JP6849223B2 - 糞便試料から物質を抽出する方法 - Google Patents
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Description
(A)以下の(a)〜(g)のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程A:
(a)水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒:
(b)水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(c)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(d)親水性有機溶媒を含む溶媒:
(e)疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(f)親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(g)水からなる溶媒:
(B)前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程B:及び、
(C)前記液層からタンパク質を除去した後、1種又は2種以上の物質を得る工程C:
を含むと、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
(h)水性溶媒及び高濃度(例えば75重量%以上)の親水性有機溶媒を含む溶媒:
(i)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(1)糞便試料から1種又は2種以上の物質を抽出する方法であって、
以下の(a)〜(g)のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程A:
(a)水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒:
(b)水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(c)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(d)親水性有機溶媒を含む溶媒:
(e)疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(f)親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(g)水からなる溶媒:
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程B:及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、1種又は2種以上の物質を得る工程C:
を含むことを特徴とする、物質を抽出する方法や、
(2)工程Aが、(a)〜(g)のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程A−1であることを特徴とする上記(1)に記載の物質を抽出する方法や、
(3)溶媒が水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が10〜50重量%の範囲内であることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載の物質を抽出する方法や、
(4)工程A−1におけるビーズの直径が、0.02〜0.5mmの範囲内であることを特徴とする上記(2)又は(3)に記載の物質を抽出する方法や、
(5)工程A又は工程A−1より前に、乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Xをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程A又は工程A−1の糞便試料として用いることを特徴とする上記(1)〜(4)のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
(6)工程Xにおけるビーズの直径が、0.6〜15mmの範囲内であることを特徴とする上記(5)に記載の物質を抽出する方法や、
(7)溶媒が、さらに疎水性有機溶媒を含むことを特徴とする上記(3)〜(6)のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
(8)工程A又は工程A−1より前に、採取した糞便試料を以下の(h)又は(i)の溶媒中で保存する工程Yをさらに含み、該工程Yで保存後の糞便試料を工程A又は工程A−1の糞便試料として用いることを特徴とする上記(1)〜(4)及び(7)のいずれかに記載の物質を抽出する方法:
(h)水性溶媒及び75重量%以上の親水性有機溶媒を含む溶媒:
(i)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:や、
(9)水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする上記(1)〜(8)のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
(10)親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(1)〜(9)のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
(11)疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(1)〜(10)のいずれかに記載の物質を抽出する方法に関する。
(12)糞便試料中の1種又は2種以上の物質を同定し、及び、前記1種又は2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
上記(1)〜(11)のいずれかに記載の方法で抽出した前記1種又は2種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び/又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記1種又は2種以上の物質を同定し、及び、前記1種又は2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程P:
を含むことを特徴とする、方法や、
(13)複数の対象を2以上のクラスターに分類する方法であって、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記(12)に記載の方法を行うことによって、2種以上の物質を同定し、及び、前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Q:及び、
前記工程Qで得られた前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を2以上のクラスターに分類する工程S:
を含むことを特徴とする、方法や、
(14)工程Qと工程Sの間に、前記工程Qで得られた前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Rをさらに含み、
前記工程Rで標準化したデータを、工程Sにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする上記(13)に記載の方法に関する。
本発明の「糞便試料から1種又は2種以上の物質を抽出する方法」(以下、「本発明の抽出方法」とも表示する。)としては、糞便試料から1種又は2種以上の物質を抽出する方法であって、
以下の(a)〜(g)のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程A:
(a)水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒:
(b)水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(c)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(d)親水性有機溶媒を含む溶媒:
(e)疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(f)親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(g)水からなる溶媒:
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程B:及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、1種又は2種以上の物質を得る工程C:
を含んでいる限り、特に制限されない。
本発明における「糞便試料」の由来となる生物種としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
本発明における「物質」としては、糞便試料中に含まれる物質である限り特に制限されないが、親水性物質、親油性物質、両親媒性物質が挙げられ、より詳しくは、酸性、中性又は塩基性の親水性物質、酸性、中性又は塩基性の親油性物質、酸性、中性又は塩基性の両親媒性物質が挙げられる。また、本発明における好ましい「物質」としては、腸内代謝物質;DNAやRNA等の核酸;コール酸やデオキシコール酸などの胆汁酸;酢酸やプロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸;乳酸やコハク酸などの有機酸;アミノ酸;単糖や二糖、三糖などの糖質;インドキシル硫酸などの尿毒素;脂肪酸や中性脂肪などの脂質;等が挙げられる。
本発明の抽出方法における工程Aとしては、上記(a)〜(g)のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程である限り特に制限されない。
これらの溶媒における「水性溶媒」としては、精製水等の水;緩衝水溶液;pH調整剤を含む水溶液;等が挙げられるが、より多種類の腸内代謝物質を抽出する観点から、水が好ましい。また、塩を含む緩衝水溶液を用いて抽出した抽出液を濃縮して質量分析法に供した場合、測定の際に過剰な電流が流れて測定が妨げられる可能性があるため、上記の水性溶媒としては、緩衝水溶液よりも、水が好ましい。緩衝水溶液や、pH調整剤を含む水溶液のpHとしては、抽出目的である1種又は2種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、pH4〜10の範囲内や、pH6〜8の範囲内とすることができる。上記の緩衝水溶液としては、例えば、リン酸塩緩衝水溶液、トリス−塩酸塩緩衝水溶液、グッド緩衝水溶液等を挙げることができる。これらの水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
(a1)水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒:
(b1)水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、親水性有機溶媒を含まない溶媒:
(c1)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(d1)親水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含まない溶媒:
(e1)疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含まない溶媒:
(f1)親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒を含まない溶媒:
(b2)水性溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒:
(c2)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒:
(d2)親水性有機溶媒からなる溶媒:
(e2)疎水性有機溶媒からなる溶媒:
(f2)親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒:
上記(a)〜(g)のいずれかの溶媒中に糞便試料を懸濁する際には、上記溶媒中に上記糞便試料を添加して懸濁してもよいし、上記溶媒を上記糞便試料に添加して懸濁してもよい。上記溶媒中に上記糞便試料を懸濁する方法としては特に制限されず、上記溶媒及び上記糞便試料を振とう及び/又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が挙げられ、中でも、上記溶媒及び上記糞便試料を、超音波式、圧力式等のホモジナイザーで攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法や、上記溶媒及び上記糞便試料(好ましくはこれらを含む容器)をボルテックスミキサーで振とう及び/又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が好ましく挙げられる。
糞便試料からより多種の物質を抽出する観点や、糞便試料中の腸内細菌内からより多種の物質をより高濃度で抽出する観点から、上記工程Aの中でも、以下の工程A−1が好ましく挙げられる。
工程A−1:上記(a)〜(g)のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程A−1:
一方、ビーズでの破砕処理を行うことによって、腸内細菌内に蓄積している代謝物質を含めた代謝物質プロファイルを取得できれば、より精度の高いメタボローム解析を行うことができる。この高精度のメタボローム解析の結果と、前述の遺伝子情報を統合すれば、腸内細菌叢の生理的機能をより詳細に解明することができると考えられる。
本発明の抽出方法は、以下の工程Xをさらに有していなくてもよいが、乾燥糞便小片を得ることによって、抽出に用いる各糞便試料の量をできるだけ揃えることができる点で、工程A又は工程A−1より前に、以下の工程Xをさらに有していることが好ましい。
工程X:乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程X:
本発明の抽出方法は、以下の工程Yをさらに有していなくてもよいが、糞便試料を採取した後、その糞便試料から物質の抽出を行うまでの間、冷凍せずにその糞便試料を保存する場合には、保存中のその糞便試料における代謝物質プロファイルの変動を抑制する観点から、工程A又は工程A−1より前に、以下の工程Yをさらに有していることが好ましい。
工程Y:採取した糞便試料を以下の(h)又は(i)の溶媒中で保存する工程Y:
(h)水性溶媒及び75%重量以上の親水性有機溶媒を含む溶媒:
(i)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(h1)水性溶媒及び75%重量以上の親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒:
(i1)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒:
(h2)水性溶媒及び75%重量以上の親水性有機溶媒からなる溶媒:
(i2)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒:
上記工程(Y)において保存する際の温度範囲としてより具体的には、−90〜40℃の範囲内、−90〜30℃の範囲内、−80〜30℃の範囲内、−80〜25℃の範囲内、−60〜20℃の範囲内などが挙げられる。また、本発明の意義がより多く享受する観点で好適な保存温度の範囲としてより具体的には、0〜40℃の範囲内、0〜30℃の範囲内、0〜25℃の範囲内、0〜20℃の範囲内、0〜15℃の範囲内、0〜10℃の範囲内、0〜5℃の範囲内、3〜25℃の範囲内、3〜20℃の範囲内、3〜15℃の範囲内、3〜10℃の範囲内、3〜5℃の範囲内、4〜25℃の範囲内、4〜20℃の範囲内、4〜15℃の範囲内、4〜10℃の範囲内、4〜5℃の範囲内、6〜25℃の範囲内、6〜20℃の範囲内、6〜15℃の範囲内、6〜10℃の範囲内などが挙げられる。
本発明の抽出方法における工程Bとしては、上記工程A又は工程A−1で得た懸濁液から、上記溶媒を含む液層を分取する工程である限り特に制限されない。
上記懸濁液から、上記液層を分取する方法としては、特に制限されないが、例えば、上記懸濁液を遠心してその上清を分取する方法を好ましく挙げることができる。懸濁液の遠心は、市販の遠心分離装置を用いて行うことができる。
本発明の抽出方法における工程Cとしては、上記工程Bで分取した液層からタンパク質を除去した後、1種又は2種以上の物質を得る工程である限り特に制限されない。
上記工程Bで分取した液層からタンパク質を除去する方法としては、特に制限されず、限外濾過フィルターや、逆浸透フィルター等のフィルターを用いて上記液層のタンパク質を除去する方法を好ましく挙げることができる。限外濾過フィルターや、逆浸透フィルターは、市販のものを用いることができる。
本発明の「糞便試料中の1種又は2種以上の物質を同定し、及び、前記1種又は2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法」(以下、「本発明の同定・測定方法」とも表示する。)としては、本発明の抽出方法で抽出した1種又は2種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び/又は核磁気共鳴分光法に供することによって、上記1種又は2種以上の物質を同定し、及び、上記1種又は2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程P:を含んでいる限り、特に制限されない。上記工程Pにおける「クロマトグラフィー」としては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーが挙げられ、液体クロマトグラフィーが好ましく挙げられる。クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動(CE:Capillary Electrophoresis)による物質の分離は、市販のクロマトグラフ(クロマトグラフィー用の装置)や、キャピラリー電気泳動装置を用いて、常法により行うことができる。
本発明の「複数の対象を2以上のクラスターに分類する方法」(以下、「本発明の分類方法」とも表示する。)としては、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、2種以上の物質を同定し、及び、前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Q:及び、
前記工程Qで得られた前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を2以上のクラスターに分類する工程S:
を含んでいる限り、特に制限されない。
本発明の分類方法における「対象」とは、糞便試料の採取源である生物を意味する。かかる生物の種類としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
本発明の分類方法において分類する「クラスター」とは、糞便試料中の1種又は2種以上のうち、いずれか1種又は2種以上(好ましくは1種)の物質の有無や、濃度の高低などから選択される1種又は2種以上(好ましくは1種)の特性が共通する「対象の集団」を意味する。
本発明の分類方法における工程Qとしては、複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、2種以上の物質を同定し、及び、前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程である限り特に制限されない。
本発明の分類方法における工程Sとしては、前記工程Qで得られた前記2種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を2以上のクラスターに分類する工程である限り特に制限されない。上記工程Sにおけるクラスター解析の手法としては、複数の対象を2以上のクラスターに分類できる限り特に制限されず、階層的クラスタリングであってもよいし、分割最適化クラスタリングであってもよく、該分割最適化クラスタリングとしては、PAMクラスタリング(partitioning around medoid clustering)を好ましく挙げることができる。これらのクラスター解析は、市販のソフトウェアにより行うことができる。
本発明の分類方法は、上記の工程Qと工程Sの間に工程Rをさらに含んでいなくてもよいが、工程Rをさらに含んでいてもよい。該工程Rとしては、上記工程Qで得られた上記2種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程である限り特に制限されない。かかるデータの標準化は、市販のソフトウェアなどを用いて行うことができる。
糞便試料中の腸内細菌の代謝物質を、キャピラリー電気泳動(capillary electrophoresis:CE)−飛行時間型質量分析計(Time-of-Flight mass spectrometer;TOFMS)(CE−TOFMS)を用いて検出するために、まず、代謝物質の抽出の条件検討を行った。
1−1−1 代謝物質の抽出法
〔1〕健常人から糞便試料を採取し、採取後直ちに−80℃で保存した。
〔2〕内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有する0.1×PBS溶液(以下、単に「PBS溶液」という)を、10mgの糞便試料あたり100μLの割合で加え、ハンディーホモジナイザー(SIGMA社製)で糞便試料全体が均一になるまで撹拌し、糞便懸濁液を調製した。
〔3〕糞便懸濁液を100μLずつ4本のスクリューキャップチューブ(バイオメディカルサイエンス社製)に分注し、以下の〔4〕〜〔9〕に示す抽出条件(図1及び表1)により抽出サンプル1、及び2〜5をそれぞれ得た。
〔4〕上記工程〔3〕で調製した糞便懸濁液100μLを、17,800×gで10分間遠心し、上清(上清a)を回収した。上清aを除いた後の沈殿物に、PBS溶液を、10mgの糞便試料あたり100μLの割合で加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、上清(上清b)を回収した。上清aと上清bを、それぞれ分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で2倍に希釈したものを測定に用いた。測定後、上清aと上清bから得られた濃度を足しあわせたものを抽出サンプル1とした。
〔5〕上記工程〔4〕において、上清bを除いた後の沈殿物に、10mgの糞便試料に対して100μLのPBS溶液を加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、17,800×gで10分間遠心分離した。その後、上清を取り除く洗浄工程を2度繰り返し、細胞外代謝物質と内部標準物質を除いた。沈殿物に、100μLの50%メタノール溶液/上記内部標準物質3種含有MilliQ水、3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)3個、及び約0.1gの0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)を加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、17,800×gで5分間遠心し、上清(「抽出サンプル2」)を回収した。抽出サンプル2を、分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、50μLのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔6〕上記工程〔3〕で調製した糞便懸濁液100μLに、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで10分間撹拌した。この際、ビーズの添加は行っていない。その後、17,800×gで5分間遠心し、上清(「抽出サンプル3」)を回収した。抽出サンプル3を、分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で2倍に希釈し測定に用いた。
〔7〕上記工程〔3〕で調製した糞便懸濁液100μLに、3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)3個、及び0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)約0.1gを加え、Shakemaster NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500 rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、17,800×gで5分間遠心し、上清(「抽出サンプル4」)を回収した。抽出サンプル4を、分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、50μLのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔8〕上記工程〔3〕で調製した糞便懸濁液100μLに、100% メタノール溶液を100μL(最終濃度では50%のメタノール)、3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)3個、及び0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)約0.1g加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、17,800×gで5分間遠心し、上清(「抽出サンプル5」)を回収した。抽出サンプル5を分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、50μLのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
抽出サンプルはCE−TOFMS(Agilent Technologies社製)の陽イオンモードで測定を行った。CE−TOFMSによる測定は、文献(Hirayama, A., et al. "Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry." Cancer research;69(11)2009, pp.4918-4925.)に記載の方法にしたがって行った。CE−TOFMSにより測定したデータは、解析ソフトウェアMaster Hands(Sugimoto, M., et al. "Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles." Metabolomics : Official journal of the Metabolomic Society;6(1), 2010, pp.78-95.)を用いて、代謝物質の同定と濃度を算出した。抽出条件ごとの代謝物濃度を比較するため、各条件の代謝物濃度からZスコアを算出し(すなわち、各条件の代謝物濃度を標準化し)、MeV TM4 version 4.8(Saeed, A.I., et al. "TM4 microarray software suite." Methods in enzymology 2006;411:134-193.)を用いてヒートマップを作製し、代謝物質についてk-meansを用いたクラスタリングを行った。また、同定された代謝物質の種類とその濃度について、各抽出サンプル間で階層的クラスタリングを行った。
各抽出条件での代謝物質濃度を比較するため、各代謝物質の濃度をZスコアに変換し、得られた代謝物質の種類とその濃度を可視化し、代謝物質についてk-meansクラスタリングを行い、抽出条件ごとの特徴を反映したクラスターI〜IVに分類した(図2)。
抽出サンプル5が得られた条件を基に、代謝物質抽出の条件検討をさらに行った。すなわち、抽出サンプル5が得られた条件と同様に、メタノールを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合(以下、「メタノール法」という)と、メタノール及びクロロホルムを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合(以下、「メタノール・クロロホルム法」という)とで、検出できる代謝物質の差異をCE−TOFMSにより分析した。
2−1−1 メタノール法
〔1〕健常人(男女計75名)から糞便試料をそれぞれ採取し、凍結乾燥処理した。
〔2〕凍結乾燥処理後の糞便試料に、3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)4個を加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて糞便試料全体が均一になるまで撹拌した。
〔3〕撹拌処理後の糞便試料10mgに対して、上記内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有する50%メタノールを400μL、及び0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)を0.1g加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500 rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、15,000rpm、4℃、5分間遠心し、上清(「抽出サンプルMe」)を回収した。抽出サンプルMeを分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、内部標準物質2種(200μM 3−アミノピロリジン及び200μMトリメセート)を含有するMilliQ水を100μL加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。
上記「2−1−1 メタノール法」の工程〔2〕で撹拌処理した糞便試料10mgに対して、上記内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有する100%メタノールを500μL、及び0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)を0.1g加え、さらに、500μLのクロロホルム及び200μLのMilliQ水を加えた後、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、15,000rpm、4℃、5分間遠心し、上清(「抽出サンプルMeCr」)を回収した。抽出サンプルMeCrを分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、内部標準物質2種(200μM 3−アミノピロリジン及び200μMトリメセート)を含有するMilliQ水を100μL加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。
CE−TOFMSによる代謝物質の測定及び解析は、上記「1−1−2 CE−TOFMSによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。
メタノール法で抽出された代謝物質のプロファイルと、メタノール・クロロホルム法で抽出された代謝物質のプロファイルとはよく類似していた。一方、かかる2種類の抽出方法で抽出された代謝物質の濃度について比較したところ、全体的にメタノール・クロロホルム法よりもメタノール法で抽出した方が検出される代謝物質の濃度は高かった。すなわち、両方法で1.5倍以上の差異が認められた代謝物質は、表8に示す29種類の物質であったが、そのうちメタノール・クロロホルム法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は4種類あったのに対して、メタノール法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は25種類もあった(表8)。
3−1−1 PBS溶液での抽出
〔1〕健常人から糞便試料を採取し、凍結乾燥処理した。
〔2〕凍結乾燥処理後の糞便試料10mgに対して、上記内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有する1×PBS溶液を500μL、3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)4個、及び、約0.1gの0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)を加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで5分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、15,000rpm、4℃、5分間遠心し、上清(「抽出サンプルPBS溶液」)を回収した。抽出サンプルPBS溶液を分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、内部標準物質2種(200μM 3−アミノピロリジン及び200μM トリメセート)を含有するMilliQ水を20μL加えてよく攪拌して再溶解した。この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率(以下、「この溶液の濃縮率」とも表示する。)は15倍であり、この溶液のPBS濃度は15×PBSとなっている。この溶液にMilliQ水を加え、この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率がそれぞれ10倍(×10)、5倍(×5)、1倍(×1)、0.2倍(×0.2)となるように希釈した。これらの希釈溶液を、CE−TOFMSにより分析した。
上記「3−1−1 PBS溶液での抽出」の工程〔2〕における「上記内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有する1×PBS溶液」に代えて、上記内部標準物質3種(20μM メチオニンスルホン、20μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び20μM 2-モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有するMilliQ水を用いて同様の抽出処理を行い、得られた各希釈溶液を、CE−TOFMSにより分析した。
上記3−1−1や3−1−2で得られた各希釈溶液の代謝物質の、CE−TOFMSによる測定及び解析は、上記「1−1−2 CE−TOFMSによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。
各希釈液において検出された代謝物質の種類数を図6に示す。PBS溶液で抽出した場合は、5倍以上の濃縮率のサンプル(PBSの×5、×10、×15)では、塩濃度の影響で電流が過剰に流れてしまい、正確に測定することができなかった。PBS溶液で抽出した、×0.2や×1の希釈溶液(サンプル)と、水で抽出した、×0.2や×1の希釈溶液(サンプル)との間で、検出された代謝物質の種類数を比較したところ、水で抽出したサンプルは、PBSで抽出したサンプルよりも、割合として11〜17%程度多い代謝物質が検出された(図6)。
糞便試料を採取してから、代謝物質を検出するまでの糞便試料の保存状態が、代謝物質の検出にどのような影響を及ぼすかについて検討した。具体的には、健常人から糞便試料を採取し、室温(20〜25℃)で1〜2日間保存した後、実施例2に記載の方法にしたがって、50%メタノールを溶媒として代謝物質を抽出し、CE−TOFMSにより代謝物質を測定した。測定は実施例1に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行った。なお、コントロールとして、健常人から糞便試料を採取した後、直ちに超低温フリーザー(−80℃)で保存したものを用いた。
冷凍設備のない場所で糞便試料を採取して、該糞便試料を遠方の分析施設まで移送する場合など、糞便試料を採取した後、直ちに冷凍保存することが困難な場合も考えられる。そこで、冷凍以外の保存方法を検討するために、糞便試料を、各種有機溶媒(100%メタノール[100%MeOH]、50%メタノール[50%MeOH]、又は、メタノール・クロロホルム[MeOH/CHCl3])中に保存した場合に、代謝物質プロファイルがどのように変動するかについて解析した。具体的には、糞便試料を100%メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法(表9の「方法1」)、糞便試料を50%メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法(表9の「方法2」)、糞便試料を50%メタノール液中で保存後、メタノール及びPCI(フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール;25:24:1)液で代謝物質を抽出する方法(表9の「方法3」)、並びに糞便試料をメタノール・クロロホルム液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法(表9の「方法4」)を検討した。なお、コントロールとして、糞便試料を有機溶媒非存在下で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法(表9の「方法C」)を行った。また、各々の抽出方法において、糞便試料を各種有機溶媒中に加えた直後(方法1〜4)、もしくは糞便試料を有機溶媒非存在下(方法C)で直ちに−80℃で保存した試料をコントロールに用いた。詳細な方法を以下に示す。
〔1〕健常人から糞便試料を採取し、重量を測定し、保存用溶媒(表9の「保存用溶媒」)を添加した。
〔2〕室温(20〜25℃)、4℃、又は−80℃で2日間保存した。
〔3〕代謝物質の抽出条件(表9の「抽出溶媒の組成」)となるように、添加用溶媒(表9の「添加用溶媒」)を保存用溶媒に添加した。またその際に、内部標準物質3種(1000μM メチオニンスルホン、1000μM D−カンファー10−スルホン酸[CSA]及び1000μM 2−モルホリノエタンスルホン酸[MES])を含有するMilliQ水を10μL添加した。
〔4〕3mmジルコニアビーズ(TOMY社製)3個、及び0.1mmジルコニアビーズ(TOMY社製)約0.1g加え、Shake master NEO(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて、1,500rpmで10分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。
〔5〕15,000rpm、4℃、5分間遠心し、上清を回収した後、分画分子量5kDaの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機(LABCONCO社製)で40℃、3時間乾固させた後、100μLの内部標準物質2種(200μM 3−アミノピロリジン及び200μM トリメセート)を含有するMilliQ水に再溶解し、実施例1に記載の方法にしたがって、CE−TOFMSにより代謝物質を測定した。
糞便試料を、有機溶媒非存在下(すなわち保存溶媒なし)(表9の「方法C」)で4℃又は室温で保存した場合、或いは50%メタノール液中(表9の「方法2」や「方法3」)で4℃又は室温で保存した場合は、それぞれ−80℃で保存した場合と比べ、代謝物質濃度の増減がより多く認められた(図11)。一方、糞便試料を、100%メタノール液中(表9の「方法1」)で4℃又は室温で保存した場合や、メタノール・クロロホルム液中(表9の「方法4」)で4℃又は室温で保存した場合は、それぞれ−80℃で保存した場合と類似の代謝物質プロファイルを示し、保存による代謝物質濃度の増減が抑制された(図11、図12)。
Claims (9)
- ヒト由来の糞便試料から1種又は2種以上の腸内代謝物質を抽出する方法であって、
以下の(a)〜(f)のいずれかの溶媒中で、前記糞便試料を直径0.02〜0.5mmの範囲内のビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程A−1:
(a)水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒であって、水性溶媒の含量が10〜50重量%の範囲内であり、かつ、親水性有機溶媒の含量が90〜50重量%の範囲内である溶媒:
(b)水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、親水性有機溶媒を含まない溶媒であって、水性溶媒の含量が10〜50重量%の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が90〜50重量%の範囲内である溶媒:
(c)水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒であって、水性溶媒の含量が5〜60重量%の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が10〜70重量%の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が10〜70重量%の範囲内である溶媒:
(d)親水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含まない溶媒:
(e)疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含まない溶媒:
(f)水:
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程B:及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、1種又は2種以上の腸内代謝物質を得る工程C:
を含み、
工程A−1より前に、ヒト由来の前記糞便試料を乾燥し、該乾燥した糞便試料を、直径0.6〜15mmの範囲内のビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Xをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程A−1の糞便試料として用いることを特徴とする、腸内代謝物質を抽出する方法。 - 前記工程A−1で使用する溶媒が前記(a)の溶媒であって、前記(a)の溶媒が、水及びメタノールを含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が10〜50重量%の範囲内であり、メタノールの含量が90〜50重量%の範囲内であることを特徴とする請求項1に記載の腸内代謝物質を抽出する方法。
- 前記工程A−1で使用する溶媒が前記(c)の溶媒であって、前記(c)の溶媒が、水、メタノール及びクロロホルムを含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が10〜50重量%の範囲内であることを特徴とする請求項1に記載の腸内代謝物質を抽出する方法。
- 前記水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の腸内代謝物質を抽出する方法。
- 前記親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項1又は4に記載の腸内代謝物質を抽出する方法。
- 前記疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項1、4及び5のいずれかに記載の腸内代謝物質を抽出する方法。
- 糞便試料中の1種又は2種以上の腸内代謝物質を同定し、及び、前記1種又は2種以上の腸内代謝物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の方法で抽出した前記1種又は2種以上の腸内代謝物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び/又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記1種又は2種以上の腸内代謝物質を同定し、及び、前記1種又は2種以上の腸内代謝物質の濃度、組成又は割合を測定する工程P:
を含むことを特徴とする、方法。 - 複数の対象を2以上のクラスターに分類する方法であって、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、請求項7に記載の方法を行うことによって、2種以上の腸内代謝物質を同定し、及び、前記2種以上の腸内代謝物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Q:及び、
前記工程Qで得られた前記2種以上の腸内代謝物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、腸内代謝物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を2以上のクラスターに分類する工程S:
を含むことを特徴とする、方法。 - 工程Qと工程Sの間に、前記工程Qで得られた前記2種以上の腸内代謝物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Rをさらに含み、
前記工程Rで標準化したデータを、工程Sにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする請求項8に記載の方法。
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