JP6795670B1 - テトラペプチド化合物及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】新規テトラペプチド化合物の提供とその機能、活性の利用。【解決手段】植物発酵液から新規で有用な新規ピログルタミルテトラペプチド化合物を単離した。この化合物は、関節炎の症状を緩和することができるため、飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態での利用が期待される。【選択図】図１

Description

本発明は、分子量４８６のピログルタミルテトラペプチド、およびそのペプチドの機能、活性に基づく発明に関する。

生体は、細菌、ウィルス等の感染、腫瘍、細胞傷害などに対して、免疫反応によって対応する。免疫反応は免疫細胞間で放出されるインターロイキン（以下、ＩＬと略す）やＴＮＦαといったサイトカインが担っている。
現在、ＩＬに属するサイトカインは３０種類以上が知られているが、その一つであるＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインと言われており、炎症性サイトカインの作用を抑制し、過剰な免疫反応を鎮静化する機能を有する。詳細について以下に示す（特許文献1より引用）。

（１）単球／マクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦα産生を抑制する。
（２）単球／マクロファージからのＩＬ−１レセプターアンタゴニストの産生を増強する。
（３）単球／マクロファージのシクロオキシゲナーゼ２（以下、ＣＯＸ２と略す）産生を抑制する。ＣＯＸ２は痛みの元となるプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２と略す）の産生に関与する酵素であることから、痛みを軽減する作用を有する。
（４）マクロファージのＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子、ＣＤ８６分子の発現を抑制する。
（５）Ｔ細胞の増殖を抑制する。
（６）Ｔ細胞からのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５産生を抑制する。
（７）ＩＬ−１０産生調節性Ｔ細胞を誘導する。
（８）好酸球、好中球、マスト細胞からのＩＬ−１、ＩＬ−８、ＴＮＦα産生を抑制する。
（９）ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強する。

細胞性免疫反応の後、液性免疫反応が起こる。生物には生体内に侵入した細菌やウィルス、花粉、特定のタンパクなどの抗原を体外へ排出するための機能として、抗原抗体反応が備わっている。生体内に侵入した抗原を感知したマクロファージ等の抗原提示細胞が提示した抗原に対し、Ｂ細胞がＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡといった抗体を生成する。抗体は抗原と結合し、抗原を弱毒化させ、生体外へ便として排出したりなどして生体を守る。ＩＬ−１０は抗原提示細胞の抗原提示能を弱めて、過剰な免疫反応による疾患、具体的にはＩｇＧ抗体が関与するリウマチ様関節炎、ＩｇＥ抗体が関与するアレルギー性鼻炎又はアトピー性皮膚炎などを予防したり、改善したりする（非特許文献１）。更に、ＩＬ−１０は抗体産生細胞であるＢ細胞を成熟させ、抗体産生を促進する作用を有する（非特許文献２）。即ち、ＩｇＡ等の抗体産生を促進することから、生体防衛能を高める効果がある。
以上のことから、生体内のＩＬ−１０産生促進効果によって、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、慢性リウマチ、アレルギー、乾癬、アトピー性皮膚炎、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍、慢性腸炎など、多くの疾患の予防、治療に利用可能になるものと期待されている。

また、ヒトの体内には少なくとも２４種類のタンパク分解酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ；以下、ＭＭＰと略す）が存在することが分かっている。その中で、軟骨を分解する酵素は数種類確認されている。
変形性膝関節症は関節を使いすぎた際に生じる摩擦によって、ＭＭＰによる軟骨の破壊と修復のバランスが崩れることで起こる。体重などの負担がかかりやすい膝関節や股関節など、限られた関節にだけ症状が起こるのが特徴である。病気が進行すると痛みや変形が悪化する。変形性関節症はＭＭＰ−１３の増加と関連が深い。
一方、関節性リウマチは免疫の異常によって多くのＭＭＰが放出されて発症するが、特にＭＭＰ−１３が関与しており、リウマチモデルラットにＭＭＰ−１３抑制剤を投与するとリウマチの進行を抑制したと報告されている。

以上のことから、変形性膝関節症及び関節性リウマチのいずれにもＭＭＰ−１３が関与している（特許文献２、非特許文献２〜４）。
なお、ＭＭＰの産生量が増加することにより、炎症性細胞の浸潤が活発に起こり、がん細胞の転移又は血管新生が起こる。逆に、炎症性細胞の浸潤が抑制される場合はＭＭＰの産生が抑制されていると考えられる（非特許文献５）。

特許第５０１９９６１号 特開２０１９−１２３６７９号公報

Eur. J. Immunol. (2006) Vol.36, No.12, p.3227-3237 Biosci. Biotechnol. Biochem. (2004) Vol.68, No.11, p.2279-2284 Ann. Rheum. Dis. (2010) Vol.69, No.9, p.898-902. doi:10.1136/ard.2008.106021 Drug Dev. Res. (2019 May) Vol.80, No.3, p.360-367. doi: 10.1002/ddr.21510. Epub 2019 Jan 4 J. Electrophoresis (2003) Vol.47, p.111-116

本発明は、生体内のＩＬ−１０産生促進効果及びＭＭＰ−１３産生抑制効果によりもたらされる関節炎を抑制するための組成物、関節炎の治療、予防又は緩和用組成物の提供をその課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、植物発酵液からの既知の有用な画分や、新たな精製工程による画分を種々作成して研究を行った結果、植物発酵液に含まれる新規テトラペプチド化合物を同定し、この化合物がＩＬ−１０産生促進効果及びＭＭＰ−１３産生抑制効果を有する物質であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、以下（１）のテトラペプチド化合物またはその塩、（２）のＩＬ−１０産生促進剤、（３）のＭＭＰ−１３産生阻害剤に係るものである。
（１）ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
（２）上記（１）に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を有効成分とする、ＩＬ−１０産生促進剤。
（３）上記（１）に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を有効成分とする、ＭＭＰ−１３産生阻害剤。

また、本発明は、以下（４）〜（９）の関節炎を抑制するための組成物に係るものである。
（４）上記（１）に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を含有し、炎症性のサイトカインの産生を低下させることで関節炎を抑制するための組成物。
（５）マクロファージのＣＯＸ２産生を低下させることでＰＧＥ２の産生を抑制する、上記（４）に記載の関節炎を抑制するための組成物。
（６）抗原提示細胞の抗原提示能を弱めて、過剰な免疫反応による疾患を予防しまたは改善する、上記（４）に記載の関節炎を抑制するための組成物。
（７）関節炎の治療、予防、または緩和用である、上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の関節炎を抑制するための組成物。
（８）飲食品、サプリメント、または医薬品の形態である、上記（４）ないし（７）のいずれかに記載の関節炎を抑制するための組成物。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物を経口摂取させたリウマチモデルラットを用いた動物実験において、本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物はラットの浮腫スコアを改善させ、炎症性細胞浸潤を抑制した。本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物は、発酵食品の材料由来であるため毒性もなく、経口摂取により関節炎の緩和が期待できる飲食品、サプリメント、または医薬品としての活用が期待される。

ヒト急性白血病由来Ｔ細胞株にピログルタミルテトラペプチドを添加し、ＩＬ−６で刺激した際のＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現量を示す。 ヒト急性白血病由来Ｔ細胞株にピログルタミルテトラペプチドを添加し、ＩＬ−６で刺激した際に発現したＩＬ−１０タンパク質のウェスタンブロッティング法により撮影した写真を表す。 図２の写真を画像解析して数値化したタンパク質量を表す。 ヒト軟骨肉腫細胞株にピログルタミルテトラペプチドを添加し、ＩＬ−１βで刺激した際のＭＭＰ−１３ ｍＲＮＡ発現量を示す。 ヒト軟骨肉腫細胞株にピログルタミルテトラペプチドを添加し、ＩＬ−１βで刺激した際に発現したＭＭＰ−１３タンパク質のウェスタンブロッティング法により撮影した写真を表す。 図２の写真を画像解析して数値化したタンパク質量を表す。 リウマチモデルラットの各浮腫スコアの参考写真を示す。 リウマチモデルラットにピログルタミルテトラペプチドを含む食品を投与した際の浮腫スコアを示す。 リウマチモデルラットにピログルタミルテトラペプチドを含む食品を投与した際の血清中ＩｇＧ抗体量を示す。 リウマチモデルラットにピログルタミルテトラペプチドを含む食品を投与後の、足根部組織病理写真を示す。 膝関節に違和感をもつヒトにピログルタミルテトラペプチドを摂取させた際の膝関節痛アンケート結果を示す。

本発明において、ピログルタミルテトラペプチド化合物には、本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物が有するＩＬ−１０産生促進活性またはＭＭＰ−１３産生阻害活性を失わない範囲で、その薬学的に許容される塩、または誘導体も含まれる。薬学的に許容される塩としては、ナトリム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、硫酸塩、硝酸塩などの有機酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩が例示される。誘導体としては、エステル化、アミド化、アシル化、カルボキシル化、ホルミル化、ホスホリル化、リン酸化、グリコシル化が例示される。

本発明のｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるピログルタミルテトラペプチド化合物の構造式を、下記[式１]に示す。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏは、配列番号では、配列番号１：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏと表される。本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物は、例えば固相合成法で鎖状ペプチドを合成する公知の方法でＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを化学合成し、Ｎ末端のグルタミン酸残基が自発的に縮合してピログルタミン酸となることで製造することができる。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏは、植物発酵液から精製した分子量４８６のサンプルに対して、ｉ）ＬＣ／ＭＳによる分子量と分子式の決定、ｉｉ）アミノ酸分析、ｉｉｉ）構成アミノ酸の絶対立体配置、およびｉｖ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により同定された。

ｉ）ＬＣ／ＭＳによる分子量と分子式の決定
ＨＰＬＣ分析で１ピークとなり、ＭＳ分析で分子量が４８６であった精製サンプルの精密質量による推定分子式は、Ｃ_２４Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_７であった。

ｉｉ）アミノ酸分析
試料２ｍｇを秤量し６Ｎ塩酸を加えて密封し、１０５℃で１１時間加熱した。その後、減圧乾固し、０．１Ｎ塩酸に再溶解させ１００ｍＬとし、アミノ酸分析を行った。ＨＰＬＣ装置は、Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）、検出器は、蛍光検出器ＲＦ−２０Ａｘｓ (島津製作所製)を用いた。
その結果、チロシン：グルタミン酸：プロリン＝１：１：２で検出された。

ｉｉｉ）構成アミノ酸の絶対立体配置
改良Ｍａｒｆｅｙ法を行った。試料５ｍｇを秤量し６Ｎ塩酸１ｍＬを加えて密封し、１０５℃で１６時間加熱した。その後、減圧乾固してから、蒸留水２００μＬに再溶解させた。サンプル５０μＬに１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ２０μＬ及び１％ Ｎ^α−（５−Ｆｌｕｏｒｏ−２,４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ (Ｌ−ＦＤＬＡ)アセトン溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間加温した。加温後、１Ｍ塩酸２０μＬを加え冷却し、アセトニトリル３９０μＬで希釈して、ＨＰＬＣ分析に供した。
結果は、分子量４８６を構成しているアミノ酸は、全てＬ体であった。

ｉｖ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
構成アミノ酸がどのように結合しているのかを調べるために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣを用いた。質量分析装置は、Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓ型を用いた。
フラグメント解析の結果、Ｎ末端にピログルタミン酸を有するｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏの可能性が考えられた。次に、合成品も同様にフラグメント解析を行い、精製品のフラグメントと比較した。その結果、ＬＣのリテンションタイムは同じであり、かつＬＣ／ＭＳ／ＭＳのフラグメントも同じパターンであったことから、分子量４８６を構成するアミノ酸は、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏであることが判明した。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物は、関節炎の予防、緩和や治療のための飲食品、サプリメント、医薬品として様々な形態で利用することができる。「飲食品」には、通常の飲食品の他、経腸栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが含まれる。また、「飲食品」および「医薬品」の対象はヒトに限定されるものではなく、ペットや家畜のような哺乳動物用の医薬品および飼料も包含する。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることができる。種々の剤型の経口用組成物を製造するための各種成分および製造法は、サプリメント、医薬品等の製造分野で公知な成分から適宜選択することができる。本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するための各種の添加剤として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を添加することができる。

経口用以外にも注射剤、点滴剤、外用剤、座薬剤等の非経口用投与剤としての各種製剤形態で使用できる。また、製剤中の本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき症状の程度、投与対象の状態（年齢、性別を含む）、剤型などによって異なる。ピログルタミルテトラペプチド化合物の１日投与量が約１０〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。

以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物の急性Ｔリンパ芽球性細胞におけるＩＬ−１０遺伝子の発現抑制活性について試験した。
[ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現量のリアルタイムＰＣＲでの測定]
急性Ｔリンパ芽球性細胞（ＴＡＬＬ−１）をウシ血清１０％含有ＲＰＭＩ培地にて８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。２４ウェルプレートに２０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、ピログルタミルテトラペプチド溶液（溶媒は０．０１％ジメチルスルホキシド溶液とした）及びＩＬ−６，Ｈｕｍａｎ（ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で７２時間培養を行った。
７２時間後に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ５０ｐｒｅｐｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｅｚＤＮａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い、ｃＤＮＡを合成した。その後、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて調製したサンプルを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ システムを用いて、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。内部標準はＧＡＰＤＨを用いた。ｍＲＮＡ発現量はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。
〈ＧＡＰＤＨプライマーセット〉
Ｆｗ：５’−ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ−３’
Ｒｖ：５’−ＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ−３’
〈ＩＬ−１０ プライマーセット〉
Ｆｗ：５’−ＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣ−３’
Ｆｗ：５’−ＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣ−３’

結果を図１に示す。コントロールは０．０１％ジメチルスルホキシド溶液であり、本発明のピログルタミルテトラペプチドは、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現を、コントロールに比べて促進した。

本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物の急性Ｔリンパ芽球性細胞におけるＩＬ−１０タンパク質の発現抑制活性について試験した。
[ＩＬ−１０タンパク質発現量のウェスタンブロッティング法による確認]
ウェスタンブロッティングの試薬は全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣのものを使用した。
急性Ｔリンパ芽球性細胞（ＴＡＬＬ−１）をウシ血清１０％含有ＲＰＭＩ培地にて８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。２４ウェルプレートに２０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、ピログルタミルテトラペプチド溶液（溶媒は０．０１％ジメチルスルホキシド溶液とした）及びＩＬ−６，Ｈｕｍａｎ（ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で７２時間培養を行った。
Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したＭ−ＰＥＲ Ｒｅａｇｅｎｔにてタンパクを抽出した。
抽出したタンパクの量をＢｒａｎｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにて調整し、ｎａｎｏ ｄｒｏｐにて測定した（比色法）。
タンパク液にＢｏｌｔ ＬＤＬ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔを添加して７０℃、１０分間加熱処理を行った。Ｂｏｌｔ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと１５ｗｅｌｌゲルを用い、電気泳動を行った（２００Ｖ，２２分間）。
ゲルを取り出して、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステムによって転写を行った。
ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＧＡＰＤＨ及びＩＬ−１０タンパクの抗原抗体反応を行った。
メンブレンをＭｉｌｌｉＱ水で洗い、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｋ ＷＥＳＴ Ｄｕｒａに含まれる２種類の試薬をそれぞれ１．０ｍＬずつ混合して、メンブレンの入ったタッパーに入れ、５分間反応させた。
メンブレンをＢＩＯ ＲＡＤのｃｈｅｍｉ ＤｏｃＸＲＳ＋システムに挿入して、イメージングを行った。

ＳＤＳの結果を図２に示す。コントロールは０．０１％ジメチルスルホキシド溶液であり、左レーンから、０．０１％ジメチルスルホキシド溶液；ＩＬ−６（−）、０．０１％ジメチルスルホキシド溶液；ＩＬ−６（＋）、０．０３μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液；ＩＬ−６（＋）、０．３μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液、３μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液；ＩＬ−６（＋）であり、タンパクレベルにおいても、本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物はＩＬ−１０タンパク質の発現を促進することが確認された。
画像解析ソフトによりＧＡＰＤＨ及びＩＬ−１０タンパクの検出点を数値化し、グラフ化した結果、ｍＲＮＡの発現量のグラフと相関性が高い結果となり、濃度依存的に発現が増加した（図３）。

ヒト軟骨肉腫細胞に本発明のピログルタミルテトラペプチド化合物を添加して、ＭＭＰ−１３ ｍＲＮＡ遺伝子の発現量に与える影響を試験した。
[ＭＭＰ−１３ ｍＲＮＡ発現量のリアルタイムＰＣＲでの測定]
［使用細胞］ ヒト軟骨肉腫細胞（ＯＵＭＳ−２７）
［培地］ ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１％＋Ｐ．Ｓ．１％
［手順］
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）の密度で細胞を播種し、培養を行った（３７℃、５％ＣＯ_２、加湿）。４８時間後に、ピログルタミルテトラペプチド溶液及びＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β，Ｈｕｍａｎ（ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、培養を行った（３７℃、５％ＣＯ_２、加湿）。
２４時間後に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ５０ｐｒｅｐｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｅｚＤＮａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)を用い、ｃＤＮＡを合成した。その後、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ システムを用いて、リアルタイム−ＰＣＲ法にて、ＭＭＰ−１３ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。内部標準はＧＡＰＤＨを用いた。ｍＲＮＡ発現量はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。
〈ＧＡＰＤＨプライマーセット〉
Ｆｗ：５’−ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ−３’
Ｒｖ：５’−ＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ−３’
〈ＭＭＰ−１３- プライマーセット〉
Ｆｗ：５’−ＣＣＡＧＴＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡ−３’
Ｒｖ：５’−ＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＣ−３’

結果を図６に示す。本発明のピログルタミルテトラペプチドは、ＭＭＰ−１３ ｍＲＮＡの発現を、陽性コントロールに比べて抑制した。

実施例３と同様に、ヒト軟骨肉腫細胞にピログルタミルテトラペプチドを添加し、ウェスタンブロッティング法にて、ＭＭＰ−１３タンパク質の発現に与える影響を確認した。
なお、ウェスタンブロッティングの試薬は全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣのものを使用した。
サンプル添加までは実施例３のｍＲＮＡ発現量確認試験と同様に行った。
サンプル溶液を含む培地での培地交換を２４時間ごとに４日間行った。
Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したＭ−ＰＥＲ Ｒｅａｇｅｎｔにてタンパクを抽出した。
抽出したタンパクの量をＢｒａｎｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにて調整し、ｎａｎｏ ｄｒｏｐにて測定した（比色法）。
タンパク液にＢｏｌｔ ＬＤＬ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔを添加して７０℃、１０分間加熱処理を行った。Ｂｏｌｔ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと１５ｗｅｌｌゲルを用い、電気泳動を行った（２００Ｖ，２２分間）。
ゲルを取り出して、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステムによって転写を行った。
ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＧＡＰＤＨ及びＩＬ−１０タンパクの抗原抗体反応を行った。
メンブレンをＭｉｌｌｉＱ水で洗い、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｋ ＷＥＳＴ Ｄｕｒａに含まれる２種類の試薬をそれぞれ１．０ｍＬずつ混合して、メンブレンの入ったタッパーに入れ、５分間反応させた。
メンブレンをＢＩＯ ＲＡＤのｃｈｅｍｉ ＤｏｃＸＲＳ＋システムに挿入して、イメージングを行った。

コントロールは０．０１％ジメチルスルホキシド溶液であり；ＩＬ−６（−）、０．０１％ジメチルスルホキシド溶液；ＩＬ−６（＋）、０．０１μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液；ＩＬ−６（＋）、０．１μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液、１μｇ／ｍＬピログルタミルテトラペプチド溶液；ＩＬ−６（＋）である。
結果を図５に示す。本発明のピログルタミルテトラペプチドは、ＭＭＰ−１３タンパク質の発現を、陽性コントロールに比べて、抑制した（図６）。

リウマチモデルラットにピログルタミルテトラペプチドを含む食品を投与し、リウマチ発症初期の症状である浮腫を抑制する効果、及び軟骨破壊の抑制効果について試験を行った。
ＤＡ／Ｓｌｃラット（雌）、６匹×４群に対し、普通飼料を自由摂取させながら、各試験試料を５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ．／ｄａｙずつ３０日間、強制経口投与した。
対照区;蒸留水 ５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ．／ｄａｙ
ピログルタミルテトラペプチド低用量群（１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．／ｄａｙ）
ピログルタミルテトラペプチド中用量群（２０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．／ｄａｙ）
ピログルタミルテトラペプチド高用量群（４０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．／ｄａｙ）

投与１４日目にウシ軟骨由来II型コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ濃度溶液を尾根部の左右に対し０．０５ｍＬずつ注射し、関節炎を惹起した。
関節炎評価日は惹起から１１〜１４日目とした。
浮腫の程度は関節炎スコアリング(下記表１参照)によって評価した。また、血清抗II型コラーゲンＩｇＧ抗体量を測定した。図７に参考写真を示す。

試験の結果、ピログルタミルテトラペプチド２０ｍｇ/ｋｇ ｂ.ｗ.および４０ｍｇ/ｋｇ ｂ.ｗ.の投与により、対照群に比べ、浮腫を有意に抑制した（表２および図８）。
また、該投与群において、血清中のＩｇＧ抗体量が対照群に比べ低値を示した（図９）。

ウシ軟骨由来II型コラーゲン惹起１４日後に、全動物の左右の足根についてＨＥ染色を行って標本とし、病理組織学的検査を行った。好中球を主体とする多形核白血球と、比較的少数のリンパ球及びマクロファージ等の単核細胞の、全ての炎症性細胞の浸潤の程度を総合的に評価した。その結果、対照群に比べ、ピログルタミルテトラペプチド高容量投与群で炎症性細胞浸潤が抑制された（図１０）。従って、ＭＭＰ−１３産生が抑制されたことが明らかとなった。

膝関節に違和感をもつヒトにおける関節への影響を確認した。
［試験デザイン］プラセボ対照二重盲検比較試験
［被験者］膝関節に痛み・違和感がある４０歳以上６９歳以下の日本人男性及び女性（健常者）
［選択基準］膝関節可動域検査（ゴニオメーター）で評価が悪い者
ＪＫＯＭ膝関節痛アンケートが低値の方（原則４５点以下）を基準とする。
ＪＯＡでスコアが高値の方（７０点以上 但し１００点を除く）を基準とする。
［試験食品］
試験群・・・ピログルタミルテトラペプチドを含むハードカプセル（ピログルタミルテトラペプチド１５ｍｇ／３粒／日）
対照群・・・プラセボ食品（ピログルタミルテトラペプチドの代わりにデキストリンを配合した同一形状のハードカプセル）
［用法用量］：夕食後３０分以内に１日１回３粒摂取する。
［観察項目］
１）主要評価項目
（１）ＪＫＯＭ（ＶＡＳ含む）膝関節痛アンケート調査（０から１００までの数値）
スコアが高い（大きい）程、膝関節の痛みやこわばりが強く、ＱＯＬが低い。
（２）ＪＯＡ調査 日本整形外科学会が作成した調査票。医師が問診してスコア化した。
（３）膝関節可動域検査 ゴニオメーターによる屈曲・伸展度の評価。
（４）高感度ＣＲＰ 血清中のＣＲＰを測定し、炎症反応の程度を評価した。

２）副次評価項目
安全性(血液・血圧・体重)
［摂取期間］２０１９年２月中旬から５月中旬の１２週間
［観察時期］摂取前、摂取６週後、摂取１２週後
試験計画書内容の被験者選択基準に該当する健常成人被験者男性１４例、女性２８例の合計４２例が参加した。

除外基準に抵触する以下の被験者を除外した。試験期間中の左大腿骨頸部骨折による同意撤回１名、定期的な鎮痛薬服用が判明した２名、試験期間中に生活習慣の変更があった１名を除外である。その他重篤な副作用の報告はなく、食品摂取期間に摂取コンプライアンス８０％を違反する者もいなかったため、年齢４２歳〜６６歳（平均年齢５２．３歳）の男女、計３８名を解析対象とした。
ＪＫＯＭ（膝関節痛アンケート調査）において、ピログルタミルテトラペプチド摂取群では膝の痛み・こわばりが１２週目に有意に低下した（図１１）。

Claims (8)

1. ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
2. 請求項１に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を有効成分とする、インターロイキン１０産生促進剤。
3. 請求項１に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を有効成分とする、マトリックスメタロプロテアーゼ１３産生阻害剤。
4. 請求項１に記載のテトラペプチド化合物またはその塩を含有し、炎症性のサイトカインの産生を低下させることで関節炎を抑制するための組成物。
5. マクロファージのシクロオキシゲナーゼ２産生を低下させることでプロスタグランジンＥ２の産生を抑制する、請求項４に記載の関節炎を抑制するための組成物。
6. 抗原提示細胞の抗原提示能を弱めて、過剰な免疫反応による疾患を予防しまたは改善する、請求項４に記載の関節炎を抑制するための組成物。
7. 関節炎の治療、予防、または緩和用である、請求項４ないし６のいずれかに記載の関節炎を抑制するための組成物。
8. 飲食品、サプリメント、または医薬品の形態である、請求項４ないし７のいずれかに記載の関節炎を抑制するための組成物。