JP6862542B2

JP6862542B2 - チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体およびその用途

Info

Publication number: JP6862542B2
Application number: JP2019515262A
Authority: JP
Inventors: フーンシュー，ギョン; ヘカン，ウン; ハンキム，イル; ホワンユング，ジョン; セリー，キ; キョンキム，ミ
Original assignee: イーアンドエスヘルスケアカンパニーリミテッド
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2021-04-21
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: CN109863176A; KR20180029673A; RU2747929C2; EP3527589A4; AU2016422911A1; JP2019532630A; AU2016422911B2; BR112019004901A2; EP3527589A1; US11002739B2; RU2019110953A; CN109863176B; RU2019110953A3; US20200200750A1; WO2018052153A1; KR101982782B1

Description

本出願は、２０１６年０９月１３日に出願された韓国特許出願第１０−２０１６−０１１８０５３号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。

本発明は、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体およびその用途に関し、より詳細には、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組み換えベクター、宿主細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、乳癌の診断用キット、乳癌の診断に必要な情報を提供する方法に関する。

チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｔｒｘ）は、チオレドキシン還元酵素によりＮＡＤＰＨ依存還元をする１２ｋＤａ程度の小さい酸化還元タンパク質であって、哺乳類チオレドキシン１（Ｔｒｘ１）およびチオレドキシン２（Ｔｒｘ２）を含む。チオレドキシンは、生長因子として作用し、細胞内に毒性を及ぼす過酸化水素を除去し、バクテリアでリボヌクレオチド還元酵素としての役割および転写活動に関連する重要要素をＤＮＡに結合する役割をし、真核細胞で転写関連因子であるＮＦ−ｋＢ（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｋＢ）の活性に影響を及ぼす。したがって、チオレドキシンは、細胞死滅と腫瘍に影響を与えて、癌細胞の成長を調節するのに重要な役割をし、酸化した他のタンパク質のジスルフィド結合を切って、再び還元状態の活性を有するように助ける。チオレドキシン１と２酵素は、哺乳動物細胞内でシステインアミノ酸の酸化窒素を除去して細胞死滅に影響を及ぼし、炎症疾患、心臓まひ、癌を含む多くの疾病で潜在的な重要性を有する。また、抗−チオレドキシン抗体を利用した免疫組織化学的分析は、肝、結腸、すい臓および子宮頸部を含むヒト癌組織でチオレドキシンの発現を示し、このような発現は、腫瘍誘発過程でチオレドキシンの関連可能性を示す。

このような背景下に、本発明者らは、乳癌の診断または予後を早期に予測できる乳癌診断用マーカーについて研究している間、チオレドキシン１が、正常乳房組織では低く発現するが、乳癌組織では非常に高く発現することを確認し、チオレドキシン１が乳癌の診断用マーカーとして有用であることを立証した（韓国特許登録第１０−１０５８２３０号公報）。

ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）を基盤とする体外診断用医薬品（Ｉｎｖｉｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ＩＶＤ）を高い正確度と精密度を示すように開発するために、同じ抗原タンパク質のそれぞれ異なる部位を高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する抗体ペア（２種）が要求される。しかも、一定の親和度を有する抗体を少ない金額で毎回生産するシステムを備えることも必要である。これより、本発明では、ヒト血清に存在するチオレドキシン１（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−１、Ｔｒｘ１）を検出するために、高性能の組み換え単一クローン抗体２種を開発し、前記抗体がチオレドキシン１に非常に特異的に結合して、乳癌患者をスクリーニングするに有用であることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、高い敏感度と特異度で乳癌を診断できる単一クローン抗体またはその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記単一クローン抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含む組み換えベクターを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組み換えベクターを含む宿主細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記宿主細胞を培養する段階を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前述した単一クローン抗体またはその抗原結合断片を含む乳癌診断キットを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前述した単一クローン抗体またはその抗原結合断片を利用して乳癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供することにある。

上述した課題を解決するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含むことができる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖を含むことができる。

本発明は、また、配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含むことができる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖を含むことができる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記抗体は、ＩｇＧ１重鎖およびカッパ（κ）軽鎖を含むことができる。

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｖまたは単鎖抗体分子であってもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。

本発明は、また、前述した抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号２１のヌクレオチド配列または配列番号２３のヌクレオチド配列からなり得る。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記重鎖をコードする核酸分子は、配列番号２２のヌクレオチド配列または配列番号２４のヌクレオチド配列からなり得る。

本発明は、また、前記重鎖をコードする核酸分子、前記軽鎖をコードする核酸分子または前記重鎖および軽鎖をコードする核酸分子の全部を含む組み換えベクターを提供する。

本発明は、また、前記組み換えベクターを含む宿主細胞および前記宿主細胞を培養する段階を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。

本発明は、また、前述した抗体またはその抗原結合断片を含む乳癌診断キットを提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記キットは、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）キットであってもよい。

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、直接的サンドイッチＥＬＩＳＡおよび間接的サンドイッチＥＬＩＳＡよりなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。

本発明は、また、（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を、乳癌が疑われる個体から分離した生物学的試料に接触させる段階と；（ｂ）抗原−抗体複合体の形成を通じて前記生物学的試料で単一クローン抗体またはその抗原結合断片に結合されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階と；（ｃ）前記（ｂ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階と；を含む乳癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。

また、本発明は、（ａ）固体支持体を請求項２、４または６に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片でコーティングする段階と；（ｂ）乳癌が疑われる個体から分離した生物学的試料を前記コーティングされた固体支持体に適用する段階と；（ｃ）結合されないサンプルを除去する段階と；（ｄ）請求項１、３または５に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を固体支持体に適用する段階と；（ｅ）結合されていない単一クローン抗体またはその抗原結合断片を除去する段階と；（ｆ）チオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階と；（ｇ）前記（ｆ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階と；を含む乳癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記チオレドキシン１タンパク質の発現水準は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、免疫クロマトグラフィー分析法、ＦＡＣＳおよびタンパク質チップ方法のうちいずれか一つ以上の方法よりなる群から選ばれるいずれか一つの方法で測定することができる。

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記分離した生物学的試料は、全血、血清、血漿、乳房組織および乳房細胞よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。

他の方式で定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家により通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。

本願で使用される主な用語の定義は、次の通りである。

用語「抗原」は、抗体により結合され得、また、抗原のエピトープに結合され得る抗体を生産するために動物に使用され得る分子または分子の一部を意味する。抗原は、一つ以上のエピトープを有し得る。

用語「抗体」または「Ａｂ」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、一つ以上の抗原認識部位を通じて特異的標的または抗原、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等を認識し、これと結合できる免疫グロブリン分子である。本願に使用されたような、用語「抗体」は、単一クローン抗体；多クローン抗体；特定抗原（例えば、Ｔｒｘ１）に特異的に結合できる能力を保有している抗体の「抗原結合断片」、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｃ等；単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；二重特異的抗体；異種接合体抗体、その突然変異体；抗体、またはその抗原−結合性断片（例えば、ドメイン抗体）を有する融合タンパク質；単一鎖（ＳｃＦｖ）および単一ドメイン抗体［例えば、サメおよびカメリド（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体］；マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ；ヒト化抗体；キメラ抗体；および要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のすべての変形された立体配置（抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体および共有的に変形された抗体を含む）を含むが、これらに制限されない、いかなる類型の抗体も包括することができる。抗体は、ムリン、ラット、ヒト、または他のすべての起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であってもよい。

特定の標的または抗原（例えば、Ｔｒｘ１タンパク質）と「特異的に結合」する抗体またはポリペプチドは、関連技術分野において広く理解される用語であり、このような特異的結合を決定する方法も、関連技術分野に広く公知されている。特定分子は、これがさらに他の細胞または物質との場合よりさらに頻繁に、さらに迅速に、さらに大きい持続性でおよび／またはさらに大きい親和度で特別な細胞または物質と反応したり、連合する場合に、「特異的結合」を示すものと見なされる。特定の抗体は、これが他の物質と結合することより、さらに大きい親和度、結合活性度で、より迅速におよび／またはさらに大きい持続性で結合する場合に、特定の標的または抗原と「特異的に結合」する。

本願に使用された用語「結合親和度」または「Ｋ_Ｄ」は、特別な抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を示す。Ｋ_Ｄは、解離速度（「離脱速度」または「ｋ_ｄ」と呼ばれることがある）対結合速度、または「作動速度」または「ｋ_ａ（結合速度定数、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｎｓｔａｎｔ）」の比である。したがって、Ｋ_Ｄは、ｋ_ｄ／ｋ_ａであり、これは、モル濃度（Ｍ）として表現される。Ｋ_Ｄがさらに小さいほど、結合親和度は、さらに強力になるという結論が出る。したがって、１μＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して、弱い結合親和度を表示する。抗体に対するＫ_Ｄ値は、関連技術分野に広く確立された方法を利用して決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定する一つの方法は、典型的にバイオセンサーシステム、例えばビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））システムを使用して、表面プラズモン共鳴を利用するものである。

用語「ベクター」は、連結された他の核酸を運搬できる核酸分子を含む。ベクターの一つの形態は、「プラスミド」であって、これは、付加のＤＮＡ切片が結合され得る原型二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの他の形態は、ウイルスベクターであって、ここで、付加のＤＮＡ切片は、ウイルスゲノムに結合され得る。或るベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律複製され得る（例えば、細菌起源複製を有する細菌ベクターおよびエピゾーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例：非−エピゾーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞のゲノムとして統合され得、これにより、宿主ゲノムに沿って複製される。また、或るベクターは、それらが作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）遺伝子の発現を指示することができる。前記ベクターは、本明細書で「組み換え発現ベクター（または単に「発現ベクター」）と言及される。一般的に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書で、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も通常的に使用されるベクターの形態であるから、相互交換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等な機能をする他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠乏レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルス）を含む。

用語「宿主細胞」は、形質転換されたり、核酸配列により形質転換された後、選択された関心遺伝子を発現させることができる細胞を意味するために使用される。前記用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が本来両親と形態的にまたは遺伝的構成面において同一であるか否かに関わらず、母細胞の子孫を含む。

本発明の単一クローン抗体は、チオレドキシン１に対する結合親和度に優れていて、チオレドキシン１に非常に特異的に結合し、また、敏感度と特異度が非常に高いため、乳癌患者をスクリーニングするのに有用に使用され得る。ひいては、既存の他の乳癌診断バイオマーカーであるＣＡ１５−３を検出することより、本発明のチオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体を使用してチオレドキシン１を検出することが、敏感度と特異度が格別に優れているので、乳癌の診断の正確性および信頼性を顕著に高めることができる。

図１は、チオレドキシン１抗原を発現する組み換えベクターの切断地図および実施例１で獲得した抗体のアイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）結果を示すものである。図２は、実施例１で獲得した９Ｇ７（ＡＢ１）抗体の軽鎖（ａ）および重鎖（ｂ）アミノ酸配列を示すものである。図３は、実施例１で獲得した２Ｂ４（ＡＢ２）抗体の軽鎖（ａ）および重鎖（ｂ）アミノ酸配列を示すものである。図４は、親和度の良い抗体Ｂ２６４の軽鎖（ａ）および重鎖（ｂ）を発現する組み換えベクターの切断地図を示すものである。図５は、親和度の良い抗体Ｂ２６６の軽鎖（ａ）および重鎖（ｂ）を発現する組み換えベクターの切断地図を示すものである。図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用した抗体の還元（＋）および非−還元（−）状態を確認したものであって、（ａ）は、抗体Ｂ２６４を、（ｂ）は、抗体Ｂ２６６を示す。図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用した抗体Ｂ２６６−１の還元（＋）および非−還元（−）状態を確認したものであって、前記抗体Ｂ２６６−１は、抗体Ｂ２６６のＦｃ部分がヒトＩｇＧ１に変更されたものである。図８は、抗体Ｂ２６６−１とＢ２６４の親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を分析した結果を示すものであって、（ａ）は、抗体濃度による反応値とそれによるグラフを示すものであり、（ｂ）は、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）プログラムを利用した抗体の親和度を分析した結果である。図９は、抗体Ｂ２６６−１とＢ２６４を利用したＥＬＩＳＡによる結果をＲＯＣ分析して敏感度と特異度を計算した結果を示す図である。

以下、本発明をより詳細に説明する。

上述したように、本発明者らは、以前の研究を通じて、チオレドキシン１が、正常乳房組織では低く発現するが、乳癌組織では非常に高く発現することを確認し、チオレドキシン１が乳癌の診断用マーカーとして有用であることを立証したことがある。

これより、本発明者らは、追加の研究を通じて、チオレドキシン１に非常に特異的に結合して乳癌患者をスクリーニングするのに有用な単一クローン抗体を開発した。本発明の単一クローン抗体は、チオレドキシン１に対する結合親和度に優れているので、チオレドキシン１に非常に特異的に結合し、また、敏感度と特異度が非常に高いため、乳癌患者をスクリーニングするのに有用に使用され得る。ひいては、既存の他の乳癌診断バイオマーカーであるＣＡ１５−３を検出することより、本発明のチオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体を使用してチオレドキシン１を検出することが、敏感度と特異度が格別に優れているので、乳癌の診断の正確性および信頼性を顕著に高めることができる。

本発明は、ヒトチオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−１、Ｔｒｘ１）に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明の単一クローン抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せを利用した方法等の当該技術分野に公知となった非常に多様な技術を使用して製造することができる。例えば、単一クローン抗体は、当該技術分野において公知となった技法などのハイブリドーマ技法を利用して製造することができる。本願で「単一クローン抗体」という用語は、ハイブリドーマ技法を通じて生産される抗体だけを限定するものではない。用語「単一クローン抗体」は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンなどの単一クローンに由来する抗体を指し、その生産方法を指すものではない。

ハイブリドーマ技法を利用した特異抗体の生産およびスクリーニング方法は、当該技術分野において日常的であり、既に公知となっている。非制限的な例として、マウスを目的抗原またはこのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。免疫反応が検出されれば、例えば、マウス血清で抗原に特異的な抗体が検出されれば、マウスの脾臓を回収して脾臓細胞を分離する。その後、脾臓細胞を周知の技法で任意の適合した骨髄腫細胞、例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３等と融合する。ハイブリドーマを選別し、制限希釈によりクローニングする。その後、ハイブリドーマクローンに対して当該技術分野に公知となった方法で抗原に結合できる抗体を分泌する細胞であるかを評価する。一般的に、抗体を高い水準で含む腹水は、陽性のハイブリドーマクローンをマウス腹腔に接種することによって作ることができる。本発明の好ましい一実施例では、図１（ａ）の切断地図を有する組み換えベクターを大腸菌に形質感染させて、Ｔｒｘ１抗原を製造した。以後、抗原により免疫化したネズミの脾臓を分離し、骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌ；ｓｐ２／０）と融合して、Ｔｒｘ１と反応する抗体を生産する細胞をＥＬＩＳＡ法で確認した。

本発明の好ましい単一クローン抗体またはその抗原結合断片は、次の（ａ）または（ｂ）を含むことができ、本願でそれぞれＢ２６４およびＢ２６６−１と指称され得る：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域。

本明細書で、用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）には、それぞれ３個のＣＤＲが含まれており、これらのＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するに際して主要な接触残基を提供する。

本発明の好ましい単一クローン抗体またはその抗原結合断片は、次の（ｃ）または（ｄ）を含むことができ、本願でそれぞれＢ２６４およびＢ２６６−１と指称され得る：
（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；または
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。

本発明の好ましい単一クローン抗体またはその抗原結合断片は、次の（ｅ）または（ｆ）を含むことができ、本願でそれぞれＢ２６４およびＢ２６６と指称され得る：
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖；または
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖。

本発明の好ましい単一クローン抗体は、Ｂ２６４、Ｂ２６５、Ｂ２６６、Ｂ２６７、Ｂ２６８またはＢ２６９と指称され、最も好ましくはＢ２６４またはＢ２６６−１であってもよい。Ｂ２６６−１は、Ｂ２６６のＦｃ部分がヒトＩｇＧ１に変更された単一クローン抗体である。

自然発生的な抗体構造単位は、通常、四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を含む。前記四量体は、それぞれ通常的に２個の同じポリペプチド鎖のペアで構成され、各ペアは、１個の全長軽鎖（通常、分子量が約１５ｋＤａである）および１個の全長重鎖（通常、分子量が約５０〜７０ｋＤａである）を有する。軽鎖および重鎖それぞれのアミノ−末端部位は、通常的に抗原認知に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ−末端部位は、通常的に効果器の機能に関与する不変領域を限定する。ヒト軽鎖は、通常的にカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、通常的にミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥであって、抗体のイソタイプを定義する。ＩｇＧは、これらに制限されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、これらに制限されるものではないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、これらに制限されるものではないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに細分される。全長軽鎖および重鎖内で、通常的に可変および不変領域は、約１２個以上アミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は、また、約１０個以上アミノ酸の「Ｄ」領域を含む。それぞれの軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、通常、抗原−結合部位を形成する。本発明の好ましい一実施例によれば、本発明の単一クローン抗体の重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡまたはＩｇＭイソタイプであってもよく、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であってもよく、好ましくはカッパ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖であってもよい。

本発明の単一クローン抗体またはその抗原結合断片において、「その抗原結合断片」は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２およびＦｖまたは単鎖抗体分子などを含む。抗体結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆ（ａｂ′）は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差異がある。Ｆ（ａｂ′）_２は、Ｆａｂ′のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成して生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体断片をいう。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができ、例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペブシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ′）２断片を得ることができ、好ましくは、遺伝子組み換え技術を通じて製作することができる。

本発明の好ましい抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全なヒト抗体であってもよい。

キメラ抗体は、一種の抗体生成細胞から収得された可変軽鎖および重鎖領域（ＶＬおよびＶＨ）とさらに他の種からの不変軽鎖および重鎖領域を組み合わせることによって、組み換え手段により製造され得る。通常的に、キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を生成させるために、げっ歯類またはウサギ可変領域およびヒト不変領域を利用する。このようなキメラ抗体の生成は、当該分野に広く公知されており、これは、標準手段により達成され得る。本発明のキメラ抗体のヒト不変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７、ＩｇＧ８、ＩｇＧ９、ＩｇＧ１０、ＩｇＧ１１、ＩｇＧ１２、ＩｇＧ１３、ＩｇＧ１４、ＩｇＧ１５、ＩｇＧ１６、ＩｇＧ１７、ＩｇＧ１８またはＩｇＧ１９不変領域から選択され得ることがさらに考慮される。

ヒト化抗体は、より一層ヒトと類似した免疫グロブリンドメインを含有するように工学処理され、これは、動物由来抗体の相補性決定領域だけを含む。これは、モノクロナール抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検査し、前記配列をヒト抗体鎖の構造に適合化させることによって達成される。

完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含んで軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から発生した抗体分子である。

本発明は、また、本発明の単一クローン抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。

本発明で用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子の配列は、変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。

本発明の核酸分子は、上記したヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記した本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列（ａｌｉｇｎ）し、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを利用して整列した配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、一つの特定例では、最小９０％の相同性、他の特定例では、最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

本発明の好ましい一実施例によれば、本発明の単一クローン抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号２１のヌクレオチド配列からなり得、重鎖をコードする核酸分子は、配列番号２２のヌクレオチド配列からなり得る。

本発明のさらに他の好ましい一実施例によれば、本発明の単一クローン抗体の重鎖をコードする核酸分子は、配列番号２３のヌクレオチド配列からなり得、軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号２４のヌクレオチド配列からなり得る。

本発明は、また、前記単一クローン抗体の重鎖をコードする核酸分子と軽鎖をコードする核酸分子または前記核酸分子の全部を含む組み換えベクターを提供することにある。

本発明の組み換えベクターシステムは、当業界に公知となった多様な方法を通じて構築され得る。本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築され得る。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築され得る。例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合サイトおよび転写／解読終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が利用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター部位、そしてファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター）が調節部位として利用され得る。宿主細胞としてバチルス菌が利用される場合、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーターまたはバチルス菌で発現可能ないかなるプロモーターであっても、調節部位として利用され得る。

一方、本発明の組み換えベクターは、当業界で使用されるプラスミド（イェ：ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例：λｇｔ４・λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例：ＳＶ４０等）を操作して製作され得る。

本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用され得、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

本発明の組み換えベクターは、それから発現する抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合することもできる。融合する配列は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）；マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）；ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）；６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）、Ｐｒｅ−Ｓ１、ｃ−Ｍｙｃのようなタグ配列；ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢのような先導配列などがある。また、本発明のベクターにより発現するタンパク質が抗体であるので、精製のための追加的な配列がなくても、発現した抗体は、タンパク質Ａのカラム等を通じて容易に精製することができる。

一方、本発明の組み換えベクターは、選択標識として当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明の抗体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖が一つのベクターで同時に発現するベクターシステムであるか、または軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムが全部可能である。後者の場合、二つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）および標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて宿主細胞に導入される。同時形質転換は、軽鎖および重鎖をコードするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖と重鎖を全部発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（または重鎖）を含むベクターで形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（または軽鎖）を含むベクターで再び形質転換して、軽鎖および重鎖の全部を発現する細胞を最終的に選別する方法である。

本発明は、また、本発明の組み換えベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、本発明の組み換えベクターで形質転換された細胞である。本発明のベクターを安定し且つ連続的にクローニングおよび発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知となっており、いかなる宿主細胞も利用することができ、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノスス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これらに制限されるものではない。

前記ベクターの適合した真核細胞宿主細胞は、子嚢菌門（ＰｈｙｌｕｍＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ）に属するアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）等の多細胞性かび（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｇｉ）とピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のような酵母を含む単細胞性かび（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｇｉ）、その他の下等真核細胞、昆虫−由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして植物または哺乳動物に由来した細胞を利用することができる。

本発明で用語「形質感染」は、本発明の組み換えベクターを利用して宿主細胞に目的とする遺伝子を導入することを言い、「形質転換」と同じ意味で使用される。したがって、宿主細胞への「形質感染」および／または「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野において公知となっているように、宿主細胞によって適合した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を利用した撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストランサルフェート、リポフェクタミンおよび乾燥／抑制媒介された形質転換方法などが含まれるが、これらに制限されない。

本発明は、また、前記宿主細胞を培養する段階を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。

抗体またはその抗原結合断片製造のための宿主細胞の培養は、当業界に知られている適当な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者なら選択される菌株によって容易に調整して使用することができる。細胞培養は、細胞の成長方式によって懸濁培養と付着培養に区分され、培養方法によって回分式、流加式および連続培養式の方法に区分される。培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。

動物細胞の培養に使用する前記培地は、多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。使用され得る炭素源の例は、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、デンプンおよびセルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油およびココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸のような脂肪酸、グリセロールおよびエタノールのようなアルコール、そして酢酸のような有機酸を含む。これらの炭素源は、単独または組合わせて使用され得る。使用され得る窒素源の例は、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）および大豆粉のような有機窒素源および尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。これらの窒素源は、単独または組合わせて使用され得る。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素カリウムおよび対応するソジウム−含有塩が含まれ得る。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他に、アミノ酸、ビタミン、および適切な前駆体などが含まれ得る。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素−含有気体（例、空気）を注入する。培養物の温度は、普通、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。

宿主細胞を培養して収得した抗体は、精製しない状態で使用され得、さらに多様な通常の方法、例えば透析、塩沈殿およびクロマトグラフィーなどを利用して高純度で精製して使用され得る。その中で、クロマトグラフィーを利用する方法が最も多く使用され、カラムの種類と順序は、抗体の特性、培養方法などによってイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどから選択することができる。

また、本発明は、本発明の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を含む乳癌診断キットおよびこれを利用して乳癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。

本発明で用語、「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、乳癌発病の有無を確認することである。

チオレドキシン１タンパク質は、乳癌診断マーカーであって、正常乳房組織に比べて乳癌組織で発現水準が高く現れる。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記乳癌診断キットは、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）キットであってもよく、好ましくは直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、直接的サンドイッチＥＬＩＳＡおよび間接的サンドイッチＥＬＩＳＡよりなる群から選ばれる１種以上であってもよい。本発明の好ましい一実施例では、サンドイッチＥＬＩＳＡキットに含まれた２種の抗体は、コーティング抗体として単一クローン抗体Ｂ２６６−１、検出抗体として単一クローン抗体Ｂ２６４が含まれる。

本発明の乳癌診断キットは、Ｔｒｘ１に対する抗体以外に免疫学的分析に使用される当業界に公知となったツールまたは試薬をさらに含むことができる。

前記で免疫学的分析は、抗原と抗体の結合を測定できる方法であれば、全部含まれ得る。このような方法は、当該分野に公知となっており、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析法、放射免疫拡散法、免疫蛍光分析法、免疫プロット、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、免疫クロマトグラフィー分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これらに制限されるものではない。

免疫学的分析に使用されるツールまたは試薬としては、適合した担体または支持体、検出可能な信号を生成できる標識、溶解剤、洗浄剤、および安定化剤などを含むことができる。適合した担体としては、これに限定されないが、また、標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定できる基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された２次抗体、発色基質および反応停止剤などを含むことができる。

本発明のキットに含まれる、Ｔｒｘ１に対する抗体は、好ましくは適合した担体または支持体に文献に開示されたような多様な方法を利用して固定され得、適合した担体または支持体の例としては、ＰＢＳ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、リポソーム、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、斑糲岩、濾過紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体、ナイロン、金属、ガラス、ガラスビーズ、または磁性粒子などが含まれる。その他の他の固体基質としては、細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブおよびポリマー性膜がある。前記支持体は、任意の可能な形態、例えば球形（ビーズ）、円筒形（試験管またはウェル内面）、平面形（シート、試験ストリップ）を有することができる。

検出可能な信号を生成できる標識は、抗原−抗体複合体の形成を定性または定量的に測定可能にし、その例としては、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子および放射性同位元素などを使用することができる。酵素としては、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、マレートデハイドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ、インベルターゼ、ルシフェラーゼなどを使用することができる。蛍光物質としては、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フルオレセインイソチオシアネートなどを使用することができる。リガンドとしては、ビオチン誘導体などがあり、発光物質としては、アクリジニウムエステル、ルシフェリンなどがある。微小粒子としては、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、レドックス分子としては、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノンなどがある。放射性同位元素としては、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１８６Ｒｅなどがある。しかし、上記に例示されたもの以外に、免疫学的分析法に使用できるものであれば、いずれも使用することができる。

酵素発色基質として、例えば酵素標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を選択した場合には、基質として、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、３，３−ジアミノベンジジン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、ｏ−ジアニシジン、または３，３−ジメトキシベンジジンを含む溶液を使用することができる。また、酵素標識としてアルカリホスファターゼを選択した場合には、基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、ニトロブルーテトラゾリウム、またはｐ−ニトロフェニルホスフェートを含む溶液を使用することができる。また、酵素標識としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを選択した場合には、基質としてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む溶液を使用することができる。その他にも、当業界に知られている多様な酵素および酵素発色基質を使用することができる。

本発明の好ましい一実施例によれば、本発明の乳癌の診断に必要な情報を提供する方法は、次の段階で行われ得る：
（ａ）本発明の単一クローン抗体またはその抗原結合断片のうちいずれか１種を、乳癌が疑われる個体から分離した生物学的試料に接触させる段階；
（ｂ）抗原−抗体複合体の形成を通じて前記生物学的試料で単一クローン抗体またはその抗原結合断片に結合されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、本発明の乳癌の診断に必要な情報を提供する方法は、次の段階で行われ得る：
（ａ）固体支持体を請求項２、４または６に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片でコーティングする段階；
（ｂ）乳癌が疑われる個体から分離した生物学的試料を前記コーティングされた固体支持体に適用する段階；
（ｃ）結合されていないサンプルを除去する段階；
（ｄ）請求項１、３または５に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片で固体支持体に適用する段階；
（ｅ）結合されていない単一クローン抗体またはその抗原結合断片を除去する段階；
（ｆ）チオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階；および
（ｇ）前記（ｆ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階。

本発明で、用語「分離した生物学的試料」とは、乳癌マーカーであるＴｒｘ１タンパク質の発現水準が異なる組織（乳房組織）、細胞（乳房細胞）、全血、血漿、血清、血液、唾液、滑液、尿、喀痰、リンパ液、脳脊髄液、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上澄み液、または破裂した真核細胞などを含み、癌の原発病巣だけでなく、転移病巣に由来した試料を含む。これらの生物学的試料を操作したり、操作しない状態で本発明の単一クローン抗体と反応させて、Ｔｒｘ１タンパク質の発現水準を確認することができる。

本発明で用語「個体」は、牛、豚、羊、鶏、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類などを含み、乳癌が疑われる個体は、制限なしに含まれる。

以下、本発明の理解を助けるために実施例などにより詳細に説明することとする。しかし、本発明による実施例は、いろいろ他の形態に変形され得、本発明の範囲が下記実施例に限定されると解すべきものではない。本発明の実施例は、当業界において平均的な知識を有する者に本発明をより詳細に説明するために提供されるものである。

［実施例１］
ヒトチオレドキシン１（Ｔｒｘ１）抗原の製造
１−１．Ｔｒｘ１発現ベクターの製造
ヒトチオレドキシン１タンパク質を暗号化する遺伝子を大腸菌で発現するために、大腸菌コドン使用（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ）に基づいて遺伝子を合成した。合成されたヒトチオレドキシン１の遺伝子配列は、下記の表１に示された通りである。

ヒトチオレドキシン１遺伝子を増幅するために使用したプライマー配列は、下記の表２に示された通りである。

プラスミドにクローニングするために、遺伝子を増幅するためにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。鋳型として使用するために合成した遺伝子、プライマー（ｈＴｒｘ１−Ｆｏｒ、ｈＴｒｘ１−Ｒｅｖ）それぞれ１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（それぞれ２．５ｍＭ）、ＥｘｐｒｉｍｅＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと緩衝溶液を添加して混合する。この溶液を９５℃、２分間反応後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で２０秒間反応を３５回繰り返した後、７０℃で２分間反応し、反応を終結した。増幅した遺伝子を精製した後、ｐＵＣ５７プラスミドのマルチクローニングサイト(ＭＣＳ）に存在するＥｃｏＲＶ位置にクローニングするために、プラスミドに当該制限酵素を処理して精製する。精製した遺伝子と制限酵素が処理されたプラスミド、リガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）と緩衝溶液を混合し、反応した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αで形質転換するために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αコンピテント細胞株を４℃で溶かした後、プラスミド混合溶液と混合し、４℃で３０分間反応した。反応後、４２℃で３０秒間熱衝撃を加えた後、再び４℃で２分間安定化し、抗生剤（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｕｒｔａｎｉ）固体培地に分注して、均一に吸収させて、３７℃で１６時間以上培養した。培養した培地で成長したコロニーのうちヒトチオレドキシン１の遺伝子を有するプラスミドを選別した。

１−２．Ｔｒｘ１の発現および精製
選別されたヒトチオレドキシン１遺伝子を有するプラスミドを精製した後、タンパク質を発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株に上記に言及した方法によって形質転換した。形質転換された菌株からチオレドキシン１タンパク質を発現するために、３７℃の下でＯＤ_６００＝０．５まで抗生剤を含むＬＢ液体培地で菌株を培養した後、１ｍＭの濃度になるように、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して、３時間さらに培養した。以後、タンパク質発現の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。このタンパク質を純粋精製するために収得した細胞株を超音波細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を利用して破砕後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）して、上澄み液を得た。得られた上澄み液に、購入した抗チオレドキシンＩ抗体（ＬＦ−ＭＡ００５５、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ）を添加して発現したチオレドキシンＩと結合した後、抗体と結合するＰｒｏｔｅｉｎＡ／ＧＰＬＵＳ−Ａｇａｒｏｓｅ（ｓｃ−２００３、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を添加して反応し、遠心分離して精製した。以後、純度および定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。

［実施例２］
Ｔｒｘ１に特異的な単一クローン抗体の生産および精製
２−１．マウスの免疫化
精製されたヒトチオレドキシン１タンパク質をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）にアジュバントと混合して注射し、マウスの血液を採取して、抗体生成の有無をＥＬＩＳＡで確認した。２回免疫後、抗体の力価（１：５，０００）が適正に増加することを確認した。

２−２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
免疫したマウスから脾臓を取り出して、Ｂリンパ球を分離した後、培養した骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞（ｓｐ２／０）と融合させた。融合した細胞をヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）およびチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）が添加されている培地（ＨＡＴｍｅｄｉｕｍ）で培養して、骨髄腫とＢリンパ球だけが融合した細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を選択的に選別して培養した。

２−３．Ｔｒｘ１に特異的な単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選別
得られたハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞のうちヒトチオレドキシン１タンパク質と反応する抗体３種をＥＬＩＳＡを利用して確認した。ＥＬＩＳＡ陽性反応である細胞を限界希釈法（Ｌｉｍｉｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を利用して抗原に反応する抗体を生産するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を選別した。

２−４．単一クローン抗体の生産および精製
獲得した３種のハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）をマウスに注入して腹水を獲得し、これをＰｒｏｔｅｉｎＡａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを利用して純粋精製した。精製された抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。

［実施例３］
単一クローン抗体のイソタイプ確認
ＲａｐｉｄＥＬＩＳＡＭｏｕｓｅｍＡｂｓＩｓｏｔｙｐｉｎｇＫｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．３７５０３）キットを使用して前記実施例２で獲得した３種の抗体のイソタイプを確認した。

その結果、図１（ｂ）に示されたように、単一クローン抗体２Ｂ４の重鎖は、ＩｇＧ１、単一クローン抗体８Ｆ３の重鎖は、ＩｇＧ１２ａ、単一クローン抗体９Ｇ７の重鎖は、ＩｇＧ２ｂであることが確認され、軽鎖は、全部カッパ（κ）であることを確認した。

［実施例４］
単一クローン抗体９Ｇ７（ＡＢ１）と２Ｂ４（ＡＢ２）のアミノ酸配列の分析
前記実施例２で獲得した３種の単一クローン抗体のうち９Ｇ７（ＡＢ１）と２Ｂ４（ＡＢ２）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を分析した。逆翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）と組み換え発現（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に適合したＦｃ領域との融合が可能な配列としてアミノ酸配列を決定した。ＩＭＴＧギャップ（ｇａｐ）配列を通じて決定された配列を配列し、超突然変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）表を利用して超突然変異および完全なＣＤＲ３部分を探した。正確な質量ペプチドマップ（ａｃｃｕｒａｔｅｍａｓｓｐｅｐｔｉｄｅｍａｐｓ）等を通じて配列を確認し（図２および図３）、ＭＳ／ＭＳスペクトルを利用して超突然変異とＣＤＲ３を確認した。

［実施例５］
ＥＬＩＳＡを利用した親和度比較および抗体決定
前記過程を通じて獲得したアミノ酸配列のうち超突然変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が可能な位置を選定し、これにより、９Ｇ７（ＡＢ１）は、４種（Ｂ２６６、Ｂ２９７、Ｂ２６８およびＢ２６９）で、２Ｂ４（ＡＢ２）は、２種（Ｂ２６４およびＢ２６５）で塩基配列に変化を与えて遺伝子を合成した。得られた６種（Ｂ２６４〜Ｂ２６９）を発現して、それぞれの抗体の抗原に対する親和度をＥＬＩＳＡを通じて確認した（表３〜表５に提示されたＴ以後番号は、それぞれの生産バッチ（ｂａｔｃｈ）番号を示す）。

３種類の抗原、すなわち、何も結合しない（ｎａｋｅｄ）Ｔｒｘ１、Ｆｃが結合されたＴｒｘ１（Ｔｒｘ１−Ｆｃ）およびＨｉｓタグが結合されたＴｒｘ１（Ｔｒｘ１−Ｈｉｓ）のそれぞれに対して直接（ｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡを通じて親和度を確認し、その結果を下記表３〜表５に順に示した。表３〜表５に示されたように、ＩｇＧ１（κ）は、Ｂ２６４、ＩｇＧ２ｂ（κ）は、Ｂ２６６が三つの抗原に対して最も良い親和度を示した。

何も結合しないＴｒｘ１抗原に対する反応結果

Ｔｒｘ１−Ｆｃ抗原に対する反応結果

Ｔｒｘ１−Ｈｉｓ抗原に対する反応結果

親和度の高い抗体Ｂ２６４およびＢ２６６のアミノ酸配列は、下記表６に示された通りである。

［実施例６］
抗体Ｂ２６４およびＢ２６６の生産
６−１．抗体Ｂ２６４およびＢ２６６の発現プラスミドの製造
前記表６のように抗体Ｂ２６４およびＢ２６６のアミノ酸配列が明らかにされたので、前記抗体の軽鎖および重鎖に相当する遺伝子を化学的に合成することが可能である。合成された遺伝子配列は、下記表７に示した。合成された遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。

６−２．抗体Ｂ２６４およびＢ２６６の発現および精製
Ｂ２６４抗体を発現するために、ｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１１−ＬとｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１１−Ｈを、Ｂ２６６抗体を発現するためにｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１２−ＬとｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１２−ＨをＨＥＫ２９３細胞株に共同形質感染（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、７日間培養した。細胞株を培養し、培養液で分泌された組み換え単一クローン抗体をタンパク質Ａクロマトグラフィーを利用して収得および精製した。組み換え単一クローン抗体を含む溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）を限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で濃縮し、０．２μｍの滅菌フィルターを利用して濾過して、高純度の抗体を収得した。

純粋精製された抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて純度とサイズなどを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、図６に示されたように、抗体Ｂ２６４およびＢ２６６は、還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で重鎖が４７ｋＤａ、軽鎖が２５ｋＤａであり、非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で１５０ｋＤａであって、予想したサイズに符合するように発現することを確認した。

［実施例７］
サンドイッチ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ）ＥＬＩＳＡを用いた獲得された２種の単一クローン抗体のペアリング（ｐａｉｒｉｎｇ）の可否確認
ウェル（ｗｅｌｌ）当たり１００μｌコーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）（０．０１５ＭのＮａ_２ＣＯ_３、０．０３５ＭのＮａＨＣＯ_３、０．００３ＭのＮａＮ_３、ｐＨ９．６）と１００ｎｇのコーティング抗体（ｃｏａｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂ２６６）を混ぜて分注後、４℃、Ｏ／Ｎ反応した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳＡ；遮断バッファー）をウェル当たり２００μｌ分注した後、常温で６０分間反応した。以後、抗原（５０、２５、１２．５または０ｎｇ）２０μｌを分注し、検出抗体（ビオチン−標識されたＢ２６４；Ｂ２６４−Ｂ）８０μｌを分注した後、３７℃、９０分間反応した。反応溶液を除去した後、０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ；洗浄バッファー）をウェル当たり２００μｌ分注して洗浄した。前記の過程を３回処理した。

１：２００で希釈したストレプタビディン−ＨＲＰをウェル当たり１００μｌを処理した後、３７℃、３０分間反応させ、反応溶液を除去した後、０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ；洗浄バッファー）をウェル当たり２００μｌを分注して洗浄した。前記の過程を３回処理した。

ウェル当たりＴＭＢ溶液１００μｌを分注した後、暗条件、常温下で１０分間反応させ、ウェル当たり２．５Ｍ硫酸溶液（Ｈ_２ＳＯ_４；ＳＴＯＰｂｕｆｆｅｒ）１００μｌを処理した後、４５０ｎｍで結果を確認した。

その結果、表８に示されたように、抗原の濃度によって反応値が増加することを確認することによって、これらの抗体が抗原を検出することが確認された。ただし、抗原がない場合のＯ．Ｄ．測定値が高いため、抗体を利用した性能向上実験が要求される。

コーティング抗体としてＢ２６６、検出抗体としてＢ２６４を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ

［実施例８］
抗体の性能向上のためのＦｃ部分イソタイプ変更
抗体の発現システムが、ハイブリドーマを利用するものではなく、組み換えプラスミドを利用した一時的な形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）であるので、組み換えプラスミドのうち重鎖を有するプラスミドを他のイソタイプの重鎖を有するプラスミドで共同感染させた。すなわち、９Ｇ７（ＡＢ１）を発現するために使用するｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１２−ＬとｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１２−ＨのうちｐｃＤＮＡ３−ＳＳＪ１２−Ｈでなく、他の重鎖を暗号化する遺伝子を有するプラスミドを共同形質感染した。

このような方法を通じてＢ２６６のＦｃ部分がヒトＩｇＧ１に変更された抗体（Ｂ２６６−１）を獲得した。この抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて性状を確認した（図７）。

最終的に選定された単一クローン抗体Ｂ２６４およびＢ２６６−１の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、表９に示し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、表１０に示した。

［実施例９］
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた獲得されたＢ２６６−１とＢ２６４の単一クローン抗体のペアリングの可否確認
ウェル当たり１００μｌコーティングバッファーと１００ｎｇのコーティング抗体（Ｂ２６６−１）を混ぜて分注後、４℃、Ｏ／Ｎ反応させ、反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌ洗浄バッファーを分注して洗浄した。この過程を２回処理した。

ウェル当たり２００μｌＰＢＳＡを分注した後、常温で１２０分間反応させ、抗原（２５または０ｎｇ）２０μｌを分注し、検出抗体（Ｂ２６４−Ｂ）８０μｌを分注した後、３７℃、９０分間反応させた。反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌ洗浄バッファーを分注して洗浄した。この過程を３回処理した。

１：２００で希釈したストレプタビディン−ＨＲＰをウェル当たり１００μｌを処理した後、３７℃、３０分間反応させ、反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌ洗浄バッファーを分注して洗浄した。この過程を３回処理した。

ウェル当たりＴＭＢ溶液１００μｌを分注した後、暗条件、常温下で１０分間反応させ、ウェル当たり停止バッファー１００μｌを処理した後、４５０ｎｍで結果を確認した。

その結果、表１１に示されたように、抗原に適切に反応することを確認し、実施例６で使用した抗体に比べてブランク（ｂｌａｎｋ）値が減少することを確認した。

コーティング抗体としてＢ２６６−１、検出抗体としてＢ２６４を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ

［実施例１０］
抗原に対する単一クローン抗体の親和度分析
抗原Ｔｒｘ１に特異的に作用する２種の単一クローン抗体は、プラスミドを利用した一時的形質感染システムを利用して発現することによって、安定的に生産される。これより、抗原に対する親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を確認するために、ＥＬＩＳＡを利用して分析した（図８ａ）。

ウェル当たり１００μｌコーティングバッファーと１００ｎｇのＴｒｘ１を混ぜて分注後、４℃、１６時間以上反応させ、反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌＰＢＳＡを分注して、３７℃、１２０分間反応させた。反応溶液を除去した後、製作された抗体Ｂ２６６−１またはＢ２６４抗体を０．１μＭから１／５で希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ分注し、３７℃、１２０分間反応させた。反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌ洗浄バッファーを分注して洗浄した。この過程を３回処理した。

抗体Ｂ２６６−１は、ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：４０００で希釈）を、Ｂ２６４は、マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：４０００で希釈）をそれぞれ１００μｌ分注し、３７℃、６０分間反応させた。反応溶液を除去した後、ウェル当たり２００μｌ分注して洗浄した。この過程を３回処理した。

ウェル当たりＴＭＢ溶液１００μｌを分注した後、暗条件、常温下で１０分間反応させ、ウェル当たり停止バッファー１００μｌを処理した後、４５０ｎｍで結果を確認した。獲得した結果値は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ社）を利用して分析した（図８ｂ）。

コーティング抗体Ｂ２６６−１と検出抗体Ｂ２６４の親和度を分析した結果、Ｂ２６６−１の反応力によってブランク（ｂｌａｎｋ）値が高いが、Ｂ２６６−１とＢ２６４は、抗原の濃度が増加するにつれて結合程度も増加することを確認した。これは、Ｂ２６６−１とＢ２６４が抗原と結合することを示す。Ｐｒｉｓｍプログラムを利用した分析によりＫ_Ｄ（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｏｎｓｔａｎｔ）値を求める場合、Ｂ２６６−１は、１．１ｘ１０^−１１、Ｂ２６４は、１．３ｘ１０^−１０であった。Ｋ_Ｄ値が１０^−１０から１０^−１２の間である場合、ピコモル（ｐＭ）水準の抗原に対する敏感度を有するものと評価されるので、Ｂ２６６−１とＢ２６４は、高い水準の抗原に対する敏感度を有することが分かる。

［実施例１１］
乳癌患者の血清でのサンドイッチＥＬＩＳＡ試験
コーティング抗体（Ｂ２６６−１）を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡを次のような過程で準備した。

コーティングバッファー１００ｍｌと１ｍｇ／ｍｌ濃度のＢ２６６−１０．１ｍｌを添加して、１μｇ／ｍｌ濃度のコーティング抗体溶液を製造した。製造されたコーティング抗体溶液を各９６ウェルプレートのウェル当たり１００μｌずつ分注した後、４℃、１２時間反応させた。抗体溶液を除去し、ウェル当たり２００μｌ０．０５％ＰＢＳＴを分注して洗浄した。この洗浄過程を３回繰り返した。ウェル当たり２００μｌＰＢＳＡを処理し、４℃、４時間反応（遮断工程）させた。ＰＢＳＡを除去し、９６ウェルプレートを恒温恒湿器（２０℃、３０％Ｒ．Ｈ．）で３時間乾燥させた。

次に、検出抗体（Ｂ２６４）を次のような過程でビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）した。

２０ｍｇ／ｍｌビオチン−７−ＮＨＳにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を混ぜて、２ｍｇ／ｍｌのビオチン−７−ＮＨＳを作った。１ｍｇ／ｍｌのＢ２６４抗体当たり２ｍｇ／ｍｌのビオチン−７−ＮＨＳ１５μｌ（３０μｇ）を混ぜて、１５〜２５℃、２時間反応させた。アミコンウルトラ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に反応溶液を入れ、ＰＢＳ溶液で最終体積まで満たした後、０．５ｍｌが残るまで３，６００×ｇで遠心分離した。この過程を３回繰り返した。アミコンフィルターの内部に残った抗体溶液（ビオチン化したＢ２６４；Ｂ２６４−Ｂ）を１．５ｍｌのチューブに移した後、ＰＢＳＡを利用して最終濃度を０．３ｍｇ／ｍｌで作った。

次に、乳癌患者の血清からヒトＴｒｘ１抗原検出を次のような過程で行った。

コーティング抗体としてコーティングして準備した９６ウェルプレートの一番目のカラム（ｃｏｌｕｍｎ）に標準抗原溶液を分注した。２０μｌ乳癌患者から獲得された血清を分注した後、８０μｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ）Ｂ２６４−Ｂ溶液を分注した。以後、３７℃、６０分間反応させた後、抗原および抗体反応溶液を除去し、ウェル当たり２００μｌＰＢＳＴを分注して洗浄した。この洗浄過程を３回繰り返した。１：４００で希釈したストレプタビディン−ＨＲＰ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）１００μｌを分注し、３７℃、３０分間反応させた。反応終了後、反応溶液を除去し、ウェル当たり２００μｌＰＢＳＴを分注して洗浄した。この洗浄過程を３回繰り返した。１００μｌＴＭＢ溶液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ）を処理し、常温、１５分間暗条件下で反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４溶液１００μｌを分注し、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を利用して４５０ｎｍ吸光度で測定した。

最後に、ＲＯＣ分析を次のような過程で行った。

Ｔｒｘ１に対する単一クローン抗体であるＢ２６６−１とＢ２６４を利用したＥＬＩＳＡによる結果を分析して、敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を計算した。カット−オフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆｖａｌｕｅ）が１０．８ｎｇ／ｍｌであるとき、敏感度は、９３．０％、特異度は、９７．４％であることを確認した（図９）。

［実施例１２］
乳癌を診断する他のＥＬＩＳＡキットとの比較分析
本実施例では、組み換え単一クローン抗体であるＢ２６６−１とＢ２６４の性能を評価するために、乳癌の有無を診断する他のバイオマーカーであるＣＡ１５−３を検出する他のＥＬＩＳＡキットと比較分析した（表１２）。

その結果、表１２に示されたように、本発明のＴｒｘ１に特異的に結合する単一クローン抗体の使用時、敏感度および特異度がＣＡ１５−３に比べて格別に高かった。

本発明のキットとＡｘＳＹＭＣＡ１５−３キットの比較

本発明の単一クローン抗体は、チオレドキシン１に対する結合親和度に優れているので、チオレドキシン１に非常に特異的に結合し、また、敏感度と特異度が非常に高いため、乳癌患者をスクリーニングするのに有用に使用され得る。ひいては、既存の他の乳癌診断バイオマーカーであるＣＡ１５−３を検出することより、本発明のチオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体を使用してチオレドキシン１を検出することが、敏感度と特異度が格別に優れているので、乳癌の診断の正確性および信頼性を顕著に高めることができるので、産業上の利用可能性が大きい。

Claims

配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
配列番号１のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖および配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖を含むことを特徴とする請求項２に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、ＩｇＧ１重鎖およびカッパ（κ）軽鎖を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｖまたは単鎖抗体分子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片。
請求項１に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸分子。
前記核酸分子は、配列番号２１のヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分子。
請求項１に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードする核酸分子。
前記核酸分子は、配列番号２２のヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１２に記載の核酸分子。
請求項２に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸分子。
前記核酸分子は、配列番号２３のヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１４に記載の核酸分子。
請求項２に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードする核酸分子。
前記核酸分子は、配列番号２４のヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１６に記載の核酸分子。
請求項１０に記載の軽鎖をコードする核酸分子、請求項１２に記載の重鎖をコードする核酸分子または前記核酸分子の全部を含む組み換えベクター。
請求項１４に記載の軽鎖をコードする核酸分子、請求項１６に記載の重鎖をコードする核酸分子または前記核酸分子の全部を含む組み換えベクター。
請求項１８に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
請求項１９に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
請求項２０または２１に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、チオレドキシン１に特異的に結合する単一クローン抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
請求項１〜６のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を含む乳癌診断キット。
前記キットは、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）キットであることを特徴とする請求項２３に記載の乳癌診断キット。
前記ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、直接的サンドイッチＥＬＩＳＡおよび間接的サンドイッチＥＬＩＳＡよりなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項２４に記載の乳癌診断キット。
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を、乳癌が疑われる個体から分離した血清に接触させる段階と；
（ｂ）抗原−抗体複合体の形成を通じて前記血清で単一クローン抗体またはその抗原結合断片に結合されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階と；
（ｃ）前記（ｂ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階と；
を含む乳癌の診断に必要な情報を提供する方法。
前記チオレドキシン１タンパク質の発現水準は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、免疫クロマトグラフィー分析法、ＦＡＣＳおよびタンパク質チップ方法のうちいずれか一つ以上の方法よりなる群から選ばれるいずれか一つの方法で測定することを特徴とする請求項２６に記載の乳癌の診断に必要な情報を提供する方法。
（ａ）固体支持体を請求項２、４または６に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片でコーティングする段階と；
（ｂ）乳癌が疑われる個体から分離した血清を前記コーティングされた固体支持体に適用する段階と；
（ｃ）結合されていないサンプルを除去する段階；
（ｄ）請求項１、３または５に記載の単一クローン抗体またはその抗原結合断片を固体支持体に適用する段階と；
（ｅ）結合されていない単一クローン抗体またはその抗原結合断片を除去する段階と；
（ｆ）チオレドキシン１タンパク質の発現水準を測定する段階と；
（ｇ）前記（ｆ）段階で測定されたチオレドキシン１タンパク質の発現水準を対照群と比較して、対照群に比べて前記タンパク質の発現水準が高ければ、乳癌患者と判定する段階と；
を含む乳癌の診断に必要な情報を提供する方法。
前記チオレドキシン１タンパク質の発現水準は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、免疫クロマトグラフィー分析法、ＦＡＣＳおよびタンパク質チップ方法のうちいずれか一つ以上の方法よりなる群から選ばれるいずれか一つの方法で測定することを特徴とする請求項２８に記載の乳癌の診断に必要な情報を提供する方法。