JP6749617B2 - 抗菌性合剤の探索方法 - Google Patents

Description

本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物を有効成分として含有する抗菌性合剤に関する。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、健康を脅かす薬剤耐性病原体として最もよく知られている病原体の１つである。ＭＲＳＡの爆発的な流行に立ち向かうため、グリコペプチド系抗菌化合物であるバンコマイシン（以下、「ＶＣＭ」と略記する場合がある）は世界中の病院で患者の治療に用いられている。一方、ＶＣＭの乱用により、近年耐性株が出現するようになった。

ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institutes）では、バンコマイシン低感受性（中間耐性）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）は、ＶＣＭのＭＩＣ（minimum inhibitory concentration；最小発育阻止濃度）値が４〜８μｇ／ｍＬであると定義され、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）はＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であると定義されている。
ＶＲＳＡは蔓延してはいないが、βラクタム系抗生物質と同様に、黄色ブドウ球菌感染にＶＣＭが全く効かなくなることは時間の問題に過ぎない。よって、ＶＣＭ等の抗生物質に対して耐性を獲得するメカニズムの解明及び代替治療方法の開発は、近い将来に起こり得るＶＲＳＡの蔓延に備えるために極めて重要である。

これまでに、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との併用により、ＶＩＳＡの増殖阻害について相乗効果を示すことが示唆されている（非特許文献１、２）。
非特許文献１、２で用いられているＶＩＳＡに対する、ＶＣＭのＭＩＣ値は２μｇ／ｍＬ以下であり、そのＶＩＳＡについて、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果により、ＶＣＭのＭＩＣ値が１μｇ／ｍＬになったことが開示されている。
しかしながら、一般に抗菌化合物（抗生物質）の力価の評価において、２倍以下の差を評価することは難しいとされている。したがって、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果が本当にあるのか否かについて議論が残っている。また、非特許文献１、２において抗菌の対象となっている菌はＶＲＳＡではなくＶＩＳＡである。

また、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との併用により、臨床現場で分離されたＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果があるとしている文献がある（非特許文献３）。
非特許文献３で用いられているＶＲＳＡは、ＶＣＭ耐性エンテロコッカス菌からｖａｎＡ遺伝子を獲得したことにより、ＶＣＭ高耐性を獲得したと考えられている。
しかしながら、本当にｖａｎＡ遺伝子が転移することにより、ＶＣＭ高耐性を獲得するかどうかという点について議論が残っている。
更に、今後蔓延する可能性が指摘されているＶＣＭ耐性菌は、ｖａｎＡ遺伝子等の外来遺伝子の獲得によらず、菌自体が変異してＶＣＭ耐性を獲得するのではないかと考えられている。
したがって、ｖａｎＡ遺伝子転移に起因しない、ＶＣＭ高耐性菌に効果がある抗菌剤の開発が急がれる。

Steinkraus, G. et al, J Antimicrob Chemother., 60, 788-94, 2007 Werth, B. J. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57, 2376-9, 2013 Paige, M. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 2951-6, 2006

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、ＶＲＳＡに対しても十分に抗菌活性を発揮する新規の抗菌剤を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ｖａｎＡ遺伝子転移とは別の、変異蓄積により黄色ブドウ球菌に高ＶＣＭ耐性を獲得させる、すなわちＶＲＳＡを作製することができることを見出した。

そして、作製したＶＲＳＡを用いて初めて検討できた結果、本発明者らは、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物との併用により、上記作製したＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果を示すことを見出した。更に、これらの抗菌化合物の体内動態を一致させることにより、上記相乗効果が増強することを見出した。

すなわち、本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及びβラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗菌性合剤であり、該グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び該βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることにより相乗作用を発揮することを特徴とする抗菌性合剤を提供するものである。

本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、既に医療現場に蔓延しているＶＩＳＡや、将来医療現場で蔓延する危険性が指摘されている菌自体が変異することによりＶＣＭ耐性を獲得したＶＲＳＡに対して十分に抗菌活性を発揮する抗菌性合剤を提供することができる。

また本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物の体内動態を一致させることによって抗菌活性について相乗効果を発揮させるという特異な技術思想に基づいており、本発明の抗菌性合剤は新規性・進歩性を有する。

また、本発明の抗菌性合剤は、少なくともバンコマイシン耐性低感受性菌（ＶＩＳＡ）やバンコマイシン耐性菌（ＶＲＳＡ）の両者に上記相乗作用を発揮することができる。

（Ａ）ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示したグラフである。（Ｂ）ＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示すグラフである。 ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（左）ＭＲ３、（右）ＶＲ３ 本発明で作製した細菌変異株に対して行ったポピュレーション解析の結果を示すグラフである。（Ａ）親株がＭＲ３である細菌変異株、（Ｂ）親株がＭＲ７である細菌変異株 （Ａ）ＶＲ７（ＯＸＡ＋）に対するＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（Ｂ）ＯＸＡの濃度と、ＯＸＡとＶＣＭとの相乗効果との関係を示すグラフである。（Ｃ）ＯＸＡ存在下／非存在下におけるポピュレーション解析の結果を示すグラフである。 変異原処理により得られたＶＲＳＡに対するＶＣＭとの併用効果における、セフトリアキソン及びサイクロセリンの用量依存性の検討を行った結果を示すグラフである。 変異原処理により得られたＶＲＳＡに対する抗生物質の併用による治療効果の結果を示すグラフである。

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

本発明の抗菌性合剤は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩（以下、単に「グリコペプチド系抗菌化合物」と略記する場合がある）、及び、βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩（以下、単に「βラクタム系抗菌化合物」と略記する場合がある）を有効成分として含有する抗菌性合剤であり、該グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び該βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることにより相乗作用を発揮することを特徴とする。

本発明の抗菌性合剤は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及びβラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。

上記グリコペプチド系抗菌化合物の例として、バンコマイシン、テイコプラニン等が挙げられる。バンコマイシンを用いることが好ましい。

上記βラクタム系抗菌化合物の例として、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、チモシリン、アモキシシリン、ピペラシリン、タランピシリン、バカンピシリン、アンピシリン、チカルシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン等のペニシリン系抗菌化合物；セファロチン、セファゾリン、セフォチアム、セフメタゾール、セフォタキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォペラゾン、セフミノクス、ラタモキセフ、フロモキセフ、セフピロム、セフェピム、セフォゾプラン、セファレキシン等のセフェム系抗菌化合物；イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、テビペネム等のカルバペネム系抗菌化合物；等が挙げられる。
上記グリコペプチド系抗菌化合物と体内動態を一致させる点で、セフェム系抗菌化合物を用いることが好ましく、セフォジジム、セフトリアキソン又はセフミノクスを用いることがより好ましい。

本発明の抗菌性合剤は、上記グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び上記βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることによって、抗菌活性について相乗作用を発揮する。本明細書において、「体内動態」とは、「体内での化合物の吸収、分布、代謝、排泄等の動態」を指す。「体内での化合物の吸収」には、別化合物で該化合物の吸収が制御されている場合も含む。別化合物の例として、腸溶剤等が挙げられる。
上記体内動態が血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランス等の血中動態であることが好ましく、血中半減期であることがより好ましい。
カイコとヒトの体内動態が類似していることは既に知られている（例えば、特開２００９−０４７５５２号公報、特開２０１０−０７５０９６号公報等）。

例えば、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物の血中半減期を１〜１０時間にすることが好ましく、２〜９時間にすることがより好ましく、４〜８時間にすることが特に好ましい。

グリコペプチド系抗菌化合物に併用するβラクタム系抗菌化合物の血中半減期は、グリコペプチド系抗菌化合物の血中半減期の１／３倍〜３倍が好ましく、１／２倍〜２倍がより好ましく、１／１．５倍〜１．５倍が特に好ましく、１／１．２倍〜１．２倍が更に好ましい。
上記範囲であると、体内動態が一致していると言え、両者の相乗効果に基づく血中の細菌数の減少、並びにそれによる治療等の効果を発揮する。

グリコペプチド系抗菌化合物がバンコマイシンの場合、バンコマイシンの血中半減期は４．３〜５．２時間であるので、バンコマイシンと併用するβラクタム系抗菌化合物の血中半減期は、１．４３〜１５．６時間が好ましく、２．２〜１０．４時間がより好ましく、２．９〜７．８時間が特に好ましく、３．６〜６．２時間が更に好ましい。

本発明の抗菌性合剤は、少なくとも、バンコマイシン耐性低感受性菌とバンコマイシン耐性菌の両者に上記相乗作用を発揮する。バンコマイシン耐性低感受性菌として、バンコマイシン低感受性（中間耐性）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）等が挙げられる。バンコマイシン耐性菌として、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等が挙げられる。本発明は特に、バンコマイシン耐性菌用抗菌性合剤であり、更には、ＶＲＳＡ用抗菌性合剤である。
また、本発明の抗菌性合剤は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対しても抗菌活性を発揮する。

本発明の抗菌性合剤に対する、各抗菌化合物の含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができる。該抗菌性合剤全体を１００質量部としたときに、上記グリコペプチド系抗菌化合物は、０．１〜９０質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．５〜８５質量部、特に好ましくは１〜８０質量部の含量で配合することができる。また、上記βラクタム系抗菌化合物は、０．１〜９０質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．５〜８５質量部、特に好ましくは１〜８０質量部の含量で配合することができる。

本発明の抗菌性合剤は、上記有効成分に加えて、「その他の成分」を含有することができる。

前記抗菌性合剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌性合剤中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明の抗菌性合剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

本発明の抗菌性合剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。

また、前記抗菌性合剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記抗菌性合剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度、投与方法等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の経口投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記抗菌性合剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療（改善）的に投与されてもよい。

＜合剤の評価方法＞
また、本発明は、カイコでの体内動態が一致する２つ以上の化合物を、それぞれ合剤の候補とすることを特徴とする合剤のスクリーニング方法である。

本発明の合剤のスクリーニング方法において、上記体内動態は、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランス等のカイコの血中動態であることが好ましく、カイコの血中半減期であることがより好ましい。

上記体内動態が血中半減期であり、２つの化合物を合剤の候補とするとき、一方の化合物の血中半減期は、他方の血中半減期の１／３倍〜３倍が好ましく、１／２倍〜２倍がより好ましく、１／１．５倍〜１．５倍が特に好ましく、１／１．２倍〜１．２倍が更に好ましい。
上記範囲であると、体内動態が一致していると言え、両者の相乗効果に基づく効果を十分に発揮する。

［作用］
本発明において、グリコペプチド系抗菌化合物とβラクタム系抗菌化合物が相乗効果を発揮する作用・原理は明らかではなく、また、本発明は、かかる作用・原理の範囲に限定されるわけではないが、以下のことが考えられる。
βラクタム系抗菌化合物は、黄色ブドウ球菌のペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ、Penicillin Binding Proteins）に結合し、ペプチドグリカン生合成におけるペプチド鎖の架橋構造の形成を阻害し、抗菌活性を示す（Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775-781, doi:10.1038/35021219 (2000)）。ＭＲＳＡは、βラクタム系抗菌化合物に対する親和性が著しく低いＰＢＰ２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣ−ｍｅｃ領域をゲノムＤＮＡ中に含んでいることが知られており、このＰＢＰ２’の発現により菌は、βラクタム系抗生物質に対して耐性となる。
ＯＸＡは０．１２５μｇ／ｍＬ、ＣＴＲＸは０．５μｇ／ｍＬ、という単独では抗菌効果を示さない濃度で、ＶＲＳＡのＶＣＭに対するＭＩＣの顕著な低下を引き起こす。これらのβラクタム系抗菌化合物は、ＶＲＳＡのＰＢＰ２’以外のＰＢＰｓに作用して細胞壁合成に影響を及ぼしていると考えらえる。ＶＣＭは伸長しているＧｌｃＮＡＣ−ＭｕｒＮＡＣ単位末端のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａと結合してペプチドの架橋反応を阻害する。
よって、βラクタム系抗菌化合物のＰＢＰｓへの作用が、ＶＲＳＡの細胞壁の構造変化をもたらした結果、ＶＣＭが効果的に作用できるようになり、ＶＲＳＡの生育を止めると考えられる。

以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。

＜＜アルキル化剤処理及び薬剤耐性株の選択＞＞
アルキル化剤としてメタンスルホン酸エチル（以下、「ＥＭＳ」と略記する場合がある）を使用した。黄色ブドウ球菌（８種類のＭＲＳＡ及び４種類のＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌））をそれぞれ０．１％ＥＭＳ存在下で培養した。一晩培養後、ＥＭＳが存在しない培地に播種した。その後、薬剤を含有する寒天培地を用いて薬剤耐性菌を選択した。

＜＜ポピュレーション解析＞＞
ＢＨＩ培地（brain heart infusion broth）で培養し、一晩培養した培養液をＯＤ_５７６が０．３になるように希釈し、８、１６、２４、又は２８μｇ／ｍＬの薬剤（ＶＣＭ）を含む寒天培地に播いた。７２時間３７℃でインキュベーション後、プレート中のコロニー数を数えた。

＜＜抗菌活性の測定＞＞
各種抗菌化合物のＭＩＣ値の測定は、Ishii, et al., Sci Rep, 5, 17092, 2015に記載の方法を参考にした。簡潔に記述すると、寒天培地上で培養した各菌株のコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に懸濁後、ＯＤ_６００が０．５になるように調整した。調整した菌液をＣａ^２＋およびＭｇ^２＋を加えたMueller Hinton Broth（ＭＨＢ、Ｄｉｆｃｏ）に１／４００に希釈し、９６ウェル丸底プレートに分注した。この時、適当な濃度の抗菌化合物をＭＨＢに加えた。その後、分注した菌液入りＭＨＢに抗菌化合物を適当な濃度を各ウェルに２倍ずつ希釈した各種抗菌化合物を加え、３７℃で４８時間培養後、各ウェル内の菌液の生育を観察した。本実施例においては、ＭＩＣ値の比較において４倍以上の差がある場合、顕著な差があるとした。

＜＜カイコの飼育＞＞
実験に用いたカイコ幼虫は、Kaito, et al., Microb Pathog, 32, 183-190, 2002に記載の方法を参考にし、飼育した。簡潔に記述すると、愛媛蚕種株式会社から購入した受精卵（交雑種ふ・よう×つくば・ね）を、消毒した２７℃のインキュベーター内で孵化させて飼育した。飼料には、日本農産工業株式会社から購入した抗生物質入りの人工飼料であるシルクメイト２Ｓを用いた。４齢眠のカイコを分離し、１終夜絶食させ、脱皮したものを５齢１日目とした。

＜＜黄色ブドウ球菌カイコ感染モデルを用いた抗菌化合物の治療効果の検証＞＞
カイコ感染モデルを用いた抗菌化合物の治療効果の検証は、Hamamoto, et al., Antimicrob Agents Chemother, 48, 774-779, 2004に記載の方法を一部改変して行った。５齢１日目のカイコに対して、１．１〜１．２ｇの人工飼料（抗生物質を含まない、日本農産工業株式会社製）を与え、２７℃で約２０〜２４時間飼育した。翌日、黄色ブドウ球菌の終夜培養菌液の希釈液を５０μＬカイコに注射し（注射菌量は１匹のカイコ当たり１．１×１０^８細胞）、引き続いて生理食塩水又は様々な濃度の抗菌化合物を５０μＬずつカイコの体液内に注射した。注射に用いた各抗菌化合物の濃度は、バンコマイシン（ＶＣＭ）１００μｇ／ｍＬ、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ）８００μｇ／ｍＬ、オキサシリン（ＯＸＡ）８００μｇ／ｍＬであった。

菌液及び抗菌化合物を注射後、カイコを３７℃のインキュベーター内で培養し、経時的にカイコの生死を観察した。また、統計処理としてＰｒｉｓｍソフトによるログランクテスト（Log-rank test）を使用し、菌液と抗菌化合物を注射した後のカイコの生存率の経時的変化を求めた。更に、菌液と薬剤を注射した後の経過時間とその時のカイコの生存率をプロットして作成した生存曲線をもとに、黄色ブドウ球菌感染カイコの生存率が５０％となるのに要した時間を、半数致死時間（ＬＴ_５０）として求めた。

実施例１
［黄色ブドウ球菌臨床株からのＶＣＭ耐性変異株の選択］
まず、ＲＮ４２２０（メチシリン感受性実験室株）を親株として、連続突然変異誘発（ｓｅｒｉａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によるＶＣＭ耐性株を得ることを試みた。ＥＭＳ処理及びＶＣＭ耐性株選択（以下、「ＥＭＳ／ＶＣＭ選択」と略記する場合がある）により得られた変異株について、ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ａに示す。

図１Ａの横軸はＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。
その結果、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数が多くなるほど、ＶＣＭのＭＩＣ値が上昇することがわかった（図１Ａ、◇印）。

次に、日本においてそれぞれ異なる地域で単離された臨床ＭＲＳＡ株及びＭＳＳＡ株に対してＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った。結果を表１、図１Ａ及び図２に示す。

図１Ａの結果、親株に関わらず、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、全ての変異株においてＶＣＭのＭＩＣ値が上昇していた。

図２はＥｔｅｓｔ（登録商標、ビオメリュー社）を用いてＭＩＣ値の測定を行った結果である。３７℃で７２時間インキュベーション後にＭＩＣ値を測定した。左がＭＲ３（親株）、右がＶＲ３（ＶＲ３−ＥＭＳ２１、変異株）の結果である。
図２の結果より、微量希釈法以外の測定法でも、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株について、ＶＩＣのＭＩＣ値が上昇していたことがわかった。

また、１０回以上のＥＭＳ／ＶＣＭ選択後、ＭＲＳＡ由来変異株において、オキサシリン（ＯＸＡ）の感受性が増大していた（ＭＩＣ値が２μｇ／ｍＬ以下だった）。この結果は、ＶＣＭ耐性株の選択により、本来ＭＲＳＡが有する性質（βラクタム抗生物質に対する耐性）が欠損したことを意味し、既に報告されている結果と一致している（Sieradzki et al，1999）。

また、ＯＸＡ含有寒天培地におけるＶＣＭ耐性株の表現型の特徴を調べる過程において、ＯＸＡ感受性株の中に、ＯＸＡ耐性株が存在していることがわかった。そこで、得られた変異株を、５０μｇ／ｍＬのＯＸＡが存在する培地に移して、ＯＸＡ耐性株を単離（ＯＸＡ選択）し、更にその中からＶＣＭ耐性株の単離（ＥＭＳ／ＶＣＭ選択）を続けた。ＯＸＡ選択後にＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株についてＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ｂ及び表２に示す。

図１Ｂの横軸はＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。

表２中のＭＩＣ値は３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法を用いて測定した。「ＶＣＭ」はバンコマイシン、「ＶＣＭ＋ＯＸＡ」はオキサシリン（２μｇ／ｍＬ）存在下でのバンコマイシンのＭＩＣ値を示す。表２中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＲ１〜ＶＲ８については、それぞれＥＭＳ／ＶＣＭ選択の途中で、ＯＸＡ選択を行っており、Ｍｕ３及びＭｕ５０はＯＸＡ選択を行っていない。

表２の結果、合計１９〜２６回のＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、ＶＣＭに対して高い耐性を有するＭＲＳＡ由来変異株が得られた。更に該変異株は、ＯＸＡのＭＩＣ値も１２８μｇ／ｍＬ以上であり、ＯＸＡに対しても高い耐性を有していた。
また、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られたＶＲ１〜８については、オキサシリン存在下において、ＶＣＭのＭＩＣ値は、何れの変異株においても２μｇ／ｍＬとなった。この結果は、バンコマイシンとオキサシリンを併用することによって、ＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であるＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果が確認されたことを示している。

検討例１
［ＶＣＭ耐性株における抗生物質の感受性］
実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７）について、ＭＲＳＡ感染治療に用いられる抗生物質（アレベカシン（ＡＢＫ）、リネゾリド（ＬＮＺ）、ダプトマイシン（ＤＡＰ）、ゲンタマイシン（ＧＴＭ）及びリファンピシン（ＲＦＰ））の感受性を検証した。また近年本発明者らによって同定された、細胞膜中のメナキノンを標的としているライソシンＥ（ＬＹＥ）（Hamamoto，H et al，Nat Chem Biol.，11，127-33，2015、特許第５８７８３０２号等）についても感受性を検証した。更に、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果についても検証した。結果を表３及び図４に示す。

３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法によりＭＩＣ値を測定した。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。
表３の結果より、実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７株）は、ＶＲ７に対するダプトマイシンのＭＩＣ値を除いて、親株に対するＭＩＣ値とほぼ同じＭＩＣ値を示していた。これらの結果より、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択を繰り返すことによる高レベルのＶＣＭ耐性獲得には多剤耐性表現型は伴わないことがわかった。

また、表３の結果より、ライソシンＥはＶＲ３、ＶＲ７何れについても効果があった。よって、ライソシンＥはＶＣＭ耐性株に対して、代替化学療法の１つとして使用することができることがわかった。ライソシンＥは細菌の細菌膜に存在するメナキノンと相互作用し、細胞溶解を引き起こすことがわかっている。このような抗菌メカニズムは他の抗生物質の作用機序とは異なる。以上の結果は、ライソシンＥはＶＣＭ及び他の抗生物質とは異なる、新規の抗菌ターゲットを有することを示している。

また、表３中、「ＶＣＭ＋ＯＸＡ」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＣＦＺ」は２μｇ／ｍＬのＣＦＺを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＧＴＭ」は０．２５μｇ／ｍＬ（ＭＲ３及びＶＲ３）又は８μｇ／ｍＬ（ＭＲ７及びＶＲ７）のＧＴＭを含む培地を用いたときの、ＶＣＭのＭＩＣ値を示す。

表３の結果より、２μｇ／ｍＬのＯＸＡ存在下における、ＶＲ３及びＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値を微量希釈法によって測定した結果、それぞれ親株とほとんど変わらなかった。ＯＸＡと同じくβラクタム系抗生物質であるセファゾリンでも同様に、ＶＣＭ耐性株に対するＶＣＭの感受性が増加したが、アミノ配糖体系抗生物質であるゲンタマイシンでは変化がなかった。

図４Ａは２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有するミューラーヒントン寒天培地を用い、Ｅｔｅｓｔ（登録商標）によりＭＩＣ値を測定した結果である。図の写真は３７℃で７２時間インキュベーション後の結果であり、ＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値の結果である。
微量希釈法以外の測定法でも、ＯＸＡの存在下でのＶＣＭ耐性株のＶＣＭ感受性が上昇することを確認した。

図４ＢはＯＸＡ存在下で２４時間インキュベーション後に、微量希釈法によりＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果である。横軸はＯＸＡの濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）である。○はＭＲ７（親株）、◆はＶＲ７（変異株）の結果を示す。
ＶＲ７に対するＶＣＭ感受性は、ＯＸＡの濃度が０．１２５μｇ／ｍＬ以上の場合では、用量依存的に増加していた。

図４ＣはＯＸＡ存在／非存在下のポピュレーション解析の結果を示すグラフである。ＭＲ７又はＶＲ７を、ＶＣＭを含有するＢＨＩ寒天培地に播き、３７℃７２時間インキュベーション後のコロニー数を測定した。グラフ中の「ＯＸＡ−」はＯＸＡを含まない培地を用いた場合、「ＯＸＡ＋」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有する培地を用いた場合を示す。
ＯＸＡ存在下におけるＶＲ７のポピュレーション解析を行った結果、ＯＸＡの存在により劇的に、ＶＣＭに対して感受性を有する変異株が増えていた。

表３及び図４の結果より、本発明により作製されたＶＣＭ耐性菌においてβラクタム系抗生物質がＶＣＭと相乗的に作用していると考えられる。

実施例２
［錠剤の製造］
バンコマイシン塩酸塩１０ｍｇ、セフォジジムナトリウム１０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５〜１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。

実施例３
［液剤の製造］
テイコプラニン６ｍｇ及びセフトリアキソンナトリウム水和物４ｍｇを、２質量％２−ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。

実施例４
［セフトリアキソンとバンコマイシンとの併用効果］
次に、別のβラクタム系抗生物質であるセフトリアキソン（ＣＴＲＸ）とＶＣＭとの相乗効果の有無を、上記ＭＲ１〜８株及びＶＲ１〜８株について、検討した。
ＣＴＲＸ又はＶＣＭのＭＩＣ値、若しくはＣＴＲＸを併用した時のＶＣＭのＭＩＣ値を、３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法により測定した。
結果を表４に示す。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＣＭと併用したＣＴＲＸの濃度は４μｇ／ｍＬである。

表４の結果、８株のＶＣＭ耐性株（ＶＲ１〜８株）全てがＣＴＲＸ耐性（ＭＩＣ＞１２８μｇ／ｍＬ）を示したが、４μｇ／ｍＬの ＣＴＲＸ存在下では、ＶＲ８株を除く７株において、ＶＣＭに対するＭＩＣ値が顕著に低下することが分かった。特にＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３、ＶＲ６、ＶＲ７のＶＣＭに対するＭＩＣ値は、１／８に低下していた。ＶＲ８においても、ＶＣＭに対するＭＩＣ値は、ＣＴＲＸにより１／２に低下した。

ＶＲ１〜ＶＲ８株の８株は、それぞれ異なるＭＲＳＡから独立に分離されたＶＣＭ体制株である。したがって、βラクタム系抗菌化合物とＶＣＭの相乗効果は、今後出現することが危惧されるＶＲＳＡ全般に対しても見られるであろうと予想される。

更に、種々の濃度のセフトリアキソン（ＣＴＲＸ）存在下でのＶＣＭとの相乗効果の有無を検討した。結果を図５に示す。
図５中、縦軸がＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸がＣＴＲＸの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

図５の結果、ＶＲ７に対して、０．５μｇ／ｍＬ以上の濃度のＣＴＲＸが、ＶＣＭに対するＭＩＣ値の顕著な低下をもたらすことが分かった。

次に、ＯＸＡやＣＴＲＸ以外の様々なβラクタム系抗菌化合物が、ＶＲＳＡ株のＶＣＭに対するＭＩＣ値に及ぼす効果を検討した。結果を表５及び表６に示す。
表中、ＣＦＺはセファゾリン、ＤＭＰＰＣはメチシリン、ＡＢＰＣはアンピシリン、ＰＣＧはベンジルペニシリン、ＣＢＰＣはカルベニシリン、ＣＴＲＸはセフトリアキソン、ＣＥＸはセファレキシン、及びＭＣＩＰＣはクロキサシリンを示す。

ＭＲ７株とＶＲ７株を用い、３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法によりＭＩＣ値を測定した。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＣＭと併用した各βラクタム系抗菌化合物の濃度は２μｇ／ｍＬである。
表５及び表６の結果、検討した９種類何れのβラクタム系抗菌化合物についても、ＶＲ７のＶＣＭに対するＭＩＣ値（１６μｇ／ｍＬ）が、顕著に低下する（４μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）ことが分かった。

実施例５
［カイコ感染モデルを用いた、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物の併用による治療効果の評価］
一般に、抗菌化合物の治療効果の評価には、動物実験が必要不可欠である。なぜなら、抗菌化合物の体内動態の問題のために、試験管内の結果が必ずしも動物体内では反映されないからである。そこで、カイコの感染モデルを用いて、上記で分離したＶＲＳＡ株による感染症に対するＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物の併用による治療効果が見られるか否かを検討した。
ＶＲ７に感染したカイコに対して、生理食塩水、ＶＣＭ（５μｇ／匹）、ＯＸＡ（４０μｇ／匹）、及びＣＴＲＸ（４０μｇ／匹）を単独投与、またはＶＣＭとＯＸＡ、ＶＣＭとＣＴＲＸを併用投与した際の（ＶＣＭは５μｇ／匹、ＯＸＡ又はＣＴＲＸは４０μｇ／匹投与）、各時間におけるカイコの生存率（ＬＴ_５０、半数致死時間）を測定した。注射菌数は１．１×１０^８ｃｆｕ／匹であり、１群あたりｎ＝５で行った。
また統計処理として、ＶＣＭを単独投与した群、及びＶＣＭとＯＸＡ又はＣＴＲＸを併用投与した群の生存曲線をログランクテストに供し、Ｐ値を算出した。
検討結果を図６及び表７に示す。
図６中の縦軸はカイコの生存率（Survival silkworms）を示し、横軸はＶＲ７及び抗菌化合物を投与後の時間を示す。

ＶＲ７をカイコの体液中に注射するとカイコは感染死した。一方、ＶＣＭとＣＴＲＸを併用した場合には、ＶＣＭ単独に比べ、統計的に有意な差の延命効果が認められた （図６及び表７）。これに対してＶＣＭとＯＸＡを併用投与した群では、ＶＣＭ単独投与群と比べ延命効果に統計的に有意な差は認められなかった（図６及び表７）。また、４０μｇ／匹のＯＸＡ又はＣＴＲＸを単独投与したときは、延命効果はみられなかった（表７）。

＜実施例のまとめ＞
ＭＲＳＡの変異原処理により得られたＶＣＭ高度耐性ＭＲＳＡ（ＶＲＳＡ）を用いて、βラクタム系抗菌化合物（オキサシリン、セフトリアキソン、セファゾリン、メチシリン、アンピシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、セファレキシン、クロキサシリン）がインビトロ（in vitro）での抗菌効果の評価系において顕著なＶＣＭに対するＭＩＣの低下を引き起こすことを明らかにした。また、ＶＣＭとＣＴＲＸが、カイコを用いたインビボ（in vivo）での治療効果評価系において、相乗効果をもたらすことを見出した。
一方、ＶＣＭとＯＸＡの組み合わせは、カイコ感染モデルでは治療効果を示さなかった。これらの結果は、将来問題となることが危惧される高度ＶＣＭ耐性ＭＲＳＡ感染症に対して、ＶＣＭと特定のβラクタム系抗菌化合物の併用療法が有効であることを示唆された。

これまでに、in vitroにおけるＶＩＳＡに対する抗菌活性に、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物が相乗効果を示すことが指摘されている （非特許文献２）。しかしながら、従来の試験に用いられているＶＩＳＡのＶＣＭに対する耐性が低いため（ＭＩＣ≦８μｇ／ｍＬ）、ＭＩＣの低下で判定される相乗効果の有無については議論が残っていた。また、動物モデルでの治療効果に対するデータは得られていなかった。

本実施例で、変異原処理により得られたＶＲＳＡに対してin vitroにおいて抗菌活性の上昇が見られた８種類のβラクタム系抗菌化合物とＶＣＭの組み合わせが何れも、試験管内での菌の増殖に対して明瞭な相乗効果を示すことを明らかにした。さらに、カイコを用いたin vivoの感染治療評価系においても、ＣＴＲＸとＶＣＭが相乗効果をもたらすことを見出した（図６、表７）。
一方、カイコを用いたin vivoでの薬効評価において、ＯＸＡはＶＣＭとの併用効果を示さなかった（図６、表７）。ＯＸＡはヒトにおいて、血中半減期が短く、血清タンパク質の結合率が高く、体内動態に問題があることが指摘されている（Barza, M. & Weinstein, L. Some determinants of the distribution of penicillins and cephalosporins in the body. Practical and theoretical considerations. Ann N Y Acad Sci, 235, 613-620 (1974)）。ＯＸＡの血中半減期はカイコでも短いことが予測される。よって、ＯＸＡとＶＣＭによる治療に対する両者の相乗効果が、カイコ感染モデルで見られない原因であると示唆された。

ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合の相乗効果は、ＭＲＳＡの各種株に対してもわずかであるが見出された（表２、表５）。何れのＭＲＳＡもＶＣＭに対して感受性である為、ＭＩＣ値の低下を顕著な差として明確に判定することは困難である。しかしながら、現在問題となっている、ＭＲＳＡのＶＣＭ感受性に関するＭＩＣ Ｃｒｅｅｐと呼ばれる現象に対して、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合の併用効果は有用性があると示唆された。

既存薬を見直し、適用疾患を拡張させるドラッグリポジショニングが提唱されている（Ashburn, T. T. & Thor, K. B. Drug repositioning: identifying and developing new uses for existing drugs. Nat Rev Drug Discov 3, 673-683, doi:10.1038/nrd1468 (2004)）。このドラッグリポジショニングの考え方を元に、耐性菌の出現で使用が不適当であると判定される抗菌化合物を併用することにより再利用するとい「ドラッグリユース（Drug reuse）」という新たなコンセプトを本明細書で提案する。既に安全性や体内動態の問題がないことが立証されている抗菌化合物の組み合わせによる治療法の確立は、急速に出現する薬剤耐性菌感染症を低コストでしかも迅速に克服する上で有用であると示唆された。

本発明である新規の抗菌性合剤は、今後蔓延する可能性が指摘されているバンコマイシン耐性菌に対して有効性を示すことから、新たな感染症治療薬として利用可能である。

Claims (3)

1. グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び、βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の組み合わせに関し、
   連続突然変異誘発（serial mutagenesis）による変異蓄積によって、該グリコペプチド系抗菌化合物に対して耐性低感受性若しくは耐性を獲得させた黄色ブドウ球菌を用い、
   カイコ感染モデルにおけるカイコ生存率の測定、又は、該グリコペプチド系抗菌化合物と該βラクタム系抗菌化合物のカイコ血中半減期の比較によって、
   該組み合わせから治療効果を示す組み合わせを選択することを特徴とする抗菌性合剤の探索方法。
2. 上記グリコペプチド系抗菌化合物がバンコマイシンである請求項１に記載の抗菌性合剤の探索方法。
3. 上記βラクタム系抗菌化合物が、セフェム系抗菌化合物、ペニシリン系抗菌化合物、又は、カルバペネム系抗菌化合物である請求項１又は請求項２に記載の抗菌性合剤の探索方法。