JP6858177B2 - ナノセルロースをベースにした医療移植片 - Google Patents

Description

本発明は、医療移植片に関し、具体的には胆管の修復用の医療移植片に関し、そしてこのような移植片を製造するための方法に関する。

肝臓−胆道手術においては、胆管の再生がしばしば重要な問題となる。これは胆管組織の喪失がしばしば外科医に高リスクの手術、すなわち胆管-消化管吻合のような手術を強いるからである。
このような組織の喪失、すなわち損傷は、胆嚢が除去され、そして共有の胆汁管が偶発的に傷つけられた場合、あるいは局所貧血、たとえば肝臓移植又は主要切除によって損傷が引き起こされた場合に、起こり得る。

このような胆管に関する損傷の再生は困難である。多くの場合、いわゆる「胆管-消化管吻合」（“bilioenteric anastomosis”）が行われ、これは共通の胆汁管と胃腸管の部分との間の結合である。
この手技において腸係蹄が上記の共通胆管に接続される。この方法の基本的な問題は、胆管系と腸管腔との間の自然なバリヤである括約筋機構がバイパスされることである。これはしばしば腸内細菌の胆管への移動をもたらし、これはこの胆道系の感染をもたらし得る。
とりわけ患者は肝臓移植後には、この問題に襲われ、そして患者の免疫抑制状態のために危険にさらされる。

胆管欠損を排除しようとする試みが、２，３の科学団体から提案されている。
例えば、アイカワ（Ａｉｋａｗａ）等（２０１２）は、再吸収され得るポリマーチューブの移植による胆管の代用を報じている。しかしながら、完全に再生された胆管の組織学的な証拠は、４か月経過より前には得ることはできなかった。
これは人体への適用が成功したとするには長すぎる時間である。さらに、胆管の新生及び上記のポリマーチューブの再吸収を調和させることは、特に個別の患者の固有の体質及び状況を考慮した場合、難しいことである。
また、パルメス（Ｐａｌｍｅｓ）等（２００９）によって報じられている技術が用いられた場合にも同じ問題が生じる。
ここでは自己移植用の血管の一部（外頸静脈）の移植が、吸収可能又は再吸収可能なステントを用いて行われそして安定化された。
しかしながら、この方法を用いると、新しい胆管を生成するには６か月もかかった。しかもすべての患者が適合した血管を有している訳ではなく、必要な血管部分を得るためには、さらなる外科的な介入が必要である。

本発明は、改良された医療移植片を提供するという課題に基づくものであり、具体的には胆管における欠損の修復のためのものである。
具体的には本発明の目的は、胆嚢、胆管、及び肝臓の手術用の材料を提供することであり、以下のような課題の１つ以上を満足することができるものである。
−胆管における欠損を、好ましくは長い距離に渡ってバイパス又はブリッジすること。
−胆嚢又は胆管と胃腸管の一部との間を結合すること無しに、胆管の再建を可能とすること。
−胆管上皮組織の再生を誘導すること。

本発明を用いて上記の目的の１つ以上が実現される。すなわち、本発明は、独立請求項（複数）に記載されているように、１つの医療移植片を提供し、そしてこのような移植片を製造するための方法を提供する。

本発明により、一般的に、又は特定の実施形態において、１つ以上の以下の利点が得られることが分った。
−体の自己組織から新しい胆管が、この移植片上に形成され得ること。すなわち、胆管上皮組織は、この移植片上に形成される。この移植片は、少なくとも胆管に関しては、体組織の再生に対する刺激を生成する。胆管における欠損は、こうして本発明による移植片を用いて修復することができる。充分な吻合を実現することができる。
−本発明による移植片は容易に製造することができる。すなわち、このナノセルロースチューブの直径、長さ、及び特にその内表面と外表面の構造及び特性は、対象とするアプリケーション又は状況を考慮して、バイオリアクター内で直接形成することができる。
−長距離に渡る胆管における欠損を修復することが可能である。すなわち、こうして形成された移植片において、括約筋機構が維持され、さらには、感染を避けることもできる。
−胆管の再生後、この移植片は容易に除去することができる。すなわち、ナノセルロースは、新しく形成された体組織に対して、強固な結合を形成しないということである。したがって、除去してしまえば、器官には異物は全く残らないことになる。
−この移植片は、恒久的又は一時的な中間挿入物として、使用することができる。
−この移植片のナノセルロースチューブは、特に胆管用のインターポネートとして使用することができる。
−驚くべきことに、本発明において、生きている器官において、劣化しない人工移植片が、新しく形成された胆管上皮組織によって覆われ、これにより体細胞から新しい胆管が形成されることである。そして、この移植片は、この新しい胆管の形成が完了した後、除去することができるという利点がある。すなわち、本発明の移植片は、一時的な移植片として適している。

本発明は、具体的には以下のものを備える医療移植片を提供する。
−微生物セルロースチューブであって、内表面と外表面とを有する壁部を備え、この壁部は微生物セルロースの複数の層を備え、これらの層がこのチューブの長手方向の軸に対し同心円状又は実質的に同心円状になっている微生物セルロースチューブである。
−上記の微生物セルロースのチューブの内側に配設されるステントである。

上記の移植片においては、上記の微生物セルロースチューブは、上記のステントを包囲している。

１つの実施形態においては、上記のステントの外表面は、上記の微生物セルロースチューブの内表面に接触している。この実施形態においては、上記の微生物セルロースチューブは、上記のステントの外表面に配置されている。

本発明による医療移植片は、好ましくは一時的な医療移植片として用いられ、この一時的な移植片はその役割が全うされたのち、完全又は部分的に除去することができる。部分的な除去においては、上記のステントが本体から除去される。完全に除去される場合は、上記のチューブも除去される。臨床アプリケーション用では、上記のチューブ及び上記のステントは、内視鏡を用いた方法により除去することができる。我々の実験においては、再生された胆管は安定であった。こうして全て、又はほぼ全ての「異物」は胆道系から除去される。

本発明の基本原理によれば、上記の微生物セルロースチューブは、胆管を代替することを目的とするものではない。むしろ、この微生物セルロースチューブは、体の自己組織からの新しい胆管あるいは胆管の一部の成長を助けるものである。
したがって、本発明による移植片は、体の自己組織から新しい胆管を生成するために特に適しており、あるいは既に在る２つの胆管端部の間に、体の自己組織から新しい胆管部分を生成することによって胆管を修復するために特に適している。

本発明による移植片を使用する場合、その使用の最後においては、体組織は上記の微生物セルロースチューブの表面上に成長し、あるいは成長しており、こうして１つの胆管を形成又は修復することができる。

上記のステントは、上記の微生物セルロースチューブ（単に、「チューブ」とも略称される）に挿入され、すなわち空洞とも称されるこのチューブの内側に挿入される。
このステントは、このチューブの内部すなわち管腔が開放されたままとし、そしてこのチューブが閉鎖されることを防止する。
したがって、以下に説明するように、ステントは、このチューブの拡張をもたらし得るので、これにより上記の移植片の機能を改善することができる。好ましくは、このステントは、上記の微生物セルロースチューブに挿入される。そして、この微生物セルロースチューブはこのステントを包囲している。

１つの実施形態においては、上記のステントは、チューブ状のステントである。このチューブ状のステントなる用語は、上記のチューブの表面又は被覆上に１つ以上の開口部を有するステントも含むものである。このチューブ状のステントは、メッシュ構造でできているチューブ又は穴のない被覆を有するチューブを備えていてもよい。

上記のステントの外径は、上記の微生物セルロースチューブの内径と、同じか、小さいか、又は大きくてよく、特に僅かに大きくてよい。
仮に、このステントの外径が大きければ、このチューブは拡張される。本発明による移植片は、拡張された微生物セルロースチューブを備えてよく、好ましくは径方向に拡張されている。
拡張とは上記のステントと組み合わされていないチューブに比べての拡張を意味している。上記のセルロースチューブの内径とは、これが上記のステントと組み合わされる前のチューブの内径のことである。

ステントとは、体内に設置される中空の器具であり、２つの中空の空間の間の通路を形成するため、あるいは中空の器官又は体内の管を開放されたままとするために用いることができる。
本発明においては、ステントは、上記の微生物セルロースチューブの堅い支持体として使用される。この観点から、このステントは、上記の微生物セルロースチューブを開放されたままとするために用いられる。このステントは、体内に存在している管の部分、たとえば胆管の部分を開放されたままとすることができる。

本発明のステントは、好ましくは胆管ステントである。このステントは、ポリマーでできていてよく、特にこれはポリマーチューブであってよい。
このステントは、その外表面に開口部（複数）を備えてよい。このような開口部は、ステントの両端にある開口部に加えてさらに存在する開口部であってよい。

また、本発明のステントは、その全長に渡って、上記の微生物セルロースのチューブの内側に配設されてよく、又はその長さの一部がこのチューブの内側に配設されていてよい。
１つの実施形態においては、このステントは、この微生物セルロースチューブの１つの端部（第１の端部）及びこの微生物セルロースチューブの反対側の端部（第２の端部）において、この微生物セルロースチューブから突出している。突出することは、たとえば２つの胆管部分の間に新しい組織を生成させて、これら２つの胆管部分を接続する場合、このステントの突出している端部（複数）をそれぞれ胆管に挿入することができるという利点を有する。また、突出とは、長手方向、すなわちこのチューブの長手軸（Ｌ）の方向における突出を意味している。

本発明による移植片の挿入に関して、以下のステップを備えている。
−上記のステント、具体的には上記のステントの突出部分（複数）を２つの胆管部分に挿入するステップ。
−これらの２つの胆管部分の間に上記のセルロースチューブを配設するステップ。この際両方の胆管部分の各々の端部は、それぞれこのチューブの端部で、このチューブの端部の近傍に配置されてよい。１つの胆管の端部は、このチューブの端部に接触していてもよい。
−任意で追加的に、接続手段を用いて、このチューブの１つの端部を１つの胆管に接続し、好ましくはこのチューブの両端で接続するステップ。この接続手段は、たとえば縫合糸であってもよい。

上記の移植片の挿入の後、体組織は、上記の２つの胆管部分が再接続されるまで、上記のチューブを覆って成長することができる。
この結果、この移植片は除去することができる。

また、別の１つの実施形態においては、上記の移植片におけるＢＮＣチューブの外層は、たとえばステントを用いてこのＢＮＣチューブを拡張することによってもたらされる圧力又は応力を受ける。
このような方法によって、メッシュの目が狭くなり、この外層におけるＢＮＣファイバの構造は、圧縮を受ける。
この結果を得るために、１つの実施形態においては、チューブの内径より大きな外径を有するステントが用いられていてもよい。
このチューブの内径とは、これがこのステントと組み合わされる前のこのチューブの内径のことである。拡張することによって、少なくともこのＢＮＣチューブの外層は、圧縮を受ける。したがって、少なくともこのチューブの外層の間隙率は減少する。
このような方法によって、この移植片がさらに良好に機能することが見出されており、特にこの外層上に形成された体組織からの良好な取り外しが得られた。
本発明による移植片は、好ましくは径方向に拡張された、微生物セルロースチューブを備えてよい。「拡張された」なる用語は、ステントと組み合わされていないチューブ、たとえばその製造後に、適合した液体媒体、たとえば脱イオン水に適宜保管されているチューブに比べての拡張を意味している。

さらに、別な１つの実施形態においては、上記の微生物セルロースチューブは、上記のステントによって径方向に拡張されている。
径方向における拡張は、少なくともこのチューブの内径が増大され、そして好ましくはこのチューブの内径及び外径が増大されるということを意味している。
この拡張は１つ以上の径方向で行うことができる。このチューブは、少なくとも１つの径方向に拡張することができ、好ましくはさらに多くの径方向に拡張することができ、さらに好ましくは、径方向に何段階にも、あるいは各々の方向に何段階にも拡張することができる。
このチューブの直径は少なくとも１つの径方向において増大されていてよく、好ましくはさらに多くの径方向に増大されていてよく、さらに好ましくは、径方向に何段階にも、あるいは各々の方向に何段階にも増大されていてよい。
このチューブは、その長手方向に関して、又はその長手軸における１つの特徴的な位置又は点に関して、対称的又は非対称的に拡張することができる。
また、このチューブは、その長手軸に沿った１つ以上の位置で径方向に拡張することができ、好ましくは多段に拡張することができる。最も好ましくは、このチューブはその長さの大部分又はその全長に渡って径方向に拡張されている。

上記のチューブ及び上記のステントは、直線状又は曲線状であってよく、あるいは１つ以上の屈曲部を有してよい。直線状のチューブは、中空シリンダとも呼ばれる。

以下の説明は、微生物セルロースのチューブ、その構造、及び製造するための方法に対するものである。これらの事項に対しては、特に国際公開第２０１３／１１３６７５号及びその開示全体が引用され、これはここで参照することにより本願に組込まれるものである。

「微生物セルロース」なる用語は、微生物によって生産されるセルロースを意味する。例示的な微生物は菌類，細菌類，及び藻類である。多数の微生物が微生物セルロースを生産することができる。
特に限定するものではないが、これらはバロニア（Valonia）及びマガタマモ（Boergesenia）のような藻類、タマホコリカビ（Dictyostelium）のような菌類、そしてグルコノアセトバクター（Gluconacetobacter；Komagataeibacter），エンテロバクター（Enterobacter），アグロバクテリウム（Agrobacterium），サルシナ（Sarcina），シュードモナス（Pseudomonas），リゾビウム（Rhizobium），及びズーグレア（Zoogloea）のような細菌類を含む。アセトバクター・キシリナム属の例は、アセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasturianus），アセロバクター・アセチ（Acetobacter aceti），アセトバクター・ランセンス（Acetobacter ransens）である。
特に有用な微生物は、グルコノアセトバクター（Gluconacetobacter）であり、具体的にはグルコノアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）である。

上記のチューブにおける微生物セルロースの層は、具体的にはファイバのネットワークでできている。

微生物セルロースは、空気と培養液との間の界面において、バイオフィルム（フリース）の形態で生産することができる。
上記の細菌類は、このセルロースを原繊維の形態で生産する。これらは自己集合してファイバとなる。これらのファイバの織り込みによって、３次元的な、約９９％の水及び１％のセルロースから成る、極めて含水性のナノファイバーネットワークが生成される（Jonas R, Farah LF;Production and application of microbial cellulose., Polym. Degrad. Staff (1998), 59 (1-3), 101-106; A Hirai, Horii F: Cellulose Assemblies produced by Acetobacter xylinum. ICR Annual Report (1999) 6, 28-29; Terminal D, Heublein B, Fink HP, Bohn A: Cellulose: Fascinating Biopolymer as sustainable raw material, Angew. Chem. Int. Ed. (2005) 44, 3358-3393)。

微生物セルロースは、もしそれが細菌類によって生産されているならば、ここでは「バクテリアセルロース」，「バクテリアナノセルロース」（ＢＮＣ）とも呼称され、あるいは単に「ナノセルロース」と呼称される。
この「バクテリアセルロース」なる用語は、細菌によって生産されたセルロースであることに由来するものであり、これは上述のようにナノファイバーネットワークを形成する。

１つの実施形態においては、数個の微生物セルロースの層を備えており、上記の微生物セルロースチューブは、以下のステップを備える方法によって得ることができる。
ａ）上記の微生物セルロースの空洞及びこの空洞の内壁のネガティブモールドである１つのテンプレートの表面を、液体培地及びセルロースを生産する微生物を含むストック混合物に接触させるステップ。
ｂ）上記のテンプレートと上記のストック混合物との接触を中断するステップであって、ここでこのテンプレートの表面上に上記の液体培地及び上記の微生物を含む液体フィルムが残るステップ。
ｃ）この液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そしてこの液体フィルム内に、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップ。
ｄ）ステップｃ）で得られた微生物セルロースを上記のストック混合物に接触させるステップ。
ｅ）この微生物セルロースとこのストック混合物との間の接触を中断するステップであって、ここでこの微生物セルロースの表面上に液体フィルムが残り、この液体フィルムが液体培地と微生物を含むステップ。
ｆ）この液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そしてこの液体フィルム内で、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップ。
ここで上記の一連のステップｄ），ｅ）及びｆ）は、１回以上繰り返される。
ｇ）上記の微生物セルロースを上記のテンプレートから分離するステップ。

この方法を用いて、微生物セルロースの複数の単層から成る１つのチューブを生産することができる。

１つの実施形態においては、本発明による移植片そのもの又はこの移植片の一部である、上記の微生物セルロースチューブは、以下の１つ以上の特徴を、それ単体又は任意の組合せで有するものとすることができる。
−長さ１０〜２００ｍｍ、好ましくは２０〜１８０ｍｍ、さらに好ましくは５０〜１５０ｍｍの範囲内の値である。
−内径２〜１０ｍｍ、好ましくは２〜８ｍｍの範囲内の値である。
−外径３〜１５ｍｍ、好ましくは４〜１０ｍｍの範囲内の値である。
−壁厚１〜５ｍｍ、好ましくは１〜３ｍｍの範囲内の値である。
−ＢＮＣ単層の数３〜１０、好ましくは５〜１０の範囲内の値である。

「ブロス」（“broth”）とも呼ばれる培地、あるいはブロスは、グルコース，ペプトン，酵母エキス，リン酸水素ナトリウム，及びクエン酸の水溶液（ヘストリン−シュラム培地）のような、セルロースを生産する微生物用の従来の成分を含んでよい。１つの代替の酸性培地は、グルコース，ペプトン，酢酸，及びエタノールの水溶液から成っている。

上記の方法は、好ましくは２０〜４０℃の温度で実施される。

上記のチューブを生産するための方法においては、培養は純粋に静的に行われるものではない。
すなわち、上記のテンプレートならびに、培養液及び微生物を含むストック混合物は、このテンプレートの表面が濡らされるように互いに相対的に動かされる。
このテンプレートとこの混合ストックとの恒常的な接触は排除される。このテンプレートならびに、上記の培養液及び上記の微生物を有するこの混合物の容器は、互いに相対的に動かされ、これによってこれらは一時的に、但し非恒常的に接触させられる。
したがって、本発明の特徴は、周期的に、ただし非恒常的に培養液及び微生物と接触されられるテンプレートであり、この培地及び微生物を含むフィルムをこのテンプレート上で形成すること、及びこのテンプレートにおけるセルロースの生合成が、このストック混合物の外側で、このフィルム内でのみ、及び／又はこのフィルム上でのみ行われることである。

上記の「接触の中断」なる用語は、上記のテンプレートと混合ストックとの間の接触が中断されて、このテンプレートの表面のいかなる部分もこの中断の間にこの混合ストックと接触しないことを意味している。

上記の方法においては、上記のチューブの内室、あるいは内部の輪郭が、適合した形状のテンプレートによって規定され、このテンプレートの表面上には、この方法を実施する際に、液体フィルムが形成され、この液体フィルムにおいて、セルロースの生合成が起こる。
こうしてこのテンプレート表面上に直接生産されたセルロースは、この後このチューブの内表面を形成する。セルロースの第１の層はこのテンプレート上に形成される。
さらなる層（複数）が、ステップｄ），ｅ），ｆ）及びこれらの反復によって形成される。ステップｂ）及びｃ）は、組み合わせた１つのステップとすることができる。ステップｅ）及びｆ）は、組み合わせた１つのステップとすることができる。
本発明による上記の中空体の外側の成形は、上記の接触無しに、重力の影響のみによって行われる。上記の濡らし処理（“wetting process”）の後、上記の濡らされたテンプレートは、その周囲の酸素を含む雰囲気の中に露出されており、そして上記のセルロース形成プロセスが上記のフィルム内で、及び／又は上記のフィルム上で行われる。上記の中空体の外形は、培養条件の設定のみによって規定される。この培養条件は、以下に説明するように、たとえば重力の方向，個々の処理ラウンドの周波数及び間隔、上記の濡らし時間（“wetting times”）の時間間隔，滞留時間であり、温度及び培養時間である。

上記のチューブを生産するための方法は、国際公開第２０１３／１１３６７５号に記載された装置で実施することができる。

この方法によって生産されるＢＮＣチューブは、改善された機械的特性及び生理活性表面を特徴とする。こうして生理活性な外表面に体組織、具体的には胆管上皮組織を生成することができる。

このチューブの長さ及び内径は変更可能であり、また長さ及び内径は様々に組み合わせることができる。例示的な内径は１〜３０ｍｍであり、好ましくは２〜８ｍｍであり、そして例示的な長さは５〜５００ｍｍであり、好ましくは１００〜２００ｍｍである。
そして、径（内径）に対する長さの比は好ましくは１より大きい。この内径は１つのチューブ内で変化させることもできる。

上記のチューブ、特にその空洞は、様々な形状の断面を有してもよく、たとえば円形の代わりに正方形、長方形、三角形、又は星形の断面を有してよい。

既に述べたように、上記のテンプレートは、上記のチューブの空洞及びこのチューブの内壁のネガティブモールドである。
この「ネガティブモールド」なる用語は、雄のモールド、この場合は上記のチューブ／空洞／チューブ内壁、を得ることを目的とする治具を意味する。
このテンプレートは、生成される所望の空洞の形状に対し相補的な形状となっており、これに対応して規定されている。これに対応して、このテンプレートの形状は、上述の空洞の形状で規定される。
このテンプレートは、この空洞の内部形状を決める。たとえば、このテンプレートは円柱状であり、１〜３０ｍｍの直径、好ましくは２〜８ｍｍの直径を有し、そして５〜５００ｍｍの長さ、好ましくは１００〜２００ｍｍの長さを有する。上記のチューブ空洞として、このテンプレートは、円形、長方形、特に正方形、矩形、三角形、又は星形、又は雪の結晶状のような、任意の断面を有することができる。

１つの実施形態においては、上記のテンプレートは、ミリメートル、マイクロメートル、及び／又はナノメートルの規模の構造（複数）を有する表面を備える。これらの構造は、たとえば突起又は凹部、又はこれら両方である。これらの構造は、異なる幾何形状を有してよい。

上記のテンプレートの表面ができている材料は、原則として制限されない。 １つの実施形態においては、このテンプレートは、木、あるいはアルミニウム、ステンレス鋼、又はチタンのような金属、プラスチック、セラミック、あるいはポリプロピレン，ポリエステル，ポリアミド，又はテフロン（登録商標）のような合成ポリマー、紙、あるいはガラス繊維布、からできている表面を有している。このテンプレート材料は、単にそのまま用いられてよく、あるいは適宜表面コーティングされて用いられてよい。このテンプレート全体が、上述の材質の１つから成ることも可能である。

１つの特定の実施形態においては、複数のテンプレートから成る構成体が上記のプロセスで用いられ、この構成体はテンプレート配列体と呼ばれる。このテンプレートは、同じ幾何形状又は異なる幾何形状、特に異なる断面で型抜きされることができ、及び／又は同じ又は異なる材料が用いられてよい。これにより複数の同一又は異なるチューブがこの方法で得られる。複数のテンプレートの構成体の例は、複数のチューブの生産のための、複数の柱状のテンプレートからなる構成体である。同じ又は異なる幾何形状の複数のテンプレート（テンプレート配列体）が、１つの治具に固定されていてよい。

上記の方法においては、上記のテンプレートは周期的に、好ましくは短時間、上記の培養液及び上記の微生物を含む混合物で濡らされる。
ここでこのテンプレートの表面上に液体フィルムが形成される。この液体フィルムの形状は、空間におけるこのテンプレートの位置によって決定される。これは重力がこのフィルムに作用するためである。

上記のテンプレートの表面上には、上記の液体培地及び上記の微生物を含むフィルムが形成されている。この液体フィルム内及び／又はこの液体フィルム上に、微生物セルロースが形成される。この液体フィルムは、上記のテンプレートを１つ以上の空間軸、たとえば直交座標系のＸ，Ｙ，及び／又はＺの回りに回転することによって、このテンプレート上に広げることができる。これは国際公開第２０１３／１１３６７５号の例においては、このような動作装置を用いて説明されている。
このテンプレートの所定の動きによって、この液体のさらに良好な分布を実現することができる。この液体の分布は、このテンプレートの所定の回転動作のタイプによって影響を受けるが、ここでこの回転動作は中断されてもよい。こうして上記のチューブの外形は液体フィルムの分布によって、そして重力の影響下の所定の動きによって決定される。

好ましくは、上記のテンプレートは、直径に対する長さの比が１より大きい幾何形状を有する。たとえば、このテンプレートは、１つのストレートチューブを生産するために、直径に対する長さの比が１より大きい円柱状の幾何形状を有してよい。
このテンプレートは１つの長手軸を有する。具体的には、このチューブは、１つの中空円筒を備え、この中空円筒は、この円筒の空洞の拡がりの中心を長手方向に延伸する１つの中心軸を有する。次にこのテンプレートが１つ以上の軸の回りに回転されるように、上記のプロセスが行われる。

上述したように、液体フィルムは上記のテンプレートの表面上に形成される。この液体フィルムは、上記のテンプレート、及び上記の培養液と上記の微生物とを含む上記の混合物が、互いに相対的に動かされ、そしてこれによってこれらが接触した時に、形成される。

１つの実施形態においては、上記の混合物への上記のテンプレートの表面の接触は、上記のテンプレートが上記の培養液及び上記の微生物を含む上記の混合物の中に浸漬されて行われる。１つ以上の空間軸におけるこのテンプレートの動き、特に回転は、この浸漬、すなわちこの混合物へのこのテンプレートの接触の中断に合わせて行われる。

上記の酸素を含む雰囲気は、好ましくは空気又は純粋な酸素又は酸素を含むガス混合物である。
微生物セルロースは、上記の液体フィルム内及び／又は上記の液体フィルム上に、この液体フィルムが酸素と接触した時に形成される。

（テンプレートとチューブとの分離）
本発明による移植片を使用するために、ナノセルロースで形成された上記のチューブが上記のテンプレートから分離される。
かかる分離は、たとえば形成されたセルロースが上記のテンプレートから剥ぎ取られるか、又はこのテンプレートが他の方法で除去されることによって行われる。
たとえば、このセルロースは、円柱状のテンプレートから剥ぎ取られて、上記のチューブが得られる。

上記のテンプレートは、少なくともステップｃ）及び／又はステップｆ）の間に、又はこのステップｆ）が複数回行われる場合は１回以上のステップｆ）の間に、１つ以上の空間軸の回りに回転されてよい。
この方法を用いて、上記の液体フィルムの分布の形状及び形成される生産物の形状を制御することができる。
換言すれば、上記のテンプレートは、規定された液体フィルムでコーティングされ、次にこれは上記の生産物の規定された形状をもたらす。上記の回転は、ステップａ）及びｂ）の間に、及び／又は上記のステップｄ）及びｅ）の間に行われてよい。

これらの一連のステップｄ）〜ｆ）は、所望の量のセルロースが上記のテンプレートの表面上に形成され、
そして、このセルロースが所望の全層厚に達するまで１回以上繰り返される。このいわゆる全体層は、複数の単層又は相からなっていてよい。さらなる微生物セルロースの合成が既に形成されているセルロース上で起こる。

１つのテンプレートの表面のストック混合物との接触（ステップａ）の時間、及びステップｃ）において生成された微生物セルロースの上記のストック混合物との接触（ステップｄ）の時間は、「濡らし時間」（“wetting time”）と呼ばれる。上記の液体フィルムの酸素を含む雰囲気との接触の時間（ステップｃ及びｆ）は、「滞留時間」と呼ばれる。濡らし時間及び滞留時間は、互いに独立に制御することができる。この滞留時間は、１つの実施形態においては、１〜６０分であり、好ましくは５〜４０分である。

合計培養時間は、好ましくは１〜７日である。この合計培養時間は、合計プロセス時間に対応し、この合計プロセス時間内に、回転、濡らし、及び他のステップ等の上記の方法の全てのステップが実施される。この手順の持続時間が、上記のテンプレート上に形成される微生物セルロースの厚さを決定し、これが上記のチューブの壁厚に対応する。

上記の方法で生産されたチューブは、培養液ならびに微生物の残渣及び成分を除去するために洗浄されてよい。洗浄には、水、酸性又はアルカリ性水溶液、又は有機溶剤、又はこれらの組合せを用いることができる。

上記の方法を用いて生産されたチューブは、洗浄後の乾燥及び殺菌の処理無しに、本発明による移植片の生産に使用することができる。

以下の説明は、上記の微生物セルロースチューブの構造に関する。

このチューブにおいては、好ましくは少なくとも上記の微生物セルロースチューブの外表面又は外層は多孔質となっている。多孔性は、このチューブを上述の方法によって生産することによって実現される。多孔性はこの微生物セルロース上での組織の形成／生成を改善する。

具体的には、上記のチューブは、内表面と外表面とを有する壁部を備えており、ここでこの内表面及び外表面は、単位面積当たり同一又は同程度の量の微生物セルロースのファイバで覆われている。
上述のように、ＢＮＣは、多少密度の低い、そして多少多孔質のネットワークを形成する。画像解析の方法を用いて、ファイバが存在する表面領域（たとえばＳＥＭ画像で明るく見える）と、ファイバが全く存在しない表面領域（間隙、たとえばＳＥＭ画像で暗く見える）とを識別することができ、全領域に対するこれらの領域を確定することができる。

単位面積当たりの被覆率は、以下のように表すことができる。
被覆率＝ファイバで覆われた領域区画の部分／前領域区画
この被覆率は、パーセントで表されてよい。

この観点から、上記の「同程度」なる用語は、上記の内表面及び上記の外表面の被覆率が、互いに最大で２０％、好ましくは最大で１０％、最も好ましくは最大で５％、異なっていることを意味している。

これらの値の間の差のパーセント値は、以下のように計算される。
差(％)＝（大きい方の値の数値−小さい方の値の数値）/小さい方の値の数値×100

上記のような同程度の被覆率は、内表面及び外表面の同程度の空隙率を表し、ここでこの空隙率は表面に対して２次元で以下のように定義される。
空隙率（２次元）＝
観測された領域区画のファイバで覆われていない部分／この領域区画の全領域。
なお、ファイバで覆われていない領域は、「空孔表面」又は「表面空孔」と呼ばれる。

被覆率と２次元空隙率との間の関係は、以下のようになっている。
空隙率＋被覆率＝１、又はパーセント値で表すと、
空隙率＋被覆率＝１００％。

この被覆率及び空隙率においては、仮定した２次元の内表面／外表面の丁度その外側にあるＢＮＣファイバが考慮されている。電子顕微鏡画像においては、上記の中空体の壁部の内表面又は外表面の２次元表示が得られる。
撮像されたＢＮＣファイバは、しかしながら常に１つの平面上にあるわけではない。これはこの表面が、ある程度でこぼこしていること、及び／又は、場合によっては観測されるＢＮＣファイバがこの表面の背後で観測者の視界の外にあるからである。
本発明による上記の中空体においては、上記の壁部の外表面は、内表面よりも粗くなり得ることが判明した。
上記の被覆率と空隙率の確定においては、好ましくは、走査電子顕微鏡画像（拡大率１０，０００倍）上で視認できるすべてのＢＮＣファイバが考慮され、そしてこれらのＢＮＣファイバは、この被覆率／空隙率が単位面積当たりのものであるため、あたかも１つの平面上にあるように取り扱われる。

こうして上記のチューブは、１つの内表面及び１つの外表面を有し、この内表面及び外表面は、同程度の上記の空隙率を有している。
この「同程度」なる用語は、この空隙率に関して、上記の内表面及び上記の外表面の空隙率が、互いに最大で２０％、好ましくは最大で１０％、最も好ましくは最大で５％、異なっていることを意味している。

これらの値の間の差のパーセント値は、以下のように計算される。
差（％）＝（大きい方の値の数値−小さい方の値の数値）/小さい方の値の数値×100

上記のチューブは、１つの内表面及び１つの外表面を有する壁部を備え、ここでこの壁部は、微生物セルロースの多層を備え、この多層はこの壁部の内表面及び外表面に対し平行に延伸している。
これらの層は、以下では「相」とも呼ばれる。これらの層は、上記の中空体の壁部の上記の「単層又は相」に対応している。

好ましくは、これらの相は、その全厚に渡って密度が均一となっており、すなわちこれらは密度勾配を有しない。

上記の相（複数）は、好ましくは均一（等方的）に良好に分岐したネットワークを特徴とする。これらの相の数及び強度は、制御調整可能である。

これらの相は、濡らし／フィルム形成及びこれに続くこのフィルム上でのセルロース形成から成る、１つの単一のプロセスサイクルで得られなくともよい。
１つの相が複数のこのようなサイクルによって形成されてよい。
これらの相は、走査電子顕微鏡によって、たとえば拡大率２４倍で、各々区別して視認可能である。
これらの相は、バクテリアナノセルロースのファイバのネットワークからできており、ここでこれらの相のファイバ構造は、これらの相を比較した場合、同一であっても異なっていてもよい。

本発明は、１つのチューブも提示し、このチューブの壁部は、上述したように相（複数）とも呼ばれる層（複数）からできており、ここでこれらの層の１つが、上記の内表面、すなわち上記の空洞側の表面を備え、そしてもう１つの層が、上記の外表面を備え、ここでこれら２つの層は同一又は同様の空隙率を有している。
上記の壁部の内表面を備える層／相は、「管腔側層／相」、又は「空洞側層／相」とも呼ばれる。上記の壁部の外表面を備える層／相は、「外側層／相」とも呼ばれる。

空間的に形成された層／相については、その空隙率は空間的に規定され、以下のようになる。
空隙率（空間、３次元）＝空隙体積／全体積

この全体積においては、上記の層／相の全体の体積が用いられてよい。
しかしながら、この層／相の体積の一部のみに着目し、上記の空隙率を測定する目的のためこの体積部分を「全体」と見做すことも可能である。
上記の「同程度」なる用語は、この空間的空隙率に関して、上記の管腔側相の空隙率、及び上記の外側相の空隙率が、互いに最大で２０％、好ましくは最大で１０％、最も好ましくは最大で５％、変化していることを意味している。

これらの値の間の差のパーセント値は、以下のように計算される。
差（％）＝（大きい方の値の数値−小さい方の値の数値）/小さい方の値の数値×100

同一又は同様の３次元空隙率は、上記管腔側の層／相の空隙率、及び上記の外側の層／相の空隙率が、同一又は同様の密度を有することを意味している。
上記のような同一又は同様の３次元空隙率は、上記管腔側層／相の空隙率、及び上記の外側層／相の空隙率が、同一又は同様のファイバ密度を有することを意味している。

上記の密度は、好ましくは質量／体積で与えられ、そして上記のファイバ密度はファイバ数／体積の数値として規定される。

上記の体積に対しては、上記の層／相の全体の体積が用いられてよい。
しかしながら、上記の密度又は上記のファイバ密度を確定するために、上記の層／相の体積の一部のみを考慮することも可能であり、また好ましいものである。
上記の「同程度」なる用語は、この密度及びファイバ密度に関して、上記の管腔側相の密度／ファイバ密度、及び上記の外側相の密度／ファイバ密度が、互いに２０％以下、好ましくは最大で１０％、最も好ましくは最大で５％、異なっていることを意味している。

これらの値の間の差のパーセント値は、以下のように計算される。
差（％）＝（大きい方の値の数値−小さい方の値の数値）/小さい方の値の数値×100

好ましくは、１つ以上の相が、上記の管腔側相と上記の外側相との間に配設される。特に好ましくは、これらの１つ以上の相は、上記の管腔側相及び上記の外側相のような、同一又は同様な空隙率、密度、及びファイバ密度を有している。

もう１つの態様においては、本発明は、医療移植片を生産するためのプロセスに向けられており、以下のステップを備える。
−微生物セルロースチューブを生産するステップであって、
ａ）上記の微生物セルロースの空洞及びこの空洞の内壁のネガティブモールドである１つのテンプレートの表面を、液体培地及びセルロースを生産する微生物を含むストック混合物に接触させるステップと、
ｂ）上記のテンプレートと上記のストック混合物との接触を中断するステップであって、ここでこのテンプレートの表面上に上記の液体培地及び上記の微生物を含む液体フィルムが残るステップと、
ｃ）この液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そしてこの液体フィルム内に、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた微生物セルロースを上記のストック混合物に接触させるステップと、
ｅ）この微生物セルロースとこのストック混合物との間の接触を中断するステップであって、ここでこの微生物セルロースの表面上に液体フィルムが残り、この液体フィルムが液体培地と微生物を含むステップと、
ｆ）この液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そしてこの液体フィルム内で、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップと、
を備え、
ここで上記の一連のステップｄ），ｅ）及びｆ）は、少なくとも１回以上繰り返され、
ｇ）上記の微生物セルロースを上記のテンプレートから分離するステップと、
−１つのステント、好ましくは１つのチューブ状のステントを、上記の微生物セルロースチューブの中に導入するステップと、
を備える。

このような方法を用いて、上述したようなどのような移植片も生産することができる。サブステップａ）〜ｇ）を備える、上記の微生物セルロースチューブを生産する方法ステップは、既に説明されている。

上記のチューブに１つのステントを導入するステップは、このステントをこのチューブの内側／空洞の中に挿入することによっておこなうことができる。

本発明による移植片は、手術に、又は手術の方法に使用することができる。この移植片は、胆嚢の手術、肝・胆道の悪性腫瘍の手術、胆管及び／又は肝臓の手術、たとえば胆嚢除去あるいは肝臓移植に使用することができる。この移植片は、特に胆管の修復又は再生に使用することができる。他の分野の使用は、食道移植又は尿管移植のような移植であり、特に食道又は尿管の損傷の場合におけるものである。

したがって、本発明は、ここで説明したように、胆嚢の手術、胆・肝道の悪性腫瘍の手術、胆管、食道、尿管、又は肝臓の手術において、あるいはこれらの手術の方法において使用される医療移植片にも関するものである。

したがって、本発明は、ここで説明したように、胆管、食道損傷又は尿管損傷の修復あるいは再生、又はこれらの修復あるいは再生の方法に使用される医療移植片にも関するものである。

本発明が実施例を参照して以下に説明される。

１つのテンプレート上のＢＮＣチューブを断面で示す。 本発明による１つの医療移植片を示す。 胆管を再生するために動物の体に挿入された、本発明による１つの医療移植片を示す。

（実施例１）医療移植片の調製
ａ）ＢＮＣチューブの調製
国際公開第２０１３／１１３６７５号の図１に示して説明しているような装置及び反応器が、ＢＮＣチューブの準備用に用いられている。上記の生産物の調製のため、複数の棒状のテンプレートがクランプされて並べられ、この装置の運動手段にはめ込まれる。次にこの反応器は閉鎖され、殺菌される。この反応器全体の殺菌の後、この反応器の容器は殺菌状態で、セルロースを生産する微生物と、別に殺菌されている培養液との混合物で充填される。

次に、この装置の動力源が起動され、そして以下のステップが実行される。
−上記のテンプレート（複数）を上記の容器内の、セルロースを生産する微生物と培養液との混合物に浸漬するステップであって、これによりこれらのテンプレートの表面をこの混合物に接触させるステップ。
−上記のテンプレートを上記の容器から取り出されるステップであって、これにより上記のテンプレートと上記の混合物との接触を中断し、ここでこのテンプレートの表面に上記の液体培地及び上記の微生物を含む液体フィルムが残るステップ。
−このテンプレート上の液体フィルムを、上記の装置内の酸素を含む雰囲気に接触させ、そしてこの液体フィルム内に、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップ。このステップにおいては、規定された、そして好ましい均等なフィルムの分布を達成するために、これらのテンプレートは少なくとも２つの回転軸の回りに回転される。

上記の一連のステップは、上記のテンプレート上のＢＮＣチューブが所望の形状、すなわち約１〜３ｍｍの所望の壁厚になると推定されるまで、複数回繰り返される。各々のＢＮＣチューブの長さ及び内径は、それぞれ対応する棒形状のテンプレートの寸法で決定される。

上記のプロセスの最後に、上記のチューブは上記のテンプレートから剥ぎ取られ、そして濡れた状態で、好ましくは脱イオン水の中で保管される。

上記のＢＮＣチューブは、約８０〜１５０ｍｍの長さ、約２〜４ｍｍの内径、そして約４〜１０ｍｍの外径を有していた。このチューブにおけるＢＮＣ単層の数は約５〜７となっている。

得られたＢＮＣチューブ１の断面が図１に示されている。このＢＮＣチューブ１は、金属棒であるテンプレート８上に配設されている。ＬはこのＢＮＣチューブ１の長手方向軸である。Ｌは図の紙面に垂直な方向に延伸している。このＢＮＣチューブ１は、３つの層５，６，７から成っており、ここで層５は内層であり、層６は中間層、層７は外層である。この外層７とこの内層５との間に、ここに示す層６より多い層が存在してよい。これらの層５，６，７は、このチューブ１の長手方向軸（Ｌ）に対して同心円状であり、あるいは実質的に同心円状となっている。このＢＮＣチューブの管腔の内表面は、参照番号３で示されており、外表面は４で示されている。

１つの例示的な層構造の走査電子顕微鏡像が、国際公開第２０１３／１１３６７５号の図３に示されている。

微生物セルロースの層５，６，７はファイバでできている。例示的な構造が、国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１１３６７５Ａ１号明細書の図４，５，６に示されている。

ＢＮＣとステントの接合
長さ５０〜１２０ｍｍ、直径８．５Ｆｒの胆管ステント（８．５Ｆｒ胆管ドレナージチューブセット／オリンパス、東京、日本）が、上記のＢＮＣチューブに、このチューブの両端で対称的に突出するようになるまで、挿入された。

得られた移植片１００が、添付した図２に示されている。

微生物セルロースチューブ１は、内表面３及び外表面４（以下、単に表面４と称する場合がある。）を有する壁部２を備える。この壁部２は、図１に示すＢＮＣ層５，６，７から成っている。

管状ステント９が、この微生物セルロースチューブ１の内部に配設されている。このステントの外表面１０は、微生物セルロースチューブ１の内表面３に接している。

図２に示すように、ステント９の長さｌ_２は、ＢＮＣチューブ１の長さｌ_１より長い。この管状ステント９は、この微生物セルロースチューブの第１の端部１１及びこの微生物セルロースチューブの第２の端部１２において、この微生物セルロースチューブから突出している。

図２の例においては、ステント９の外径は、（ステント９無しでの）ＢＮＣチューブ１の内径よりも大きくてよい。この場合、チューブ１は、径方向に拡張されている。拡張の例示的な方向が矢印Ｒで示されている。この例においては、このステント９及びこのチューブ１は円形であるので、拡張は他の径方向においても起こっていると理解されるべきである。おおよそ対称的な拡張が起こっており、これによってチューブ１の内径が増大する。

（実施例２）胆管を再生するための動物への移植片の挿入
比較例
第１の実験において、ステント無しに、１つのＢＮＣチューブのみが移植片として用いられた。移植は豚の胆管の一部を切除した後に行われた。この切除部の長さは３ｃｍである。上記のＢＮＣチューブが、端と端を合わせるやりかたで長さを調整した後に、中間挿入され、６／０プロリーン（登録商標）縫合糸が用いられた。

第２の実験において、図２に示す移植片が用いられた。図３は豚に用いられたこの移植片１００を概略図で示す。参照番号は、この移植片１００に関する限り、図２の参照番号に対応している。

図３は、第１の胆管部分、すなわち第１の胆管端部１４を有する豚の肝臓１３の一部、及び第２の胆管部分、すなわち第２の胆管端部１６を有する十二指腸１５の一部を示す。この第１の胆管部分１４において、ステント９の第１の突出部が挿入された。この第２の胆管部分１６において、ステント９の第２の突出部が挿入された。このＢＮＣチューブ１は、上記の胆管部分１４，１６の間に配置されている。このＢＮＣチューブ１と上記の胆管部分１４，１６との間の結合は、縫合糸１７，１８によって行われている。

図３に示すように、この移植片１００を豚に挿入した後、この移植片１００は４乃至８週間この動物内に放置された。以下の結果が得られた。

上記のＢＮＣチューブは、まだ胆管内、すなわち胆管部分１４，１６の間にあったが、これらの胆管部分と共に伸びることはなかった。

新しい胆管上皮組織が、このＢＮＣチューブの表面４上に連続して形成されたことが組織学的に示された。結果として、これらの胆管部分１４，１６は、新しい胆管上皮組織によって結合された。吻合リングが見られたことから、この吻合は充分であった。悪く治癒した、あるいは不十分な吻合は全く見られなかった。上記のインターポネート（interponate）、すなわち上記のＢＮＣチューブが取り外されると、吻合は事実上もはや存在していなかった。

移植片１００、すなわちＢＮＣチューブ１及びステント９は、胆管部分１４，１６及び新しく生成された胆管上皮組織から除去された。そして、ステント９は十二指腸１５を通って除去された。この際、ＢＮＣチューブ１も除去された。したがって、かかるＢＮＣチューブ１は、このチューブの表面上に成長した、新しい胆管上皮組織から切り離された。

Claims (11)

1. 医療移植片（１００）であって、
   −微生物セルロースチューブ（１）であって、内表面（３）と外表面（４）とを有する壁部（２）を備え、当該壁部は微生物セルロースの複数の層（５，６，７）を備え、当該層が当該チューブの長手方向（Ｌ）の軸に対し同心円状又は実質的に同心円状になっている微生物セルロースチューブと、
   −前記微生物セルロースチューブ（１）の内側に配設される、穴のない被覆を有するチューブ状のステント（９）であって、前記微生物セルロースチューブが前記ステントにより径方向に拡張される、ステント（９）と、
   を備えることを特徴とする医療移植片。
2. 前記ステントの外表面（１０）は、前記微生物セルロースチューブ（１）の内表面に接触していることを特徴とする、請求項１に記載の医療移植片。
3. 前記ステント（９）は、前記微生物セルロースチューブの第１の端部（１１）及び前記微生物セルロースチューブ（１）の第２の端部（１２）において、前記微生物セルロースチューブからから突出していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医療移植片。
4. 前記微生物セルロースの層（５，６，７）はファイバでできていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の医療移植片。
5. 少なくとも前記微生物セルロースチューブ（１）の前記外表面（４）又は外層（７）は、多孔質となっていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の医療移植片。
6. 前記ステント（９）は、胆管ステント、尿管ステント、又は食道用ステントであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の医療移植片。
7. 前記ステント（９）は、ポリマーでできていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の医療移植片。
8. 手術に用いられることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の医療移植片。
9. 胆嚢の手術、胆・肝道の手術、胆管、食道、尿管、又は肝臓の手術において使用されることを特徴とする、請求項８に記載の医療移植片。
10. 胆管、食道損傷又は尿管損傷の修復あるいは再生に使用されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の医療移植片。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の医療移植片を生産するための方法であって、
    −微生物セルロースチューブを生産するステップであって、
    ａ）前記微生物セルロースの空洞及び当該空洞の内壁のネガティブモールドである１つのテンプレートの表面を、液体培地及びセルロースを生産する微生物を含むストック混合物に接触させるステップと、
    ｂ）前記テンプレートと前記ストック混合物との接触を中断するステップであって、ここで前記テンプレートの表面に前記液体培地及び前記微生物を含む液体フィルムが残るステップと、
    ｃ）前記液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そして当該液体フィルム内に、及び／又は当該液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップと、
    ｄ）ステップｃ）で得られた前記微生物セルロースを前記ストック混合物に接触させるステップと、
    ｅ）前記微生物セルロースと前記ストック混合物との間の接触を中断するステップであって、ここでこの微生物セルロースの表面上に液体フィルムが残り、この液体フィルムが液体培地と微生物を含むステップと、
    ｆ）前記液体フィルムを、酸素を含む雰囲気に接触させ、そして前記液体フィルム内で、及び／又はこの液体フィルム上に微生物セルロースを形成するステップと、を備え、
    前記の一連のステップｄ），ｅ）及びｆ）が、少なくとも１回以上繰り返され、
    ｇ）前記微生物セルロースを前記テンプレートから分離するステップと、
    −前記微生物セルロースチューブの中に、穴のない被覆を有するチューブ状のステントを導入するステップと、
    を備え、
    前記微生物セルロースチューブ内にスライドする前は、前記ステントの外径は、ステップｇ）で得られる前記微生物セルロースチューブの内径より大きく、前記ステントが前記微生物セルロースチューブの中に導入されるとき、前記微生物セルロースチューブが前記ステントにより径方向に拡張されることを特徴とする医療移植片を生産するための方法。

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