CN109863176A

CN109863176A - 与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN109863176A
Application number: CN201680089262.7A
Authority: CN
Inventors: 徐经薰; 姜恩惠; 金一韩; 郑锺焕; 李基世; 金美庆
Original assignee: E&s Medical Care Co Ltd
Current assignee: E&s Medical Care Co Ltd
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: KR20180029673A; RU2747929C2; EP3527589A4; JP6862542B2; AU2016422911A1; JP2019532630A; AU2016422911B2; BR112019004901A2; EP3527589A1; US11002739B2; RU2019110953A; CN109863176B; RU2019110953A3; US20200200750A1; WO2018052153A1; KR101982782B1

Abstract

本发明涉及与硫氧还蛋白1特异性结合的抗体及其用途，更详细地，涉及与硫氧还蛋白1特异性结合的抗体或其抗原结合片段、用于编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体、宿主细胞、上述抗体或其抗原结合片段的制备方法、乳腺癌诊断用试剂盒、为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

Description

与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体及其用途

技术领域

本申请要求于2016年9月13日申请的韩国专利申请第10-2016-0118053号的优先权，整篇的上述说明书为本申请的参考文献。

本发明涉及与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体及其用途，更详细地，涉及与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、用于编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体、宿主细胞、上述抗体或其抗原结合片段的制备方法、乳腺癌诊断用试剂盒、为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

背景技术

硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)为借助硫氧还蛋白还原酶进行NADPH依赖还原的12kDa左右的小的氧化还原蛋白质，包括哺乳类硫氧还蛋白1(Trx1)及硫氧还蛋白2(Trx2)。硫氧还蛋白作为生长因子起作用，去除在细胞内产生毒素的过氧化氢，在细菌中用作核糖核苷酸还原酶且起到使与转录活动相关的重要的要素与DNA结合的作用，在真核细胞中，对作为与转录相关的因子的NF-kB(nuclear transcript ion factor kB)的活性产生影响。因此，硫氧还蛋白由于对细胞凋亡和肿瘤产生影响而具有调节癌细胞生长的重要的作用，通过切断氧化的其他蛋白质的二硫键来帮助其重新具有还原状态的活性。硫氧还蛋白1酶和硫氧还蛋白2酶在哺乳动物细胞内去除半胱氨酸的氧化氮而对细胞凋亡产生影响，在包括炎症疾病、心脏麻痹、癌症在内的多种疾病中具有潜在性的重要性。并且，在利用抗-硫氧还蛋白抗体的免疫组织化学分析中，在包括肝脏、结肠、胰脏以及子宫颈的人类癌组织产生硫氧还蛋白的表达，这种表达意味着可能在肿瘤诱发过程中的硫氧还蛋白牵涉可能性。

在这种背景下，本发明人在研究能够在早期预测乳腺癌的诊断或预后的乳腺癌诊断用标记物的过程中，发现了硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中产生低表达，但在乳腺癌组织中产生非常高的表达，且证实了硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断用标记物而非常有用(韩国授权专利第10-1058230号)。

为了开发具有高准确性和精密度的基于酶联免疫吸附分析法(EL ISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的体外诊断(In vitro di agnostics，IVD)，需要相同抗原蛋白质的各个其他部位具有高亲和性(affinity)的抗体对(两种)。同时，也需要具备每次以低成本生产具有规定的亲和性的抗体的系统。对此，本发明中，为了检测存在于人类血清中的硫氧还蛋白1(thioredoxin-1，Trx1)，开发了两种高性能的重组单克隆抗体，上述抗体有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，从而确认了上述抗体有用于筛选乳腺癌患者，由此完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供可通过高灵敏度和特异度来诊断乳腺癌的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明的再一目的在于，提供用于编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。

本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的重组载体。

本发明的还有一目的在于，提供包含上述重组载体的宿主细胞。

本发明的又一目的在于，提供包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。

本发明的又一目的在于，提供包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。

本发明的又一目的在于，提供利用上述单克隆抗体或其抗原结合片段来为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

解决问题的手段

为了解决如上所述的问题，本发明提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：轻链可变区，包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列3的氨基酸序列形成的轻链CDR3；以及重链可变区，包含由序列4的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列5的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列6的氨基酸序列形成的重链CDR3。

根据本发明一优选实施例，上述抗体可包含由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区。

根据本发明另一优选实施例，上述抗体可包含由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链。

并且，本发明提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：轻链可变区，包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列9的氨基酸序列形成的轻链CDR3；以及重链可变区，包含由序列10的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列11的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列12的氨基酸序列形成的重链CDR3。

根据本发明一优选实施例，上述抗体可包含由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。

根据本发明再一优选实施例，上述抗体可包含由序列19的氨基酸序列形成的轻链及由序列20的氨基酸序列形成的重链。

根据本发明另一优选实施例，上述抗体可包含免疫球蛋白G1重链及κ轻链。

根据本发明还有一优选实施例，上述抗原结合片段可为Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv或单链抗体分子。

根据本发明又一优选实施例，上述抗体可为嵌合抗体、人源化抗体或人型抗体。

并且，本发明提供用于编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。

根据本发明一优选实施例，用于编码上述轻链的核酸分子可由序列21的核苷酸序列或序列23的核苷酸序列形成。

根据本发明一优选实施例，用于编码上述重链的核酸分子可由序列22的核苷酸序列或序列24的核苷酸序列形成。

并且，本发明提供包含用于编码上述重链的核酸分子、用于编码上述轻链的核酸分子或用于编码上述重链及轻链的核酸分子的重组载体。

并且，本发明提供包含上述重组载体的宿主细胞以及包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。

并且，本发明提供包含上述抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。

根据本发明一优选实施例，上述试剂盒可为酶联免疫吸附分析(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay)试剂盒。

根据本发明另一优选实施例，上述酶联免疫吸附分析可为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析以及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。

并且，本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，包括：步骤(a)，使根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑乳腺癌的个体分离的生物学试样接触；步骤(b)，通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测；以及步骤(c)，将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

进一步地，本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，包括：步骤(a)，利用根据权利要求2、4或6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段涂敷固体支撑体；步骤(b)，将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体；步骤(c)，去除未结合的样品；步骤(d)，将根据权利要求1、3或5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段适用于固体支撑体；步骤(e)，去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；步骤(f)，检测硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平；以及步骤(g)，将在上述步骤(f)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

根据本发明一优选实施例，上述硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平可通过选自由蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、夹心酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法(FACS)以及蛋白质芯片方法中的一种以上方法组成的组中的一种方法来检测。

根据本发明另一优选实施例，所分离的上述生物学试样可为选自由全血、血清、血浆、乳腺组织以及乳腺细胞组成的组中的一种以上。

除另有定义，本说明书中所使用的所有技术术语及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义具有相同的含义。一般而言，本发明中所使用的命名方式为在本技术领域中公知且通常所使用的。

本文中所使用的主要术语的定义如下所述。

术语“抗原”可通过抗体而结合，是指为了生产可与抗原的表位结合的抗体而可使用于动物的分子或分子的一部分。抗原可具有一个以上的表位。

术语“抗体”或“Ab”为位于免疫球蛋白分子的可变区的通过一个以上的抗原识别部位来识别如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性靶或抗原并可与其结合的免疫球蛋白分子。如本文所述，术语“抗体”包括但不限定于单克隆抗体；多克隆抗体；如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、Fc等具有可与特定抗原(例如，Trx1)特异性结合的能力的抗体的“抗原结合片段”；单独的互补性决定区(CDR)；双特异性抗体；异质接合体抗体、其突变体；具有抗体、或其抗原-结合性片段(例如，结构域抗体)的融合蛋白质；单链(ScFv)及单域抗体[例如，鲨鱼及骆驼科动物(camelid)抗体]；最大抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、细胞内抗体(intrabody)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、v-NAR以及bis-scFv；人源化抗体；嵌合抗体；以及包含所需的特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的其他所有变形的空间构象(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价性变形的抗体)的任何类型的抗体。抗体可为来源于鼠科动物、大鼠、人类或其他的所有抗体(包括嵌合抗体或人源化抗体)。

在相关技术领域中，与特定靶或抗原(例如，Trx1蛋白)“特异性结合”的抗体或多肽为广泛理解的术语，决定这种特异性结合的方法在相关技术领域中也是广为人知的。相比于特定分子与其他细胞或物质反应或结合的情况，在特定分子以更经常、更迅速、更大的持续性和/或更大的亲和性与特殊的细胞或物质反应或结合的情况下，呈现“特异性结合”。相比于特定抗体与其他物质反应或结合的情况，在特定抗体以更大的亲和性、结合活性、更迅速和/或更大的持续性结合的情况下，与特定靶或抗原“特异性结合”。

本文中所使用的“结合亲和性”或“K_D”是指特殊的抗原-抗体相互作用的平衡解离常数。K_D为解离速度(也称为“脱离速度”或“k_d”)与结合速度、或“启动速度”或“k_a(结合速率常数，Association rate constant)”之比。因此，K_D为k_d/k_a，以摩尔浓度(M)来表示。K_D越小，结合亲和性越强。因此，1μM的K_D比1nM的K_D呈现出弱的结合亲和性。与抗体有关的K_D值可在相关技术领域中利用公知的方法来决定。用于决定抗体的K_D的一种方法为使用如系统等典型的生物传感器系统来利用表面等离子共振仪的方法。

术语“载体”包含可运输连接的其他核酸的核酸分子。载体的一种形态为“质粒”，其是指可结合有附加的DNA片段的圆形双链DNA环。载体的其他形态为病毒载体，其中，附加的DNA片段可与病毒基因组结合。有些载体可在它们被转导的宿主细胞中自主地进行复制(例如，具有细菌起源复制的细菌载体及游离基因哺乳动物载体)。当其他载体(例如，非游离基因哺乳动物载体)转导至宿主细胞时，可合并为宿主细胞的基因组，由此，复制宿主基因组。并且，某些载体可指示它们启动性连接的(operatively linked)基因的表达。上述载体在本说明书中称为“重组表达载体(或简单地称为“表达载体”)”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体往往以质粒的形态存在。在本说明书中，“质粒”及“载体”为质粒用作最通常所使用的载体的形态，因此可相互交换来使用。但是，本发明包括具有同等功能的其他形态的表达载体，例如，病毒载体(例如，复制缺乏逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)。

术语“宿主细胞”是指能够表达转化或者可表达由核酸序列转化后选定的感兴趣的基因的细胞。只要存在选定的基因，不管子孙与父母在形态上或遗传结构上是否相同，上述术语包括母细胞的子孙。

发明的效果

本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，并且，由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而，相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的CA15-3，使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。

附图说明

图1示出表达硫氧还蛋白1抗原的重组载体的酶切图及从实施例1中获得的抗体的同种型(isotying)结果。

图2示出从实施例1中获得的9G7(AB1)抗体的轻链(a)及重链(b)氨基酸序列。

图3示出从实施例1中获得的2B4(AB2)抗体的轻链(a)及重链(b)氨基酸序列。

图4示出表达亲和性优秀的抗体B264的轻链(a)及重链(b)的重组载体的酶切图。

图5示出表达亲和性优秀的抗体B266的轻链(a)及重链(b)的重组载体的酶切图。

图6为确认利用SDS-PAGE的抗体的还原(+)及非还原(-)状态的图，图6的(a)部分示出抗体B264，图6的(b)部分示出抗体B266。

图7为确认利用SDS-PAGE的抗体B266-1的还原(+)及非还原(-)状态的图，上述抗体B266-1为抗体B266的Fc部分变为人类IgG1的抗体。

图8示出分析抗体B266-1和抗体B264的亲和性(affinity)的结果，图8的(a)部分示出基于抗体浓度的反应值和相应的曲线图，图8的(b)部分为分析利用Prism程序的抗体的亲和性的结果。

图9示出对利用抗体B266-1和抗体B264并通过酶联免疫吸附分析得到的结果进行ROC分析来计算灵敏度和特异度的结果。

具体实施方式

以下，更详细地说明本发明。

如上所述，本发明人通过之前的研究发现了硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中产生低表达，但在乳腺癌组织中产生非常高的表达，且证实了硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断用标记物而非常有用。

对此，本发明人通过进一步的研究开发了有效地与硫氧还蛋白1特异性结合而有用于筛选乳腺癌患者的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，并且，由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而，相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的CA15-3，使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。

本发明提供与人类硫氧还蛋白(Thioredoxin-1，Trx1)特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明的单克隆抗体可使用利用杂交瘤、重组以及噬菌体展示技术或它们的组合的方法等的在本技术领域中公知的很多种技术来制备。例如，单克隆抗体可利用在本技术领域中公知的技术等的杂交瘤技术来制备。在本文中，术语“单克隆抗体”不仅限定于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指任意的真核生物、原核生物或噬菌体克隆等的单克隆来源抗体，而并不是指其生产方法。

利用杂交瘤技术的特异抗体的生产及筛选方法是在本技术领域中常规且公知的。作为非限制性的例，可利用靶抗原或表达这种抗原的细胞对小鼠进行免疫化。若检测到免疫反应，例如，从小鼠血清中检测到对抗原具有特异性的抗体，则回收小鼠脾脏来分离脾脏细胞。之后，通过周知的技术使脾脏细胞与如P3U1、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8-653等任意的适合的骨髓瘤细胞融合。筛选杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。之后，通过在本技术领域中公知的方法来对杂交瘤克隆评价是否为分泌可与抗原结合的抗体的细胞。通常，包含高水平抗体的腹水可通过将阳性的杂交瘤克隆接种于小鼠腹腔来制备。在本发明一优选实施例中，将具有图1的(a)部分的酶切图的重组载体转染到大肠杆菌来制备Trx1抗原。之后，分离由抗原免疫化的小鼠的脾脏并通过酶联免疫吸附分析法确认了生产通过与骨髓瘤细胞(myeloma cell；sp2/0)融合来与Trx1反应的抗体的细胞。

本发明优选实施例的单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(a)或(b)，在本文中可分别称为B264及B266-1：

(a)包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列3的氨基酸序列形成的轻链CDR3的轻链可变区以及包含由序列4的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列5的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列6的氨基酸序列形成的重链CDR3的重链可变区；或者

(b)包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列9的氨基酸序列形成的轻链CDR3的轻链可变区以及包含由序列10的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列11的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列12的氨基酸序列形成的重链CDR3的重链可变区。

在本说明书中，术语“CDR(complementarity determining region)”是指免疫球蛋白重链及轻链的超变区(hypervariable region)的氨基酸序列。重链(CDRH1、CDRH2以及CDRH3)及轻链(CDRL1、CDRL2以及CDRL3)分别包含3个CDR，这些CDR在抗体与抗原或表位结合中提供主要的接触残基。

本发明优选实施例的单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(c)或(d)，在本文中可分别称为B264及B266-1：

(c)由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区；或者

(d)由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。

本发明优选实施例的单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(e)或(f)，在本文中可分别称为B264及B266：

(e)由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链；或者

(f)由序列19的氨基酸序列形成的轻链及由序列20的氨基酸序列形成的重链。

本发明的优选单克隆抗体称为B264、B265、B266、B267、B268或B269，优选地，可称为B264或B266-1。B266-1为B266的Fc部分变为人类IgG1的单克隆抗体。

自发性抗体结构单位通常包含四聚体(tetramer)。上述四聚体通常分别由两个相同的多肽链的一对构成，各对具有一个全长轻链(分子量通常为约15kDa)及一个全长重链(分子量通常为约50kDa至70kDa)。轻链及重链各自的氨基-末端部位通常包含参与抗原识别的约100至约110或以上的氨基酸的可变区。各链的羧基-末端部位通常限定参与效应器功能的不变区。人类轻链通常分为κ轻链及λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或υ，分别以IgM、IgD、IgG、IgA及IgE定义抗体的同种型。IgG具有包含IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的几个小类，但并不限定于此。IgM具有包含IgM1及IgM2的小类，但并不限定于此。类似地，IgA细分为IgA1及IgA2的小类，但并不限定于此。在全长轻链及重链内，通常，可变区及不变区通过约12个以上的氨基酸的“J”区结合，并且，重链包含约10个以上的氨基酸的“D”区。各个轻链/重链对的可变区通常形成抗原-结合部位。根据本发明一优选实施例，本发明的单克隆抗体的重链可为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM同种型，轻链可为κ链及λ链，优选地，可为κ轻链及IgG1重链。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段中，“其抗原结合片段”是指具有抗原结合功能的片段，包含Fab、F(ab')、F(ab')₂以及Fv或单链抗体分子等。抗体结合片段中，Fab为轻链及重链的可变区和轻链的不变区及重链的第一个不变区(CH1)的结构，具有一个抗原结合部位。F(ab')与Fab的区别在于，F(ab')在重链CH1结构域的C-末端包含一个以上的半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)。F(ab')₂在Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键的过程中生成。Fv是指仅具有重链可变部位及轻链可变部位的最小的抗体片段。这种抗体片段可利用蛋白水解酶来获得，例如，若利用木瓜蛋白酶切断整个抗体，则可获得Fab，若利用胃蛋白酶切断，则可获得F(ab')₂片段，优选地，可通过基因重组技术来制作。

本发明的优选抗体可为嵌合抗体、人源化抗体或全人类抗体。

嵌合抗体可通过组合从一种抗体生成细胞获得的可变轻链及重链区(VL及VH)与从另一种获得的不变轻链及重链区并利用重组手段来制备。通常，嵌合抗体主要为了生成具有人类结构域的抗体而利用啮齿类或兔可变区及人类不变区。这种嵌合抗体生成为在本领域中公知的，其能够通过标准手段而实现。还可考虑本发明的嵌合抗体的人类不变区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgG10、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18或IgG19不变区中。

为了使人源化抗体含有更接近于人类的免疫球蛋白结构域，而进行工程学处理，其仅包含来源于动物的抗体的互补性决定区。通过多加检查单克隆抗体的可变区的过可变环的序列并将上述序列适用于人类抗体链的结构来实现。

全人类抗体为包含CDR且轻链及重链两者的整个序列从人类基因产生的抗体分子。

并且，本发明提供用于编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。

本发明中所使用的“核酸分子”具有统筹包含DNA(gDNA及c DNA)及RNA分子的含义，在核酸分子中作为基本构成单位的核苷酸不仅包括天然的核苷酸，而且还包括糖或碱基部位变形的相似物(analogue)。本发明的用于编码重链及轻链可变区的核酸分子的序列可变形。上述变形包括核苷酸的增加、缺失或非保守置换或保守置换。

本发明的核酸分子解释为还包含对上述核苷酸序列产生实质性同一性的核苷酸序列。上述实质性同一性是指以最大限度地对应的方式排列(align)上述的本发明的核苷酸序列与任意其他序列，在利用在本领域中通常利用的算法来分析所排列的序列的情况下，呈现最小80％的相同性、在一特定例中呈现最小90％的相同性、在其他特定例中呈现最小95％的相同性的核苷酸序列。

根据本发明一优选实施例，本发明的用于编码单克隆抗体的轻链的核酸分子可由序列21的核苷酸序列形成，用于编码重链的核酸分子可由序列22的核苷酸序列形成。

根据本发明另一优选实施例，本发明的用于编码单克隆抗体的重链的核酸分子可由序列23的核苷酸序列形成，用于编码轻链的核酸分子可由序列24的核苷酸序列形成。

并且，本发明提供包含用于编码上述单克隆抗体的重链的核酸分子及用于编码轻链的核酸分子或所有上述核酸分子的重组载体。

本发明的重组载体系统可通过在本领域中公知的多种方法来构建。本发明的载体可由典型的用于克隆的载体或用于表达的载体构建。并且，本发明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。例如，在本发明的载体为表达载体且将原核细胞作为宿主的情况下，通常包含可进行转录的强烈的启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子以及T7启动子等)、用于启动解毒的核糖体结合位置及转录/解毒终结序列。在将E.coli(例如，HB101、BL21、DH5α等)利用为宿主细胞的情况下，可将E.coli色氨酸生物合成路径的启动子及操纵因子部位以及噬菌体λ的左向启动子(pLλ启动子)利用为调节部位。在将芽孢杆菌利用为宿主细胞的情况下，可将苏云金杆菌的毒素蛋白基因的启动子或可在芽孢杆菌表达的任何启动子也都利用为调节部位。

另一方面，本发明的重组载体可通过操作在本领域中所使用的质粒(例如，pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列以及pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1以及M13等)或病毒(例如，SV40等)来制作。

在本发明的载体为表达载体且将真核细胞作为宿主的情况下，可利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、肌动蛋白启动子、人球蛋白启动子以及人肌酸启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒(EBV)的启动子以及呼吸道合胞病毒(RSV)的启动子)作为转录终结序列，通常具有多腺苷酸化序列。

本发明的重组载体为了使从其表达的抗体的纯化变得容易而也可与其他序列融合。例如，融合的序列包括谷胱甘肽S-转移酶(Amersh am Pharmacia Biotech，USA)；麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)；FLAG(IBI，USA)；如6x His(hexahistidine；Qiagen，USA)、Pre-S 1、c-Myc等标签序列；如ompA、pelB等先导序列等。并且，由本发明的载体表达的蛋白质为抗体，因此，即使没有用于纯化的额外的序列，也可以通过蛋白A柱等来容易纯化所表达的抗体。

另一方面，本发明的重组载体包含在本领域中通常所利用的抗生剂耐性基因作为选择性标志，例如，对氨苄西林、艮他霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素以及四环素的耐性基因。

本发明的用于表达抗体的载体可实现轻链和重链在一个载体同时表达的载体系统或使轻链和重链分别在单独的载体表达的系统。在后者的情况下，两个载体通过共转化(co-transfomation)及靶向转化(targeted transformation)而导入到宿主细胞中。共转化为将用于编码轻链及重链的各个载体DNA同时导入到宿主细胞中后筛选均表达轻链和重链的细胞的方法。靶向转化为通过筛选转化为包含轻链(或重链)的载体的细胞并将表达轻链的所筛选的细胞重新转化为包含重链(或轻链)载体来最终筛选均表达轻链及重链的细胞的方法。

并且，本发明提供包含本发明的重组载体的宿主细胞。上述宿主细胞由本发明的重组载体转化的细胞。可稳定且连续地克隆及表达本发明的载体的宿主细胞在本领域中公知，因此可利用任何宿主细胞，例如，包括如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)以及苏云金芽胞杆菌(B.thuringensis)等芽孢杆菌属菌株(Bacillus spp.)、如链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococus carnosus))等原核宿主细胞，但并不限定于此。

作为上述载体的适合的真核细胞宿主细胞，可利用属于子囊菌门(PhylumAscomycota)的曲霉属(Aspergillus spp.)及粗糙链孢菌(Neurospora crassa)等多细胞真菌(multicellular fungi)和包含如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)等酵母的单细胞真菌(unicellular fungi)、低等真核细胞、如来源于昆虫的细胞等高等真核细胞以及来源于植物或哺乳动物的细胞。

本发明中所使用的术语“转染”是指利用本发明的重组载体来导入靶向宿主细胞的基因的过程，与“转化”的含义相同。因此，包括将“转染”和/或“转化”到宿主细胞的核酸导入到有机体、细胞、组织或器官的任意方法，如在本领域中所公知，可根据宿主细胞选择适合的标准技术来执行。这种方法包括电穿孔法(electroporation)、原生质体融合、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、利用碳化硅纤维的搅拌、由重组质粒转化脓杆菌介导的转化、PEG、右旋糖酐硫酸酯、脂质体以及由干燥/抑制介导的转化方法，但并不限定于此。

并且，本发明提供包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。

用于制备抗体或其抗原结合片段的宿主细胞的培养可根据在本领域中公知的适当的培养基和培养条件来进行。只要是本技术领域的普通技术人员，可根据所选择的菌株容易调整并使用这种培养过程。细胞培养根据细胞的生长方式分为悬浮培养和附着培养，根据培养方法分为分批式、流加式以及连续培养的方法。在培养中所使用的培养基需要适当满足特定的要求条件。

在动物细胞培养中所使用的上述培养基包含多种碳源、氮源以及微量元素成分。作为可使用的碳源的例，包括如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉以及纤维素等碳水化合物；如豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油等脂肪；如软脂酸、硬脂酸以及亚油酸等脂肪酸；如丙三醇及乙醇等醇；以及如乙酸等有机酸。这些碳源可单独使用或者可组合来使用。可用作氮源的例包含如胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸渍液(CSL)及大豆小麦之类的有机氮源及尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵之类的无机氮源。这些氮源可单独或组合使用。在上述培养基中，作为磷源可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及相应的含钠盐。并且，可包含如硫酸镁或硫酸铁等金属盐。此外，可包含氨基酸、维生素以及适当的前体等。

培养过程中，向培养物中以适当方式添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸以及硫酸等化合物来调整培养物的pH。并且，培养过程中，可使用如脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制气泡的生成。并且，为了维持培养物的呼吸状态，向培养物内注入氧或含氧气体(例如，空气)。培养物的温度通常为20℃至45℃，优选地为25℃至40℃。

通过培养宿主细胞来获得的抗体能够以未纯化的状态使用，可通过进一步利用如透析、盐沉淀以及色谱法等多种常规的方法并以高纯度进行纯化来使用。其中，最常用的是利用色谱法的方法，柱的种类和顺序可根据抗体的特性、培养方法等而从离子交换色谱法、尺寸排除色谱法、亲和色谱法等中选择。

并且，本发明提供包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒以及利用其来为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。

本发明中的术语“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。对于本发明的目的，诊断为确认乳腺癌发病与否。

硫氧还蛋白1蛋白作为乳腺癌诊断标记物，相比于正常乳腺组织，在乳腺癌组织中产生高表达。

根据本发明一优选实施例，上述乳腺癌诊断试剂盒可为酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)试剂盒，优选地，可为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析以及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。在本发明一优选实施例中，夹心酶联免疫吸附分析试剂盒所包含的两种抗体中，单克隆抗体B266-1为包被抗体，单克隆抗体B264为检测抗体。

本发明的乳腺癌诊断试剂盒还可包含除了与Trx1有关的抗体以外还使用于免疫学分析的本领域中公知的用具或试剂。

只要是可检测抗原与抗体的结合的方法，上述免疫学分析可包含所有办法。这些方法为在本领域中公知的，例如，包括蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫荧光分析法、免疫印迹法、琼脂双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组化法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法以及蛋白质芯片方法等，但并不限定于此。

免疫学分析中所使用的用具或试剂可包含适合的载体或支撑体、能够生成可检测的信号的标志、溶解剂、清洗剂以及稳定剂等。作为适合的载体，在标志物质为酶的情况下，包含可检测酶活性的基质、适当的缓冲液、显色酶以及反应终止剂等，但并不限定于此。

优选地，可利用文献中所揭示的多种方法来将本发明的试剂盒所包含的与Trx1有关的抗体固定于适合的载体或支撑体，作为适合的载体或支撑体的例，包括PBS、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、琼脂糖(agarose)、纤维素、硝化纤维、代血浆、交联葡萄糖、琼脂糖(Sepharose)、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、斑粝岩、过滤纸、离子交换树脂、塑料薄膜、塑料管、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、金属、玻璃、玻璃珠或磁性粒子等。此外，作为其他固体基质有细胞培养板、酶联免疫吸附分析板、管以及聚合物性膜。上述支撑体可具有如球形(微珠)、圆柱形(试管或孔内面)、平面形(片、试条)等任意形态。

能够生成可检测的信号的标志可定性或定量地检测抗原-抗体复合物的形成，作为其例可使用酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒子(microparticle)、氧化还原分子以及放射性同位素等。作为酶，可使用β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶(辣根过氧化物酶等)、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、苹果酸酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可使用荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻胆素、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氰酸荧光素等。作为配体，包括生物素衍生物，作为发光物质，包括吖啶酯、虫荧光素等。作为微粒子，包括胶质金、着色乳胶等，作为氧化还原分子，包括二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、氢醌等。作为放射性同位素，包括³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re等。但是，除了上述所例示的之外，只要是可使用于免疫学分析的，没有特别限制。

作为酶显色基质，例如，在选择辣根过氧化物酶(HRP)作为酶标志的情况下，作为基质，可使用包含3-氨基-9-乙基咔唑、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺、2，2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、3，3-二氨基联苯胺、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、联甲氧基苯胺或3，3'-二甲氧基联苯胺的溶液。并且，在选择碱性磷酸酶作为酶标志的情况下，作为基质，可使用包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、硝基蓝四唑或对硝基苯酚磷酸盐的溶液。并且，在选择β-D-葡萄糖苷酶作为酶标志的情况下，作为基质，可使用包含邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的溶液。此外，可使用在本领域中公知的多种酶及酶显色基质。

根据本发明一优选实施例，本发明的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法可包括：步骤(a)，使本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样接触；步骤(b)，通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测；以及步骤(c)，将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

根据本发明另一优选实施例，本发明的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法可包括：步骤(a)，利用根据权利要求2、4或6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段涂敷固体支撑体；步骤(b)，将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体；步骤(c)，去除未结合的样品；步骤(d)，将根据权利要求1、3或5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段适用于固体支撑体；步骤(e)，去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；步骤(f)，检测硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平；以及步骤(g)，将在上述步骤(f)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

在本发明中，术语“所分离的生物学试样”包括作为乳腺癌的标记物的Trx1蛋白质表达水平具有差异的组织(乳腺组织)、细胞(乳腺细胞)、全血、血浆、血清、血液、唾液、滑液、尿、咯痰、淋巴液、脑脊液、组织剖检试样(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液或破裂的真核细胞等，不仅包括来源于癌症的原发性病灶的试样，而且还包括来源于转移病灶的试样。可通过使这些生物学试样以操作或未操作的状态与本发明的单克隆抗体进行反应来确认Trx1蛋白质表达水平。

本发明中的术语“个体”包括如牛、猪、羊、鸡、狗、人类等哺乳动物、鸟类等，对怀疑患有乳腺癌的个体没有特别限制。

以下，为了有助于理解本发明而通过实施例等来详细说明。然而，本发明的实施例能够以多种其他形态变形，而应解释为本发明的范围限定于下述实施例。本发明的实施例是为了更详细地说明本发明而提供给本技术领域的普通技术人员的。

本发明的实施方式

实施例1

人类硫氧还蛋白1(Trx1)抗原制备

1-1.Trx1表达载体的制备

为将用于编码人类硫氧还蛋白1蛋白的基因在大肠杆菌中表达，根据大肠杆菌密码子使用(codon usage)来合成基因。所合成的人类硫氧还蛋白1基因序列如下列表1所示。

表1

为了扩增人类硫氧还蛋白1基因而使用的引物序列如下列表2所示。

表2

为了克隆到质粒并扩增基因而执行PCR(Polymerase chain reaction)。添加10pmol的所合成的基因、10pmol的引物(hTrx1-For、hTrx1-Rev)、dNTP(分别为2.5mM)、Exprime Taq polymerase以及缓冲液并进行混合来作为模板。使该溶液在95℃的温度下反应2分钟后，在95℃的温度下反应30秒钟，在55℃的温度下反应30秒钟，在70℃的温度下反应20秒钟，反复此过程35次后，在70℃的温度下反应2分钟，从而结束反应。纯化所扩增的基因后，为了克隆到存在于pUC57质粒的multi-cloning site(MCS)的EcoR V位置，对质粒处理对应的限制酶来进行纯化。混合所纯化的基因、经限制酶处理的质粒、连接酶(Ligase)和缓冲液并进行反应。为了将质粒转化为E.coli DH5α，在4℃的温度下溶解E.coli DH5αcompetent细胞株后，与质粒混合溶液混合并在4℃的温度下反应30分钟。反应后，在42℃的温度下施加热冲击30秒钟后，重新在4℃的温度下进行稳定化2分钟，并倒入包含抗生剂(50μg/ml的氨比西林(ampicillin))的LB(Luria-Burtani)固体培养基中以均匀地吸收，在37℃的温度下培养16小时。在所培养的培养基中生长的菌落中筛选具有人类硫氧还蛋白1基因的质粒。

1-2.Trx1的表达及纯化

对具有所筛选的人类硫氧还蛋白1基因的质粒进行纯化后，为了表达蛋白质而按照如上所述的方法转化E.coli BL21菌株。为了从所转化的菌株表达硫氧还蛋白1蛋白，在37℃的温度下在包含抗生剂的LB液体培养基中培养菌株直到OD₆₀₀＝0.5后，添加IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactopyranoside)再培养3小时，以使浓度成为1mM。之后，通过SDS-PAGE确认了蛋白质表达与否。为了纯化该蛋白质，利用超声波降解器(sonication)来破碎所获得的细胞株并进行离心分离(12000rpm，30分钟，4℃)来获得上清液。向所获得的上清液中添加购买的抗硫氧还蛋白I抗体(LF-MA0055，Abfrontier)来与表达的硫氧还蛋白I结合后，添加与抗体结合的Protein A/G PLUS-Agarose(sc-2003，Santa Cruz)并进行离心分离来纯化。之后，在SDS-PAGE上确认了纯度及定量。

实施例2

对Trx1具有特异性的单克隆抗体的生产及纯化

2-1.小鼠的免疫化

将所纯化的人类硫氧还蛋白1蛋白与佐剂(adjuvant)混合后注射到小家鼠并对小家鼠进行采血，通过酶联免疫吸附分析法确认了是否生成抗体。进行免疫化两次后，确认了抗体的潜在性(1：5000)适当增加。

2-2.细胞融合及杂交瘤的制备

从经免疫化的小家鼠摘取脾脏并分离B淋巴细胞后，与所培养的骨髓瘤(myeloma)细胞(sp2/0)融合。将所融合的细胞在添加有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨喋呤(aminopterine)以及胸苷酸(thymidine)的培养基(HAT medium)中培养来选择性地筛选骨髓瘤和仅融合有B淋巴细胞的细胞(hybridoma)并进行培养。

2-3.生产对Trx1具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选

利用酶联免疫吸附分析法来确认了所获得的杂交瘤(hybridoma)细胞中与人类硫氧还蛋白1蛋白反应的三种抗体。对酶联免疫吸附分析中产生阳性反应的细胞利用极限稀释法(Limiting dilution method)来筛选生产与抗原反应的抗体的杂交瘤(hybridoma)。

2-4.单克隆抗体的生产及纯化

向小家鼠注入所获得的三种杂交瘤(hybridoma)来获得腹水，利用Protein Aaffinity chromatography来对此进行纯化。通过SDS-PAGE确认了所纯化的抗体。

实施例3

单克隆抗体的同种型确认

使用Rapid酶联免疫吸附分析Mouse mAbs Isotyping Kit(Pierce，Cat.37503)试剂盒确认了在上述实施例2中获得的三种抗体的同种型。

其结果，如图1的(b)部分所示，确认了单克隆抗体2B4的重链为IgG1，单克隆抗体8F3的重链为IgG12a，单克隆抗体9G7的重链为IgG2b。确认了轻链均为κ链。

实施例4

单克隆抗体9G7(AB1)和2B4(AB2)的氨基酸序列分析

分析了在上述实施例2中所获得的三种单克隆抗体中9G7(AB1)和2B4(AB2)的重链及轻链氨基酸序列。将可与适合于backtranslation和重组表达(recombinationexpression)的Fc区融合的序列决定为氨基酸序列。通过IMTG gap排列来排列所决定的序列，利用高突变(hypermutation)表来查找高突变及完整的CDR3部分。通过精确的质量肽图(accurate mass peptide maps)等确认序列(图2及图3)，并利用MS/MS谱图确认了高突变及CDR3。

实施例5

利用酶联免疫吸附分析法的亲和性比较及抗体决定

选定了通过上述过程获得的氨基酸序列中可实现高突变(hypermu tation)的位置，由此，通过9G7(AB1)以四种(B266、B297、B268以及B269)且2B4(AB2)以两种(B264及B265)使碱基序列发生改变来合成基因。通过表达所获得的六种(B264～B269)并通过酶联免疫吸附分析法来确认了对各个抗体的抗原的亲和性(表3至表5中所示的T之后的编号表示各个生产batch编号)。

三种种类的抗原，即，通过直接(direct)酶联免疫吸附分析法来对什么都没结合的(naked)Trx1、与Fc结合的Trx1(Trx1-Fc)以及与His标签结合的Trx1(Trx1-His)确认了亲和性，其结果按下列表3至表5的顺序示出。如表3至表5所示，IgG1(κ)中B264、IgG2b(κ)中B266对三种抗原具有最好的亲和性。

表3

对什么都没结合的Trx1抗原的反应结果

抗体(Antibody)ID	5000×(OD Value)
		AB264-T150514-7	2.0575
B265-T150514-10	1.3225
		AB264-T150514-8	1.1635
B265-T150514-9	0.9515
		B267-T150519-5	0.8155
B269-T150519-9	0.735
		B268-T150519-8	0.716
B268-T150519-7	0.670
		B266-T150519-3	0.6625
B266-T150519-4	0.6615
		B269-T150519-10	0.626
B267-T150519-6	0.522

表4

对Trx1-Fc抗原的反应结果

抗体ID	5000×(OD Value)
		AB264-T150514-7	1.171
AB264-T150514-8	0.494
		B265-T150514-10	0.378
B265-T150514-9	0.273
		B266-T150519-3	0.198
B266-T150519-4	0.181
		B267-T150519-5	0.043
B267-T150519-6	0.023
		B268-T150519-8	0.015
B268-T150519-7	0.003
		B269-T150519-9	0.002
B269-T150519-10	-0.001

表5

对Trx1-His抗原的反应结果

抗体ID	5000×(OD Value)
		AB264-T150514-7	1.996
B265-T150514-10	1.465
		AB264-T150514-8	1.142
B265-T150514-9	1.03
		B267-T150519-5	0.857
B268-T150519-8	0.783
		B269-T150519-9	0.77
B268-T150519-7	0.761
		B269-T150519-10	0.717
B266-T150519-3	0.696
		B266-T150519-4	0.667
B267-T150519-6	0.554

亲和性高的抗体B264及抗体B266的氨基酸序列如下列表6所示。

表6

实施例6

抗体B264及抗体B266的生产

6-1.抗体B264及抗体B266的表达质粒制备

如上述表6所示，由于抗体B264及抗体B266的氨基酸序列被揭露，可以对与上述抗体的轻链及重链相应的基因进行化学合成。所合成的基因序列如下列表7所示。将所合成的基因克隆到pcDNA3.0。

表7

6-2.抗体B264及抗体B266的表达及纯化

为了表达B264抗体而将pcDNA3-SSJ11-L和pcDNA3-SSJ11-H且为了表达B266抗体而将pcDNA3-SSJ12-L和pcDNA3-SSJ12-H共转染(co-transfection)到HEK293细胞株并培养7天。培养细胞株并利用蛋白A色谱法来获得及纯化由培养液分泌的重组单克隆抗体。通过超过滤(ultrafiltration)浓缩包含重组单克隆抗体的洗脱剂(eluent)，利用0.2μm的灭菌过滤器来过滤，从而获得高纯度的抗体。

通过SDS-PAGE确认了所纯化的抗体的纯度和大小。SDS-PAGE结果，如图6所示，抗体B264及抗体B266在还原(reducing)条件下，重链为47kDa，轻链为25kDa，在非还原(non-reducing)条件下为150kDa，从而确认了以符合所预期的大小的方式表达。

实施例7

通过夹心(Sandwich)酶联免疫吸附分析法的所获得的两种单克隆抗体的配对与否确认

混合100μl的包被液(coating buffer)(0.015M的Na₂CO₃，0.035M的NaHCO₃，0.003M的NaN₃，pH9.6)和100ng的包被抗体(coating antibody，B266)并倒入每个孔(well)中后，在4℃的温度、O/N条件下进行反应。向每个孔中倒入200μl的包含1％的BSA的PBS(PBSA；隔离缓冲液)后，在常温下反应60分钟。之后，倒入20μl的抗原(50ng、25ng、12.5ng或0ng)，倒入80μl的检测抗体(生物素-标志的B264；B264-B)后，在37℃的温度下反应90分钟。去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的包含0.05％的吐温20的PBS(PBST；清洗缓冲液)并进行清洗。上述过程反复进行3次。

向每个孔处理100μl的以1：200稀释的链霉亲和素-HRP后，在37℃的温度下反应30分钟，去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的包含0.05％的吐温20的PBS(PBST；清洗缓冲液)并进行清洗。上述过程反复进行3次。

向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后，在暗的条件下，在常温下反应10分钟，向每个孔处理100μl的2.5M的硫酸溶液(H₂SO₄；终止缓冲液(STOP buffer))后，在450nm确认了结果。

其结果，如表8所示，抗原的反应值随着浓度而增加，从而确认了这些抗体检测出抗原。但是，在没有抗原的情况下，O.D.检测值高，因此，需要进行利用抗体的性能提高实验。

表8

将B266用作包被抗体且将B264用作检测抗体的夹心酶联免疫吸附分析

Trx1(ng/ml)	0	12.5	25	50
					O.D.<sub>450nm</sub>	0.828	1.226	1.506	2.257

实施例8

用于抗体的性能提高的Fc部分同种型变更

抗体的表达系统为利用重组质粒的瞬时转染(transient transfection)，而并非是利用杂交瘤的转染，因此，将重组质粒中具有重链的质粒共转染具有其他同种型的重链的质粒。即，对具有为了表达9G7(AB1)而使用的pcDNA3-SSJ12-L和pcDNA3-SSJ12-H中用于编码非pcDNA3-SSJ12-H的其他重链的基因的质粒进行共转染。

通过这种方法来获得了B266的Fc部分变为人类IgG1的抗体(B266-1)。通过SDS-PAGE确认了该抗体的性状(图7)。

最终，所选定的单克隆抗体B264及抗体B266-1的轻链CDR1至CDR3以及重链CDR1至CDR3的氨基酸序列如表9所示，轻链可变区及重链可变区的氨基酸序列如表10所示。

表9

	氨基酸序列
		B264轻链CDR1	SRISYM(序列1)
B264轻链CDR2	DTS(序列2)
		B264轻链CDR3	HQRSSYP(序列3)
B264重链CDR1	GFNIKDTF(序列4)
		B264重链CDR2	IDPANGNT(序列5)
B264重链CDR3	A(序列6)
		B266-1轻链CDR1	QSIVHSNGNTY(序列7)
B266-1轻链CDR2	KVS(序列8)
		B266-1轻链CDR3	FQGSHVP(序列9)
B266-1重链CDR1	GFNIKDTF(序列10)
		B266-1重链CDR2	IDPANGNT(序列11)
B266-1重链CDR3	A(序列12)

表10

实施例9

通过夹心酶联免疫吸附分析法的所获得的B266-1和B264的单克隆抗体的配对与否确认

混合100μl的包被液和100ng的包被抗体(B266-1)并倒入每个孔中后，在4℃的温度、O/N条件下进行反应，去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行2次。

向每个孔中倒入200μl的PBSA后，在常温下反应120分钟。之后，倒入20μl的抗原(25ng或0ng)，倒入80μl的检测抗体(B264-B)后，在37℃的温度下反应90分钟。去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。

向每个孔处理100μl的以1：200稀释的链霉亲和素-HRP后，在37℃的温度下反应30分钟，去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。

向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后，在暗的条件下，在常温下反应10分钟，向每个孔处理100μl的终止缓冲液后，在450nm确认了结果。

其结果，如表11所示，与抗原适当的进行反应，并确认了相比于在实施例6中所使用的抗体，空白(blank)值降低。

表11

将B266-1用作包被抗体且将B264用作检测抗体的夹心酶联免疫吸附分析

实施例10

对抗原单克隆抗体的亲和性分析

对抗原Trx1具有特异性的两种单克隆抗体通过利用质粒的瞬时转染系统来表达，从而可稳定地生产。对此，为了确认对抗原的亲和性(affinity)，利用酶联免疫吸附分析法进行分析(图8的(a)部分)。

混合100μl的包被液和100ng的Trx1并倒入每个孔中后，在4℃的温度下反应16小时以上，去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的PBSA后，在37℃的温度下反应120分钟。去除反应溶液后，所制作的抗体B266-1或抗体B264从0.1μM以1/5稀释并向每个孔中导入100μl，在37℃的温度下反应120分钟。去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。

将人类IgG-HRP(以1：4000稀释)作为抗体B266-1且将小鼠IgG-HRP(以1：4000稀释)作为抗体B264并分别倒入100μl，在37℃的温度下反应60分钟。去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl并进行清洗。此过程反复进行3次。

向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后，在暗的条件下，在常温下反应10分钟，向每个孔处理100μl的终止缓冲液后，在450nm确认了结果。利用Prism(Graphpad公司)来分析所获得的结果值(图8的(b)部分)。

分析包被抗体B266-1和检测抗体B264的亲和性的结果，确认了因B266-1的反应力而空白(blank)值高，但B266-1和B264的结合程度随着抗原的浓度而增加。这表示B266-1和B264与抗原结合。若根据利用Prism程序的分析计算K_D(equilibrium dissociationconstant)值，则B266-1为1.1×10^-11，B264为1.3×10^-10。K_D值在10^-10至10^-12之间的情况下，评价为具有对皮可摩尔(pM)水平的抗原的灵敏度，因此，可知B266-1和B264具有对高水准的抗原的灵敏度。

实施例11

乳腺癌患者的血清中的夹心酶联免疫吸附分析法试验

利用包被抗体(B266-1)的夹心酶联免疫吸附分析通过如下所述的过程来准备。

添加100ml的包被液和0.1ml的浓度为1㎎/ml的B266-1来制备浓度为1μg/ml的包被抗体溶液。向各96-孔板的每个孔中倒入100μl的所制备的包被抗体溶液后，在4℃的温度下反应12小时。去除抗体溶液，向每个孔中倒入200μl的0.05％的PBST并进行清洗。此清洗过程反复进行3次。向每个孔处理200μl的PBSA，在4℃的温度下反应4小时(隔离工序)。去除PBSA，将96-孔板在恒温恒湿机(20℃，30％R.H.)干燥3小时。

然后，通过如下的过程对检测抗体(B264)进行生物素化。

向20㎎/ml的生物素-7-NHS中混合DMSO(dimethyl sulfoxide)来制备2㎎/ml的生物素-7-NHS。每1㎎/ml的B264抗体中混合2㎎/ml的15μl(30μg)的生物素-7-NHS并在15～25℃的温度下反应2小时。向Amicon ultra-15(Millipore)中放入反应溶液，将PBS溶液填满至最终体积后，以3600xg进行离心分离，直到剩0.5ml。此反复进行3次。将Amicon过滤器内部中所剩的抗体溶液(生物素化的B264；B264-B)移至1.5ml的试管后，利用PBSA来使最终浓度达到0.3㎎/ml。

然后，通过如下的过程来从乳腺癌患者的血清检测人类Trx1抗原。

向利用包被抗体涂敷来准备的96-孔板的第一个柱(column)中倒入标准抗原溶液。倒入20μl的从乳腺癌患者获得的血清后，倒入，80μl(0.3㎎/ml)的B264-B溶液。之后，在37℃的温度下反应60分钟后，去除抗原及抗体反应溶液，向每个孔中倒入200μl的PBST并进行清洗。此过程反复进行3次。倒入100μl的以1：400稀释的链霉亲和素-HRP(R&D Systems)后，在37℃的温度下反应30分钟，反应结束后，去除反应溶液后，向每个孔中倒入200μl的PBST并进行清洗。此过程反复进行3次。处理100μl的TMB溶液(Sure Blue)并在常温且暗的条件下反应15分钟。倒入100μl的2N的H₂SO₄溶液，利用酶标仪(microplate reader)来检测450nm吸光度。

最后，通过如下的过程进行ROC分析。

对基于利用作为与Trx1有关的单克隆抗体的B266-1和B264的酶联免疫吸附分析的结果进行分析来计算灵敏度(sensitivity)和特异度(specificity)。当cut-off值(cut-off value)为10.8ng/ml时，确认了灵敏度为93.0％，特异度为97.4％(图9)。

实施例12

与诊断乳腺癌的其他酶联免疫吸附分析试剂盒之间的比较分析

在本实施例中，为了评价作为重组单克隆抗体的B266-1和B264的性能，与检测作为诊断乳腺癌与否的其他生物标记物的CA15-3的酶联免疫吸附分析试剂盒进行比较分析(表12)。

其结果，如表12所示，相比于CA15-3，当使用本发明的与Trx1特异性结合的单克隆抗体时，灵敏度及特异度特别高。

表12

本发明的试剂盒与AxSYM CA15-3试剂盒比较

产业上的可利用性

本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合，并且，由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而，相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的CA15-3，使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高，因此，产业上的可利用性很大。

序列表

<110> E&S医疗保健有限公司

<120> 与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体及其用途

<130> PCT5036720

<150> KR 10-2016-0118053

<151> 2016-09-13

<160> 27

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR1 of monoclonal antibody B264

<400> 1

Ser Arg Ile Ser Tyr Met

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR2 of monoclonal antibody B264

<400> 2

Asp Thr Ser

1

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR3 of monoclonal antibody B264

<400> 3

His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR1 of monoclonal antibody B264

<400> 4

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR2 of monoclonal antibody B264

<400> 5

Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 6

<211> 1

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR3 of monoclonal antibody B264

<400> 6

Ala

1

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR1 of monoclonal antibody B266-1

<400> 7

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR2 of monoclonal antibody B266-1

<400> 8

Lys Val Ser

1

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain CDR3 of monoclonal antibody B266-1

<400> 9

Phe Gln Gly Ser His Val Pro

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR1 of monoclonal antibody B266-1

<400> 10

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR2 of monoclonal antibody B266-1

<400> 11

Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 12

<211> 1

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain CDR3 of monoclonal antibody B266-1

<400> 12

Ala

1

<210> 13

<211> 94

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain variable region of monoclonal antibody B264

<400> 13

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Ile Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro

85 90

<210> 14

<211> 97

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain variable region of monoclonal antibody B264

<400> 14

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

<210> 15

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain variable region of monoclonal antibody B266-1

<400> 15

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro

100

<210> 16

<211> 97

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain variable region of monoclonal antibody B266-1

<400> 16

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

<210> 17

<211> 212

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain of monoclonal antibody B264

<400> 17

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Ile Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe

85 90 95

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr

100 105 110

Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val

130 135 140

Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser

145 150 155 160

Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr

165 170 175

Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys

180 185 190

Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn

195 200 205

Arg Asn Glu Cys

210

<210> 18

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain of monoclonal antibody B264

<400> 18

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Leu Gln Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu

225 230 235 240

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val

245 250 255

Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val

275 280 285

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met

305 310 315 320

Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser

325 330 335

Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser

370 375 380

Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr

385 390 395 400

Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn

420 425 430

Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser

435 440 445

Arg Ser Pro Gly

450

<210> 19

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain of monoclonal antibody B266

<400> 19

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 20

<211> 443

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> heavy chain of monoclonal antibody B266

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Glu Gly Gly Phe Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 21

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain of monoclonal antibody B264

<400> 21

gacgtgctga tgacacagac accactcagc ctccctgtga gcctgggcga ccaggcctct 60

atttcttgcc ggtctagcca gagcatcgtg cactccaacg gcaacacata cttggagtgg 120

tatctacaga agcccggcca gtcccctaag ctgctgatat acaaggtgtc taaccgcttc 180

tccggcgtgc ccgacaggtt ctctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctcaaaata 240

tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacgttcca 300

tacacattcg gcggcggcac aaagttggaa attaagcgcg ctgacgcagc cccaacagtg 360

agcatctttc ctccatcctc tgaacaactt acctctggag gagcctctgt ggtgtgtttc 420

ctgaacaact tctacccaaa ggacatcaat gtgaagtgga agattgatgg ctctgagaga 480

cagaatggag tgctgaactc ctggacagac caggacagca aggacagcac ctacagtatg 540

agtagcaccc tgaccctgac caaggatgaa tatgagagac acaactccta cacttgtgag 600

gctacccaca agaccagcac cagcccaatt gtcaaatcct tcaacaggaa tgagtgttaa 660

<210> 22

<211> 1332

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Heavy chain of monoclonal antibody B264

<400> 22

caggtgcagc tccagcagtc cggcgccgaa ctggccagac ctggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaagg cctccggcta cacattcaca tcttacacca tgcactgggt gaagcagaga 120

cccggccagg gcctggagtg gattggctac attaacccaa catccgacta cacaaactac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccacactc accgccgaca agtcttctag cacagcctac 240

atgcagctgt ctagcctgac aagcgaggac tctgccgtgt acttctgcgc ctctgagggc 300

ggcttcctgt actacttcga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gtcctctgcc 360

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 420

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 480

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 540

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 600

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 660

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 720

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 780

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 840

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 900

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 960

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1020

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1080

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1140

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1200

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1260

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1320

cctggtaaat aa 1332

<210> 23

<211> 639

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Light chain of monoclonal antibody B266

<400> 23

cagatcgtgc tcacacagtc tccagccatc atgagcgcct ctcctggcga gaaggtgaca 60

atgacctgct ctgcctctag ccgcatttct tacatgtact ggtatcagca gaagccaggc 120

acctccccta agaggtggat atacgacaca tccaagctgg cctccggcgt gcccgcccgg 180

ttcagcggct ctggcagcgg cacaagctac tccctgacaa ttagcacgat ggaggccgag 240

gacgccgcca catactactg ccaccagcgc tcgtcctacc caacattcgg cgccggcaca 300

aaattggaac tgaagagagc tgacgcagcc ccaacagtga gcatctttcc tccatcctct 360

gaacaactta cctctggagg agcctctgtg gtgtgtttcc tgaacaactt ctacccaaag 420

gacatcaatg tgaagtggaa gattgatggc tctgagagac agaatggagt gctgaactcc 480

tggacagacc aggacagcaa ggacagcacc tacagtatga gtagcaccct gaccctgacc 540

aaggatgaat atgagagaca caactcctac acttgtgagg ctacccacaa gaccagcacc 600

agcccaattg tcaaatcctt caacaggaat gagtgttaa 639

<210> 24

<211> 1359

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> heavy chain of monoclonal antibody B266

<400> 24

gaggtgcagt tacaacagtc cggcgccgag ctagtgaagc caggcgccag cgtgaagctg 60

tcttgcacag ccagcggctt caacattaag gacaccttca tgcactgggt gaagcagaga 120

cctgagcagg gcttagagtg gattggccgg atcgaccccg ccaacggcaa cacaaagtac 180

gacccaaagt tccagggcaa ggccacaatt accgccgaca catcttccaa cacagcctac 240

ctccagctgt cgtctctcac cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cctgctccag 300

tactccgcga tggactactg gggccagggc acatctgtga ccgtgtctag cgccaagacc 360

accccaccat ccgtgtaccc actcgcccca ggctgcggcg acaccacagg ctctagcgtg 420

acactgggct gcctggtgaa gggctacttc cccgagtctg tgacagtgac ctggaactct 480

ggctctctgt ctagctctgt gcacaccttc cccgccctgc tgcaatccgg cctgtacaca 540

atgtcttctt ctgtgacagt gcctagctct acatggccat ctcagacagt gacatgctct 600

gtggcccacc ccgcctctag cacaaccgtg gacaagaagc tggagccatc cggccctatt 660

tctacaatta acccttgccc tccttgcaaa gaatgccaca agtgccccgc cccaaacctg 720

gagggcggcc cttctgtgtt cattttccct cctaacatta aggacgtgct gatgatcagc 780

ctcaccccaa aggtgacatg cgtggtggtg gacgtgtccg aggacgaccc tgacgtgcag 840

atttcttggt tcgtgaacaa cgtggaggtg cacaccgccc agacccagac ccaccgggag 900

gactacaact ccaccattcg ggtggtgtct acactgccta ttcagcacca ggactggatg 960

agcggcaaag agttcaagtg caaggtgaac aacaaggacc tgccatctcc tattgagaga 1020

acaatttcta agattaaggg cctggtgcgc gcccctcagg tgtacattct gcctcctccc 1080

gccgagcagc tgagccggaa ggacgtgtcc ctcacatgcc tcgtggtggg cttcaaccct 1140

ggcgacatta gcgtggagtg gacatctaac ggccacacag aagaaaacta caaggacaca 1200

gcccctgtgc tcgactccga cggctcttac ttcatatact ctaagctgaa catgaaaaca 1260

tctaagtggg aaaagaccga ctctttctct tgcaacgtgc ggcacgaggg cctgaagaac 1320

tactacctca agaaaaccat tagcagaagt ccaggctaa 1359

<210> 25

<211> 315

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Human Thioredoxin-1

<400> 25

atggtcaaac agatcgaatc aaaaaccgca tttcaagaag ccctggacgc cgctggtgac 60

aaactggtcg tggtggactt tagtgctacc tggtgcggcc cgtgtaaaat gattaaaccg 120

tttttccata gcctgtctga aaaatacagt aacgttatct ttctggaagt ggatgttgat 180

gactgccagg acgtcgcgag cgaatgcgaa gtgaaatgta tgccgacgtt ccagtttttc 240

aaaaaaggtc aaaaagtcgg tgaatttagc ggtgccaaca aagaaaaact ggaagccacg 300

attaacgaac tggtg 315

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Human Thioredoxin-1 forward primer

<400> 26

taatggtcaa acagatcgaa tc 22

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Human Thioredoxin-1 reverse primer

<400> 27

caccagttcg ttaatcgtgg taatgaaagc t 31

Claims

1.一种与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含：

轻链可变区，包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列3的氨基酸序列形成的轻链CDR3；以及

重链可变区，包含由序列4的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列5的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列6的氨基酸序列形成的重链CDR3。

2.一种与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含：

轻链可变区，包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列9的氨基酸序列形成的轻链CDR3；以及

重链可变区，包含由序列10的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列11的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列12的氨基酸序列形成的重链CDR3。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体包含由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区。

4.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体包含由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体包含由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链。

6.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体包含由序列19的氨基酸序列形成的轻链及由序列20的氨基酸序列形成的重链。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体包含免疫球蛋白G1重链及κ轻链。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段为Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv或单链抗体分子。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人型抗体。

10.一种核酸分子，其特征在于，用于编码根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链。

11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子由序列21的核苷酸序列形成。

12.一种核酸分子，其特征在于，用于编码根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链。

13.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子由序列22的核苷酸序列形成。

14.一种核酸分子，其特征在于，用于编码根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链。

15.根据权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子由序列23的核苷酸序列形成。

16.一种核酸分子，其特征在于，用于编码根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链。

17.根据权利要求16所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子由序列24的核苷酸序列形成。

18.一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求10所述的用于编码轻链的核酸分子、根据权利要求12所述的用于编码重链的核酸分子或所有上述核酸分子。

19.一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求14所述的用于编码轻链的核酸分子、根据权利要求16所述的用于编码重链的核酸分子或所有上述核酸分子。

20.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求18所述的重组载体。

21.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求19所述的重组载体。

22.一种与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，包括培养根据权利要求20或21所述的宿主细胞的步骤。

23.一种乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

24.根据权利要求23所述的乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，上述试剂盒为酶联免疫吸附分析试剂盒。

25.根据权利要求24所述的乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，上述酶联免疫吸附分析为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析以及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。

26.一种为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，使根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样接触；

步骤(b)，通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测；以及

步骤(c)，将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

27.根据权利要求26所述的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，上述硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平通过选自由蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、夹心酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法以及蛋白质芯片方法中的一种以上方法组成的组中的一种方法来检测。

28.根据权利要求26所述的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，所分离的上述生物学试样为选自由全血、血清、血浆、乳腺组织以及乳腺细胞组成的组中的一种以上。

29.一种为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，利用根据权利要求2、4或6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段涂敷固体支撑体；

步骤(b)，将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体；

步骤(c)，去除未结合的样品；

步骤(d)，将根据权利要求1、3或5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段适用于固体支撑体；

步骤(e)，去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；

步骤(f)，检测硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平；以及

步骤(g)，将在上述步骤(f)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较，若上述蛋白质表达水平比对照组高，则判定为乳腺癌患者。

30.根据权利要求29所述的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，上述硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平通过选自由蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、夹心酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法以及蛋白质芯片方法中的一种以上方法组成的组中的一种方法来检测。

31.根据权利要求29所述的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法，其特征在于，所分离的上述生物学试样为选自由全血、血清、血浆、乳腺组织以及乳腺细胞组成的组中的一种以上。