CN113999819A - 分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗Trx蛋白单克隆抗体 - Google Patents

分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗Trx蛋白单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学和体外诊断分支技术领域。用于Trx蛋白的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，本领域对于Trx蛋白的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。本发明提供了一种分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株和单克隆抗体。所述分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其传代细胞株，命名为16H6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2021186。本发明的杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗Trx蛋白单克隆抗体，分泌的抗体具有高亲和力和特异性，可用于体外诊断的多个分支领域。

Description

分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗Trx蛋白单克 隆抗体
技术领域
本发明属于免疫学和体外诊断分支技术领域，涉及一种分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗Trx蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
硫氧还蛋白(Trx)是一种低分子量(约12KD)、热稳定的酸性蛋白，存在于细菌、植物及动物等多种生物体内，通过二硫键和硫醇变化在多种反应中起重要作用。Trx在植物体内分布广泛，在叶绿体、线粒体、细胞质和细胞核中均有发现，参与多种生命活动。相对来说，动物体内种类较少，主要参与缓解氧化胁迫，并能控制生长和细胞程序死亡。
通过对Trx的分离测序，发现不同种类的Trx具有很高的同源性，都含有一个高度保守的活性中心。通过共振检测，氧化Trx和还原Trx只在构象上略有差异。
Trx的溶解性高，稳定性好，对于一些在大肠杆菌中不溶或难溶性的蛋白，硫氧还蛋白标签可以促进其以可溶性的方式表达。通过对Trx蛋白的深入研究，人们对它的特点和功能等有了更多的认识，它在生物医药和体外诊断行业中的应用也越来越多。
目前用于Trx蛋白的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，本领域对于Trx蛋白的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗Trx蛋白单克隆抗体及其应用，该Trx蛋白的单克隆抗体效价高，灵敏度高，特异性好。
本发明一方面，提供一种能分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2021186。
本发明另一方面提供所述杂交瘤细胞株的制备方法：
杂交瘤细胞株，是取免疫小鼠脾脏的B淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合得到的，该细胞株能够稳定分泌抗Trx蛋白单克隆抗体。
利用大肠杆菌重组表达系统，进行Trx蛋白、Sumo蛋白、GST蛋白、MBP蛋白的重组表达和纯化。
用重组Trx蛋白进行小鼠免疫，取免疫小鼠脾脏的B淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆和筛选得到部分细胞株，并对细胞株进行特异性验证，最终得到特异性好的细胞株，命名为16H6。该细胞株能够稳定分泌抗Trx蛋白单克隆抗体。
本发明第三方面提供抗Trx蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体由上述保藏编号为CCTCC NO：C2021186的杂交瘤细胞株产生。该抗体具有高效价和特异性，亚型为IgG1，亚型单一，抗体稳定性好，可在4℃长期保存。
本发明还提供抗Trx蛋白单克隆抗体在制备体外诊断试剂盒中的应用。用抗Trx蛋白单克隆抗体结合重组抗原上的Trx标签，充分暴露抗原表位，增强试剂盒的信号强度，检测灵敏度高。
有益效果：
本发明提供了具有以下优势：本发明提供了分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为NO：C2021186，该杂交瘤细胞株及其传代细胞株能够稳定分泌抗Trx蛋白单克隆抗体；分泌的抗体亚型为IgG1，亚型单一，抗体效价高；该抗体能特异性结合Trx，特异性好。
生物保藏说明：
培养物名称：杂交瘤细胞株16H6，于2021年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021186。
附图说明
图1是杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的检测结果；
图2是抗体效价、亲和力的检测结果；
图3是抗体亚型的检测结果；
图4是特异性的检测结果；
图5是抗体稳定性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1、小鼠免疫
用Trx蛋白免疫6周龄的雌性balb/c小鼠。蛋白按照100μg/只的剂量与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。三周后加强免疫，蛋白按照50μg/只的剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。1周后，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价。血清效价达到5万以上，准备融合。融合前3天，对小鼠进行腹腔注射免疫，不加佐剂，免疫剂量为100μg/只。
2、细胞融合
融合时，在无菌环境下，取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，离心后收集小鼠B淋巴细胞，按照5:1(B淋巴细胞：SP2/0)的比例进行混合，离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无胎牛血清，在37℃水浴中，用1mL PEG进行细胞融合，在1min内边滴加PEG，边轻柔混合，静置30s，使PEG充分作用。
融合结束后，用20ml无血清DMEM终止融合，加入速度有慢到快，在10min内加完。终止结束后，将细胞放入二氧化碳培养箱中孵育20min，800rpm/min离心10min，用HAT培养基重悬融合细胞，置于96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱进行培养。
3、杂交瘤细胞筛选和亚克隆
融合后第五天用HAT培养基全换液，第七天通过间接ELISA的方法检测培养上清。具体检测方法如下：
(1)包被：用CBS缓冲液将Trx蛋白稀释成0.5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μL/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用HAT培养基做空白对照，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。
选择第一次筛选的阳性孔，重新用HAT培养基换液，隔天收集细胞上清，用间接ELISA方法验证效价，挑选效价高的细胞进行亚克隆。亚克隆采用倍比稀释法，取200-500个细胞，转移到新的96孔细胞培养板的A1孔，按照纵向和横向各2倍稀释，进行亚克隆。七天后用间接ELISA的方法检测培养上清，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100％。继续重复2次亚克隆，阳性率均在100％，结束亚克隆，保证杂交瘤细胞株的稳定性。
5、杂交瘤细胞株保存
选取生长稳定的杂交瘤细胞株，用间接ELISA方法，包被Trx蛋白、Sumo蛋白、GST蛋白、MBP蛋白，验证细胞上清的特异性。筛选特异性好的细胞株进行扩大培养，细胞密度达到80％时，收集细胞，用细胞冻存液冻存细胞。将该杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞株16H6，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2021186。。
4、杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
将杂交瘤细胞16H6进行传代培养，共培养30代，分别在1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30代时收集培养上清，用间接ELISA的方法检测Trx质控品，分析细胞分泌抗体的稳定性。检测结果如图1所示：细胞传代30次分泌抗体效价呈现较高的一致性。
实施例2Trx标签单克隆抗体的制备
1、腹水制备
选取12周龄左右的Balb/c雌鼠，每只小鼠腹腔注射500μL的液体石蜡，一周后腹腔注射杂交瘤细胞，剂量为106个/只。5天后，持续观察小鼠，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，12000rpm/min离心，去除杂质，置于-80℃冰箱保存。
2、腹水纯化
将腹水从冰箱取出，融化后离心，用0.22μm滤膜进行过滤。参照博格隆protein-A柱说明书进行纯化。收集纯化的抗体，用20mM PB进行透析，48h后收集抗体，0.22μm滤膜过滤后，分装，置于-80℃冰箱中保存，用于后续检测和验证。
具体纯化方法如下：
(1)平衡：取Protein-A层析柱，用10倍体积的上样缓冲液平衡柱子。
(2)上样：将处理好的腹水加入层析柱，用离心管收集流穿液。样品全部过柱后，将流穿液再次上样，同时收集流穿液，将流穿液做好标记(上样过程中，控制流速慢一点，使样品和纯化柱充分结合)。
(3)平衡：上样结束后，用10倍柱体积的上样缓冲液平衡柱子，同时用考马斯亮蓝试剂检测出口液体，液体蛋白浓度低于1mg/mL时，即为平衡完全。
(4)洗脱：提前在600μLEP管中加入30μl中和缓冲液，用10倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱时，每管收集400uL洗脱液，并及时混匀。用考马斯亮蓝试剂检测洗脱液中抗体的浓度(注意收集开始和结束的节点)，并做好标记。
(5)平衡：用10倍柱体积的上样缓冲液进行平衡，用PH试纸检测出口液体的PH，与上样缓冲液PH一致时，结束平衡。用20％乙醇进行冲洗柱子，并储存于20％乙醇中，放置4℃保存。
实施例3单克隆抗体鉴定
1、抗体效价和亲和力测定
采用间接ELISA的方法，对抗体的效价和亲和力进行比对，相较于对照抗体(T8)，本发明所述的抗体效价更高，且线性由于对照抗体。检测结果如图2所示。具体检测方法如下：(1)包被：用CBS缓冲液将Trx蛋白稀释成0.5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。
2、抗体亚型检测
使用Southern Biotech公司的SBA亚型检测试剂盒，按照说明书进行检测，本发明所述抗体的亚型为IgG1。检测结果如图3所示。
具体检测方法如下：
(1)包被：用CBS缓冲液将试剂盒中的包被抗原稀释成5μg/mL,100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中(每个抗体做8个检测)，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体(包含IgA-HRP、IgM-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、κ-HRP、λ-HRP)500倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。
3、抗体特异性检测
采用间接ELISA方法，包被4种不同的标签蛋白(Trx蛋白、Sumo蛋白、GST蛋白、MBP蛋白)以及4种含有Trx标签的重组蛋白(Ag1-Trx、Ag5-Trx、Ag13-Trx、Ag15-Trx)，包被蛋白做3个稀释梯度，同时做空白对照，检测抗Trx蛋白单克隆抗体的特异性。本发明说述抗体与其他标签蛋白不反应，与含Trx标签的重组蛋白反应良好，特异性高。检测结果如图4所示。
具体检测方法如下：
(1)包被：用CBS缓冲液将8种包被蛋白稀释，浓度分别为0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.02μg/mL，空白对照包被PBST，100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(4)加酶标二抗：用PBST缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育15min；用2M硫酸终止液进行终止，50μL/孔，于450nm波长下检测。
4、抗体稳定性检测
将本发明所述抗体和外购对照抗体(T8)，按照100μL的装量进行分装，分别进行37℃水浴破坏6天和10天，4℃放置1个月和2个月，-20℃反复冻融20次实验，本发明所述抗体的效价变化比较小，CV值在10％以内，对照抗体CV值在20％以内，本发明说述抗体在稳定性上明显优于外购抗体。检测结果如图5所示，1-6的含义：1、-20℃样本；2、-20℃反复冻融；3、4℃1个月；4、4℃2个月；5、37℃6天；6、37℃10天。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.分泌抗Trx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C2021186。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，是取免疫小鼠脾脏的B淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合得到的，该细胞株能够稳定分泌抗Trx蛋白单克隆抗体。
3.抗Trx蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到。
4.根据权利要求3所述单克隆抗体，其特征在于，亚型为IgG1。
5.权利要求3所述单克隆抗体在制备体外诊断试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求3所述单克隆抗体是作为标记原料使用。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述单克隆抗体，还包括抗原，所用抗原为含Trx标签的重组蛋白。
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