JP6768798B2 - 組換えfviii変異型をコードする血友病a遺伝子治療用高発現ウイルスベクター - Google Patents
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Description
本出願は、2015年11月13日に出願された米国仮特許出願第62/255,317号に対する優先権を主張するものであり、その記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出した配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年11月9日作成のかかるASCIIファイルの写しのファイル名は008073_5107_WO_Sequence_Listing.txtであり、サイズ353,479バイトである。
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる、複数の生化学反応が相互に依存する複雑かつ動的な生物学的経路を介して進行する。凝固第VIII因子(FVIII)はカスケードの主要成分である。第VIII因子は出血部位に動員され、活性化第IX因子(FIXa)及び因子×(FX)とXase(テナーゼ)複合体を形成する。Xase複合体はFXを活性化し、それによりプロトロンビンが活性化されてトロンビンとなり、次いで、凝固カスケードの他成分が活性化され安定な血餅を生成する(Saenko et al.,Trends Cardiovasc.Med.,9:185−192(1999)(非特許文献1);Lenting et al.,Blood,92:3983−3996(1998)(非特許文献2)に概説されている)。
したがって、コード配列がより効率的に遺伝子治療ベクターにパッケージングされ、その遺伝子治療ベクターを介して送達される第VIII因子変異型が必要とされている。また、第VIII因子をより効率的に発現するコドン改変合成核酸も必要とされている。そのような第VIII因子変異型及びコドン改変核酸により、第VIII因子欠乏症(例えば、血友病A)の改善された治療が可能になる。開示のコドン改変第VIII因子変異型により、上記の欠乏症及び第VIII因子欠乏症(例えば、血友病A)治療に関連した他の問題が軽減または取り除かれる。
[本発明1001]
CS01−FL−NA(配列番号13)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1002]
前記ヌクレオチド配列が、CS01−FL−NA(配列番号13)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1003]
前記ヌクレオチド配列がCS01−FL−NA(配列番号13)である、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1004]
第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記重鎖は、CS01−HC−NA(配列番号24)に対して少なくとも95%の同一性を有する第1のヌクレオチド配列によってコードされ、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記軽鎖は、CS01−LC−NA(配列番号25)に対して少なくとも95%の同一性を有する第2のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
前記ポリペプチドリンカーは、furin切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1005]
前記ポリペプチドリンカーが、BDLO01(配列番号5)に対して少なくとも95%の同一性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1004のポリヌクレオチド。
[本発明1006]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS01−HC−NA(配列番号24)に対して少なくとも99%の同一性を有し、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS01−LC−NA(配列番号25)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1004または1005のポリヌクレオチド。
[本発明1007]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS01−HC−NA(配列番号24)であり、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS01−LC−NA(配列番号25)である、本発明1004または1005のポリヌクレオチド。
[本発明1008]
CS04−FL−NA(配列番号1)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1009]
前記ヌクレオチド配列が、CS04−FL−NA(配列番号1)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1004のポリヌクレオチド。
[本発明1010]
前記ヌクレオチド配列がCS04−FL−NA(配列番号1)である、本発明1004のポリヌクレオチド。
[本発明1011]
第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記重鎖は、CS04−HC−NA(配列番号3)に対して少なくとも95%の同一性を有する第1のヌクレオチド配列によってコードされ、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記軽鎖は、CS04−LC−NA(配列番号4)に対して少なくとも95%の同一性を有する第2のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
前記ポリペプチドリンカーは、furin切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1012]
前記ポリペプチドリンカーが、BDLO04(配列番号6)に対して少なくとも95%の同一性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1011のポリヌクレオチド。
[本発明1013]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS04−HC−NA(配列番号3)に対して少なくとも99%の同一性を有し、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS04−LC−NA(配列番号4)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1011または1012のポリヌクレオチド。
[本発明1014]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS04−HC−NA(配列番号3)であり、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS04−LC−NA(配列番号4)である、本発明1011または1012のポリヌクレオチド。
[本発明1015]
CS23−FL−NAに対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1016]
前記ヌクレオチド配列が、CS23−FL−NA(配列番号20)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1015のポリヌクレオチド。
[本発明1017]
前記ヌクレオチド配列がCS23−FL−NA(配列番号20)である、本発明1015のポリヌクレオチド。
[本発明1018]
第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記重鎖は、CS23−HC−NA(配列番号22)に対して少なくとも95%の同一性を有する第1のヌクレオチド配列によってコードされ、
前記第VIII因子ポリペプチドの前記軽鎖は、CS23−LC−NA(配列番号23)に対して少なくとも95%の同一性を有する第2のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
前記ポリペプチドリンカーは、furin切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1019]
前記ポリペプチドリンカーが、BDLO23(配列番号7)に対して少なくとも95%の同一性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1018のポリヌクレオチド。
[本発明1020]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS23−HC−NA(配列番号22)に対して少なくとも99%の同一性を有し、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS23−LC−NA(配列番号23)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1018または1019のポリヌクレオチド。
[本発明1021]
前記第1のヌクレオチド配列が、CS23−HC−NA(配列番号22)であり、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が、CS23−LC−NA(配列番号23)である、本発明1018または1019のポリヌクレオチド。
[本発明1022]
前記コードされたポリペプチドリンカーが、NG1−AA、NG4−AA、NG5−AA、NG6−AA、NG7−AA、NG9−AA、NG10−AA、NG16−AA、NG17−AA、NG18−AA、NG19−AA、NG20−AA、NG21−AA及びNGV−AAからなる群から選択されるグリコシル化ペプチドに対して少なくとも92%の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化ペプチドを含む、本発明1004、1011、及び1018のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1023]
前記コードされたポリペプチドリンカーが、NG1−AA、NG4−AA、NG5−AA、NG6−AA、NG7−AA、NG9−AA、NG10−AA、NG16−AA、NG17−AA、NG18−AA、NG19−AA、NG20−AA、NG21−AA及びNGV−AAからなる群から選択されるグリコシル化ペプチドを含む、本発明1004、1011、及び1018のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1024]
前記グリコシル化ペプチドが、NG1−NA、NG4−NA、NG5−NA、NG6−NA、NG7−NA、NG9−NA、NG10−NA、NG16−NA、NG17−NA、NG18−NA、NG19−NA、NG20−NA、NG21−NA及びNGV−NAからなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、本発明1022または1023のポリヌクレオチド。
[本発明1025]
前記グリコシル化ペプチドが、NG1−NA、NG4−NA、NG5−NA、NG6−NA、NG7−NA、NG9−NA、NG10−NA、NG16−NA、NG17−NA、NG18−NA、NG19−NA、NG20−NA、NG21−NA及びNGV−NAのうち1つから選択される、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、本発明1022または1023のポリヌクレオチド。
[本発明1026]
前記ポリペプチドリンカーが、BDLNG1−NA、BDLNG3−NA、BDLNG5−NA、BDLNG6−NA、BDLNG9−NA、BDLNG10−NA、BDLNG16−NA、BDLNG17−NA、BDLNG18−NA、BDLNG19−NA、BDLNG20−NA及びBDLNG21−NAからなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1004、1011、及び1018のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1027]
CS04−FL−AA(配列番号2)に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第VIII因子ポリペプチドをコードする、本発明1001〜1021のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1028]
CS04−FL−AA(配列番号2)のアミノ酸配列を含む第VIII因子ポリペプチドをコードする、本発明1001〜1021のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1029]
CS01−SC1−NA(配列番号26)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1030]
前記ヌクレオチド配列が、CS01−SC1−NA(配列番号26)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1031]
前記ヌクレオチド配列がCS01−SC1−NA(配列番号26)である、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1032]
CS04−SC1−NA(配列番号9)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1033]
前記ヌクレオチド配列が、CS04−SC1−NA(配列番号9)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1034]
前記ヌクレオチド配列がCS04−SC1−NA(配列番号9)である、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1035]
CS23−SC1−NA(配列番号28)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1036]
前記ヌクレオチド配列が、CS23−SC1−NA(配列番号28)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1037]
前記ヌクレオチド配列がCS23−SC1−NA(配列番号28)である、本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1038]
CS01−SC1−AA(配列番号10)に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、本発明1029〜1037のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1039]
CS01−SC1−AA(配列番号10)のアミノ酸配列を含む第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、本発明1029〜1037のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1040]
CS01−SC2−NA(配列番号27)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1041]
前記ヌクレオチド配列が、CS01−SC2−NA(配列番号27)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1040のポリヌクレオチド。
[本発明1042]
前記ヌクレオチド配列がCS01−SC2−NA(配列番号27)である、本発明1040のポリヌクレオチド。
[本発明1043]
CS04−SC2−NA(配列番号11)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1044]
前記ヌクレオチド配列が、CS04−SC2−NA(配列番号11)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1045]
前記ヌクレオチド配列がCS04−SC2−NA(配列番号11)である、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1046]
CS23−SC2−NA(配列番号29)に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1047]
前記ヌクレオチド配列が、CS23−SC2−NA(配列番号29)に対して少なくとも99%の同一性を有する、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1048]
前記ヌクレオチド配列がCS23−SC2−NA(配列番号29)である、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1049]
CS01−SC2−AA(配列番号12)に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、本発明1040〜1048のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1050]
CS01−SC2−AA(配列番号12)のアミノ酸配列を含む第VIII因子一本鎖ポリペプチドをコードする、本発明1040〜1048のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1051]
CS01−HC−NA、CS01−LC−NA、CS04−HC−NA、CS04−LC−NA、CS23−HC−NA、CS23−LC−NAからなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1052]
CS01−HC−NA、CS01−LC−NA、CS04−HC−NA、CS04−LC−NA、CS23−HC−NA、CS23−LC−NAからなる群から選択される配列に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1053]
CS01−HC−NA、CS01−LC−NA、CS04−HC−NA、CS04−LC−NA、CS23−HC−NA、CS23−LC−NAからなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1054]
CS01−FL−AA(配列番号2)に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第VIII因子ポリペプチドをコードする、本発明1051〜1053のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1055]
CS01−FL−AA(配列番号2)のアミノ酸配列を含む第VIII因子ポリペプチドをコードする、本発明1051〜1053のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1056]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328Sを含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1057]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171Pを含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1058]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に関して、アミノ酸AIEPRSF755〜761の欠失、及び
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対する、N754の後へのアミノ酸TTYVNRSL(配列番号33)の挿入
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1059]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328S、ならびに
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換C1918G及びC1922G
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1060]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、L171P、及びF328Sを含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1061]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328S、
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に関して、アミノ酸AIEPRSF755〜761の欠失、及び
(c)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対する、N754の後へのアミノ酸TTYVNRSL(配列番号33)の挿入
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1062]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171P、
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に関して、アミノ酸AIEPRSF755〜761の欠失、及び
(c)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対する、N754の後へのアミノ酸TTYVNRSL(配列番号33)の挿入
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1063]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328S、
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換C1918G及びC1922G、及び
(c)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171P
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1064]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328S、
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換C1918G及びC1922G、
(c)FVIII−FL−AA(配列番号19)に関して、アミノ酸AIEPRSF755〜761の欠失、及び
(d)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対する、N754の後へのアミノ酸TTYVNRSL(配列番号33)の挿入
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1065]
前記コードされた第VIII因子ポリペプチドが、
(a)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171P、
(b)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換F328S、
(c)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対するアミノ酸置換C1918G及びC1922G、
(d)FVIII−FL−AA(配列番号19)に関して、アミノ酸AIEPRSF755〜761の欠失、及び
(e)FVIII−FL−AA(配列番号19)に対する、N754の後へのアミノ酸TTYVNRSL(配列番号33)の挿入
を含む、本発明1001〜1055のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1066]
前記第VIII因子ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントをさらに含む、本発明1001〜1065のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1067]
前記プロモーターエレメントが、前記第VIII因子ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の上流の肝臓特異的プロモーター配列である、本発明1066のポリヌクレオチド。
[本発明1068]
前記肝臓特異的プロモーター配列と、前記第VIII因子ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列との間に位置するイントロン配列をさらに含む、本発明1067のポリヌクレオチド。
[本発明1069]
本発明1001〜1068のいずれかのポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
[本発明1070]
本発明1001〜1068のいずれかのポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
[本発明1071]
本発明1001〜1068のいずれかのポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子に感染した、宿主細胞。
[本発明1072]
哺乳類の宿主細胞内に本発明1001〜1068のいずれかのポリヌクレオチドを導入する段階を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは前記哺乳類宿主細胞における複製能力がある、前記方法。
[本発明1073]
血友病Aを治療するための方法であって、それを必要とする患者に対し、本発明1070のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1074]
宿主細胞に形質導入するための方法であって、前記宿主細胞を本発明1070のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させる段階を含む、前記方法。
I.緒言
AAVを用いた遺伝子治療は血友病患者の治療にとって有望である。血友病Bの場合、最初の臨床データは期待できるものであり、約10%のFIXレベルを少なくとも数人の患者で1年以上維持することができる。しかし、血友病Aの場合、AAVベクターによる治療的発現レベル5〜10%を達成することはさまざまな理由により依然として困難である。第1に、第VIII因子コード配列は従来のAAVを用いたベクターには大き過ぎる。第2に、工学的操作によるBドメイン欠失型または切断型の第VIII因子構成体は、コドンが最適化されている場合でも生体内での発現が低いという問題がある。第3に、これらのBドメイン欠失型または切断型の第VIII因子変異型構成体は生体内での半減期が短く、低発現という影響をさらに悪化させる。第4に、たとえ発現した場合でも、FVIIIは第IX因子などの他の凝固因子のようには効率的に細胞から分泌されない。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、他に明記しない限り、それらに与えられている意味を有する。
CpGアイランドの同定方法に関するさらなる情報については、その記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれるGardiner−Garden M.et al.,J Mol Biol.,196(2):261−82(1987)を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本開示は、第VIII因子変異型をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変型ポリヌクレオチドは、AAVを用いた遺伝子治療構成体にして投与した場合、第VIII因子の発現を顕著に改善する。また、コドン改変型ポリヌクレオチドは、従来の方法でコドンを最適化した構成体と比較して改善されたAAV−ビリオンパッケージングも示す。実施例2及び実施例4で実証されるように、出願人らは、ヒト野生型第VIII因子の重鎖と軽鎖と、生体内で活性FVIIIaタンパク質の成熟を促進するfurin切断部位が含有される14アミノ酸の短いBドメイン置換リンカー(「SQ」リンカー)とを有した、第VIII因子ポリペプチドをコードする3つのコドン改変型ポリヌクレオチド(CS01−FL−NA、CS04−FL−NA、及びCS23−FL−NA)の発見により、上記利点を達成している。実施例4でさらに実証されるように、コードされた第VIII因子分子内にF328S、X5、及びX1の各アミノ酸変異をさまざまに組み合わせて組み込むことにより、第VIII因子活性の生体内発現がさらに高まった。
本明細書に記載する第VIII因子構成体のAAVベクターによる発現効率をさらに高めるため、いくつかの実施態様では、分泌改善、特定活性の増大、及び/または第VIII因子の安定性増強が既知であるアミノ酸置換をさらに組み込む。所与のベクター用量でFVIII活性の血漿レベルを高める多数の潜在的変異型を同定した。これらの変異型には、シグナルペプチド効率の高いもの、BiP相互作用を防げるアミノ酸置換、より効率的に分泌第VIII因子オルソログ(例えば、ブタの第VIII因子)に類似するアミノ酸置換、一本鎖の第VIII因子変異型、ならびに第VIII因子を安定化させ、かつ/またはサブユニットの解離を低下させるアミノ酸置換を有する変異型が含まれる。
いくつかの実施形態では、FVIIIの重鎖と軽鎖の間の結合(例えば、野生型第VIII因子のBドメイン)をさらに改変する。AAVパッケージング量の大きさは限られているため、Bドメインが欠失している、切断されている、及びまたはリンカーが置換された変異型にはFVIII遺伝子治療構成体の効率改善が必要である。従来より最も使用されているBドメイン置換リンカーはSQ FVIIIのリンカーであり、わずか14アミノ酸のBドメインをリンカー配列として保持している。ブタ第VIII因子(「OBI−1」、米国特許第6,458,563号に記載)の別の変異型はCHO細胞で良好に発現し、24アミノ酸というわずかに長いリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第VIII因子構成体には、SQ型Bドメインリンカー配列が含まれる。他の実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第VIII因子構成体には、OBI−1−型Bドメインリンカー配列が含まれる。
が含まれる(Thim et al.,Haemophilia,16:349(2010))。いくつかの実施形態では、伸長SQ型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して1つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、伸長SQ型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して2つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、伸長SQ型Bドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図13に示すペプチド(それぞれ出現順に配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、及び75)から選択される。
を含む、ブタOBI−1−型Bドメインリンカー(Toschi et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.12:517(2010))が含まれる。いくつかの実施形態では、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して1つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して2つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図13に示すペプチド(それぞれ出現順に配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、及び75)から選択される。
を含む、O8型Bドメインリンカー(Toschi et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.12:517(2010))が含まれる。いくつかの実施形態では、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して1つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して2つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、ブタOBI−1−型Bドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図13に示すペプチド(それぞれ出現順に配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、及び75)から選択される。
コドン改変型ポリヌクレオチドCS04
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第VIII因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS04−FL−NA(配列番号1)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS04−HC−NA(配列番号3)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS04−FL−NA(配列番号1)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS04−LC−NA(配列番号4)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟(例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後)を可能にするfurin切断部位が含まれる。
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第VIII因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS01−FL−NA(配列番号13)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS01−HC−NA(配列番号24)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS01−FL−NA(配列番号13)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS01−LC−NA(配列番号25)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟(例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後)を可能にするfurin切断部位が含まれる。
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第VIII因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS23−FL−NA(配列番号20)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS23−HC−NA(配列番号22)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS23−FL−NA(配列番号20)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS23−LC−NA(配列番号23)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟(例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後)を可能にするfurin切断部位が含まれる。
BドメインのC末端に位置するfurin切断部位が除去されている第VIII因子構成体は、第VIII因子分子が正常に成熟できないにもかかわらず一本鎖ポリペプチドとしての活性を保持する(Leyte et al.(1991))。同様に、弱いfurin部位(アミノ酸置換R1664Hを含有)を有するBドメイン欠失型第VIII因子構成体は、野生型furin切断部位を有する対応する第VIII因子構成体よりも生物学的に活性である(Siner et al.(2013))。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第VIII因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子一本鎖ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。ポリペプチドリンカーには、furin切断部位は含まれない。
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第VIII因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS04−FL−NA(配列番号1)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS04−HC−NA(配列番号3)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS04−FL−NA(配列番号1)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS04−LC−NA(配列番号4)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、furin切断部位は含まれない。
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第VIII因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS01−FL−NA(配列番号13)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS01−HC−NA(配列番号24)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS01−FL−NA(配列番号13)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS01−LC−NA(配列番号25)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、furin切断部位は含まれない。
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第VIII因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第VIII因子ポリペプチドには、第VIII因子の軽鎖、第VIII因子の重鎖、及び重鎖のC末端を軽鎖のN末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、CS23−FL−NA(配列番号20)の一部であり第VIII因子の重鎖をコードするCS23−HC−NA(配列番号22)に対する配列同一性の高い、第1のヌクレオチド配列によってコードされる。第VIII因子ポリペプチドの軽鎖は、CS23−FL−NA(配列番号20)の一部であり第VIII因子の軽鎖をコードするCS23−LC−NA(配列番号23)に対する配列同一性の高い、第2のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、furin切断部位は含まれない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変型ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込む。発現ベクターの非限定的な例には、ウイルスベクター(例えば、遺伝子治療に好適なベクター)、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体等が含まれる。
実施例1−コドン改変第VIII因子変異型発現配列の構築
血友病Aの遺伝子治療に有効な第VIII因子コード配列を作製するために、2つの障害を乗り越える必要があった。第1に、遺伝子治療用の従来の送達ベクター(例えば、AAVビリオン)ゲノムサイズには限界があるため、コードされた第VIII因子ポリペプチドを大幅に短縮する必要があった。第2に、(i)送達ベクター内でのパッケージング相互作用の安定化、(ii)mRNA仲介の安定化、及び(iii)mRNAの転写/翻訳の堅牢性改善を図るために、コード配列を改変する必要があった。
コドン改変第VIII因子変異型配列の生物学的力価を検討するため、実施例1に記載のReFacto型FVIII構成体を第VIII因子欠損マウスに投与した。簡単に言えば、C57Bl/6系FVIIIノックアウト(ko)マウス(1群あたり6〜8匹)において、マウス体重1キログラムあたり4E12ベクターゲノム(vg)を尾静脈注射して評価を実施した。注射14日後に後眼窩への穿刺により採血して血漿を調製し、標準的手順を使用して凍結した。14日目の発現レベルを選択した理由は、これ以降の時期にこのマウスモデルの一部の動物に見られる阻害抗体の影響がこの時期には最小であることによる。Technochrome FVIIIアッセイを使用してマウス血漿中のFVIII活性を測定し、その際、修正は軽微にとどめ、製造者(Technoclone、オーストリア、ウィーン)の勧奨に従って実施した。アッセイでは、血漿試料を適切に希釈し、トロンビン、活性化第IX因子(FIXa)、リン脂質、第X因子及びカルシウムを含有するアッセイ試薬と混合した。トロンビンによるFVIII活性化に続き、FIXa、リン脂質及びカルシウムの複合体が生成する。この複合体によりFXが活性化されて活性化FX(FXa)となり、それが発色基質のパラ−ニトロアニリド(pNA)を切断する。pNA生成動態を405nmで測定する。比率は試料中のFVIII濃度と直接比例している。基準曲線からFVIII濃度を読み取り、結果をFVIII IU/ミリリットルで与える。
他の研究者により、野生型第VIII因子Bドメイン由来の推定上のN−結合型グリコシル化部位6つを含有する小さいペプチド(「V3ペプチド」)をBドメイン欠失遺伝子治療構成体に挿入すると、マウス血漿中の第VIII因子レベルが上昇したことが示されている(McIntosh et al.,Blood 121(17):3335−44(2013))。しかし、Bドメイン置換リンカーの小さいサイズを維持するため、かかるグリコシル化部位は野生型Bドメインにおける状況から外した。V3ペプチドを含有するリンカーのインシリコ予測(Gupta et al.、前掲)では、V3ペプチド内のこれらのグリコシル化部位のうち2つしか生体内で修飾を受けないであろうことが示唆されている(図15)。
第VIII因子の重鎖内アミノ酸変異及び/またはBドメイン置換リンカーを担持する、種々の変異Refacto型BDD−FVIII構成体を多数クローニングし、スクリーニングを行った。対応するベクターは、本明細書では「vCS」系列のベクターとされ、これらはコドンが改変されたCS01、CS04、及びCS23のバックグラウンドにおいてBDD−FVIII変異型をコードする。CS01及びCS04のバックグラウンド構築に使用した方法は実施例1に記載されている。CS23の構築に使用した方法は、コドン最適化用オンラインツール(Grote et al.,2005;Nucl.Acids Res.W526−31)であるJCATツール(www.jcat.de)に基づいた。アルブミンスーパーファミリーのコドン使用頻度がより反映されるよう配列をさらに修正した(Mirsafian et al.,Sc.Word Journal,ID 639682(2014))。なお、その記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書により明示的に組み込まれる。
同一のベクター骨格プラスミド(pCh−BB01)に異なる合成DNA断片をクローニングすることによってプラスミドを構築した。AscI及びNotIの各酵素制限部位を隣接させたRefacto型BDD−FVIII断片のDNA合成がThermoFischer Scientific(ドイツ、レーゲンスブルク)によって行われた。ベクター骨格は2つの隣接するAAV2由来末端逆位反復配列(ITR)を含有し、これらは、肝臓特異的マウストランスサイレチン遺伝子由来のプロモーター/エンハンサー配列、それぞれのRefacto型BDD−FVIIIを挿入するためのAscI及びNotIの各酵素制限部位、ならびに合成ポリA部位を包含する。調製したベクター骨格のライゲーション及びAscIとNotIの両部位を介した挿入を行った後、得られるプラスミドをミリグラム規模で増幅させた。ダイレクト・シーケンシング(Microsynth、スイス、バルガッハ)によって構成体のRefacto型BDD−FVIII配列を検証した。クローニングにより、図44に示すように異なるプラスミド構成体を得た。
AAV8を用いたベクターを、本質的にGrieger et al.(2015、前掲)に記載のように3プラスミドトランスフェクション法によって調製した。対応するFVIIIベクタープラスミド、ヘルパープラスミドpXX6X80(アデノウイルスヘルパー遺伝子を担持)及びパッケージングプラスミドpGSK2/8(rep2遺伝子とcap8遺伝子に寄与)を使用するプラスミドトランスフェクションにはHEK293懸濁液細胞を使用した。下流の処理では、1リットル培養の細胞ペレットを、上記のようにイオジキサノールグラジエントを使用して処理した。かかる手順により、表8にまとめられているベクター調製物を得た。AAV2末端逆位反復配列を標的にするユニバーサルqPCR手順を使用するqPCR(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods:Part B 23:18−28(2012))によってベクターを定量した。正確に定量した、AAV2末端逆位反復配列を担持するベクタープラスミドは、標準曲線の作成に使用した。
AAVアガロースゲル電気泳動によってベクターゲノムの完全性を分析した。Fagone et al.(Human Gene Therapy Methods,23:1−7(2012))の記載と同様に電気泳動を行った。AAVベクター調製物を0.5%SDS存在下、75℃で10分インキュベートし、その後、室温まで冷却した。1% 1xTAEアガロースゲルのレーンあたり約1.5E10ベクターゲノム(vg)を載せ、ゲル長7V/cmで60分電気泳動にかけた。その後、2倍希釈GelRed(Biotiumカタログ番号41003)溶液中でゲルを染色し、ChemiDoc(商標)MP(Biorad)で撮像した。ベクターの選択結果を図45に示す。ウイルスベクターvCS04(対照)、vCS17、vCS20、vCS24、vCS16及びvCS40(対照)はいずれも、5kbの範囲にはっきりとしたバンドが示され(図45、レーン2〜7;右側矢印)、ゲノムサイズが同一であることを示している。ゲノムは、約5.2kbというベクターサイズにもかかわらず均一なバンドになっており、やや大きいサイズのゲノム(AAV野生型ゲノムの4.7kbとの対比)が適切にパッケージングされていることを裏付けている。
種々のRefacto型BDD−FVIII構成体のスクリーニングをマウスで行った。C57Bl/6系FVIIIノックアウト(ko)マウス(1群あたり6〜8匹)において、マウス体重1キログラムあたり4E12ベクターゲノム(vg)を尾静脈注射してアッセイを実施した。注射14日後に後眼窩への穿刺により採血して血漿を調製し、標準的手順を使用して凍結した。軽微な修正を加えたTechnocloneの化学発色法(Technochrome FVIII、Technoclone、オーストリア、ウィーン)でマウス血漿中のFVIII活性を測定した。簡単に言えば、血漿試料を適切に希釈し、トロンビン、活性化第IX因子(FIXa)、リン脂質、第X因子及びカルシウムを含有するアッセイ試薬と混合した。トロンビンによるFVIII活性化に続き、FIXa、リン脂質及びカルシウムの複合体が生成する。この複合体によりFXが活性化されて活性化FX(FXa)となり、それが発色基質のパラ−ニトロアニリド(pNA)を切断する。pNA生成動態を405nmで測定する。比率は試料中のFVIII濃度と直接比例している。基準曲線からFVIII濃度を読み取り、結果をFVIII IU/ミリリットルで与える。
Claims (38)
- 第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
前記第VIII因子ポリペプチドの重鎖が、完全長の配列番号:3に対して少なくとも99%の相同性を有する第1のヌクレオチド配列によってコードされ、
前記第VIII因子ポリペプチドの軽鎖が、完全長の配列番号:4に対して少なくとも99%の相同性を有する第2のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
前記ポリペプチドリンカーが、furin切断部位と配列番号:55のアミノ酸配列を有するグリコシル化ペプチドとを含む、
前記ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドリンカーが、完全長の配列番号:38に対して少なくとも95%の相同性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドリンカーが、配列番号:38の第3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第1のヌクレオチド配列が配列番号:3であり、かつ
前記第2のヌクレオチド配列が配列番号:4である、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドリンカーが、配列番号:38の第3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントをさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターエレメントが、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流の肝臓特異的プロモーター配列である、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
- 前記肝臓特異的プロモーター配列と、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロン配列をさらに含む、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子に感染した、宿主細胞。
- インビトロで哺乳類の宿主細胞内に請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを導入する段階を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチドが前記哺乳類宿主細胞において複製能力がある、前記方法。
- 血友病Aの治療に使用するための、請求項10に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を含む医薬組成物。
- インビトロで宿主細胞を請求項10に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させる段階を含む、宿主細胞に形質導入するための方法。
- 完全長の配列番号:1に対して少なくとも99%の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドであって、
配列番号:19に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171Pを有する第VIII因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。 - 前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、かつ
前記ポリペプチドリンカーが、前記重鎖と前記軽鎖の間に挿入される配列番号:55のアミノ酸配列を有するグリコシル化ペプチドを含む、
請求項15に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号:94の配列を含む、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントをさらに含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターエレメントが、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流の肝臓特異的プロモーター配列である、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
- 前記肝臓特異的プロモーター配列と、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロン配列をさらに含む、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項15〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
- 請求項15〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 請求項15〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子に感染した、宿主細胞。
- インビトロで哺乳類の宿主細胞内に請求項15〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを導入する段階を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチドが前記哺乳類宿主細胞において複製能力がある、前記方法。
- 血友病Aの治療に使用するための、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を含む医薬組成物。
- インビトロで宿主細胞を請求項22に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させる段階を含む、宿主細胞に形質導入するための方法。
- 第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第VIII因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のC末端を前記軽鎖のN末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、前記第VIII因子ポリペプチドが、配列番号:19に対するアミノ酸置換I105V、A127S、G151K、M166T、及びL171Pを有し、
前記第VIII因子ポリペプチドの重鎖が、完全長の配列番号:3に対して少なくとも99%の相同性を有する第1のヌクレオチド配列によってコードされ、
前記第VIII因子ポリペプチドの軽鎖が、完全長の配列番号:4に対して少なくとも99%の相同性を有する第2のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
前記ポリペプチドリンカーが、furin切断部位と配列番号:55のアミノ酸配列を有するグリコシル化ペプチドとを含む、
前記ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドリンカーが、完全長の配列番号:38に対して少なくとも95%の相同性を有する第3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドリンカーが、配列番号:38の第3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントをさらに含む、請求項27〜29のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターエレメントが、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流の肝臓特異的プロモーター配列である、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
- 前記肝臓特異的プロモーター配列と、前記第VIII因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロン配列をさらに含む、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項27〜32のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
- 請求項27〜32のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 請求項27〜32のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子に感染した、宿主細胞。
- インビトロで哺乳類の宿主細胞内に請求項27〜32のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを導入する段階を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチドが前記哺乳類宿主細胞において複製能力がある、前記方法。
- 血友病Aの治療に使用するための、請求項34に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を含む医薬組成物。
- インビトロで宿主細胞を請求項34に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させる段階を含む、宿主細胞に形質導入するための方法。
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