JP6829245B2

JP6829245B2 - 有機−無機複合薄膜、ｐＨセンサおよび有機−無機複合薄膜の製造方法

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Publication number: JP6829245B2
Application number: JP2018503846A
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Inventors: 中澄　博行; 博行中澄; 壮志前田; 周太郎石川
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Priority date: 2016-03-08
Filing date: 2016-03-08
Publication date: 2021-02-10
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Description

本発明は、色素骨格を組み込んだ有機−無機複合薄膜、それを用いたｐＨセンサ、および有機−無機複合薄膜の製造方法に関する。

微生物を培養する用途では、培養液のｐＨは、一般にガラス電極を用いるｐＨセンサにより測定されている。最近では、小型の培養容器が開発されている。この小型の培養容器に対しては、ガラス電極を用いるｐＨセンサのサイズが大きいため、さらに小型のｐＨセンサが求められている。

そこで薄膜化が可能なｐＨセンサの開発が試みられている。特許文献１では、蛍光色素をポリマーマトリックスに組み込んだｐＨセンサが提案されている。非特許文献１では、色素とシリカゾルとの混合物を基板に塗布してセンサ層を形成したｐＨセンサが提案されている。

米国特許ＵＳ２００５／００９００１４Ａ１号公報

D. Wencel et al., "Sensors and Actuators B", Elsevier, 139 (2009) 208-213

微生物の培養容器中で使用されるｐＨセンサは、３８℃付近の温かい培養液中に長時間浸漬される。また、培養容器は、γ線などの放射線により滅菌処理する必要があるため、容器とともにｐＨセンサも放射線によって滅菌処理できることが要求される。

しかし、特許文献１のｐＨセンサでは、温かい培養液に長時間浸漬させると、色素が溶出したり、ポリマーが膨潤してｐＨの検知感度が大きく低下したりする。また高エネルギーのγ線を照射すると、ポリマーが分解して、薄膜が劣化し、色素が溶出する。特許文献２でも、色素の溶出を抑制することは難しい。γ線による滅菌処理は、常温にて密閉状態で行うことが可能であり、滅菌後の残留物がないことなどの利点があるため、微生物培養容器の滅菌処理方法として適している。しかし、γ線滅菌が可能な有機色素を用いた光学ｐＨセンサは未だ報告例が少なく、その開発が望まれる。

本発明の目的は、色素の溶出が抑制され、放射線に対する耐久性が高い有機−無機複合薄膜、ｐＨセンサおよび有機−無機複合薄膜の製造方法を提供することである。

本発明の一局面は、ポリシロキサン骨格と、前記ポリシロキサン骨格に組み込まれた有機塩と、を含む有機−無機複合薄膜であって、
前記有機塩は、色素骨格を有するアニオンと、ケイ素含有基を有するカチオンとで構成され、前記カチオンは、前記ケイ素含有基に含まれるケイ素原子を介して前記アニオンとともに前記ポリシロキサン骨格内に分散して組み込まれている、有機−無機複合薄膜（有機−無機ハイブリッド薄膜）に関する。

本発明の他の一局面は、上記有機−無機複合薄膜で構成された、ｐＨセンサに関する。

本発明のさらに他の局面は、アルコキシシリル基を含むカチオンと色素骨格を有するアニオンとの有機塩を形成する第１工程と、
前記有機塩と、加水分解縮合性基を有するシラン化合物とを、加水分解反応および重縮合反応させて、ポリシロキサン骨格を形成するとともに、前記有機塩を前記ポリシロキサン骨格内に分散した状態で組み込む第２工程と、
前記第２工程で得られる反応混合物を基材に塗布して加熱する第３工程と、を含む、有機−無機複合薄膜の製造方法に関する。

本発明に係る有機−無機複合薄膜によれば、培養液などの温かい溶液中に長時間浸漬しても、色素の溶出を抑制することができる。また、γ線などの高エネルギーの放射線に対する耐久性が高い。

実施例１で得られた有機−無機複合薄膜の励起スペクトルである。実施例１で得られた有機−無機複合薄膜の蛍光スペクトルである。実施例１で得られた有機−無機複合薄膜をリン酸緩衝溶液に浸漬させた状態で求めた、波長４０５ｎｍおよび４５５ｎｍのそれぞれの励起光に由来する波長５０５ｎｍの発光のピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmと、リン酸緩衝溶液のｐＨとの関係を示すグラフである。有機−無機複合薄膜のｐＨ応答性を評価するための評価装置の模式図である。リン酸緩衝溶液のｐＨを変化させた場合の、実施例１で得られた有機−無機複合薄膜についてのピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示すグラフである。リン酸緩衝溶液のｐＨを繰り返し変化させた場合の、実施例１で得られた有機−無機複合薄膜についてのピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化（再現性）を示すグラフである。実施例１で得られた有機−無機複合薄膜を、３８℃のリン酸緩衝溶液に１週間浸漬させた際のｐＨ応答性の測定において、ｐＨ６．８におけるピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmとｐＨ８．０におけるピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmとの差（ΔＩ_455nm／Ｉ_405nm）の経時変化を示すグラフである。実施例１で得られた有機−無機複合薄膜のγ線への暴露前後で、リン酸緩衝溶液のｐＨを変化させた場合のピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示すグラフである。実施例１で得られた有機−無機複合薄膜のγ線への暴露前後で、リン酸緩衝溶液のｐＨを繰り返し変化させた場合のピーク強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化（再現性）を示すグラフである。

本発明に係る有機−無機複合薄膜は、ポリシロキサン骨格と、ポリシロキサン骨格に組み込まれた有機塩と、を含む。有機塩は、色素骨格を有するアニオンと、ケイ素含有基を有するカチオンとで構成され、カチオンは、ケイ素含有基に含まれるケイ素原子を介してアニオンとともにポリシロキサン骨格に組み込まれている。

このように、色素骨格は、カチオンに含まれるケイ素原子を介してポリシロキサン骨格に組み込まれている（つまり、ケイ素元素を介して色素骨格がポリシロキサン骨格に結合している）。従って、色素の溶出を抑制することができる。また、有機−無機複合薄膜のマトリックスはポリシロキサン骨格であるため、ポリマーマトリックスの場合と比べて、培養液などの温かい溶液に長時間浸漬させた場合や、γ線などの放射線に暴露させた場合にも、膨潤や分解などが抑制され、耐久性が高い。これによっても、色素の溶出が抑制される。また、色素の吸収（または励起）および発光の高い感度を確保することもできる。

本発明の好ましい実施形態に係る有機−無機複合薄膜は、有機−無機複合薄膜に導入された色素骨格の励起（または吸収）特性および／または発光特性により、ｐＨ応答性を示す。従って、薄膜状のｐＨセンサとして利用することができる。このような薄膜状のｐＨセンサは、従来のガラス電極を用いるｐＨセンサとは異なり、極めて省スペースである。よって、小型の培養容器などに用いるのに適している。

以下、有機−無機複合薄膜およびその製造方法、ならびに有機−無機複合薄膜の製造方法を用いたｐＨセンサについてより具体的に説明する。
（有機−無機複合薄膜）
有機−無機複合薄膜は、ポリシロキサン骨格に有機塩が組み込まれた構造を含んでいる。有機塩は、色素骨格を有するアニオンとケイ素含有基を有するカチオンとの塩である。このカチオンに含まれるケイ素含有基のケイ素原子が、有機−無機複合薄膜を形成する際に、ポリシロキサン骨格に組み込まれることで、色素骨格をポリシロキサン骨格に強固に結合することができる。

色素骨格を有するアニオンは、有機−無機複合薄膜の用途に応じて公知の色素から適宜選択できる。色素は、適度な波長の光（例えば、紫外光や可視光など）を吸収して、発光したり、変色したりするものであればよい。有機−無機複合薄膜をｐＨセンサとして利用する場合には、ｐＨ応答性の色素を使用すればよい。

色素（または色素骨格）は、光エネルギーを吸収するための共役系を有しており、このような共役系として、例えば、下記式（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）：
で表される骨格を含むものなどが挙げられる。

色素骨格を有するアニオンにおいて、上記の共役系の骨格は、アニオン性基を有しており、アニオン性基に加え、さらに置換基を有していてもよい。アニオン性基としては、スルホン酸基（−ＳＯ₃ ^-）、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、カルボキシ基などが挙げられる。アニオンは、これらのアニオン性基を一種有してもよく、二種以上有してもよい。入手が容易である観点から、アニオン性基のうち、スルホン酸基および／またはカルボキシ基を有する色素を利用することが好ましい。また、アニオンにおけるアニオン性基の個数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。ポリシロキサン骨格に導入されたカチオンとの結合性を高める観点からは、２つ以上であることが好ましく、３つ以上であってもよい。

アニオンが共役系骨格に有する置換基としては、例えば、炭化水素基、ヒドロキシ基、アルカリ金属オキシ基（−ＯＮａなど）、オキソ基（＝Ｏ）、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）などが挙げられる。炭化水素基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基などが挙げられる。アニオンは、これらの置換基を一種有してもよく、二種以上有してもよい。アニオンにおける置換基の個数は特に制限されず、０個であってもよく、１個であっても、２個以上であってもよい。

骨格（ピレン系骨格）（Ｐ１）を有するアニオンとしては、（Ｐ１−１）で表される６，８−ジヒドロキシピレン−１，３−ジスルホン酸アニオン、ピラニンに対応する（Ｐ１−２）で表されるアニオン（８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸アニオン）などが例示される。骨格（Ｐ２）を有するアニオンとしては、フルオレセインに対応する（Ｐ２−１）で表されるアニオン、エオシンに対応する（Ｐ２−２）で表されるアニオンなどが例示される。骨格（Ｐ３）を有するアニオンとしては、ブロモフェノールブルーに対応する（Ｐ３−１）で表されるアニオン、フェノールスルホンレッドに対応する（Ｐ３−２）で表されるアニオンなどが例示される。

有機−無機複合薄膜は、アニオンを一種含んでもよく、二種以上含んでいてもよい。

カチオンは、ケイ素含有基を有していればよいが、このケイ素含有基のケイ素原子を介してポリシロキサン骨格に導入されている。ポリシロキサン骨格への導入が容易である観点から、ケイ素含有基は、加水分解縮合性基であるアルコキシシリル基に由来するものであることが好ましい。アルコキシシリル基を含むカチオン（またはカチオンと上記アニオンとの有機塩）のアルコキシシリル基が、加水分解反応と重縮合反応とを利用するゾルゲル反応によってポリシロキサン骨格に導入される。

有機−無機複合薄膜において、カチオンは、−Ｓｉ−Ｒ−基を有していればよく、−Ｓｉ−Ｒ−Ｎ⁺≡構造を有する窒素含有カチオンであることが好ましい。Ｒは、アルキレン基（アルキリデン基も含む）、−Ｒ¹−Ａ−基、−Ｒ¹−Ａ−Ｒ²−基であり、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれアルキレン基であり、Ａはアリーレン基である。−Ｒ¹−Ａ−基および−Ｒ¹−Ａ−Ｒ²−基においては、Ｒ¹がＳｉに結合し、ＡまたはＲ²がＮに結合している。

Ｒ、Ｒ¹およびＲ²のアルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、１，４−ブチレンなどのＣ_1-6アルキレン基（アルキリデン基も含む）が好ましく、プロピレン、トリメチレンなどのＣ_1-4アルキレン基であってもよい。Ａで表されるアリーレン基としては、フェニレン、ナフチレン、ビフェニレンなどのＣ_6-14アリーレン基が好ましい。窒素含有カチオンは、窒素含有複素環式カチオンであってもよく、アンモニウムカチオンであってもよい。

有機−無機複合薄膜において、カチオンは、−Ｓｉ−Ｒ−基を有するアルキルアンモニウムカチオンであることが好ましい。このようなカチオンは、下記式（Ｃ）で表される状態で有機−無機複合薄膜に含まれている。

（式中、Ｒ⁴、Ｒ⁵、およびＲ⁶は、それぞれアルキル基を示す。）

Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶で表されるアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシル、２−エチルヘキシル、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルなどのＣ_1-22アルキル基（好ましくはＣ_1-20アルキル基）が例示される。Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶は、全てまたは２つが同じであってもよく、全てが異なっていてもよい。アルキル基のうち、Ｃ_1-4アルキル基が好ましく、Ｒ⁴、Ｒ⁵、およびＲ⁶の全てがＣ_1-4アルキル基であってもよく、これらのうち２つがＣ_1-4アルキル基であり、残る１つが、Ｃ_6-22アルキル基（またはＣ_6-20アルキル基）であってもよい。

上記のカチオンは、有機−無機複合薄膜に導入される前は、−Ｓｉ−Ｒ基が、下記のトリアルコキシシリルアルキル基であるカチオンである。
（式中、Ｒ⁷、Ｒ⁸、およびＲ⁹は、それぞれアルキル基を示し、Ｒは前記に同じである。）

Ｒ⁷、Ｒ⁸、およびＲ⁹で表されるアルキル基としては、それぞれ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルなどのＣ_1-4アルキル基が挙げられる。なお、高い加水分解速度が得られ易い観点からは、メチル基やエチル基（中でもメチル基）が好ましい。

有機−無機複合薄膜に導入される前のカチオンの具体例としては、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムカチオン、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムカチオン、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムカチオン、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ−ドデシル−Ｎ−メチルアンモニウムカチオン、Ｎ−トリメトキシシリルベンジル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムカチオン、Ｎ−トリメトキシシリルエチルベンジル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムカチオンなどが挙げられる。

有機−無機複合薄膜中に含まれる有機塩の含有量は、例えば、０．００５〜２質量％であり、０．０１〜２質量％または０．０５〜０．５質量％であることが好ましい。有機塩の含有量がこのような範囲である場合、色素の高い感度が得られ易い。

有機−無機複合薄膜は、必要に応じて、公知の添加剤（例えば、充填剤、補強材、着色剤、顔料など）を含むことができる。有機−無機複合薄膜は、必要に応じて、コロイダルシリカを含んでもよい。有機−無機複合薄膜中のコロイダルシリカの含有量は、例えば、１０〜６０質量％であり、３０〜５０質量％または４０〜５０質量％であることが好ましい。

有機−無機複合薄膜の厚みは、用途に応じて適宜決定すればよく、例えば、０．１〜１０μｍであってもよい。ｐＨセンサに使用する場合には、例えば、１〜５μｍから適宜決定でき、１〜３μｍであることが好ましい。

（有機−無機複合薄膜の製造方法）
有機−無機複合薄膜は、アルコキシシリル基を含む上記のカチオンと、上記のアニオンとの有機塩を形成し（第１工程）、この有機塩を加水分解反応および重縮合反応（を利用するゾルゲル反応）によりポリシロキサン骨格に組み込み（第２工程）、得られる反応混合物を基材に塗布して加熱すること（第３工程）により製造できる。

（第１工程）
第１工程では、上記のカチオンとアニオンとを溶媒に溶解させることにより有機塩を含む溶液を調製する。カチオンおよびアニオンは、通常、別の塩の形態でそれぞれ準備される。これらの別の塩のカウンターイオンとしては、カチオンおよびアニオンが解離し易いものが適宜選択される。

溶媒としては、カチオンおよびアニオンを溶解して有機塩を形成できればよく、例えば、水を用いてもよく、メタノール、エタノールなどのアルコールなど、各種有機溶媒を使用してもよく、これらの混合溶媒を用いてもよい。

第１工程は、必要に応じて、加熱下または冷却下で行ってもよいが、室温（例えば、２０〜３０℃）で行うこともできる。第１工程は、大気雰囲気下で行うことができる。

（第２工程）
第２工程では、第１工程で得られるアルコキシシリル基を含む有機塩と、加水分解縮合性基を有するシラン化合物とを、加水分解反応および重縮合反応を利用するゾルゲル反応に供することにより、ポリシロキサン骨格を形成する。なお、第２工程には、公知のゾルゲル反応の条件が適宜採用できる。

加水分解縮合性基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ基などのアルコキシ基（好ましくはＣ_1-4アルコキシ基）が例示される。シラン化合物は、加水分解縮合性基を１つ有していればよく、２つ以上有していてもよい。

シラン化合物は、加水分解縮合性基以外の有機基を有していてもよい。このような有機基としては、アルキル基の他、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、ビニル基、アクリル基、メタクリル基などの官能基を有する炭化水素基（アルキル基、アリール基など）などが挙げられる。アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルなどのＣ_1-4アルキル基が好ましい。官能基を有するシラン化合物としては、シランカップリング剤として使用される材料が好ましい。

シラン化合物は、有機−無機複合薄膜の用途に応じて適宜選択できる。シラン化合物のうち、アルキルトリアルコキシシラン、シランカップリング剤（グリシドキシアルキルトリアルコキシシランなど）が好ましい。アルキルトリアルコキシシランとグリシドキシアルキルトリアルコキシシランなどのシランカップリング剤とを併用してもよい。この場合、シラン化合物に占めるアルキルトリアルコキシシランの比率を、例えば、３０〜９０モル％、好ましくは５０〜８０モル％または６０〜８０モル％とすると、有機−無機複合薄膜の耐久性をさらに高めることができる。

有機塩とシラン化合物とのモル比は、例えば、１：１００〜１：５０００の範囲で適宜決定でき、１：５００〜１：２０００または１：７５０〜１：１２５０であってもよい。モル比がこのような範囲である場合、色素の高い感度が得られ易く、また色素の溶出も抑制し易い。

第２工程は、有機塩基および／または酸の存在下で行われる。有機塩基としては、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物やアンモニアなどの無機有機塩基を用いてもよく、アミン、窒素含有複素環化合物（イミダゾール、１−メチルイミダゾール、イミダゾリンなど）などの有機塩基を用いてもよく、これらを併用してもよい。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸を用いてもよく、酢酸などの有機酸を用いてもよく、これらを併用してもよい。

第２工程は、通常、溶媒の存在下で行われる。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノールなどの有機溶媒、またはこれらの混合溶媒が使用される。第２工程は、溶媒中で、有機塩と、シラン化合物とを混合することにより行ってもよく、有機塩を含む溶液とシラン化合物を含む溶液とを混合することにより行ってもよい。複数のシラン化合物を用いる場合には、予め混合した後に、有機塩と混合してもよく、有機塩と、各シラン化合物とを混合してもよい。

第２工程は、大気中で行うことができる。第２工程は、加熱下または冷却下で行ってもよいが、室温（例えば、２０〜３０℃）で行うこともできる。
第２工程では、各成分を混合することにより、シリカを含む流動性のゾルが形成される。このゾルを用いて、続く第３工程において有機−無機複合薄膜を形成する。

（第３工程）
第３工程では、第２工程で得られた反応混合物（シリカゾル）を、基材の表面に塗布することで塗膜を形成し、加熱することにより、有機−無機複合薄膜を形成する。基材としては、ガラス、セラミックス、石英などの無機系の基材が好ましい。

加熱温度は、溶媒の種類に応じて適宜設定でき、例えば、１００〜２００℃であり、１００〜１５０℃であることが好ましい。加熱時間は、特に制限されないが、例えば、１〜２０時間であり、１〜１０時間であってもよい。

（ｐＨセンサ）
本発明の有機−無機複合薄膜は、有機−無機複合薄膜の光学特性（例えば、吸収（励起）特性および／または発光特性）と、ｐＨ応答性とを関連付けることで、ｐＨセンサとして利用できる。色素骨格は、有機塩の形態で有機−無機複合薄膜に導入されているため、有機−無機複合薄膜の吸収（励起）または発光スペクトルにおいて、色素に特徴的なピークのピーク強度が、ｐＨの変動に応じて変化する。そのため、このピーク強度と、有機−無機複合薄膜が浸漬される溶液のｐＨとを関連付けることで、ピーク強度を測定することによりｐＨを把握することができる。従って、ｐＨセンサとして有機−無機複合薄膜を利用する場合には、ｐＨ応答性の色素骨格が導入された有機−無機複合薄膜を利用すれば簡便である。

ｐＨの変動と関連付ける場合、有機−無機複合薄膜の光学スペクトルにおけるピーク強度の変動は、基準となるピークとのピーク強度比に基づいて評価すると、スペクトル測定の感度に左右されることなくｐＨを評価することができる。例えば、ｐＨが変動してもピーク強度が変化しない基準物質を既知濃度で有機−無機複合薄膜に添加しておき、この基準物質のピークのピーク強度と、有機−無機複合薄膜に含まれる色素のピーク強度とのピーク強度比と、ｐＨの変動との関係を予め調べ、この関係に基づいて、測定したピーク強度比からｐＨセンサが浸漬されている溶液のｐＨを求めることができる。また、蛍光励起スペクトルにおいて特徴的な発光のピークが少なくとも２つあるような色素骨格が導入された有機−無機複合薄膜を用いる場合には、一方の発光のピークを基準として、ピーク強度比を求め、このピーク強度比とｐＨ変動との関係を予め調べておき、この関係に基づいて、ｐＨを求めることができる。

以下、本発明を実施例および比較例に基づいて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

合成例１（トリメトキシシリル基を有する蛍光色素（ＭＳｉ−ＨＰＴＳ）の合成）
ピラニン（１）（９．８ｍｇ，９５．０μｍｏｌ）をメタノール（１．８ｍＬ）に溶かして超音波により十分拡散させた。得られたピラニン溶液に、撹拌下で、濃度６０質量％のオクタデシルジメチル（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド（２）のメタノール溶液を滴下することにより、均一な溶液を得た。このとき、化合物（２）の添加量は、２３９ｍｇ（２８９μｍｏｌ）であった。溶液から溶媒を減圧留去することで、粘性液体として、下記式で表されるＭＳｉ−ＨＰＴＳを定量的に得た。

得られたＭＳｉ−ＨＰＴＳの¹Ｈ−ＮＭＲの分析結果は以下の通りである。
¹H-NMR (CD₃OD, 400 MHz): δ 9.35 (s, 1H), 9.23 (d, 1H, J = 9.8 Hz), 9.13 (d, 1H, J = 9.6Hz), 9.06 (d, 1H, J = 9.8 Hz), 8.61 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 8.29 (s, 1H), 3.55 (s, 27H), 3.22-3.17 (m, 12H), 2.99 (s, 18 H), 2.61 (1 H), 1.77-1.73 (m, 6 H), 1.67-1.63 (m, 6 H), (m, 90 H), 0.90 (t, 9 H, J = 6 Hz), 0.58 (t, 6 H, J = 8 Hz).

実施例１（ＭＳｉ−ＨＰＴＳを含む有機−無機複合薄膜の作製）
（１）原料溶液の調製
ピラニン（１）（７．２ｍｇ，１３μｍｏｌ）、濃度６０質量％のオクタデシルジメチル（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド（２）のメタノール溶液、およびメタノール（０．２５ｍＬ）を混合することにより、ＭＳｉ−ＨＰＴＳ溶液を調製した。このとき、化合物（２）の添加量は、３３ｍｇ（３９μｍｏｌ）であった。また、（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）（１．６g，７ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール（ＭＩ）（０．４ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、水（０．５ｍＬ，２８ｍｍｏｌ）、およびエタノール（２．６ｍＬ，４５ｍｍｏｌ）)を混合することにより溶液Ａを調製した。エチルトリエトキシシラン（ＥＴＥＯＳ）（１．４ｇ，７．０ｍｍｏｌ）、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（０．５ｍＬ，塩酸０．０５０ｍｍｏｌ）、エタノール（２．６ｍＬ，４５ｍｍｏｌ）を混合することにより溶液Ｂを調製した。溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ調製から約３０分静置した。

（２）有機−無機複合薄膜の作製
ＭＳｉ−ＨＰＴＳ溶液に、溶液Ａおよび溶液Ｂを加えて、６日間攪拌することにより混合物を得た。
幅１ｃｍの短冊状にカットしたスライドガラスを、濃度３０質量％の硝酸水溶液に浸漬し、蒸留水およびエタノールで洗浄し、乾燥させた。スライドガラスの片面をマスキングした後、上記の混合物を３ｍｍ／ｓの速度でディップコートした。得られた被覆物を、１４０℃で４時間熱処理することにより、有機−無機複合薄膜を作製した。得られた有機−無機複合薄膜の厚みは、２μｍであり、透明であった。

（３）光学スペクトル測定
上記（２）で得られたＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜を、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝溶液中に浸漬し、励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。測定は、ｐＨがそれぞれ、３、４、５、６、７、８、および９であるリン酸緩衝溶液中で行った。

得られた有機−無機複合薄膜の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを図１および図２にそれぞれ示す。
図２の蛍光スペクトルでは、５０５ｎｍに１種類のピークが確認された。このピークは、ピラニンの蛍光スペクトルでも確認され、光有機プロトン移動に由来するものである。このことから、図２に示されるピークは、ピラニン骨格の光誘起プロトン移動に由来し、蛍光色素骨格の蛍光特性が有機−無機複合薄膜に導入された後も保存されていると示唆される。

図１の励起スペクトルでは、４０５ｎｍと４５５ｎｍの２つのピークが確認された。これらのピークは、それぞれ、ピラニンの励起スペクトルでも確認されることから、ピラニン骨格に由来するものと言える。また、４０５ｎｍのピークは、ｐＨが増加してもほとんど変化しないのに対し、４５５ｎｍのピークは、ｐＨの増加に応じて強度が増加している。なお、４０５ｎｍのピークは、ピラニン骨格の酸型の化学種に由来し、４５５ｎｍのピークはピラニン骨格のプロトン脱離体である有機塩基型の化学種に由来する。

このように、励起スペクトルにおいては、４０５ｎｍのピークはｐＨ変化に対して変化がなく、４５５ｎｍのピークはｐＨ変化に応じて強度が増加する一方、蛍光スペクトルでは、５０５ｎｍの波長のピーク強度がｐＨ変化に応じて増加する。そのため、４０５ｎｍの波長の励起光に由来する５０５ｎｍの発光波長のピーク強度を基準として利用し、この基準に対する４５５ｎｍの波長の励起光に由来する５０５ｎｍの発光波長のピーク強度の変化を調べれば、ｐＨを把握することができる。よって、有機−無機複合薄膜をｐＨセンサとして利用することができると考えられる。

各ｐＨについて、波長４０５ｎｍおよび４５５ｎｍの励起光のそれぞれに由来する５０５ｎｍの蛍光のピーク強度Ｉ_405nmおよびＩ_455nmを求め、Ｉ_455nmの、基準となるＩ_405nmに対する比（＝Ｉ_455nm／Ｉ_405nm）を算出した。図３に、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmとｐＨとの関係を示す。また、図３には、参照として、下記式で表されるＨＰＴＳ−ＩＰを用いて作製した有機−無機複合薄膜を用いた評価結果も合わせて示す。

なお、ＨＰＴＳ−ＩＰは、非特許文献１に記載された手順に従って合成し、有機−無機複合薄膜は、ＭＳｉ−ＨＰＴＳ溶液に代えて、合成したＨＰＴＳ−ＩＰ１３μｍｏｌを０．２５ｍＬのメタノールに溶解させた溶液を用いたこと以外は実施例１と同様にして作製した。

図３に示されるように、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた実施例１の有機−無機複合薄膜では、ｐＨ３〜９の範囲で、ｐＨの増加に伴って、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmが増加しており、ｐＨ応答性を有していると言える。ピーク強度Ｉ_405nmおよびＩ_455nmを測定し、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmを算出すれば、この強度比に基づいてｐＨを把握することができる。図３において、ｐＨ４〜８の範囲では、特に、ｐＨに対する強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの増加率が大きくなっており、感度が高くなっていると言える。ｐＨ７〜８の範囲では特に、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜は、参照色素であるＨＰＴＳ−ＩＰを用いた有機−無機複合薄膜に比べて、ｐＨに対する強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの増加率が大きくなっており、感度が高いことが分かる。また、算出したＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた実施例１の有機−無機複合薄膜のｐＫａ値は、６．３８であった。これは、生理学的に用いられるｐＨ領域に鋭敏に応答することを示しており、微生物培養容器用のｐＨセンサに応用できることが示唆された。

（４）ｐＨ応答性の評価
図４に示す評価装置を用いて、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜のｐＨ応答性を評価した。評価装置１は、溶液を収容する容器（セル）２と、セル２に緩衝溶液を導入する導入管３と、セル２内の溶液を排出する排出管４と、薄膜状のｐＨセンサ５と、ｐＨセンサ５に４０５ｎｍおよび４５５ｎｍの各励起光を照射するための発光ダイオード（ＬＥＤ）６ａ，６ｂと、ｐＨセンサ５からの発光を検出するための光電子倍増管（ＰＭＴ）７と、ＰＭＴからの検出値を評価するためのコンピュータ（ＰＣ）８とを備えている。また、セル２には、参照用にガラス電極を用いたｐＨメータ９も装着している。

セル２内に、導入管３からｐＨ６．８およびｐＨ８．０のリン酸緩衝溶液（濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ）を一定時間毎に交互に送液することで、セル２内の溶液のｐＨを６．８から８．０に変化させ、次いで８．０から再度６．８に変化させた。このとき、セル２内の溶液の温度は、３８℃に制御するとともに、必要に応じて、排出管４よりセル２内の溶液を排出させた。このとき、セル２内の溶液のｐＨは、ガラス電極を用いたｐＨメータ９でモニタした。また、ｐＨセンサ５としてセル２内の壁面にスライドガラス側を貼り付けた有機−無機複合薄膜に、ＬＥＤ６ａ，６ｂからそれぞれ波長４０５ｎｍおよび４５５ｎｍの励起光を照射し、ｐＨセンサ５からの発光をＰＭＴ７およびＰＣ８により解析して、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化をプロットした。また、上記の６．８から８．０および８．０から６．８へのｐＨ変化を１サイクルとして、３サイクル繰り返した際についても、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化を調べた。

図５は、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化を示すグラフ（実線）である。図５には、ガラス電極を用いたｐＨセンサ９によるｐＨの経時変化（点線）も合わせて示す。図６は、溶液のｐＨ変化を３サイクル繰り返した際のＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜における強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示すグラフである。図５から、薄膜状のｐＨセンサ（有機−無機複合薄膜）５による強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化は、従来のｐＨセンサ９のｐＨの経時変化とほぼ同じ挙動を示しており、ほぼ同等のｐＨ応答性を示すことが分かった。また、図６に示されるように、薄膜状のｐＨセンサ（有機−無機複合薄膜）５は、２サイクルおよび３サイクル目も１サイクル目とほぼ同じ強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示しており、ベースラインもほぼ同じである。このことから、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜がｐＨセンサとして良好な再現性を有することが分かる。

（５）温水中における耐久性（ｐＨ応答性の変化）の評価
図４の評価装置の装置を用いて、セル２内にｐＨ６．８のリン酸緩衝溶液（濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ）を入れて、攪拌しながら、ＬＥＤ６ａ、６ｂにより、４０５ｎｍおよび４５５ｎｍの励起光を１週間パルス照射した。このとき、セル２内の溶液の温度は３８℃に維持した。また、１〜４日目および７日目について、１日１回に、ｐＨ６．８からｐＨ８．０、ｐＨ８．０からｐＨ６．８へとセル２内の溶液のｐＨを変化させて強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmを求め、ｐＨ６．８における強度比とｐＨ８．０における強度比との差（ΔＩ_455nm／Ｉ_405nm）を算出した。この強度比の差は、ｐＨ応答性の感度を示す。図７に、ΔＩ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示す。図７には参照として、上記（３）で作製したＨＰＴＳ−ＩＰを用いた有機−無機複合薄膜を用いた評価結果も合わせて示す。

図７から、ＨＰＴＳ−ＩＰを用いた有機−無機複合薄膜では、１日目から薄膜の表面に凹凸が生じ、７日経過後にはスライドガラスから剥離していた。また、４日目までΔＩ_455nm／Ｉ_405nmが徐々に増加した。それに対し、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜は、７日経過後も初日と同様にｐＨ応答性の高い感度を維持しており、温水（温かい緩衝溶液）中、励起光をパルス照射した場合でも性能が維持されていることが分かる。また、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜の状態を目視で観察したところ、２日目から薄膜の表面には小さな凹凸が生じたものの、７日経過後も薄膜はスライドガラスに付着しており、剥離は全く見られなかった。

（６）温水中における耐久性（色素の溶出）の評価
ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜を、蒸留水に３０分間浸漬して洗浄し、十分に乾燥させた。洗浄および乾燥した有機−無機複合薄膜と、蒸留水５ｍＬとを、サンプル管に入れ、サンプル管を３８℃に維持した水浴に１４日間浸漬させた。このとき、１日毎に、温水の吸収スペクトルを測定し、４０５ｎｍにおける吸光度λ₁を求めた。一方、ピラニンの濃度既知の水溶液の吸収スペクトルを測定して、４０５ｎｍにおける吸光度λ₀を求めた。λ₁およびλ₀から、上記の温水に含まれる色素の量を算出した。温水中に溶出した色素の量は、１日目には０．０１ｎｍｏｌ未満であり、２日目には０．１ｎｍｏｌ未満、３日以降は、０．２ｎｍｏｌ未満と、少なく、有機−無機複合薄膜からの色素の溶出は抑制されていると言える。

（７）γ線照射に対する耐久性の評価
スライドガラスに代えて石英基板を用いたこと以外は、上記（２）と同様にしてＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜を形成した。有機−無機複合薄膜を石英基板毎、⁶⁰Ｃｏによるγ線（２０ｋＧｙ）に暴露させた。γ線への暴露前および暴露後の有機−無機複合薄膜について、ｐＨ６．８から８．０、８．０から６．８に変化させた場合のｐＨ応答性を、上記（４）と同様にして測定し、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化を調べた。結果を図８に示す。また、このときのガラス電極を用いたｐＨセンサ９によるｐＨの経時変化も合わせて図８に示す。さらに、上記の６．８から８．０および８．０から６．８へのｐＨ変化を１サイクルとして、３サイクル繰り返した際の強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化を図９に示す。

図８から、γ線への暴露前に比べて、暴露後は、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜の強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmは約０．１低下したものの、ｐＨセンサ９のｐＨ変化とほぼ同等の経時変化が示された。このことから、γ線暴露後も、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜は、ｐＨ応答性を有していることが分かる。また、図９に示されるように、γ線暴露後においても、２サイクルおよび３サイクル目も１サイクル目とほぼ同じ経時変化が得られていることから、ｐＨセンサとしての再現性も確認された。

実施例２
（１）において、ＧＰＴＭＳの量を、４．２ｍｍｏｌに変更し、ＥＴＥＯＳの量を、９．８ｍｍｏｌに変更したこと以外は、実施例１と同様にして、それぞれ、溶液Ａおよび溶液Ｂを調製し、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜を作製した。得られた有機−無機複合薄膜を、実施例１の（５）と同様にして、３８℃のリン酸緩衝溶液に浸漬し、励起光を１週間パルス照射した。このとき、ＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜は、３日目から表面に小さな凹凸が生じたものの、スライドガラスからの剥離は見られず、実施例１に比べて耐久性が向上していた。

実施例３
実施例１の（２）において、混合物に、コロイダルシリカ（平均粒径：７５ｎｍ）を４３質量％添加したこと以外は、実施例１と同様にしてＭＳｉ−ＨＰＴＳを用いた有機−無機複合薄膜を作製した。得られた有機−無機複合薄膜は乳白色であった。また、有機−無機複合薄膜を用いて、強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmおよびｐＨの経時変化を実施例と同様にして確認したところ、従来のｐＨセンサ９のｐＨの経時変化に匹敵する挙動を示していることが確認された。また、薄膜状のｐＨセンサ（有機−無機複合薄膜）は、２サイクルおよび３サイクル目も１サイクル目とほぼ同じ強度比Ｉ_455nm／Ｉ_405nmの経時変化を示しており、ｐＨセンサとして良好な再現性を有することが確認された。

合成例および実施例では、ピラニンを導入した有機−無機複合薄膜を用いた例を示したが、ピラニン以外の他の色素を用いる場合でもピラニンの場合と同様に有機−無機複合薄膜を作製することができる。ＭＳｉ−ＨＰＴＳでは、ピラニン骨格がシリカ骨格内に組み込まれていることで、温水やγ線に対する耐久性が得られているため、他の色素を用いた場合でも、同様に高い耐久性が得られることが示唆される。また、ＭＳｉ−ＨＰＴＳは、ピラニンに由来する光学特性を示すことから、有機−無機複合薄膜は、導入した色素に応じた光学特性を示すことが示唆される。よって、導入した色素に応じたｐＨ特性が得られると考えられる。

本発明に係る有機−無機複合薄膜によれば、培養液などの温かい溶液中に長時間浸漬したり、この状態で光線を照射したりしても、色素の溶出が抑制される。また、γ線などの放射線に対する耐久性が高く、滅菌処理に対する耐久性が高い。よって、培養容器中で使用されるｐＨセンサとして有用である。特に、薄膜状であるため、小型の培養容器にも用いることができる。

１：ｐＨ応答性の評価装置、２：セル、３：導入管、４：排出管、５：薄膜状のｐＨセンサ、６ａ，６ｂ：ＬＥＤ、７：ＰＭＴ、８：ＰＣ、９：ガラス電極を用いたｐＨセンサ

Claims

ポリシロキサン骨格と、前記ポリシロキサン骨格に組み込まれた有機塩と、を含む有機−無機複合薄膜であって、
前記有機塩は、色素骨格を有するアニオンと、ケイ素含有基を有するカチオンとで構成され、前記カチオンは、前記ケイ素含有基に含まれるケイ素原子を介して前記アニオンとともに前記ポリシロキサン骨格内に分散して組み込まれている、有機−無機複合薄膜
前記色素骨格は、下記式（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）：
で表される骨格を含む、請求項１に記載の有機−無機複合薄膜。
前記アニオンは、下記式（Ｐ１−１）、（Ｐ１−２）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２−２）、（Ｐ３−１）、および（Ｐ３−２）：
からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の有機−無機複合薄膜。
前記カチオンは、−Ｓｉ−Ｒ−基（式中、Ｒはアルキレン基、−Ｒ¹−Ａ−基、または−Ｒ¹−Ａ−Ｒ²−基であり、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれアルキレン基であり、Ａはアリーレン基である）を有するアルキルアンモニウムカチオンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の有機−無機複合薄膜。
前記色素骨格は、下記式（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）：
で表される骨格を含み、
前記カチオンは、−Ｓｉ−Ｒ−基（式中、Ｒはアルキレン基、−Ｒ¹−Ａ−基、または−Ｒ¹−Ａ−Ｒ²−基であり、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれアルキレン基であり、Ａはアリーレン基である）を有するアルキルアンモニウムカチオンであり、
前記有機塩の含有量は、０．０１〜２質量％である、請求項１に記載の有機−無機複合薄膜。
前記アニオンは、前記有機−無機複合薄膜の吸収、励起または発光スペクトルにおいて、前記色素骨格に特徴的なピークの強度がｐＨの変動に応じて変化するｐＨ応答性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の有機−無機複合薄膜。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の有機−無機複合薄膜で構成された、ｐＨセンサ。
アルコキシシリル基を含むカチオンと色素骨格を有するアニオンとの有機塩を形成する第１工程と、
前記有機塩と、加水分解縮合性基を有するシラン化合物とを、加水分解反応および重縮合反応させて、ポリシロキサン骨格を形成するとともに、前記有機塩を前記ポリシロキサン骨格内に分散した状態で組み込む第２工程と、
前記第２工程で得られる反応混合物を基材に塗布して加熱する第３工程と、を含む、有機−無機複合薄膜の製造方法。