JP6836275B2

JP6836275B2 - セサミンとシクロデキストリンとの包接複合体及びその製造方法

Info

Publication number: JP6836275B2
Application number: JP2018091706A
Authority: JP
Inventors: 高章久住; 利郎岡本; 亀井　淳三; 淳三亀井
Original assignee: 有限会社アグリサイエンス
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2021-02-24
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN110464850A; JP2019196339A

Description

本発明は、難水溶性リグナン類であるセサミン類がシクロデキストリン類で包接されている包接複合体及びその製造方法に関する。更に詳しくは、セサミン類がシクロデキストリン類で包接された水溶性の改善された包接複合体及びその製造方法に関する。また、本発明は、前記包接複合体を含有する食品、医薬品または医薬部外品に関する。

ゴマに含まれるリグタンの一種であるセサミンは、低コレステロール血作用、化学物質及びアルコールの肝解毒の強化、化学的に誘発された乳癌に対する保護作用、生体内酸化防止作用などを有する健康促進成分であることが知られている（特許文献１）。セサミンは、既に機能性食品素材としてゴマからの大量抽出の工業的実績があるが、水に対する溶解度が極めて低く、難水溶性であり、その生理的有用性を水性液体製剤として活用するための大きな課題となっている。
例えば、健康食品用途における、セサミンの一日必要摂取量は、約１０ｍｇ/日と一般的には言われており、それを手軽な水性液体飲料として摂取しようとすれば、セサミン単体での水への溶解度が０．４３μｇ/ｍＬであることから、約２３Ｌの量の液体の摂取となり、非実用的であると考えられる。
また、保存時、更には低温時において、わずかに溶けたセサミンが、沈殿、凝集する不安定さがあり、ましてや、それらを高濃度に水に溶解させようとしても、低い飽和溶解度のため、沈殿、凝集としての外観的性状を示す傾向がある。
また、セサミンの医薬品や機能性食品としての活用を考える際に、難水溶性であることは、消化管からの低い吸収性を示す可能性が高い。

また、セサミンの水への溶解性状に関しては、水分散性セサミン類粉末の製造法（特許文献２）において、背景技術として、セサミン類は、水にはほとんど溶解しない性質を有しており、医薬用又は食用に使用可能な有機溶媒に対してもある程度溶解するだけであり、発明の目的としては、セサミン類に対して、ＣＤでなく、食品用界面活性剤を含有することによる水分散性セサミン類粉末とすることが示されている。セサミン類の摂取者は、水分散性セサミン類粉末を水に加え攪拌することにより安定な水分散液を作製できることがうたわれるにとどまる。セサミンの水への分散としては、リグナン類化合物含有水中油型エマルジョン及びそれを含有する組成物（特許文献３）において、リグナン類が溶解された油脂（油相）を水などの水相に分散した水中油型エマルジョンが示され、水相としては、水又は水溶液の他、ジュース飲料、炭酸飲料、アルコール飲料などの水性飲料が例示されている。
このように、先行技術において、セサミンなどの難水溶性リグナン類の水性液体製剤への含有においては、種々の工夫がなされてはいるものの、いずれも水性液体製剤、特に無色透明な水性液体製剤を作製するには、水溶性が十分とはいえなかった。

また、セサミン類が有する生理活性を顕著に高めた物質として、セサミン類と、該セサミン類を包接するシクロデキストリンなどの包接化合物とからなる包接体が知られている（特許文献４）。シクロデキストリン（以下、ＣＤともいう）は、６個以上のグルコピラノース（グルコース）単位がα−１,４結合により環状に結合した底の抜けたバケツ状の分子であり、グルコピラノース単位が６、７、８個からなるα−ＣＤ（CAS No.: 10016-20-3）、β-ＣＤ（CAS No.: 7585-39-9）、γ−ＣＤ（CAS No.: 17465-86-0）及びこれらの修飾体が知られている。しかしながら、特許文献４には、水への溶解性の性状に関しては触れられていない。

特表平１０−５００９３７号公報特許５３４８８８０５号国際公開第２００６/１０６９２６号特開２０１０−２４２４０号公報

本発明の課題は、難水溶性のセサミン類の水溶性を顕著に改善したセサミン類含有包接複合体およびその製造方法を提供することである。また、本発明の他の課題は、前記セサミン類含有包接複合体を含む食品、医薬品または医薬部外品を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために、難水溶性リグナン類とＣＤ類による包接複合体を形成し、定量的かつ定性的な基礎的評価検討を行った。
水への溶解度評価法としては、ヒグチ等の方法〔T. Higuchi, K.A. Connors, Adv. Anal. Chem. Instr., 4, 117 (1965)〕が知られており、それに従い溶解度相図を作成し評価した。更には、包接体であることを¹H-NMR解析にて検証し、その水への溶解性の評価を、凝集・沈殿の有無、無色・透明度の観点から網羅的に評価することにより、セサミン類と、分岐型β−シクロデキストリンまたは化学修飾型β−シクロデキストリンとからなる包接複合体がα−、β−およびγ−シクロデキストリンとの包接接合体と比べてより顕著な水溶性を示すことを見出し、さらに、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）、示差走査熱量（ＤＳＣ）解析により、その結晶性、高次構造を評価し、その溶解挙動の特徴による有用性を見出すことにより、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
［１］セサミンと、該セサミンを包接した化学修飾型シクロデキストリンとからなる包接複合体であって、
前記化学修飾型シクロデキストリンがメチル化β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ）である包接複合体、
［２］前記［１］に記載の包接複合体を含有する食品、医薬品または医薬部外品、
［３］セサミンを溶解させた高濃度のエタノール水溶液と化学修飾型シクロデキストリンとを混合して攪拌する工程、および得られた混合溶液中の溶媒を留去し乾燥する工程を含んでおり、前記化学修飾型シクロデキストリンがメチル化β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ）であることを特徴とする前記［１］に記載の包接複合体の製造方法
に関する。

本発明の包接複合体は、セサミン類の水溶性が顕著に改善された包接複合体であるため、水難溶性であったセサミン類の用途を飛躍的に拡大することができる。例えば、本発明の包接複合体を無色透明水性液体製剤としての活用が可能となり、また粉体化することにより、錠剤や顆粒剤などの調製の際に使用が容易な製剤原体としての供給が可能となる。これにより、本発明の包接接合体は、様々な食品、医薬品、医薬部外品などに好適に使用することができる。

図1は、セサミンと各種ＣＤとの包接接合体の水に対する溶解度相図である。図２は、溶解度相図における、溶解の異なる性状により現れる曲線の類型的なパターン（型）を示す概念図である。図３は、β−ＣＤ単独、セサミン/β−ＣＤ系の包接接合体の飽和溶解度時のそれぞれ水への溶解状態を示した写真である。図４は、β−ＣＤ、セサミン/β−ＣＤ系の包接接合体の、３位及び５位並びに１位の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図５は、Ｇ１−β−ＣＤ、セサミン/Ｇ１−β−ＣＤ系の包接接合体の、３位及び５位並びに１位の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図６は、Ｇ２−β−ＣＤ、セサミン/Ｇ２−β−ＣＤ系の包接接合体の、３位及び５位並びに１位の^１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルである。図7は、セサミン、β−ＣＤ、セサミン/β−ＣＤ包接複合体のそれぞれの粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンである。図８は、セサミン、Ｍ−β−ＣＤ、セサミン/Ｍ−β−ＣＤ包接複合体のそれぞれの粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンである。図９は、セサミン、ＨＰ−β−ＣＤ、セサミン/ＨＰ−β−ＣＤ包接複合体のそれぞれの粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンである。図１０は、（詳細記載要）セサミン/Ｍ−β−ＣＤ包接複合体のそれぞれの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のスペクトルである。図１１は、（詳細記載要）セサミン/ＨＰ−β−ＣＤ包接複合体のそれぞれの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のスペクトルである。

以下、本発明について詳細に説明する。

１．包接接合体
本発明の包接接合体は、セサミン類と、該セサミン類を包接した分岐型シクロデキストリンまたは化学修飾型シクロデキストリンとからなることを特徴とする。

〔セサミン類〕
本発明で使用するセサミン類とは、水への溶解性が低い難水溶性リグナン類の一種であり、例えば、セサミンおよびエピセサミンが挙げられる。
セサミンおよびエピセサミンとしては、例えば、ゴマ油から、公知の方法で、工業的に抽出されたものであってもよいし、健康食品素材として市販されているものでもよいが、その形態や製造方法など何ら制限されるものではない。
また、後述のように、本発明の包接接合体を食品、医薬品または医薬部外品に使用する場合には、本発明の包接接合体を構成するセサミン類は、セサミンまたはエピセサミンのいずれか単独であってもよいし、２種を混合したものでもよい。

〔分岐型シクロデキストリンまたは化学修飾型シクロデキストリン〕
本発明で用いる分岐型シクロデキストリンおよび化学修飾型シクロデキストリンは、シクロデキストリンを基本骨格とする化合物である。

シクロデキストリン（ＣＤ）とは、６個以上のグルコース単位がα−１,４結合により環状に結合した非還元性の環状オリゴ糖であり、６個のグルコース単位からなるα−ＣＤ、７個のグルコース単位からなるβ−ＣＤ、８個のグルコース単位からなるγ−ＣＤ、９個以上のグルコース単位からなる大環状ＣＤ類が挙げられる。これらのＣＤはいずれも、複数のグルコース単位で構成された環状の中心部に空洞部を有する構造を備えた化合物である。
また、前記α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤは、天然型ＣＤともよばれており、デンプンなどのα−グルカンをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19）などにより処理した際に、鎖状糖とともに生成される環状のオリゴ糖である。
９個以上のグルコース単位からなる大環状ＣＤ類については、トウモロコシや馬鈴薯などから得られるデンプンを、Paenibacillus maceransなどの細菌類が生産するシクロデキストリン合成酵素（Cyclodextrin glucanotransferase、CGTase）により処理して生産される市販のＣＤ粉飴から単離・精製することにより得ることができる。また、高重合度の酵素合成アミロースを、CGTase、馬鈴薯由来のD-酵素、Thermus aquaticus由来アミロマルターゼ（Amylomaltase）及びその変異酵素、グリコーゲン脱分枝酵素（Glycogen debranching enzyme）などにより処理して得られるＣＤ類の混合物（CGTaseを用いた場合は６個以上のグルコース単位、Ｄ−酵素を用いた場合は１６個以上のグルコース単位、アミロバルターゼを用いた場合は２２個以上のグルコース単位、グリコーゲン脱分枝酵素を用いた場合は１１個以上のグルコース単位からなるＣＤ類の混合物）から単離・精製することにより得ることができる。さらに、２２〜５０個のグルコース単位からなる大環状ＣＤ類の混合物は、江崎グリコ株式会社が生産し、和光純薬工業株式会社が販売する「シクロアミロース」から単離・精製することも可能である。

分岐型ＣＤは、天然型ＣＤまたは大環状ＣＤ類に対して、グルコースなどの糖分子が、直接α−１，６結合した構造を有する。
修飾に使用される糖分子の種類としては、１グルコース単位からなるグルコース、２グルコース単位からなるマルトース、３グルコース単位からなるマルトトリオースやパノースが挙げられる。またグルコース単位以外の糖を含むマンノースやガラクトースなども分岐鎖に使用される。さらにこれらの糖がＣＤ分子の１個のグルコース単位に導入されたモノ置換体のみならず、２個以上のグルコース単位に導入された多置換体も存在する。
中でも、セサミン類の水溶性を改善する観点から、天然型ＣＤに対して分岐化したものが好ましく、β−ＣＤに対してグルコシル化（グルコシル−β−シクロデキストリン（Ｇ１−β−ＣＤ））及びマルトシル化（マルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ））されたものがより好ましい。
前記分岐型ＣＤとしては、例えば、市販品を使用することができる。また、市販されていない分岐型ＣＤに関しては、目的とする分岐型ＣＤの構成要素であるＣＤと鎖状糖の高濃度試料を、α−１，６結合の切断酵素であるプルラナーゼなどで処理することにより調製し、これを単離・精製することにより得ることができる。
また、後述のように、本発明の包接接合体を食品、医薬品または医薬部外品に使用する場合には、本発明の包接接合体を構成する分岐型ＣＤの種類は、１種であってもよいし、２種以上を混合したものでもよい。
中でも、溶解性に優れる観点から、分岐型ＣＤとしては、Ｇ1−β−ＣＤとＧ２−β−ＣＤが好ましい。

化学修飾型ＣＤは、天然型ＣＤまたは大環状ＣＤ類の水酸基が有機基により一部置換された誘導体である。
置換されるＣＤの位置および数については、特に限定はない。
前記有機基としては、メチル基（メチル化）、プロピル基（プロピル化）などが挙げられる。
化学修飾型ＣＤとしては、例えば、メチル化β−ＣＤ（Ｍ−β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ（ＨＰ−β−ＣＤ）などが挙げられるが、セサミン類の水溶性を改善する観点から、Ｍ−β−ＣＤ、ＨＰ−β−ＣＤが好ましい。
前記化学修飾型ＣＤとしては、例えば、市販品を使用することができる。
また、後述のように、本発明の包接接合体を食品、医薬品または医薬部外品に使用する場合には、本発明の包接接合体を構成する化学修飾型ＣＤは、１種であってもよいし、２種以上を混合したものでもよい。

〔包接接合体〕
本発明において、「包接複合体」とは、前記セサミン類（ゲスト分子）が、ＣＤ（ホスト分子）の空洞中に少なくとも部分的にそれ自体挿入されて、いわゆる包接された状態となっている複合体を意味する。前記包接複合体におけるセサミン類の状態については、一般的な評価法として知られる溶解度相図から求められる安定度定数、及び一部の溶解度相図から決定されるゲスト分子とホスト分子の化学量論比、更には、ゲスト分子単体、ＣＤ単体並びに包接複合体のＮＭＲの化学シフトの比較により判別することができる。
さらに、その結晶性は、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）、示差走査熱量（ＤＳＣ）解析により評価することができ、その溶解挙動の特徴による有用性が検証することができる。

本発明において、水溶性の評価は、非常に高い難水溶性を示すセサミン類に関しては、溶解度法により溶解度相図を作成し、そのグラフの曲線の形状により、溶解性性状を評価することができる。また、簡易的には、セサミン類含有水溶液中への、ＣＤ類の添加による外観目視評価により行われる。水中にセサミン類とＣＤ類とが共存することにより、白濁したり、透明な溶液と白色沈殿物の減少、更には、完全に溶解すると沈殿物の全く生じない透明な状態になることにより、確認することができる。

２．包接接合体の製造方法
本発明の包接複合体は、セサミン類とＣＤ類とを相互作用させ、包接複合体を形成させることにより調製する。
例えば、セサミン類を溶解させた高濃度のエタノール水溶液と分岐型ＣＤまたは化学修飾型ＣＤとを混合して攪拌する工程（混合工程）を経て包接接合体を製造することができる。

前記混合工程において使用する前記高濃度のエタノール水溶液とは、仕込み量のセサミン類を完全に溶解させるのに必要なエタノール濃度をいう。前記濃度は、セサミン類とＣＤ類とを効率よく溶解させる観点から、５０％以上が好ましく、８５％〜９５％がより好ましい。
前記エタノール水溶液中のエタノールと水との比率については、特に限定はないが、
セサミン類とＣＤ類とを効率よく溶解させる観点から、エタノール／水の比率（容量比）が５０／５０〜９５/５が好ましく、８５／１５〜９５／５がより好ましい。

前記混合工程において混合されるセサミン類と分岐型ＣＤまたは化学修飾型ＣＤとの量比についても、特に限定はないが、セサミン類／（分岐型ＣＤまたは化学修飾型ＣＤ）の比率（モル比）が１／１〜１／５０であればよい。
前記セサミン類については、セサミンまたはエピセサミンのいずれか単独であってもよいし、２種を混合したものでもよい。
前記分岐型ＣＤや化学修飾型ＣＤの種類は、１種であってもよいし、２種以上を混合したものでもよい。

なお、前記混合工程における温度は、特に限定はなく、常温の範囲であればよい。
前記混合工程における撹拌の速度についても特に限定はない。
また、前記混合工程は、撹拌している混合溶液の状態が透明になった時点で終了すればよい。なお、透明とは、混合溶液を入れている容器の内側表面が、目視にて、にごりなく見える状態をいう。

前記混合工程で得られた混合溶液中には、包接複合体が形成されているため、混合溶液をそのまま水性液体製剤として用いることができる。

また、前記混合溶液を乾燥処理することで、固体状の包接複合体としてもよい。
例えば、前記混合溶液中の溶媒を留去し乾燥する工程（乾燥工程）を経て固形状の包接接合体を製造することができる。

前記乾燥工程において、得られた混合溶液中に含まれるエタノール、水などの溶媒を留去する手段としては、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥（スプレードライ）などが挙げられるが、特に限定はない。
例えば、留去手段として噴霧乾燥（スプレードライ）を用いた場合、その乾燥条件としては、水-エタノール系溶媒の共沸点である７８．１５℃以上などに調整していればよい。

以上のようにして得られた固体状の包接複合体は、粉砕処理に供することで、粉末状にしたり、さらには、固形状の包接複合体を再度水またはエタノール水溶液に溶解して水性液剤として用いることもできる。

以上のようにして得られる本発明の包接複合体は、水溶性に優れたものであるため、食品、医薬品および医薬部外品に配合して使用することができる。このような食品、医薬品および医薬部外品は、セサミン類に由来する機能性作用を有する食品、医薬品または医薬部外品となる。

前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯性に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等にすることができる。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。

また、前記食品には、ヒトが食べる食品だけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤等の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりしてもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤に公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤又は点滴剤に配合して使用してもよい。

医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウォッシュ、マウスリンス、ドリンク剤が挙げられる。

本発明の包接複合体を用いて食品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状などの最終形態等にすることができる。

また、本発明の包接複合体を食品に添加する場合には、セサミンの１日当たりの必要摂取量や最大許容量の範囲内になるように添加することが好ましい。

本発明の包接複合体を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常、薬剤の態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

本発明の新規化合物を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、セサミンの１日当たりの必要摂取量や最大許容量の範囲内になるように添加するのが好ましい。

以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実験例１：各種包接接合体の水への溶解度評価〕
本発明者らは、生理活性作用のあるリグナン類の中で、水への溶解度が最も低いセサミンに注目し、ＣＤとの包接接合体とした場合の水への溶解度を溶解度相図を作成することにより評価した。
ＣＤとしては、一般的な天然型ＣＤと称される、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、更には、分岐型ＣＤとしては、グルコシル−β−ＣＤ（Ｇ１−β−ＣＤ）、マルトシル−β−ＣＤ（Ｇ２−β−ＣＤ）の２種、化学修飾型ＣＤとしては、メチル化β−ＣＤ（Ｍ−β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤの２種を用いた。
また、包接接合体は、セサミンを溶解させた高濃度（９５％）のエタノール水溶液に、各種のＣＤ類を溶解し、常温（１５〜２５℃）で攪拌後、この溶媒を除去し、包接接合体を得た。
なお、セサミンと特定のＣＤとの複合体については、「特定のＣＤ系包接複合体」または「セサミン／特定のＣＤ系」などと記載する。

図１に示す溶解度相図のように、先行技術として開示されてきたセサミンの水性液体製剤としての活用において、セサミンのＣＤ包接複合体として挙げられた、α−、β−、γ−ＣＤとの包接複合体の水への溶解度が驚くべきことに低く、γ−ＣＤがその中でも一番低い溶解度であることが見出された。
ＣＤ単体の水への溶解度（２５℃）は、α−ＣＤが、１４．５ｇ/１００ｍＬ、β−ＣＤが、１．８５ｇ／１００ｍＬ、γ−ＣＤが、２３．２ｇ/１００ｍＬと報告されており、ＣＤ単体ではγ−ＣＤが一番水への溶解度が高く、β−ＣＤが一番低いことから、ＣＤ単体での溶解度から、包接される難水溶性物質の水への溶解度の改善が一義的に決まるわけでないことが示される。

天然型ＣＤの三つの中では、単体では水への溶解度が一番低いはずのβ−ＣＤがセサミンの水への溶解度の改善が比較的高く、β−ＣＤ系包接接合体は、セサミン原体と比較するとその飽和溶解度は０．２５ｍＭ、即ち８９ｍｇ/Ｌ相当であり、約２００倍改善できていた。

先に述べたように、セサミン単体では、例えば健康食品として、水性液体飲料の形で、一日必要摂取量を摂ろうとすれば、約２３Ｌの水性液体が必要になるが、天然型ＣＤとの包接複合体の形態であれば、約１００〜５００ｍＬレベルの水性液体で摂取できることになる。
しかしながら、医薬品、医薬部外品として使用する場合を考慮すると、溶解性のさらなる改良が必要と考えた。

また、重水中におけるβ−ＣＤ単体及びセサミンとβ−ＣＤの共存系の^１Ｈ−ＮＭＲを比較したところ、ＣＤ空洞内に存在する各グルコース単位の３及び５位のプロトンに高磁場シフトが観測された。これは、セサミンがβ−ＣＤの空洞内に入り込んだため、３及び５位のプロトンの電子雲に圧縮効果が発生したためであり、セサミンとβ−ＣＤが包接複合体を形成していることが明らかとなった。加えて、溶解度相図の解析から、セサミンとβ−ＣＤは１：１の包接複合体を形成していることが確認された。
更に溶解の性状として、低濃度領域で、飽和限界に達するＢ_Ｓ型の溶解度相図を示すことから、低温で、飽和限界濃度に達し、細かい沈殿物の析出をさせることも可能であり、しかもその粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）測定からは、各純品には見られない新規のピークが観測されたことから、セサミンとβ−ＣＤの包接複合体は、結晶性複合体であることも明らかとなった。

そこで、前記のβ−ＣＤでの結果を踏まえ、分岐型β−ＣＤ系包接複合体、化学修飾型β−ＣＤ系包接複合体を作製して、これらの溶解度を調べたところ、β−ＣＤ系包接複合体に比べて、さらに水への溶解度が高く、しかも高濃度まで水溶化できることが見出された。分岐型β−ＣＤ系包接複合体および化学修飾型β−ＣＤ系包接複合体のＣＤの溶解度相図は、難水溶性のセサミンに対してＡ_Ｌ型の溶解性を示し、^１Ｈ−ＮＭＲの結果も考え合わせると、水溶性の包接複合体であることが見出された。

具体的には、溶解度は、分岐型ＣＤ濃度の増加に伴いセサミン濃度は比例的に増大し、Ｇ１−β−ＣＤ系包接接合体では、ＣＤ濃度２８ｍＭの時、セサミン単体と比較して、溶解度が９５５倍になった。また、低濃度で溶解度が頭打ちとなるβ−ＣＤ系包接接合体と比較しても、Ｇ１−β−ＣＤ系包接接合体の溶解度は約４．６倍とさらに改善することが見出された。
Ｇ２−β−ＣＤ系包接接合体では、ＣＤ濃度２３ｍＭの時、セサミン単体と比較して９６７倍、β−ＣＤ系包接接合体と比較して約４．６倍も溶解度が改善された。

化学修飾型においては、Ｍ−β−ＣＤが、分岐型ＣＤを超える一番高い溶解力を示す一方、ＨＰ−β−ＣＤは、分岐型のＧ１−β−ＣＤ及びＧ２−β−ＣＤよりは劣り、その溶解度向上には、ＣＤそれぞれによる多様性が見られる。
しかしながら、分岐型ＣＤの可溶化能力が、シクロデキストリン濃度２０ｍＭ以上では頭打ち状態になるのに比し、可溶化能力の劣っていたＨＰ−β−ＣＤは、ＣＤ添加量が３０ｍＭを超えても、ＣＤ添加量に比例して、セサミン濃度を上げることができる特性が見出された。
例えば、ＨＰ−β−ＣＤが４０ｍＭの時のセサミン濃度は１．７ｍＭであり、１ｍＬに対し、０．６０ｍｇのセサミンが水へ溶解したこととなり（０．６０ｍｇ/ｍＬ）、セサミン単体の２５℃における飽和溶解度（０．４３μｇ／ｍＬ）に比し、約３桁強の水への溶解度向上を示すことが見出された。これは、難水溶性のセサミン単体が、可溶化し、透明な沈殿のない水性液体の必要な水の量が約３桁少なくて済むということであり、高濃度のセサミン水性製剤の内容量の低減に大きな効果をもたらすと考えられる。

Ｍ−β−ＣＤの溶解度相図は、Ａ_Ｐ型（２０ｍＭ前後で直線の傾きが変化するため）を示し、高次の複合体を形成していると考えられる。
先行の特許で、定性的に開示されていたセサミンの包接複合体の水への添加活用、界面活性剤による水への溶解というよりは分散などの試みに示される、大きな解決課題に対し、定量的な基礎検討により、先行事例からは窺い知れないセサミンの水への溶解性の向上が見出された。

〔実験例２：包接複合体の構造評価〕
ＣＤ類の環状構造に、ゲスト分子であるリグナン類が、どのような形で相互作用を行い、どの程度包接されているかを、1次元の核磁気共鳴法（^１Ｈ−ＮＭＲ）により評価した。
ＣＤ類は３及び５位のプロトンが、空洞の内側を向いており、ＣＤ類の空洞にゲスト分子が包接された際、これらのプロトンと相互作用を起こす。その結果、プロトンの電子雲の圧縮効果により、３及び５位のプロトンの共鳴位置が高磁場側にシフトする。このシフトが、大きいほど、相互作用が強いと評価される。
また、包接によりＣＤ自身の環構造が変化した場合には１位のプロトンの共鳴位置が、高磁場側に移動する。これらの変化を^１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルから、読み取ることで、包接の状態が評価できる。

溶解度評価で、セサミンとβ−ＣＤは、溶解度相図では、Ｂ_Ｓ型の水への溶解性を示し、水への溶解性が向上したことが確認された。又、この結果から、化学量論比１：１で複合体を形成し、見かけの安定度定数から、かなり強固な相互作用が働いているものと考えられた。その包接構造を、^１Ｈ−ＮＭＲで評価したところ、３及び５位の両者のプロトンの共鳴位置が高磁場側にシフトしていることから、セサミンを空洞内部に包接している、包接複合体であることが見出された。しかし、１位のプロトン共鳴位置は変化していないことから、環構造を変化させることなく、包接されていることが推察された。その結果を図４に示す。

セサミンと分岐型β−ＣＤは、溶解度相図では、β−ＣＤ包接複合体の水への溶解度が頭打ちになり、その後平坦化、更には、低下を示すのに比し、ＣＤの高い濃度まで、セサミンを溶解するＡ_Ｌ型を示すことから、その包接状態を^１Ｈ−ＮＭＲで評価した。これらの結果を図５、６に示す。
具体的には、Ｇ１−β−ＣＤ、Ｇ２−β−ＣＤともに、安定度定数はβ−ＣＤより高く、安定な包接複合体の形成が推察されていたが、３及び５位の両者のプロトンの共鳴位置の高磁場側へのシフトからも、裏付けされた。
３位、５位、更には、１位の共鳴位置の高磁場シフトが、両包接複合体ともにβ−ＣＤとの包接複合体よりも大きく、少し環構造が変化する形で、空洞内に包接されていることが示唆された。また、Ｇ１−β−ＣＤとＧ２−β−ＣＤの比較では、ほぼ同じシフト量ではあるが、Ｇ１−β−ＣＤの方が少し大きいことが見出された。

（実験例３：セサミンと各種ＣＤからなる複合体の溶解度相図）
難水溶性物質の溶解度変化を解析する方法に、T. Higuchi及びK.A. Connorsにより確立された溶解度法（Solubility Method）がある。この方法はある溶媒中で一定過剰量の難水溶性であるゲスト分子（Ｇ）を一連の濃度からなるＣＤを加えて平衡に到達させた後、各系におけるＧの総濃度Ｓｔを測定する。その時、Ｇ単独の溶解度Ｓ_０より増加した分（Ｓｔ−Ｓ_０）を相互作用による溶解度変化、つまり複合体の濃度とみなして安定度定数を算出することができる。

セサミンと各種ＣＤによる複合体形成による２５℃条件下での溶解度相図を図１に示す。また、ここで、溶解度相図は、基本的に、図２に示すように、大きくＡ型とＢ型の２種類に分類される。
すなわち、上昇曲線を描くＡ型と、プラトー（Plateau）領域とそれに続く下降曲線を持つＢ型である。一般にＡ型は水溶性の複合体を形成する場合にみられ、曲線の形から更に、溶解度プロットが直線的に上昇するＡ_Ｌ型、プロットが正に偏差するＡ_Ｐ型、負に偏差するＡ_Ｎ型に分類される。一方、Ｂ型は比較的難水溶性の複合体が形成される場合であり、Ｂ_Ｓ型とＢ_Ｉ型に分類される。特にＢ_Ｉ型は、Ｇの溶解度よりも小さい溶解度の複合体が形成される場合にみられる。Ｂ_Ｓ型はＣＤ添加により可溶性複合体の溶解度が飽和に達した後、ＣＤ添加量を増やすと引き続き複合体の形成とその沈殿は進むが、Ｇの溶解度は上昇せず、平坦なPlateau領域とよばれる状態を示す。その後、過剰のＧが固相から消失し、溶液に移り終え、Ｇは複合体に変換されるが、飽和には至らず、さらにＣＤを添加すると、溶液中に残存する遊離型のＧが過剰のＣＤと結合して複合体が沈殿するため、濾過して複合体を単離できる。

セサミンとβ−ＣＤとの複合体の調製方法として、β−ＣＤは１１．３〜９０．７ｍｇ（終濃度２〜１６ｍＭ、２ｍＭステップ）をそれぞれ、褐色共栓付き試験管に量りとり、１ｍＬの水を加え溶解させた。セサミンは９５％エタノール溶液を溶媒として、１ｍｇ/ｍＬの濃度の溶液として、調製し、前述のβ−ＣＤに４ｍＬずつ添加した。ボルテックスミキサー、超音波によって、攪拌して分散させたのち、遠心エバポレーターにて溶媒留去。乾固したものを水５ｍＬに懸濁させる。この試料を２５℃の恒温室内に設置したシェーカーにて４８時間振とうした後、恒温振とう槽（２５℃）を用いてさらに４８時間かけて平衡に到達させる。この時、シェーカーに掛け始めた時点を起点として、２４、４８、７２時間、攪拌の作業を行った。遠心分離した後、メンブランフィルター（０．４５μｍ）を用いて上清を濾過し、濾液を別の褐色共栓付試験管に３．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーターで、溶媒を留去した後、７５％エタノール溶液３．５ｍＬに攪拌して再溶解させ、上清を濾過した濾液を試料とし、予め作成した検量線の範囲内に希釈し、セサミン量の測定を行った。作成した溶解度相図に見られるように、セサミンの溶解度は、β−ＣＤ添加量で７ｍＭまではＣＤ濃度に比例して増加し、７〜９ｍＭの領域で頭打ちとなり、それ以上の濃度では緩やかに低下した。この曲線はＢ_Ｓ型に分類されるもので、β−ＣＤ添加量で０〜７ｍＭまでの領域を初期上昇部分の直線とみなし見かけの安定度定数を、又Plateau領域から化学量論比を算出した。その結果、このセサミン／β−ＣＤの包接複合体の飽和溶解度は０．２５ｍＭとなり、セサミン単体の溶解度、１．２μＭと比較して約２００倍に向上した。又その直線部分から、水溶液中での見かけの安定度定数はＫ＝２．８×１０^４Ｍ^−１と算出された。さらに、セサミンとβ−ＣＤは１：１で複合体を形成していることが明らかとなった。又、β−ＣＤ単独、セサミン／β−ＣＤ系の飽和溶解度時のそれぞれ水への溶解状態を示した写真（図３）が得られた。

他の天然型ＣＤとして、γ−ＣＤを、上記と同様に調製し、セサミンとの複合体の溶解度相図を作成した。その曲線からは、水への溶解度は極端に低く、難水溶性の複合体となっていると考えられる。この結果を踏まえ、β−ＣＤの分岐型、更には化学修飾型のＣＤとの複合体の水への溶解度を検討した。調製法は、上記に順じて、セサミン、並びにＣＤ量の調製範囲を広げて、その曲線の特徴を検討した。
分岐型ＣＤとしては、グルコシル（Glucosyl）−β−ＣＤ（Ｇ１−β−ＣＤ）、マルトシル（Maltosyl）−β−ＣＤ（Ｇ２−β−ＣＤ）の２種、化学修飾型ＣＤとしては、メチル（Methylated）−β−ＣＤ（Ｍ−β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル（Hydroxypropyl）−β−ＣＤの２種を用いた。これらのＣＤとの複合体は、さらに水への溶解度が高く、しかも高濃度まで水溶化できることが見出された。特に分岐型ＣＤの溶解度相図は、難水溶性のセサミンに対してＡ_Ｌ型の溶解性を示し、水溶性の包接複合体であることが見出された。

溶解度は、分岐型ＣＤ濃度の増加に伴いセサミン濃度は比例的に増大し、ほぼ、Ｇ１−β−ＣＤ系包接接合体では、ＣＤ濃度２８ｍＭの時、セサミン濃度は、１．１５ｍＭであり、セサミン単体と比較して９５５倍、低濃度で頭打ちとなるβ−ＣＤ系包接接合体と比較しても４．６倍も溶解度が改善することが見出された。Ｇ２−β−ＣＤ系包接接合体では、濃度２３ｍＭの時、セサミン濃度は１．１６ｍＭであり、セサミン単体と比較して９６７倍、β−ＣＤ系包接接合体と比較しても４．６倍も溶解度が改善することが見出された。また、安定度定数（Ｋ）は、Ｇ１−β−ＣＤでは、Ｋ＝４．０×１０^４Ｍ^−１、Ｇ２−β−ＣＤでは、Ｋ＝３．９×１０^４Ｍ^−１と算出され、β−ＣＤのＫ＝２．８×１０^４Ｍ^−１と比較して、より安定な包接複合体が形成されている。

化学修飾型においては、Ｍ−β−ＣＤ系包接接合体が、分岐型ＣＤ系包接接合体を超える一番高い溶解力を示す一方、ＨＰ−β−ＣＤ系包接接合体は、分岐型のＧ１−β−ＣＤ及びＧ２−β−ＣＤを含む包接接合体よりは劣り、ＣＤの種類により、その溶解度向上には、ＣＤそれぞれによる多様性が見られる。
しかしながら、分岐型ＣＤ系包接接合体の可溶化能力が、２０ｍＭ以上では頭打ち状態になるのに比し、可溶化能力の劣っていたＨＰ−β−ＣＤ系包接接合体は、ＣＤ添加量が３０ｍＭを超えても、ＣＤ添加量に比例して、セサミン濃度をあげることができる特性が見出される。
例えば、ＨＰ−β−ＣＤが４０ｍＭの時のセサミン濃度は１．７ｍＭであり、１ｍＬに対し、０．６０ｍｇのセサミンが水へ溶解したこととなり（０．６０ｍｇ/ｍＬ）、セサミン単体の２５℃における飽和溶解度（０．４３μｇ/ｍＬ）に比し、約３桁強の水への溶解度向上を示すことが、見出された。また、Ｍ−β−ＣＤが、同じ４０ｍＭの時のセサミン濃度は３．７６ｍＭにも達し、ＨＰ−β−ＣＤの更に２倍強の溶解度を示すことが見出された。調製法に関しても、α−、β−、γ−ＣＤ及び分岐型ＣＤは高濃度のエタノール水溶液では、その溶解性が純水に比べ低下する。一方、Ｍ−β−ＣＤやＨＰ−β−ＣＤは９５％エタノール水溶液中でも１５ｍＭの溶液は容易に作製可能である。

一般に、包接複合体の形成は、ゲスト分子とホスト分子の両者が分子分散状態にある系ではその平衡は非常に速やかに完結する。もしこのような方法で包接複合体を調製できれば、固体のセサミンからセサミン分子をＣＤ類が引き剥がす（可溶化）ために必要な振とう時間（平衡到達時間）を省略することができ、調製作業の簡略化につながる。このため、本実施例では、セサミンを溶解した９５％エタノール水溶液に、Ｍ−β−ＣＤ又はＨＰ−β−ＣＤを添加した溶液をボルテックスミキサーによる簡単な混合後、溶媒を留去した際に残る残渣（包接複合体）の精製水への溶解という簡単な調製法が取れた。

（実験例４：重水中におけるセサミンとＣＤ間の相互作用）
包接体複合体の形成の裏付けの１つとして、^１Ｈ−ＮＭＲの評価をおこなった。
包接複合体を形成すると、空洞内に位置するグルコース単位の３及び５位のプロトンの化学シフト値が高磁場シフトすることが一般的に知られている。又、３位のプロトンは空洞の広い口側（２級水酸基側）に、５位のプロトンは狭い口側（１級水酸基側）に存在するため、その高磁場シフトの大きさから、ゲストの空洞内の存在位置をおおまかに推定することができる。
複合体試料の調製は、溶解度相図の際に使用した水を重水にして、遠心分離した後の上清をメンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過した溶液を^１Ｈ−ＮＭＲに供した。（測定装置：JNM-ECA-600II、Tetramethylsilaneを使用した外部標準法、測定温度３０℃）。又、セサミンの溶媒としては、ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulufoxide）−ｄ_６を用いた。
β−ＣＤ、セサミン／β−ＣＤ系、セサミン／Ｇ１−β−ＣＤ系、セサミン／Ｇ２−β−ＣＤ系の、３位及び５位並びに１位の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ、図４，図５、図６に示す。
いずれもピークの化学シフトにより、包接状態の詳細性状が見出された。

（実験例５：セサミンとβ−ＣＤによる結晶性包接複合体）
[粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）]
セサミンとβ−ＣＤ包接複合体は、溶解度相図がＢ_Ｓ型であることから、Plateau領域以上のβ−ＣＤを添加すると沈殿物の析出を得ることができる。また、温度による包接複合体の溶解度の違いを利用して、析出物を得ることも可能である。
そこで、溶解度相図のデータを根拠に、２Ｌの水にβ−ＣＤを１８ｇ溶かし、セサミンを９０ｍｇ加えて懸濁液を作製し、バイオシェーカー内でスターラーを用いて攪拌（５０℃、２４時間）した後、濾過し、濾液を低温室内に静置した。析出した微結晶を目皿漏斗で濾過することにより回収し、冷水で洗浄したのち、減圧乾燥させ、粉末Ｘ線回折測定（ＰＸＲＤ）の試料とした。
一方、β−ＣＤの水への溶解度が６０℃のとき７５ｍｇ/ｇ、２０℃のとき１６．４ｍｇ/ｇという報告に基づき、６０℃の湯浴で加温しながら７．５ｇのβ−ＣＤを１００ｍＬの水に溶解させた。これを４℃まで冷却し、再結晶したものを上記と同じ処理を加え、β−ＣＤ単体の測定試料とした。セサミンは入手した市販純品そのものをＰＸＲＤ測定の試料とした。
ＰＸＲＤの回折パターンを図７に示す。図７中、矢印で示した部分がセサミン、β−ＣＤの各純品には見られない新規のピークである。複合体の回折パターンに各純品には見られない新規のピークが確認できること、又ハローパターンにピークが乗ったような回折ではなく、比較的シャープなピークが観測されたことから、溶解度相図から予想されたように、本複合体は結晶性包接複合体であることが、確認かつ見出された。

（実施例４：セサミンと化学修飾型ＣＤによる非晶質包接複合体）
[粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）]
溶解度相図から、化学修飾型ＣＤとの包接複合体は、その他のＣＤと比べ、Ｍ−β−ＣＤは３０ｍＭまで、ＨＰ−β−ＣＤは４０ｍＭまでＣＤ濃度の増加に対し飽和現象が起きない水への溶解を示すＡ型であることが見出された。その構造を粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）により評価した。セサミン/Ｍ−β−ＣＤ、セサミン/ＨＰ−β−ＣＤの回折パターンが、図８、図９のようにそれぞれ見出された。
化学修飾型のＣＤに関しては、包接複合体においては、セサミン純品の回折ピークが消失し、化学修飾型のＣＤ純品の持つブロードな回折パターンと同じパターンを示すのみで、新たな明確な異なるシャープなピークは全く見られないことから、セサミンの結晶性は非常に低下し、又、生成した包接複合体も、セサミン/β−ＣＤ系とは異なり、非晶質であることが確認された。
これらの結果から、水に容易に溶解するセサミン/Ｍ−β−ＣＤ系とセサミン/ＨＰ−β−ＣＤ系の包接複合体の水への溶解性の特異性が、セサミンの結晶性の低下と非晶質な包接複合体の生成に基づくことが示唆された。

[示差走査熱量測定（ＤＳＣ）]
前出のＰＸＲＤの結果から、セサミン/Ｍ−β−ＣＤ系とセサミン/ＨＰ−β−ＣＤ系の包接複合体の水への溶解性の特異性が、セサミンの結晶性の低下と非晶質な包接複合体の生成に基づくことが示唆されたことから、熱挙動からもこれらを確認するため、セサミン、セサミン/Ｍ−β−ＣＤ系及びセサミン/ＨＰ−β−ＣＤ系の物理的混合物（ＰＭ）並びに包接複合体（ＭＢ−ＳＭ及びＨＰ−ＳＭ）の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。結晶を溶融するためには、結晶を構成している分子の分子間力を切るために外部からエネルギー（熱）を供給せねばならず、図１０及び図１１のセサミンに見られるような、融点に由来する明瞭な吸熱ピークが観測される。
一方、Ｍ−β−ＣＤやＨＰ−β−ＣＤのような非晶質では、分子の配列に規則性がなく、明瞭な吸熱ピークは現れない。Ｍ−β−ＣＤやＨＰ−β−ＣＤとセサミンの粉体を単に混合したＰＭでは、セサミンの融点に由来する吸熱ピークが観測され、結晶性のあるセサミンが残留していることがわかる。
一方、包接複合体であるＭＢ−ＳＭ及びＨＰ−ＳＭでは、セサミンの融点に由来する吸熱ピークは完全に消失している。
以上の結果から、ＰＸＲＤの結果と同様にＤＳＣにおいても、セサミンは結晶ではなく、各分子がバラバラになった状態で存在していることが示唆された。

また、セサミンは、ＢＣＳ分類（Biopharmaceutics Classification System）のClass II（難水溶性、高生体膜透過性）に分類されると予想される。ここで、一般的に、前記Class IIの薬物は、溶解性を改善すれば、吸収性は向上することが知られている。
また、薬物の腸管からの吸収が単純拡散に基づく場合、腸管側の濃度を高くすればするほど、吸収性は高くなることも知られている（Noyes-Whitney-Nernstの式など）。
したがって、分岐型ＣＤまたは化学修飾型ＣＤを用いた本発明の包接複合体は、β−ＣＤを用いた包接接合体に比べても溶解性が顕著に高いことから、セサミン類単独である場合はもちろん、β−ＣＤを用いた包接体と比べても体内吸収性は高くなると予測される。

Claims

セサミンと、該セサミンを包接した化学修飾型シクロデキストリンとからなる包接複合体であって、
前記化学修飾型シクロデキストリンがメチル化β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ）である包接複合体。
請求項１に記載の包接複合体を含有する食品、医薬品または医薬部外品。
セサミンを溶解させた高濃度のエタノール水溶液と化学修飾型シクロデキストリンとを混合して攪拌する工程、および得られた混合溶液中の溶媒を留去し乾燥する工程を含んでおり、前記化学修飾型シクロデキストリンがメチル化β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ）であることを特徴とする請求項１に記載の包接複合体の製造方法。