예 4>에서 얻어진 거대 결합체 배양액을 사용한 경우 유류 분해 효과가 가장 뛰어났다.
< 실험예 2> 토양 유류 분해 활성
<실험예 2-1> 유류 오염 지역의 토양 시료를 이용한 현장 평가 실험
실험은 하절기와 동절기로 나누어 하절기 현장 평가는 2010년 7월 5일부터 2010년 10월 3일까지 12주 동안, 동절기 현장 평가는 2010년 12월 13일부터 2011년 3월 6일까지 12주 동안 실시하였다.
시료는 상기 <실험예 1>의 예비실험에서 가장 활성이 우수한 것으로 나타난 <실시예 4>의 미생물 배양액을 사용하였다.
토양 시료의 채취는 토양 오염이 수직으로나 수평으로 균일하지 않을 수 있는 점을 고려하여 [도 5]와 같이 심도(20cm, 50cm 및 70cm)와 위치를 달리하여 채취한 3개의 시료를 사용하였다.
아래의 [표 2]와 같이, 토양 시료에 <실시예 4>의 미생물 배양액, 물, 영양염류(쌀겨 주성분으로 하고 화학비료 등 보조성분의 혼합물로서 질소 인의 비율이 10 : 1정도가 되도록 자체 제작한 것임)를 투입하였고, 주 2회 뒤집기를 실시하였다.
휘발 또는 토착 미생물에 의한 영향을 실험군과 비교하기 위하여, 대조군에 대해서는 토양 유류 분해 미생물 제제, 영양염류 등을 전혀 투입하지 않고 뒤집기만 주 2회 실시하였다.
Figure 112012007501000-pat00001
실험 기간 중 THP의 농도(3개 시료의 평균값임), 함수량(3개 시료의 평균값임), CO2 농도(3개 시료의 평균값임) 및 O2의 농도(3개 시료의 평균값임)을 1주일 간격으로 토양오염공정시험기준(환경부고시 제2009-255호)에 따라 측정하여 하절기의 결과를 [도 6]에, 동절기의 결과를 [도 7]에 나타내었으며, 최초농도(3개 시료의 평균값임)와 평가종료시의 농도(3개 시료의 평균값임)를 대조군과 비교하여 아래의 [표 3]에 나타내었다.
Figure 112012007501000-pat00002
[도 6], [도 7] 및 상기 [표 3]을 참조하여 보면, 하절기 현장 평가에서는 TPH가 최초 3,680 mg/kg에서 최종 1,516 mg/kg로 떨어졌음을 알 수 있으며(저감율 58.9%), 동절기 현장 평가에서는 최초 1,077 mg/kg에서 최종 579 mg/kg로 떨어졌음을 알 수 있다(저감율 46.3%).
한편 대조군의 경우는 TPH가 하절기 및 동절기 각각 최초 4,866 mg/kg에서 최종 2,873 mg/kg(하절기)(저감율 41.0%) 및 최초 1,263 mg/kg에서 최종 1,103 mg/kg(동절기)(12.6%)로 밖에는 떨어지지 않아 상기 실시예에서 제조된 유류 분해 미생물 제제에 의한 유류 분해 효과를 확인할 수 있다.
<실험예 2-2> 철도변 윤활유 분해 활성의 현장 평가
상기 <실험예 1>의 예비실험에서 가장 활성이 우수한 것으로 나타난 <실시예 4>의 미생물 배양액의 철도변 윤활유 분해 활성을 보기 위해서, 상기 실시예의 유류 분해 미생물 제제를 당밀과 20:1의 중량비로 혼합하여 1주일에 2회씩 1ℓ/m2를 철도변에 6주간 살포하고 TPH를 토양오염공정시험(환경부고시 제2009-255호)기준에 따라 측정하였다.
휘발 또는 토착 미생물에 의한 영향을 실험군과 비교하기 위하여, 대조군으로서 인접 지점을 선택하고 자연 상태로 방치하였다.
실험은 경춘선 금곡역 부근(실험예 1 및 대조군 2)과 서울 지하철 1호선 성북역 부근(실험예 2 및 대조군 2)에서 이루어졌다.
결과를 아래의 [표 4]에 나타내었다.
윤활유 분해 활성 현장 평가 결과
구분 최초 TPH 농도(mg/kg) 최종 TPH 농도(mg/kg)
실험군 1 4081.30 725.91
대조군 1 4134.52 4221.63
실험군 2 2246.05 242.24
대조군 2 2165.74
상기 [표 4]의 결과는 상기 실시예에서 얻어진 유류 분해 미생물 제제의 윤활유 분해 활성을 보여준다. 대조군의 경우 TPH의 농도가 약간 상승한 결과로 나타났다.

Claims (6)

  1. (a) 광합성세균, 젖산균 및 효모 중 2종 이상의 미생물을 배양하기 위한 배지를 조제하는 단계, 및 (b) 상기 배지에 광합성세균, 젖산균 및 효모 중 2종 이상의 미생물을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 미생물 배양물의 제조 방법에 의하여 얻어진 미생물 배양물을 유효성분으로 포함하는 유류 제거용 조성물로서,
    콜라겐 입자와 가바(GABA, Gamma Amino Butyric Acid)가 상기 (a) 단계의 배지 조제시에 또는 상기 (b) 단계의 배양 중에 첨가되고,
    상기 광합성 세균은 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)이고, 상기 젖산균은 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 락토바실러스 엑시도파일러스(Lactobacillus acidophilus)이며, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시에(Saccaromyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 유류 제거용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐은 상기 배지 100 중량부 기준 0.3 중량부 내지 2.0 중량부의 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 유류 제거용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 가바는 상기 배지 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 1.5 중량부 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 유류 제거용 조성물.
  6. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항 기재의 유류 제거용 조성물을 준비하는 단계, 및 그 유류 제거용 조성물을 유류로 오염된 곳의 유류와 접촉시키는 단계를 포함하는 유류 오염 토양의 정화 방법.
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이은주 외., "태안 유출 원유의 생물정화를 위한 유용 미생물 적용", 한국환경과학회지 제17권(제7호), 795~799, 2008 (2008.06.25.)*

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