JP6816409B2

JP6816409B2 - Ｍａｌｄｉ質量分析装置

Info

Publication number: JP6816409B2
Application number: JP2016168163A
Authority: JP
Inventors: 慶小寺; 秀治志知
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2021-01-20
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: JP2018036100A

Description

本発明は、マトリックスと混合した試料にレーザ光を照射し、それによって試料を気化またはイオン化するマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ：Matrix Assisted Laser Desorption Ionization）質量分析装置に関する。

ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法）は、「マトリックス」と呼ばれるＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）やＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）等のイオン化補助剤を含む溶媒と、微量の分析対象物質（タンパク質等）とを混合した試料にレーザ光を照射し、照射されたレーザ光の熱を吸収して発熱したマトリックスの一部分が急速に加熱されて気化するのに伴って分析対象物質を気化またはイオン化する方法である。
このようなＭＡＬＤＩイオン源を備えた質量分析装置で分析を行う際には、例えばサンプルプレートの上面に試料をスポット状に滴下し、乾燥により溶媒を蒸発させた後に真空チャンバ内へ載置する。そして、真空チャンバ内を真空引きするべく真空ポンプの運転を開始することにより分析が開始される。通常、サンプルプレートの上面には複数の試料がＭ行Ｎ列に並ぶように配置されており、サンプルプレートを動かしてレーザ光の照射位置に各試料の配置箇所を移動させることにより、各試料が次々とイオン化される。
ＭＡＬＤＩイオン源を備えた質量分析装置としては、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳが知られており、発生させたイオンを所定の強さの電場によって引き出し、飛行空間内に導入することで質量分析を行う。飛行空間内を飛行する各イオンの速度はその質量電荷比に依存し、質量電荷比が小さいほど大きな速度を有するため、検出器に到達するまでの飛行時間に応じて、各種イオンを質量電荷比ごとに分離して検出する。

図４および図５は、従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの構成例を示す図である。なお、地面に水平な一方向をＸ方向とし、地面に水平でＸ方向と垂直な方向をＹ方向とし、Ｘ方向とＹ方向とに垂直な方向（鉛直方向）をＺ方向とする。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２０１は、質量分析部１０と、サンプルプレート２０と、サンプルプレート２０を載置する試料ステージ３１と、試料ステージ３１を移動させるステージ駆動部３２と、観察用の可視光をサンプルプレート２０上面に照射する可視光源部（光源部）２４０と、サンプルプレート２０上面の画像を取得する画像取得装置（画像取得部）２５０と、試料に対しイオン化用のレーザ光を出射するレーザ照射部５と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２０１全体の制御を行うコンピュータ２６０とを備える。

質量分析部１０は、電場の影響を受けずにイオンが自由に飛行する自由飛行空間１２とイオン輸送光学系と質量分析器とイオン検出器１１とからなり、イオン輸送光学系としては、例えば静電的な電磁レンズや多極型の高周波イオンガイド等が用いられ、また、質量分析器としては、四重極型分析器、イオントラップ、飛行時間型分析器、磁場セクタ型分析器等が用いられる。
また、後述するサンプルプレート２０と質量分析部１０との間には、拡散するイオンを遮蔽するアパーチャ３と、イオンを質量分析部１０まで輸送するためのイオン輸送光学系としてのアインツェルレンズ２が配設されている。もちろん、アインツェルレンズ２以外の各種の構成のイオン輸送光学系を用いてもよい。
このような質量分析部１０によれば、レーザ照射によって試料から放出されたイオンは、アパーチャ３やアインツェルレンズ２を通過して、イオン輸送光学系を経て質量分析器に送られ、質量分析器で質量電荷比に応じて各種イオンが分離される。そして、分離されたイオンがイオン検出器１１に到達すると、イオン検出器１１は到達したイオン量に応じたサンプル信号をコンピュータ２６０に出力する。

サンプルプレート２０は、導電性を有する金属製の板状体（例えば８ｃｍ×３ｃｍ×０．２ｃｍ）からなり、この板状体の上面に、例えば直径３〜５ｍｍ程度の円形状のウェルがＭ行Ｎ列に並んで形成されており、そのウェル内に試料溶液が滴下されて乾化されることで試料が配置されるようになっている。

そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２０１は、このようなサンプルプレート２０が載置される試料ステージ３１と、モータ等からなるステージ駆動部３２とを備える。これにより、コンピュータ２６０は、後述するステージ制御部６１ａからステージ駆動部３２に必要な駆動信号を出力することにより、所望のＸ方向とＹ方向とに試料ステージ３１を移動させることで、載置されたサンプルプレート２０を所望の方向（Ｘ、Ｙ方向）に移動させる。

可視光源部２４０は、観察用の可視光を出射するハロゲンランプ２４１と、反射鏡４２とを備える。そして、ハロゲンランプ２４１から出射された可視光は、反射鏡４２で反射した後、サンプルプレート２０上面中の所定の範囲に照射されるようになっている。
なお、「所定の範囲」とは、設計者等によって予め決められた任意の範囲であり、例えばウェルの一部が欠けることのないように定められた領域となっている。

画像取得装置２５０は、可視光画像（光学画像）を取得する可視光カメラ２５１と、反射鏡５２とを備える。そして、サンプルプレート２０上面で反射した可視光が反射鏡５２で反射後に可視光カメラ２５１で検出されることにより、サンプルプレート２０上面中の所定の範囲の画像となる可視光画像が取得される。

レーザ照射部５は、反射鏡７と窒素レーザ６とを備える。このようなレーザ照射部５によれば、窒素レーザ６から出射された３３７ｎｍのレーザ光（紫外光）は、反射鏡７を介してサンプルプレート２０の試料に向けて出射される。この際、試料上へ照射されるレーザ光の照射径は、例えば１μｍ〜数十μｍという微小径である。

コンピュータ２６０は、ＣＰＵ２６１と入力部６２と表示部６３とを備える。また、ＣＰＵ２６１が処理する機能をブロック化して説明すると、入力部６２からの入力信号に基づいてステージ駆動部３２を制御するステージ制御部６１ａと、可視光源部２４０を制御するとともに画像取得装置２５０で取得された可視光画像を取り込んで表示部６３に表示する表示制御部２６１ｂと、窒素レーザ６を制御するとともにイオン検出器１１からのサンプル信号をデジタル化して適宜のデータ処理を実行する分析制御部６１ｃとを有する。

ところで、上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２０１では、円形状のウェル内に試料溶液が滴下されて乾化されるが、試料が必ずしもウェルの中心に配置されるとは限らず、ウェルの中心からずれた位置に配置されることがある。また、マトリックスと分析対象物質との混合試料が乾燥されることにより結晶が得られるが、不均一な大きい結晶が生成されたり、分析対象物質の分布は必ずしも均一ではなく、ウェルの中心に試料が配置されていても、試料中の最適測定部位（以下、「スイートスポット」という）は、ウェルの中心とは限らない。
そのため、ＭＡＬＤＩ質量分析装置２０１により分析を行う際には、オペレータは、表示部６３に表示された可視光画像を観察しながら入力部６２を用いて試料ステージ３１を移動させて、イオン化に適したと思われる位置を探してレーザ光の照射範囲内に存在するように位置合わせを行っている。あるいは、レーザ光を照射して測定データを確認して、スイートスポットを探すこともある。
また、輝度閾値とマススペクトルデータとを利用して、撮影画像から試料中の分析対象物質が存在する領域を識別するＭＡＬＤＩ質量分析装置も開示されている（例えば特許文献１参照）。なお、特許文献１では、撮影画像を取得する際の光源は不明であり、当然、観察用の光の種類（波長域）や照射角度については記載されていない。

特開２０１４−２１２０６８号公報

しかしながら、ＭＡＬＤＩイオン源を備えた従来の質量分析装置では、オペレータは、可視光を照射することで得られた可視光画像を見てレーザ光の照射位置を決めていたが、マトリックスの状態がイオン化に好ましいと思われる特徴的な位置と、サンプル信号が強く出力されるスイートスポットとが必ずしも一致しないという問題点があった。
また、測定データやマススペクトルデータを利用してイオン化に適した照射位置を決定する方法もあるが、レーザ光の照射位置を決めるために、測定データやマススペクトルデータをくりかえし取得することは非常に手間であった。

出願人は、ＭＡＬＤＩイオン源において、サンプルプレート２０上面に配置された試料スポットのうち、イオン化効率のよいレーザ光の照射位置を探すための方法について検討した。
ＭＡＬＤＩでイオン化用の光源として、窒素レーザや固体レーザが広く用いられている。窒素レーザから出射されるレーザ光は、３３７ｎｍの波長を有しており、固体レーザは、３５５ｎｍの波長を有している。そして、レーザ光によりイオン化されるには、マトリックスがレーザ光のエネルギを吸収する必要があるため、レーザ光の波長と同じ、波長付近に光の吸収帯（特定の波長域）を持つ物質がマトリックスとして試料と混合されている。そこで、光学画像を取得する際に、イオン化用のレーザ光の波長、あるいは、マトリックスの吸収波長域に近い光を照射して取得された光学画像を観察することで、観察されるマトリックス（結晶）の分布状態と、イオン化効率のよい領域とに相関があることに思い至った。

すなわち、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析装置は、特定の波長域の光を吸収するマトリックスを含有した試料が配置されるサンプルプレートを搭載するステージと、前記試料に微小径で前記特定の波長域のレーザ光を照射するためのレーザ照射部と、前記レーザ光が照射された前記試料から放出された気化試料またはイオンを質量分析する質量分析部と、前記レーザ照射部とは独立に設けられ、前記サンプルプレートに前記微小径よりも広い領域の観察用の光を照射する光源部と、前記観察用の光が照射されたときの前記サンプルプレートからの光を検出して光学画像を作成する画像取得部とを備えるＭＡＬＤＩ質量分析装置であって、前記光源部から照射される光の波長域は、前記特定の波長域と重複するようにしている。

本発明のＭＡＬＤＩ質量分析装置によれば、試料に照射する観察用の光の波長域が、マトリックスの吸収波長域（特定の波長域）と重複することによってマトリックスが観察用の光を吸収あるいは反射するので、マトリックス（結晶）の分布を正確に観察し、ＭＡＬＤＩによるイオン化に適した位置を判別することができる。なお、観察用の光の波長域は、マトリックスの吸収波長域と正確に一致することが好ましいが、観察用の光の波長域の一部とマトリックスの吸収波長域の一部とが重複していれば、本発明で観察されるマトリックスの分布状態とイオン化効率とには相関が得られるため、本発明の効果を得ることができる。

（他の課題を解決するための手段および効果）
また、上記発明において、前記特定の波長域は、紫外領域または赤外領域であるようにしてもよい。
また、上記発明において、前記光源部は、鉛直方向に対して所定角度（具体的には４５度）以下となる方向から紫外光または赤外光を出射し、前記画像取得部は、前記サンプルプレートの上面で反射した紫外光または赤外光を検出して光学画像を作成する紫外光カメラまたは赤外光カメラであるようにしてもよい。

ここで、「所定角度以下」とは、設計者等によって予め決められた任意の角度であり、サンプルプレートの上面で反射した紫外光や赤外光が画像取得部に入射するようにした深い角度である。
本発明のマトリックス観察装置によれば、照射された照射光は、マトリックスが分布する箇所では吸収されるため、光学画像中において黒い影として観察される。

また、上記発明において、前記光源部は、鉛直方向に対して所定角度（具体的には４５度）以上となる方向から紫外光または赤外光を出射し、前記画像取得部は、前記サンプルプレートの上面に配置された試料から放射された可視光を検出して光学画像を作成する可視光カメラであるようにしてもよい。
ここで、「所定角度以上」とは、設計者等によって予め決められた任意の角度であり、サンプルプレートの上面に配置された試料から放射された可視光が画像取得部に入射するようにした浅い角度である。
本発明のマトリックス観察装置によれば、マトリックスに吸収された紫外光や赤外光が可視光として放射されることにより、光学画像中のマトリックスの分布箇所が明るくなる。

そして、上記発明において、前記マトリックスは、ＤＨＢまたはＣＨＣＡであるようにしてもよい。
特にＤＨＢは、結晶が均一には生じないので、本発明のマトリックス観察装置が特に有効である。
さらに、上記発明において、前記サンプルプレートの上面には、複数の試料が配置されているようにしてもよい。

本発明の第一実施形態を示す構成図。本発明の第一実施形態を示す構成図。本発明の第二実施形態を示す構成図。従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの一例を示す構成図。従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの一例を示す構成図。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれる。

＜第一実施形態＞
図１および図２は、本発明の第一実施形態に係るＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す構成図である。なお、上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２０１と同様のものについては、同じ符号を付すことにより説明を省略する。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１は、質量分析部１０と、サンプルプレート２０と、サンプルプレート２０を載置する試料ステージ３１と、試料ステージ３１を移動させるステージ駆動部３２と、観察用の紫外光をサンプルプレート２０上面に照射する紫外光源部（光源部）４０と、サンプルプレート２０上面の画像を取得する画像取得装置（画像取得部）５０と、試料に対しイオン化用のレーザ光を出射するレーザ照射部５と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１全体の制御を行うコンピュータ６０とを備える。

紫外光源部４０は、観察用の紫外光を出射する紫外光ＬＥＤ４１と、反射鏡４２とを備える。そして、紫外光ＬＥＤ４１から出射された紫外光は、反射鏡４２で反射した後、Ｚ方向（鉛直方向）に対して設定角度αとなる方向からサンプルプレート２０上面中の所定の範囲に照射されるようになっている。
上記あるいは、観察用の紫外光源部４０の波長域としては、窒素レーザの波長３３７ｎｍあるいは固体レーザの波長３５５ｎｍｍを含む波長域であることが好ましい。あるいは、上記紫外光の中心波長が、レーザ照射部から出射されるレーザ光の中心波長と近いことが好ましく、レーザ照射部から出射されるレーザ光の中心波長の±２０ｎｍ以内であることがより好ましい。また、上記設定角度αは、４５°以下（所定角度以下）であることが好ましい。

画像取得装置５０は、紫外光画像（光学画像）を取得する紫外光カメラ５１と、反射鏡５２とを備える。そして、サンプルプレート２０上面で４５°となる方向に反射した紫外光が反射鏡５２で反射後に紫外光カメラ５１で検出されることにより、サンプルプレート２０上面中の所定の範囲の画像となる紫外光画像が取得される。

コンピュータ６０は、ＣＰＵ６１と入力部６２と表示部６３とを備える。また、ＣＰＵ６１が処理する機能をブロック化して説明すると、入力部６２からの入力信号に基づいてステージ駆動部３２を制御するステージ制御部６１ａと、紫外光源部４０を制御するとともに画像取得装置５０で取得された紫外光画像を取り込んで表示部６３に表示する表示制御部６１ｂと、窒素レーザ６を制御するとともにイオン検出器１１からのサンプル信号をデジタル化して適宜のデータ処理を実行する分析制御部６１ｃとを有する。

このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１によれば、オペレータは、サンプルプレート２０上面のウェル内に、ＤＨＢやＣＨＣＡ等と分析対象物質とを混合した試料溶液を滴下して乾化することで試料を配置する。そして、サンプルプレート２０を試料ステージ３１に載置した後、分析開始前に紫外光画像を観察しながら入力部６２を用いて試料ステージ３１を移動させて、イオン化に適したと思われる位置を探してレーザ光の照射範囲内に存在するようにサンプルプレート２０上面上での試料の位置合わせを行うことになるが、マトリックスが分布する箇所では紫外光は吸収されて紫外光画像中で黒い影として観察されるので、マトリックス（結晶）の分布を正確に観察することができる。

＜第二実施形態＞
図３は、本発明の第二実施形態に係るＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す構成図である。なお、上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１、２０１と同様のものについては、同じ符号を付すことにより説明を省略する。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１０１は、質量分析部１０と、サンプルプレート２０と、サンプルプレート２０を載置する試料ステージ３１と、試料ステージ３１を移動させるステージ駆動部３２と、観察用の紫外光をサンプルプレート２０上面に照射する紫外光源部（光源部）１４０と、サンプルプレート２０上面の画像を取得する画像取得装置（画像取得部）２５０と、試料に対しイオン化用のレーザ光を出射するレーザ照射部５と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１０１全体の制御を行うコンピュータ１６０とを備える。

紫外光源部１４０は、観察用の紫外光を出射する紫外光ＬＥＤ１４１を備える。そして、紫外光ＬＥＤ１４１から出射された紫外光は、Ｚ方向（鉛直方向）に対して設定角度βとなる方向からサンプルプレート２０上面中の所定の範囲に照射されるようになっている。
なお、紫外光源部１４０から出射される紫外光の波長域としては、窒素レーザの波長３３７ｎｍあるいは固体レーザの波長３５５ｎｍｍを含む波長域であることが好ましい。さらに、上記紫外光の中心波長は、レーザ照射部から出射される光の中心波長と近いことが好ましく、レーザ照射部から出射される光の中心波長の±２０ｎｍ以内であることがより好ましい。また、上記設定角度βは、４５°以上（所定角度以上）であることが好ましい。

コンピュータ１６０は、ＣＰＵ１６１と入力部６２と表示部６３とを備える。また、ＣＰＵ１６１が処理する機能をブロック化して説明すると、入力部６２からの入力信号に基づいてステージ駆動部３２を制御するステージ制御部６１ａと、紫外光源部１４０を制御するとともに画像取得装置２５０で取得された可視光画像を取り込んで表示部６３に表示する表示制御部１６１ｂと、窒素レーザ６を制御するとともにイオン検出器１１からのサンプル信号をデジタル化して適宜のデータ処理を実行する分析制御部６１ｃとを有する。

このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１０１によれば、オペレータは、サンプルプレート２０上面のウェル内に、ＤＨＢやＣＨＣＡ等と分析対象物質とを混合した試料溶液を滴下して乾化することで試料を配置する。そして、サンプルプレート２０を試料ステージ３１に載置した後、分析開始前に可視光画像を観察しながら入力部６２を用いて試料ステージ３１を移動させて、イオン化に適したと思われる位置を探してレーザ光の照射範囲内に存在するようにサンプルプレート２０上面上での試料の位置合わせを行うことになるが、マトリックスに吸収された紫外光が可視光として放射されることにより、可視光画像中におけるマトリックスの分布箇所が明るく見えるので、マトリックス（結晶）の分布を正確に観察することができる。

＜他の実施形態＞
（１）上述した実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１、１０１を例に説明したが、本発明は、イオン化効率のよいレーザ光の照射位置を探すことができる装置であり、ＭＡＬＤＩイオン源を備える分析装置全般にも適用することができる。また、真空ＭＡＬＤＩ、大気圧ＭＡＬＤＩのどちらにも適用することができる。
（２）上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１、１０１では、窒素レーザ６を有するレーザ照射部５と紫外光源部４０、１４０とを備える構成を示したが、イオン化用の赤外光を出射するＩＲ（赤外）レーザを有するレーザ照射部と、観察用の赤外光を出射する赤外光源部とを備える構成としてもよい。
このときには、赤外領域に吸収帯を持つ物質のマトリックスと分析対象物質とを混合した試料溶液を滴下して乾化することで試料を配置することになる。例えば、尿素、ＤＨＢ、コハク酸、シナピン酸等をマトリックスとして利用した場合に、照射位置によりイオン化の状態が異なるため、特に本発明が有効である。

本発明は、ＭＡＬＤＩ質量分析装置等に好適に利用することができる。

１ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＭＡＬＤＩ質量分析装置）
２０サンプルプレート
３１試料ステージ
４０紫外光源部（光源部）
５０画像取得装置（画像取得部）

Claims

特定の波長域の光を吸収するマトリックスを含有した試料が配置されるサンプルプレートを搭載するステージと、
前記試料に微小径で前記特定の波長域のレーザ光を照射するためのレーザ照射部と、
前記レーザ光が照射された前記試料から放出された気化試料またはイオンを質量分析する質量分析部と、
前記レーザ照射部とは独立に設けられ、前記サンプルプレートに前記微小径よりも広い領域の観察用の光を照射する光源部と、
前記観察用の光が照射されたときの前記サンプルプレートからの光を検出して光学画像を作成する画像取得部とを備えるＭＡＬＤＩ質量分析装置であって、
前記光源部から照射される光の波長域は、前記特定の波長域と重複することを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析装置。
前記特定の波長域は、紫外領域または赤外領域であることを特徴とする請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
前記光源部は、鉛直方向に対して４５度以下となる方向から紫外光または赤外光を出射し、
前記画像取得部は、前記サンプルプレートの上面で反射した紫外光または赤外光を検出して光学画像を作成する紫外光カメラまたは赤外光カメラであることを特徴とする請求項２に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
前記光源部は、鉛直方向に対して４５度以上となる方向から紫外光または赤外光を出射し、
前記画像取得部は、前記サンプルプレートの上面に配置された試料から放射された可視光を検出して光学画像を作成する可視光カメラであることを特徴とする請求項２に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
前記マトリックスは、ＤＨＢまたはＣＨＣＡであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
前記サンプルプレートの上面には、複数の試料が配置されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。