JP6760477B2 - 細胞観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の状態を観察する細胞観察装置に関し、さらに詳しくは、デジタルホログラフィ顕微鏡により得られる、物体波と参照波との干渉縞を記録したホログラムに対する演算処理により物体の位相画像、強度画像等の再構成画像を作成する細胞観察装置に関する。

再生医療分野では、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた研究が盛んに行われている。一般に細胞は透明であって通常の光学顕微鏡では観察しにくいため、従来、細胞の観察には位相差顕微鏡が広く利用されている。
しかしながら、位相差顕微鏡では顕微画像を撮影する際に焦点合わせを行う必要があるため、広い観察対象領域を細かく区画したそれぞれの小領域についての顕微画像を取得するような場合、測定に多大な時間が掛かり実用的でないという問題がある。これを解決するために、近年、デジタルホログラフィ技術を用いたホログラフィック顕微鏡が開発され実用に供されている（特許文献１、２等参照）。

ホログラフィック顕微鏡では、光源からの光が物体表面で反射又は透過してくる物体光と同一光源から直接到達する参照光とがイメージセンサ等の検出面で形成する干渉縞（ホログラム）を取得し、そのホログラムに基づいた所定の演算処理を実施することで物体の再構成画像として強度画像や位相画像を作成する。こうしたホログラフィック顕微鏡では、ホログラムを取得したあとの位相回復等のための演算処理の段階で任意の距離における再構成画像を形成することができるため、撮影時にいちいち焦点合わせを行う必要がなく測定時間を短縮することができるという利点がある。

一方で、ホログラフィック顕微鏡における上記利点は、撮影により得られたホログラムに基づく画像を作成する段階で適切な焦点位置を決める必要があることを意味している。細胞培養プレート内で培養中の多能性細胞を観察する場合、細胞培養プレート内のいずれの位置にある細胞に対して焦点合わせを行うのかを観察者自身が目視により判断する必要がある。そのためには、例えば一つの細胞培養プレート全体又は該プレート中の一若しくは複数のウェル全体の領域について焦点位置の異なる画像（例えば位相画像）を複数作成し、この複数の画像を観察者が表示部の画面上で見比べて最も適切な合焦状態である画像を見つける作業が必要である。

しかしながら、焦点が異なる多数の画像を一覧で見ても、或いは、観察者がマウス等によるクリック操作で一枚ずつ画像を選択指示しながら確認しても、細かな部分の焦点が合っているのか否かを判定するのは難しいし手間も掛かる。
また、一つの細胞培養プレート全体や一若しくは複数のウェル全体の領域についての画像はサイズが大きいため、焦点位置が相違する複数の画像を作成するのには時間が掛かる。
さらにまた、一つの細胞培養プレート全体や一若しくは複数のウェル全体の領域について焦点位置が共通であるとは限らず、一つの細胞培養プレート内のウェル毎に底面の高さが相違していたり細胞培養プレートの底面が傾いていたりするために、観察対象領域全体に対して一つの焦点位置を決めることができないこともある。

国際特許公開第２０１６／０８４４２０号 特開平１０−２６８７４０号公報

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、ホログラフィック顕微鏡で得られたホログラムデータに基づいて位相画像等を作成して表示する細胞観察装置において、観察者が画像を確認しながら適切な焦点位置を決める作業の際に、目視による判断を容易にするとともにその作業性を向上させることを主たる目的としている。

上記課題を解決するために成された本発明は、細胞を含む試料をホログラフィック顕微鏡で測定することにより得られたホログラムデータに基づく演算処理を行うことで、位相、強度、又は擬似位相の少なくともいずれかの２次元分布を示す再構成画像を作成して表示部に表示する細胞観察装置であって、
a)前記ホログラフィック顕微鏡による１回の撮影で得られる所定の大きさの撮像単位に対応するホログラムデータに基づいて作成される再構成画像を複数繋ぎ合わせることで観察対象領域全体の再構成画像を作成し、前記表示部に表示する全体画像作成部と、
b)前記表示部に表示された観察対象領域全体の再構成画像上で、焦点位置合わせ対象範囲をユーザに指定させる焦点位置合わせ対象範囲指定部と、
c)前記焦点位置合わせ対象範囲指定部により指定された焦点位置合わせ対象範囲に対応するホログラムデータに基づいて、該焦点位置合わせ対象範囲が複数の撮像単位に跨る場合には該複数の撮像単位にそれぞれ対応する再構成画像を繋ぎ合わせることにより、前記焦点位置合わせ対象範囲における焦点位置が相違する複数の再構成画像を作成する焦点位置比較画像作成部と、
d)前記焦点位置が相違する複数の再構成画像のうちの一つが表示される画像表示枠と、焦点位置を所定範囲で変化させるための操作子であるスライダーとが配置された画面を前記表示部に表示する焦点位置合わせ用表示処理部と、
e)ユーザによる前記スライダーの操作に応じて前記焦点位置が相違する複数の再構成画像を選択し、前記画像表示枠中に描出させる焦点位置比較画像表示処理部と、
f)ユーザにより指定された前記焦点位置が相違する複数の再構成画像のうちの一つに対応する焦点位置を合焦位置であると決定する合焦位置決定部と、
を備えることを特徴としている。

上記擬似位相とは位相差顕微鏡における位相差に相当する値、即ち、強度の要素を含む位相情報である。
また、上記ホログラフィック顕微鏡はその方式を問わず、インライン型、オフアクシス型、位相シフト型などのいずれでもよい。

本発明に係る細胞観察装置では、典型的には、前記試料は細胞培養プレートであり、前記観察対象領域は該細胞培養プレート全体又は該プレートに形成されている一又は複数のウェルが含まれる領域とすることができる。即ち、本発明に係る細胞観察装置は、細胞培養プレートにおいて培養中である生体細胞を観察するのに好適な装置である。

本発明に係る細胞観察装置において、焦点位置比較画像作成部は例えば、細胞を培養中である細胞培養プレートに対して取得されたホログラムデータに基づいて、観察対象領域全体について焦点位置がそれぞれ相違する複数の位相画像を再構成画像として作成する。焦点位置合わせ用表示処理部は、所定の大きさの画像表示枠とスライダーとが配置された画面を表示部に表示するが、焦点位置比較画像表示処理部は、そのスライダーのつまみの位置に応じた焦点位置の位相画像を上記作成されている複数の位相画像の中から選択し、それを画像表示枠中に描出する。したがって、ユーザがポインティングデバイスによりスライダーのつまみを適宜に移動させる操作を行うと、その操作に応じて、同じ領域に対する異なる焦点位置の位相画像が次々に表示される。これにより、ユーザはスライダーのつまみを移動させながら、焦点位置の変化に伴う位相画像の変化、つまり画像ボケの状態を視覚的に確認することができる。

ユーザは例えば、着目している部分が最も明瞭に見える状態つまりは合焦状態になるようにスライダーのつまみを移動させたうえで、所定の操作を行う。この操作を受けて合焦位置決定部は、そのときに表示されている位相画像に対応する焦点位置が合焦位置であると決定する。もちろん、位相画像の代わりに強度画像や擬似位相画像を利用して同様の作業を行ってもよい。こうした一連の操作により、ユーザは容易に且つ的確に再構成画像の合焦位置を決めることができる。
また上記構成によれば、ユーザが焦点位置合わせ対象範囲を絞り込むことで、焦点位置比較画像作成部により作成される位相画像等の再構成画像のデータ量を少なく抑えることができる。それによって、位相情報等を算出する処理や得られた位相情報等を用いて画像を作成する処理を高速化することができる。その結果、合焦位置を決定する作業に掛かる時間を短縮し、細胞観察の作業を効率的に行うことができる。

焦点位置を正確に合わせるにはスライダーに割り当てられる焦点位置の変化のピッチが狭い、つまりはスライダーのつまみの移動に応じて少しずつ焦点位置が変化することが望ましいが、そうすると、つまみの可動範囲に対応する焦点位置の変化の範囲が狭くなり、その範囲から合焦位置が外れる可能性がある。
そこで、本発明に係る細胞観察装置では、好ましくは、前記スライダーに割り当てられる焦点位置の変化の範囲及びその変化のピッチをユーザが設定するための焦点位置合わせパラメータ設定部をさらに備える構成とするとよい。

この構成によれば、ユーザが焦点位置合わせパラメータ設定部によりスライダーに割り当てられる焦点位置の変化の範囲及びその変化のピッチを自由に設定できるので、例えばまず焦点位置の変化の範囲を広く（変化のピッチは狭く）設定したうえでおおまかに合焦位置を決めたあと、焦点位置の変化のピッチを広く（変化の範囲は狭く）設定し直して、より細かく合焦位置を探索することができる。それにより、より正確な合焦位置を見つけ易くなる。

また本発明に係る細胞観察装置では、
前記表示部に表示されている観察対象領域全体の再構成画像である広範囲表示画像上で、同一の焦点位置を適用可能である同一焦点位置適用範囲をユーザが指定するための同一焦点位置適用範囲指定部、をさらに備え、
前記焦点位置合わせ対象範囲指定部は、前記同一焦点位置適用範囲指定部により指定された同一焦点位置適用範囲毎に焦点位置合わせ対象範囲をユーザに指定させる構成とするとよい。

ここで、同一焦点位置適用範囲指定部は例えば、表示されている画像上で任意の形状、任意の大きさの範囲を指定可能なポインティングデバイスと、それにより指定された範囲を同一焦点位置適用範囲として認識する操作受付部と、から成るものとすることができる。
この構成によれば、例えば上述したように一つの細胞培養プレート中のウェル毎に適切な焦点位置が異なる場合であっても、ウェル毎に焦点位置を定めることができ、また逆に同一ウェル内では焦点位置を共通にすることができる。

また上記構成の細胞観察装置では、
前記広範囲表示画像上の一部の範囲をユーザが拡大観察範囲として指定するための拡大観察範囲指定部と、
該指定された拡大観察範囲について少なくとも前記広範囲表示画像よりも倍率の高い拡大画像を作成し該拡大画像を前記表示部の画面上に表示する拡大画像作成部と、
をさらに備える構成とするとよい。

拡大観察範囲指定部は上記範囲指定部と同様に、例えば、表示されている画像上で任意の形状、任意の大きさの範囲を指定可能なポインティングデバイスと、それにより指定された範囲を拡大観察範囲として認識する操作受付部と、から成るものとすることができる。

例えば一つの細胞培養プレートの全体やウェル全体である広範囲の位相画像等をユーザが見ても、焦点が合っているのか否かを判断することは難しい。これに対し、上記構成によれば、ユーザは広範囲表示画像上で指定した狭い範囲における拡大画像を確認して焦点が合っているのか否かを判断することができる。それにより、合焦位置か否かの判断の的確性が向上するし、そのための作業性も向上する。

また、表示されている広範囲表示画像上でユーザが拡大観察範囲を指定して拡大画像を表示させても、その拡大観察範囲が必ずしも所望の部分でない場合もある。また、それ以外の部分の画像の状態も確認したい場合もある。

そこで、本発明に係る細胞観察装置では、
前記表示部に表示されている前記広範囲表示画像上の前記拡大観察範囲を移動させる又は拡大若しくは縮小させる操作をユーザが行うための操作部をさらに備え、
前記拡大画像作成部は、前記操作部を介した操作による移動後の又は拡大若しくは縮小後の拡大画像を作成して表示することが好ましい。
これにより、ユーザは観察対象領域内の任意の部位における拡大画像を確認して焦点位置が適当か否かを判断することができる。

本発明に係る細胞観察装置によれば、観察者（ユーザ）が位相画像等の再構成画像を目視で確認しながら適切な焦点位置を決める作業を行う際に、合焦か否かの判断が容易に且つ的確に行える。それにより、細胞観察の作業自体の効率向上を図ることができるとともに、良好な再構成画像を利用した精度の高い細胞観察が可能となる。

本発明の一実施例である細胞観察装置の要部の構成図。 本実施例の細胞観察装置における画像作成処理の説明図。 本実施例の細胞観察装置における焦点合わせの際の操作及び処理を示すフローチャート。 本実施例の細胞観察装置における焦点合わせの際の焦点位置比較画像の表示手法の説明図。 本実施例の細胞観察装置における焦点位置合わせ画面の模式図。 本実施例の細胞観察装置における焦点位置合わせ時の説明図。 本実施例の細胞観察装置における焦点位置合わせ時の説明図。 本実施例の細胞観察装置における焦点位置合わせ時の説明図。

以下、本発明に係る細胞観察装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例の細胞観察装置の要部の構成図である。

本実施例の細胞観察装置は、顕微観察部１と、制御・処理部２と、ユーザーインターフェイスである入力部３及び表示部４と、を備える。
顕微観察部１はインライン型ホログラフィック顕微鏡（In-line Holographic Microscopy：ＩＨＭ）であり、レーザダイオードなどを含む光源部１０とイメージセンサ部１１とを備え、光源部１０とイメージセンサ部１１との間に、観察対象である細胞１３を含む細胞培養プレート１２が配置される。細胞培養プレート１２は例えばモータ等の駆動源を含む移動部１４により、Ｘ軸、Ｙ軸の２軸方向に移動自在である。

制御・処理部２は顕微観察部１の動作を制御するとともに顕微観察部１で取得されたデータを処理するものであって、撮影制御部２０、測定データ記憶部２１、位相情報算出部２２、全体画像作成部２３、焦点位置比較画像作成部２４、画像データ記憶部２５、合焦処理部２６、焦点位置情報記憶部２７、表示処理部２８、操作受付処理部２９などを機能ブロックとして備える。
なお、この制御・処理部２の実体はパーソナルコンピュータ又はより高性能なワークステーションであり、そうしたコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウェアを該コンピュータ上で動作させることで上記各機能ブロックの機能が実現される。したがって、入力部３はキーボードやマウス等のポインティングデバイスを含む。また、後述するように制御・処理部２の機能を一つのコンピュータでなく、通信ネットワークを介して接続された複数のコンピュータで分担する構成とすることもできる。

次に、本実施例の細胞観察装置において細胞観察を行う際の観察者の操作及び処理について図２〜図８を参照して説明する。図２は本実施例の細胞観察装置における画像作成処理の説明図、図３は焦点合わせの際の操作及び処理を示すフローチャート、図４は焦点合わせの際の焦点位置比較画像の表示手法の説明図、図５は焦点位置合わせ画面の模式図、図６〜図８は焦点位置合わせ時の説明図である。

観察者は解析対象である細胞（多能性細胞）１３が培養されている細胞培養プレート１２を所定位置にセットし、該細胞培養プレート１２を特定する識別番号や測定日時などの情報を入力部３から入力したうえで測定実行を指示する。本例では、図２（ａ）に示すように、細胞培養プレート１２には六個の上面視円形状のウェル５０が形成されており、その各ウェル５０内においてそれぞれ細胞が培養されている。そのため、この一つの細胞培養プレート１２全体、つまりは六個のウェル５０を含む矩形状の範囲全体が観察対象領域、即ち撮像対象範囲である。上記測定指示を受けて撮影制御部２０は、顕微観察部１を制御して以下のように撮像対象範囲についてのデータを取得する。

図１には示していないが、イメージセンサ部１１の同一のＸ−Ｙ平面上には四つのＣＭＯＳイメージセンサが設置されている。この四つのＣＭＯＳイメージセンサは、図２（ａ）に示した細胞培養プレート１２全体を４等分した四つの４分割範囲５１の撮影をそれぞれ担うものである。一つのＣＭＯＳイメージセンサが１回に撮影可能である範囲は図２（ｂ）及び（ｃ）に示すように、４分割範囲５１の中の１個のウェル５０のみを含む矩形状の範囲５２をＸ軸方向に１０等分、Ｙ軸方向に１２等分して得られる撮像単位５３に相当する範囲である。したがって、４分割範囲５１は１５×１２＝１８０個の撮像単位５３から成る。四つのＣＭＯＳイメージセンサは、Ｘ軸方向に１５個の撮像単位に対応する長さの長辺を有し、Ｙ軸方向に１２個の撮像単位に対応する長さの短辺を有する矩形の四つの頂点付近にそれぞれ配置されおり、同時に細胞培養プレート１２の異なる四つの撮像単位の撮影を行う。

撮影制御部２０による制御の下で光源部１０は、１０°程度の微小角度の広がりを持つコヒーレント光を細胞培養プレート１２の所定の領域に照射する。細胞培養プレート１２及び細胞１３を透過した光（物体光１６）は、細胞培養プレート１２上で細胞１３に近接する領域を透過した光（参照光１５）と干渉しつつイメージセンサ部１１に到達する。物体光１６は細胞１３を透過する際に位相が変化した光であり、他方、参照光１５は細胞１３を透過しないので該細胞１３に起因する位相変化を受けない光である。したがって、イメージセンサ部１１に配置されている四つのＣＭＯＳイメージセンサの検出面（像面）上には、細胞１３により位相が変化した物体光１６と位相が変化していない参照光１５との干渉像（ホログラム）がそれぞれ形成され、このホログラムに対応する２次元的な光強度分布データ（ホログラムデータ）がイメージセンサ部１１から出力される。

細胞培養プレート１２は移動部１４により、Ｘ−Ｙ面内で上記撮像単位５３のサイズに相当する距離だけステップ状に移動される。これにより、光源部１０から発せられるコヒーレント光の照射領域は細胞培養プレート１２上で移動し、イメージセンサ部１１における各ＣＭＯＳイメージセンサではそれぞれ一つの撮像単位５３に対応するホログラムデータを取得することができる。細胞培養プレート１２は移動部１４により、一つの４分割範囲５１内に含まれる撮像単位５３の数に相当する１８０回ステップ状に移動され、その移動毎にホログラムデータが取得される。このようにして、細胞培養プレート１２全体についてのホログラムデータを漏れなく得ることができる。

上述したように顕微観察部１のイメージセンサ部１１で得られたホログラムデータは逐次、制御・処理部２に送られ、測定データ記憶部２１に格納される。細胞培養プレート１２全体の測定が終了すると、制御・処理部２では、位相情報算出部２２が測定データ記憶部２１から上記撮像単位５３毎のホログラムデータを読み出し、光の逆伝播計算を実行することで細胞１３の光学厚さを反映した位相情報及び強度情報を算出する。全体画像作成部２３は、撮像単位５３毎に算出された位相情報に基づく狭い範囲の位相画像を繋ぎ合わせるタイリング処理（図２（ｄ）参照）を行うことで、観察対象領域つまりは細胞培養プレート１２全体の位相画像を作成する。表示処理部２８はこの観察領域全体の位相画像を表示部４の画面上に表示する（ステップＳ１）。

なお、こうした位相情報の計算や位相画像の作成の際には、特許文献１、２等に開示されている周知のアルゴリズムを用いればよい。なお、位相情報のほかに、ホログラムデータに基づいて強度情報や擬似位相情報なども併せて算出し、これらに基づく強度画像や擬似位相画像を作成して表示するようにしてもよい。

観察者は表示部４の画面上で観察対象領域全体の位相画像を視認し、その位相画像上で同一の焦点位置を適用可能である範囲（本発明における同一焦点位置適用範囲に相当）を入力部３（ポインティングデバイス）を用いた操作により指定する。具体的には、観察者がポインティングデバイスにより縦、横共に任意のサイズの矩形状の枠を位相画像上で指定して所定の操作を行うと、操作受付処理部２９は指定された枠で囲まれる範囲を同一焦点位置適用範囲であると認識する（ステップＳ２）。こうした操作を繰り返して、複数の同一焦点位置適用範囲を指定することができる。もちろん、こうした指定を行わずに観察対象領域全体について同一の焦点位置を適用可能としてもよい。
図６は、細胞培養プレート１２全体の位相画像２００上で、二つのウェル２０１に対応する領域について同一焦点位置適用範囲２１０が指定された例を示す模式図である。

次に、観察者は図７に示すように、細胞培養プレート１２全体の位相画像２００上で同一焦点位置適用範囲２１０毎に、焦点位置合わせに使用する局所的な焦点位置合わせ対象範囲２２０を指定する（ステップＳ３）。この指定の方法は同一焦点位置適用範囲２１０と同様でよく、観察者が着目している細胞が存在している部位など、鮮明に観察したい部位や焦点を合わせ易いと想定される部位を適宜に指定すればよい。ただし、細胞培養プレート１２全体の位相画像２００では一つ一つの細胞の輪郭等は見にくいので、着目している細胞を探索するのも難しい。そこで、観察者が適宜の焦点位置合わせ対象範囲２２０を指定したうえで所定の拡大操作を行うと、操作受付処理部２９を介して指示を受けた合焦処理部２６は、図８に示すように、指定された範囲のみに対応する位相画像の拡大画像２４０を作成し表示部４の画面上に表示する（ステップＳ４）。

また、観察者が細胞培養プレート１２全体の位相画像２００上で又は拡大画像２４０上で、その拡大画像２４０で示されている範囲を移動させたり拡大又は縮小させたりする操作を行うと、合焦処理部２６はその操作による移動後又は拡大・縮小後の拡大画像を作成し、表示されている拡大画像２４０を更新する。これにより、観察者は着目する細胞を探索しながら、またその細胞が鮮明に観察可能であるか否かを拡大画像２４０において確認しながら、適切な焦点位置合わせ対象範囲２２０を見いだすことができる。そうして適切な焦点位置合わせ対象範囲２２０が決まったならば、入力部３で所定の操作を行うことで焦点位置合わせ対象範囲２２０を確定させればよい。

上述のようにして同一焦点位置適用範囲２１０及び焦点位置合わせ対象範囲２２０を指定したあと、観察者は入力部３から焦点位置合わせの実行を指示する（ステップＳ５）。この指示を受けて合焦処理部２６は、指定されている一又は複数の焦点位置合わせ対象範囲２２０について、焦点位置が複数段階に相違する位相画像を焦点位置比較画像として作成し（図４参照）、その画像を構成する画像データを画像データ記憶部２５に格納する（ステップＳ６）。焦点位置合わせ対象範囲２２０の大きさは観察者が自在に設定可能であるので、焦点位置合わせ対象範囲２２０は一つの撮像単位５３に収まっている場合もあれば複数の撮像単位５３に跨っている場合もある。後者の場合には、位相画像を作成する際に上述したタイリング処理が実施される。このように、あとで閲覧する可能性がある焦点位置比較画像を事前に全て用意しておくことで、後述するような複数の焦点位置比較画像の連続的な確認の際に円滑な表示を行うことができる。

ステップＳ６で作成される焦点位置比較画像の焦点位置の範囲やピッチは、本装置を提供するメーカが予め適宜に定めておけばよい。これらのパラメータはユーザ（観察者や装置の管理者）が適宜に変更できるようにしてもよいが、作成される焦点位置比較画像の焦点位置の範囲やピッチによって後述する画像表示時における焦点位置の変化の範囲やピッチが制約を受けるので、焦点位置の範囲が狭くなりすぎないように、また焦点位置のピッチが広くなりすぎないようにしておくことが望ましい。

一方、表示処理部２８は表示部４の画面上に、図５に示すような焦点位置合わせ画面１００を表示する（ステップＳ７）。この焦点位置合わせ画面１００には、焦点位置比較画像を表示するための画像表示枠１０１とＧＵＩ部品の一つである焦点位置変更スライダー１０２とが配置されている。焦点位置合わせ画面１００を新たに表示する際には、デフォルトで定められている焦点位置の変化範囲及び焦点位置の変化のピッチの初期値を焦点位置変更スライダー１０２に割り当て、例えばその焦点位置の変化範囲内で最大又は最小の焦点位置に対応する焦点位置比較画像を画像データ記憶部２５から選択して画像表示枠１０１中に表示する。

観察者は焦点位置合わせ画面１００の画像表示枠１０１に表示されている焦点位置比較画像を見ながら、入力部３により、焦点位置変更スライダー１０２のつまみ１０３を適宜に移動させる操作を行う。すると、操作受付処理部２９を通してその指示を受けた合焦処理部２６は、つまみ１０３の位置に応じた焦点位置に対応付けられている焦点位置比較画像を画像データ記憶部２５から選択し、画像表示枠１０１中の表示画像を更新する（ステップＳ８）。

焦点位置が相違する焦点位置比較画像ではそれぞれ、画像ボケの状態が少しずつ異なる。そこで観察者は例えば、細胞の輪郭や模様といった着目している部分が最も鮮明に見えるか否か、つまり合焦状態であるか否かを判断し（ステップＳ９）、最も焦点が合った合焦位置を見つけるように焦点位置変更スライダー１０２のつまみ１０３の位置を調整する（ステップＳ１０）。そして、つまみ１０３を或る位置にしたときに合焦状態であると判断したならば（ステップＳ９でＹｅｓ）、焦点位置合わせ画面１００の下部に配置されている「決定」ボタン１０４をクリック操作することで焦点位置の決定を指示する（ステップＳ１２）。合焦処理部２６はこの指示を受けて、その時点におけるつまみ１０３の位置に応じた焦点位置が、そのときの焦点位置合わせ対象範囲２２０が含まれる同一焦点位置適用範囲２１０についての焦点位置であることを示す情報を焦点位置情報記憶部２７に格納する（ステップＳ１３）。

ただし、上述したようにデフォルトで定められている焦点位置の変化のピッチが粗すぎる、或いは、実際の合焦位置がデフォルトで定められている焦点位置の変化の範囲から外れているような場合には、観察者が焦点位置変更スライダー１０２のつまみ１０３の位置を調整しても合焦状態であると判断できる状態にならないことがある。その場合には、観察者は入力部３による所定の操作に応じて例えばポップアップ表示されるパラメータ設定用のダイアログ画面で、焦点位置変更スライダー１０２に割り当てる焦点位置の変化の範囲やピッチを適宜変更する（ステップＳ１１）。こうした変更が行われると、表示処理部２８はその変更後の焦点位置の変化範囲及びピッチを焦点位置変更スライダー１０２に割り当てる。そして、例えばその焦点位置の変化範囲内で最大又は最小の焦点位置に対応する焦点位置比較画像を画像データ記憶部２５から選択して画像表示枠１０１中に表示する（ステップＳ７）。このように上述したステップＳ７〜Ｓ１１の繰り返しにより、観察者は焦点位置比較画像を見ながら適切な焦点位置を決めることができる。

なお、同一焦点位置適用範囲２１０を複数設定した場合には、その同一焦点位置適用範囲２１０に含まれる焦点位置合わせ対象範囲２２０毎に、図３に示した操作及び処理を実施すればよい。これにより、観察対象領域全体つまりは細胞培養プレート１２全体の位相画像についての焦点位置を決めることができる。そして、焦点位置が決まったならば、その焦点位置に対応した細胞培養プレート１２全体の又はその一部の位相画像を改めて作成する処理を実施すればよい。
なお、強度画像や擬似位相画像については位相画像について求めた焦点位置を利用してもよいし、或いは、強度画像や擬似位相画像について位相画像と同様の手法で焦点位置を決めるようにしてもよい。

上記実施例の細胞観察装置では、観察者がスライダーを手動で操作するのに対応して異なる焦点位置比較画像が次々に表示されるが、焦点位置が相違する複数の焦点位置比較画像が自動的に次々に表示される自動再生機能を付加してもよい。この場合、焦点位置比較画像の自動再生を指示するボタンを用意しておき、そのボタンが操作されたならば、そのときに定められている焦点位置変化範囲内の焦点位置比較画像を自動的に順番に表示することで動画のように再生するとよい。このとき、再生の速度を調整できるようにしてもよい。こうした自動再生は特に、観察者がおおまかな焦点位置を判断するのに都合がよい。

また、図１に示した実施例の構成では、制御・処理部２において全ての処理を実施しているが、一般に、ホログラムデータに基づく位相情報の計算やその計算結果の画像化には膨大な量の計算が必要である。そのため、通常使用されているパーソナルコンピュータでは計算に多大な時間が掛かり効率的な解析作業は難しい。そこで、顕微観察部１に接続されたパーソナルコンピュータを端末装置とし、この端末装置と高性能なコンピュータであるサーバとがインターネットやイントラネット等の通信ネットワークを介して接続されたコンピュータシステムを利用してもよい。この場合、ホログラムデータに基づく位相情報の計算や位相画像の作成などの複雑な処理はサーバ側で実施し、それによって作成された画像データを端末装置が受け取って、この画像データに基づいて位相画像を表示する処理を端末装置側で行うようにするとよい。こうした構成では、図１に示した制御・処理部２の機能ブロックが端末装置側とサーバ側とに分離されることになる。このように、制御・処理部２の機能は複数のコンピュータで分担しても構わない。

また上記実施例の細胞観察装置では、顕微観察部１としてインライン型ホログラフィック顕微鏡を用いていたが、ホログラムが得られる顕微鏡であれば、オフアクシス型、位相シフト型などの他の方式のホログラフィック顕微鏡に置換え可能であることは当然である。

さらにまた、上記実施例及び上記記載の変形例はいずれも本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲でさらに適宜の変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…顕微観察部
１０…光源部
１１…イメージセンサ
１２…細胞培養プレート
１３…細胞
１４…移動部
１５…参照光
１６…物体光
２…制御・処理部
２０…撮影制御部
２１…測定データ記憶部
２２…位相情報算出部
２３…全体画像作成部
２４…焦点位置比較画像作成部
２５…画像データ記憶部
２６…合焦処理部
２７…焦点位置情報記憶部
２８…表示処理部
２９…操作受付処理部
３…入力部
４…表示部
１００…焦点位置合わせ画面
１０１…画像表示枠
１０２…焦点位置変更スライダー
１０３…つまみ
１０４…「決定」ボタン

Claims (6)

1. 細胞を含む試料をホログラフィック顕微鏡で測定することにより得られたホログラムデータに基づく演算処理を行うことで、位相、強度、又は擬似位相の少なくともいずれかの２次元分布を示す再構成画像を作成して表示部に表示する細胞観察装置であって、
   a)前記ホログラフィック顕微鏡による１回の撮影で得られる所定の大きさの撮像単位に対応するホログラムデータに基づいて作成される再構成画像を、複数繋ぎ合わせることで観察対象領域全体の再構成画像を作成し、前記表示部に表示する全体画像作成部と、
   b)前記表示部に表示された観察対象領域全体の再構成画像上で、焦点位置合わせ対象範囲をユーザに指定させる焦点位置合わせ対象範囲指定部と、
   c)前記焦点位置合わせ対象範囲指定部により指定された焦点位置合わせ対象範囲に対応するホログラムデータに基づいて、該焦点位置合わせ対象範囲が複数の撮像単位に跨る場合には該複数の撮像単位にそれぞれ対応する再構成画像を繋ぎ合わせることにより、前記焦点位置合わせ対象範囲における焦点位置が相違する複数の再構成画像を作成する焦点位置比較画像作成部と、
   d)前記焦点位置が相違する複数の再構成画像のうちの一つが表示される画像表示枠と、焦点位置を所定範囲で変化させるための操作子であるスライダーとが配置された画面を前記表示部に表示する焦点位置合わせ用表示処理部と、
   e)ユーザによる前記スライダーの操作に応じて前記焦点位置が相違する複数の再構成画像を選択し、前記画像表示枠中に描出させる焦点位置比較画像表示処理部と、
   f)ユーザにより指定された前記焦点位置が相違する複数の再構成画像のうちの一つに対応する焦点位置を合焦位置であると決定する合焦位置決定部と、
   を備えることを特徴とする細胞観察装置。
2. 請求項１に記載の細胞観察装置であって、
   前記試料は細胞培養プレートであり、前記観察対象領域は該細胞培養プレート全体又は該プレートに形成されている一又は複数のウェルが含まれる領域であることを特徴とする細胞観察装置。
3. 請求項１に記載の細胞観察装置であって、
   前記スライダーに割り当てられる焦点位置の変化の範囲及びその変化のピッチをユーザが設定するための焦点位置合わせパラメータ設定部をさらに備えることを特徴とする細胞観察装置。
4. 請求項１に記載の細胞観察装置であって、
   前記表示部に表示されている観察対象領域全体の再構成画像である広範囲表示画像上で、同一の焦点位置を適用可能である同一焦点位置適用範囲をユーザが指定するための同一焦点位置適用範囲指定部、をさらに備え、
   前記焦点位置合わせ対象範囲指定部は、前記同一焦点位置適用範囲指定部により指定された同一焦点位置適用範囲毎に焦点位置合わせ対象範囲をユーザに指定させることを特徴とする細胞観察装置。
5. 請求項４に記載の細胞観察装置であって、
   前記広範囲表示画像上の一部の範囲をユーザが拡大観察範囲として指定するための拡大観察範囲指定部と、
   該指定された拡大観察範囲について少なくとも前記広範囲表示画像よりも倍率の高い拡大画像を作成し該拡大画像を前記表示部の画面上に表示する拡大画像作成部と、
   をさらに備えることを特徴とする細胞観察装置。
6. 請求項５に記載の細胞観察装置であって、
   前記表示部に表示されている前記広範囲表示画像上の前記拡大観察範囲を移動させる又は拡大若しくは縮小させる操作をユーザが行うための操作部をさらに備え、
   前記拡大画像作成部は、前記操作部を介した操作による移動後の又は拡大若しくは縮小後の拡大画像を作成して表示することを特徴とする細胞観察装置。

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