JP2016149994A - 細菌変異株の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
これまでに、VCM耐性エンテロコッカス菌からのトランスポゾン及びプラスミド転移により獲得したvanA遺伝子を有する黄色ブドウ球菌において、VCMのMIC値が高値だったことが報告されている(非特許文献1)。
これまでに、RNAポリメラーゼのサブユニットをコードするrpoB、二成分制御系(細菌に広くみられる環境応答・細胞内情報伝達機構の総称)をコードするgraRS、walKR及びvraRSを含むいくつかの遺伝子変異がヘテロ型VISAにおけるVCM耐性メカニズムに関与していることが報告されている(非特許文献2〜4)。
これまでに本発明者により、形質転換効率が著しく低いことが知られている臨床分離MRSA株において、形質転換効率を高めて該微生物変異株を調製する方法が提案されている(特許文献1)。しかし、人為的にバンコマイシン耐性株を作製する方法はまだ知られていない。
(a)細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Aに対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程
特に、近年臨床現場での薬剤(治療薬)乱用による薬剤耐性菌の出現が問題となっているので、該細菌耐性株を用いて、細菌が薬剤耐性を獲得するメカニズムや該薬剤に対して高耐性となるメカニズムの解明や、新たな治療方法の開発を行うことができる。
(a)細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Aに対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程
工程(a)においては、細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Aに対して耐性を有する細菌変異株を選択する。
病原菌(病原性細菌)を用いることが、臨床現場での薬剤耐性菌の研究の観点から好ましい。病原菌の例として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(以下、「MRSA」と略記する場合がある)等の黄色ブドウ球菌、腸管病原性大腸菌等の大腸菌、結核菌、コレラ菌、レジオネラ菌、ミュータンス菌、インフルエンザ菌、百科咳菌、肺炎菌等が挙げられる。黄色ブドウ球菌を使用することがより好ましく、MRSAを用いることが特に好ましい。
本発明においては、アルキル化剤を用いて公知の手段により、細菌を変異原処理し、細菌変異体を得ることができる。例えば、本明細書の実施例のように、アルキル化剤が存在する培地で細菌を一定時間培養することにより、細菌変異株を得ることができる。
すなわち、薬剤Bに対して耐性を有する細菌変異株を選択(以下、「薬剤B選択」と略記する場合がある)する前に行う工程(a)の回数をm回、薬剤B選択後に行う工程(a)の回数をn回とすると、以下の3つの要件を満たす必要がある。
(1)m≧2、(2)n≧2、(3)m+n≧5
好ましくはm≧5及びn≧5であり、より好ましくはm≧7及びn≧7、特に好ましくはm≧10及びn≧10である。また、好ましくはm+n≧10、より好ましくはm+n≧15、特に好ましくはm+n≧20である。
例えば、本明細書の実施例において、ライソシンE(NITE BP−870から生産される抗生物質)は、薬剤A(バンコマイシン)に対して耐性を有する細菌変異株に対して効果があったことより、ライソシンEはバンコマイシン耐性菌に対しての、代替化学療法の1つとして使用することができると考えられる(表4)。
本発明(後述の実施例)では、高VCM耐性を有する黄色ブドウ球菌の作製に取り組み、実験室株及び臨床株を用いて作製した変異株の表現型を検証した。異なる起源(親株)それぞれから、高VCM耐性変異株を実験室レベルで作製したのは本発明が最初である。
本明細書の実施例及び検討例においても、MRSAを親株としてEMSによる変異原処理及びバンコマイシン耐性菌の選択(以下、「EMS/VCM選択」と略記する)を行ったところ、OXAのMIC値が減少していた。シーソー効果が起こる詳細なメカニズムはまだ解明されていない。
VCM及びOXA両方に対して耐性を有する変異株について、アレベカシン、リネゾリド及びリファンピシンのような異なる抗菌メカニズムを有する抗生物質には感受性を有していた(表4)。更に、このVCM耐性株はライソシンEに対しても感受性を有していた。
一方で、本発明(後述の実施例)で作製したVCM耐性株VR7は、親株と比較してダプトマイシンに対して耐性を有するようになっていた。VCM及びダプトマイシン両方に対して耐性を有するVISAは報告されている。
VISAにおいて、OXA及びVCM、又は、CFZ及びVCMを組み合わせて使用すると、VCMのMIC値が低下することは報告されている。また、当該報告において、βラクタム系抗生物質が、細胞壁の肥厚化を阻害し、不活性細胞壁ターゲット(non-active cell wall targets)によりVCMの隔離を阻害している可能性が示唆されている。
GENとVCMを組み合わせて使用した場合、VCM感受性は上がらなかったので、VCMは特異的にβラクタム系抗生物質と相乗作用することがわかった。
以上のことは、臨床現場における抗生物質の選択に注意を要することを示している。臨床現場に存在するVISAよりも更に高VCM耐性を有する病原菌が将来出現するための備えとして、本発明で作製されたVCM耐性株を用いて、代替治療方法の探索方法をすることができる。
本発明の検討例では、非コード領域(タンパク質をコードしていない領域)の変異状況については観察していないにも関わらず、20倍以上の変異が誘発されていることがわかった。以下に示す推算により、EMS/VCM選択によって、3変異株以上で、変異が起こっていたオーバーラップ遺伝子の数がEMS処理のみに比べて多くなっていた。
EMS/VCM選択は、EMS単独処理に比べて20倍多く変異が観察されたので、15個に1個の割合で変異が起こっているとする。
その場合、3、4又は5の独立した株で同じ遺伝子に変異が起こっている確率は、それぞれ(1/15)3、(1/15)4、(1/15)5となる。一方、EMS単独処理の場合の確率はそれぞれ、1未満となる(0.9、0.06、0.004)。
以上の推算及びVCM耐性に関与しているとされる遺伝子についての報告より、各VCM耐性株で共通して変異が見られた遺伝子がVCM耐性に関与していると考えられる。
そこで、本発明(の実施例)で得られた、親株がそれぞれ異なるVCM耐性株を用いて、低MIC値群と高MIC値群間で、変異状況を比較した(図6)。
その結果、(i)低MIC値群では変異が起こっているが、高MIC値群では変異が起こっていない遺伝子が多く検出されたこと、(ii)高MIC値群間で変異が起こっていた遺伝子が完全に一致しなかったことから、高VCM耐性となるメカニズムは、1つだけではないことがわかった。
ausA遺伝子はaureusimineと呼ばれる黄色ブドウ球菌におけるペプチドの二次代謝に関与する物質をコードしている。sdrCは細菌表面に接着する物質をコードし、細菌毒性に関与していることが報告されている。SA1584はリゾホスホリパーゼL2をコードし、この酵素は大腸菌でリン脂質のターンオーバーに関与していることが報告されている。
黄色ブドウ球菌において、細胞質膜のリン脂質を別の物質に変換すると、VCMを含む抗生物質に対して耐性を有することが報告されている。上記3つの遺伝子は黄色ブドウ球菌に必須の遺伝子ではないので、得られたVCM耐性株で成長速度が遅くなること及び代謝の変化は、これらの3つの遺伝子が直接起因している可能性は低いと考えられる。
また、本実施例で作製した高VCM耐性株の表現型は、walK又はrpoBに変異が起こっているVISA株と共通の特徴を有していた(細胞壁の肥厚化及び増殖異常)。VISA表現型に関与している遺伝子に変異が発見されたことより、VISAよりも高VCM耐性である菌が将来出現する可能性が考えられる。
アルキル化剤としてメタンスルホン酸エチル(以下、「EMS」と略記する場合がある)を使用した。黄色ブドウ球菌(8種類のMRSA及び4種類のMSSA(メチシリン感受性黄色ブドウ球菌))をそれぞれ0.1%EMS存在下で培養した。一晩培養後、EMSが存在しない培地に播種した。その後、薬剤を含有する寒天培地を用いて薬剤耐性菌を選択した。
BHI培地(brain heart infusion broth)で培養し、一晩培養した培養液をOD576が0.3になるように希釈し、8、16、24、又は28μg/mLの薬剤(VCM)を含む寒天培地に播いた。72時間37℃でインキュベーション後、プレート中のコロニー数を数えた。
[黄色ブドウ球菌臨床株からのVCM耐性変異株の選択]
まず、RN4220(メチシリン感受性実験室株)を親株として、連続突然変異誘発(serial mutagenesis)によるVCM耐性株を得ることを試みた。EMS処理及びVCM耐性株選択(以下、「EMS/VCM選択」と略記する場合がある)により得られた変異株について、VCMのMIC値を測定した結果を図1Aに示す。
その結果、EMS/VCM選択回数が多くなるほど、VCMのMIC値が上昇することがわかった(図1A、◇印)。
図2の結果より、微量希釈法以外の測定法でも、EMS/VCM選択により得られた変異株について、VICのMIC値が上昇していたことがわかった。
表2の結果、合計19〜26回のEMS/VCM選択により、VCMとOXA両方に対して高い耐性を有するMRSA由来変異株が得られた。MSSA(MS9、MSSA1、Newman、及びRN4220)を親株とした場合も、EMS/VCM選択により分離した変異株において、VCMのMIC値が高かった(表2)。この結果は、MRSAのSCCmec領域がVCM耐性表現型獲得に不要である可能性を示している。臨床分離株MR3由来である、EMS/VCM選択により得られた変異株VR3(EMS/VCM選択を21回行ったことにより得られた変異株)に対するVCMのMIC値は32μg/mL、OXAのMIC値は256μg/mL以上であった(図2、表2)。
[ポピュレーション解析]
これまでの研究により、VISAとして臨床分離されたMu3及びヘテロ型VISAとして臨床分離されたMu50の中は、VCMに対してヘテロ耐性を有する細菌が含まれることが報告されている(Hiramatsu,K.,et al,1997)。そこで、EMS/VCM選択中に分離した、VCMのMIC値が4又は8μg/mLのVCM低感受性変異株を用いてヘテロ型が存在するか検証した。以下、本実施例・検討例において、MR3を「MR3−EMS0」、MR7を「MR7−EMS0」、VR3を「VR3−EMS21」、VR7を「VR7−EMS23」と示す場合がある。また、MR3又はMR7を親株としてEMS/VCM選択を6回又は10回行ったものを、それぞれ「VR3−EMS6」、「VR3−EMS10」、「VR7−EMS6」、「VR7−EMS10」と示す。結果を図3に示す。
VR3−EMS21変異株及びVR7−EMS23変異株からは、それぞれMIC値が28μg/mL、24μg/mLのコロニーが得られた(図3A及びB)。また、VR3−EMS6、VR3−EMS10、VR7−ENS6及びVR7−EMS10株に対するVCMのMIC値は、それぞれ中程度(低感受性)のVCM耐性を示した(図3A及びB)。更にヘテロ型VCM耐性株は、Mu3株及びMs50株と同様に、VR3−EMS10及びVR7−EMS10変異株でも観察された(図3A及びB)。
以上より、黄色ブドウ球菌臨床分離株からEMS/VCM選択を繰り返すことにより高いVCM耐性を示す変異株を獲得することができることがわかった。
[倍加時間の比較]
実施例1で得られた変異株(VR3及びVR7)を用いて、親株(MR3及びMR7)との表現型の違いを観察した。
まず、倍加時間(Doubling time)の比較を行った。結果を表3に示す。
表3より、VR3を含むVCM耐性変異株は、親株と比べて倍加時間が長くなっていった。
[VCM耐性株における抗生物質の感受性]
実施例1で得られた変異株(VR3及びVR7)について、MRSA感染治療に用いられる抗生物質(アレベカシン(ABK)、リネゾリド(LNZ)、ダプトマイシン(DAP)、ゲンタマイシン(GEN)及びリファンピシン(RFP))の感受性を検証した。また近年本発明者らによって同定された、細胞膜中のメナキノンを標的としているライソシンE(LYE)(Hamamoto,H et al,in press)についても感受性を検証した。結果を表4に示す。
表4の結果より、実施例1で得られた変異株(VR3及びVR7株)は、VR7に対するダプトマイシンのMIC値を除いて、親株に対するMIC値とほぼ同じMIC値を示していた。これらの結果より、EMS/VCM選択を繰り返すことによる高レベルのVCM耐性獲得には多剤耐性表現型は伴わないことがわかった。
[βラクタム系抗生物質とVCMとの相乗作用]
これまでに、臨床分離されたVISA株について、VCMはβラクタム抗生物質と相互作用する可能性があることが報告されている(Werth,B.J.et al,2013)。そこで、実施例1で得られたVCM耐性株において、βラクタム系抗生物質とVCMとの相乗効果がみられるか検証した。結果を図4及び表5に示す。
微量希釈法以外の測定法でも、OXAの存在下でのVCM耐性株のVCM感受性が上昇することを確認した。
VR7に対するVCM感受性は、OXAの濃度が0.125μg/mL以上の場合では、用量依存的に増加していた。
OXA存在下におけるVR7のポピュレーション解析を行った結果、OXAの存在により劇的に、VCMに対して感受性を有する変異株が増えていた。
[細胞壁の観察]
これまでに、VISAの細胞壁が厚いことが報告されている(Cui,L. et al,2000)。そこで、透過型電子顕微鏡を用いて、実施例1で得られた変異株の細胞壁の構造を観察した。結果を図5に示す。
図5Aは各株(MR3、VR3、MR7、VR7)の透過型電子顕微鏡による写真(スケールバーの長さは200nmを示す)である。
図5Bは各株の細胞壁の厚さの測定結果である。データはn=30〜41の菌数におけるmean±SDを示す。統計的優位性は多重比較検定(Tukey’s multicomparison test)による一元配置分散分析法を用いて系統ごとに解析した。
また、親株がMR3である菌株間のP値はいずれも0.001未満であった。親株がMR7である菌株間のP値は、VR7−EMS6及びVR7−EMS10間は0.05未満であったが、それ以外は0.001未満であった(図5B)。
以上の結果より、変異蓄積により、VCM耐性と共に細胞壁の肥厚化が誘導された可能性が考えられる。
[VCM耐性株における変異遺伝子の同定]
VCM耐性に関与している可能性がある遺伝子を探索するために、7つのMRSA及びその変異株(MR/VR1、2、3、4、5、7、8)、及びRN4220及びその変異株(RN4220及びVR−4220)について、次世代シークエンサーを用いて全ゲノム配列解析を行った。
それぞれのMRSA株について、多座位配列タイピング(MLST:multi−locus sequence typing)を行い、5つの株(MR1、3、5、7、8)についてはST5と分類し、残りの2つの株(MR2、4)はST8と振り分けた。MRSA株であるN315及びUSA300はそれぞれ、ST5及びST8の代表的な菌株であるので、この2つの菌株のゲノム配列を参照ゲノム(reference gemome)として使用した。各々のゲノム配列を参照ゲノム配列と比較して、各セット(親株とその変異株)間のコード領域の違いを検証した。
表6中、1つの遺伝子(SA0615;graS)は8変異株中5つの変異株で、変異が起こっていることが確認された。VCM耐性に関与している遺伝子として報告されているSA0500(rpoB)及びSA0501(rpoC)を含む7つの遺伝子について、8変異株中4つの変異株で変異が起こっていた。更に、臨床VISAにおいて変異が起こっていたことが報告されているSA0018(walK)を含む6つの遺伝子について、3つの変異株で変異が起こっていた。
Claims (10)
- 下記(a)の工程を含有する、薬剤Aに対して耐性を有する細菌変異株の作製方法であり、下記(a)の工程を少なくとも5回以上繰り返すことを特徴とする細菌変異株の作製方法。
(a)細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Aに対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程 - 上記細菌は黄色ブドウ球菌である請求項1に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)である請求項1又は請求項2に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記薬剤Aはバンコマイシンである請求項1ないし請求項3の何れかの請求項に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記アルキル化剤がメタンスルホン酸エチル(EMS)である請求項1ないし請求項4の何れかの請求項に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記(a)工程を複数回繰り返した後、得られた細菌変異株から薬剤Bに対して耐性を有する細菌変異株を選択し、更に上記(a)工程を複数回繰り返すことにより、薬剤A及び薬剤Bに対して耐性を有する細菌変異株を作製する請求項1ないし請求項5の何れかの請求項に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記(a)工程を少なくとも10回以上繰り返した後、得られた細菌変異株から薬剤Bに対して耐性を有する細菌変異株を選択し、更に上記(a)工程を10回以上繰り返す請求項6に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記薬剤Bはβラクタム系抗生物質である請求項6又は請求項7に記載の細菌変異株の作製方法。
- 上記βラクタム系抗生物質はオキサシリンである請求項8に記載の細菌変異株の作製方法。
- 請求項1ないし請求項9の何れかの請求項に記載の細菌変異株の作製方法によって作製された細菌変異株を用いることを特徴とする抗生物質のスクリーニング方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5544597B1 (ja) * | 1969-06-09 | 1980-11-13 | ||
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WO2000028015A1 (fr) * | 1998-11-11 | 2000-05-18 | Japan Science And Technology Corporation | Methode de mutagenese |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. Vol. 44, No. 2, JPN6019000743, February 2000 (2000-02-01), pages pp. 294-303 * |
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. Vol. 41, No. 4, JPN6019000745, April 2003 (2003-04-01), pages pp. 1687-1693 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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