JP6823358B2

JP6823358B2 - 細菌変異株の作製方法

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Publication number: JP6823358B2
Application number: JP2015030271A
Authority: JP
Inventors: 関水　和久; 和久関水; 洋浜本
Original assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Current assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Priority date: 2015-02-19
Filing date: 2015-02-19
Publication date: 2021-02-03
Anticipated expiration: 2035-02-19
Also published as: JP2016149994A

Description

本発明は、薬剤に対して耐性を有する細菌変異株の作製方法、及び該細菌変異株の作製方法によって作製された細菌変異株を用いる、抗生物質のスクリーニング方法に関する。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、健康を脅かす薬剤耐性病原体として最もよく知られている病原体の１つである。ＭＲＳＡの爆発的な流行に立ち向かうため、バンコマイシン（以下、「ＶＣＭ」と略記する場合がある）は世界中の病院で患者の治療に用いられている。一方、ＶＣＭの乱用により、近年耐性株が出現するようになった。

ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institutes）では、バンコマイシン低感受性（中間耐性）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）は、ＶＣＭのＭＩＣ（minimum inhibitory concentration；最小発育阻止濃度）値が４〜８μｇ／ｍＬであると定義され、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）はＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であると定義されている。ＶＲＳＡは蔓延してはいないが、βラクタム系抗生物質と同様に、黄色ブドウ球菌感染にＶＣＭが全く効かなくなることは時間の問題に過ぎない。よって、ＶＣＭ等の抗生物質に対して耐性を獲得するメカニズムの解明及び代替治療方法の開発は、近い将来に起こり得るＶＲＳＡの蔓延に備えるために極めて重要である。
これまでに、ＶＣＭ耐性エンテロコッカス菌からのトランスポゾン及びプラスミド転移により獲得したｖａｎＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌において、ＶＣＭのＭＩＣ値が高値だったことが報告されている（非特許文献１）。

ＶＲＳＡは比較的限られた地域で分離されているが、広範囲では確認されていない。一方、ＶＩＳＡは世界中の病院で確認されている。また、ＶＩＳＡのＶＣＭ耐性は、耐性カセットを外部から得るよりも変異蓄積により獲得することが示唆されている。現在、ゲノム全体での分析及び臨床分離株を用いたゲノム操作による、ＶＩＳＡにおけるＶＣＭ耐性のメカニズムの研究が進められている。
これまでに、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードするｒｐｏＢ、二成分制御系（細菌に広くみられる環境応答・細胞内情報伝達機構の総称）をコードするｇｒａＲＳ、ｗａｌＫＲ及びｖｒａＲＳを含むいくつかの遺伝子変異がヘテロ型ＶＩＳＡにおけるＶＣＭ耐性メカニズムに関与していることが報告されている（非特許文献２〜４）。

ＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であるＶＲＳＡ株は、臨床検体から分離しにくく、高ＶＣＭ耐性化のメカニズムは未だに解明されていない。
これまでに本発明者により、形質転換効率が著しく低いことが知られている臨床分離ＭＲＳＡ株において、形質転換効率を高めて該微生物変異株を調製する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、人為的にバンコマイシン耐性株を作製する方法はまだ知られていない。

特開２００３−００９８８２号公報

Chang，S．et al，N Engl J Med.，348，1342-7，2003 Kuroda，M．et al，Biochem Biophys Res Commun.，269，485-90，2000 Cui，L．et al，Antimicrob Agents Chemother.，49，3404-13，2009 Matsuo，M．et al，Antimicrob Agents Chemother.，55，4188-95，2011

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、臨床検体から分離しにくいＶＲＳＡ等の薬剤耐性株を人為的に作製する方法を提供することである。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程を複数回繰り返すことにより、該薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を作製することができることを見出した。

また、本発明者らは、上記工程を複数回繰り返した後、得られた細菌変異株から上記薬剤とは作用機序が異なる薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を選択し、更に上記工程を複数回繰り返すことにより、作用機序が異なる２種類の薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を作製できることを見出したことに基づき、本発明をするに至った。

すなわち、本発明は、下記（ａ）の工程を含有する、薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株の作製方法であり、下記（ａ）の工程を少なくとも５回以上繰り返すことを特徴とする細菌変異株の作製方法を提供するものである。
（ａ）細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程

また、本発明は、上記細菌変異株の作製方法によって作製された細菌変異株を用いることを特徴とする抗生物質のスクリーニング方法を提供するものである。

本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、臨床検体から分離しにくい薬剤耐性株を人為的に作製することができる。また、本発明は、親株の起源に関わらず、目的の薬剤耐性株を作製することができる。

また、本発明である細菌変異株の作製方法は、１種類の薬剤のみならず、２種類以上の薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を作製することができる。また、本発明により作製された細菌変異株は多剤耐性表現型を伴わないことにより、目的の薬剤のみに耐性を有する細菌変異株を作製することができる。

また、本発明である細菌変異株の作製方法は、高度なテクニックを必要としない。また、本発明では、プラスミドを用いた遺伝子導入技術を用いず、変異蓄積により細菌変異株を作製するので、本発明で作製された細菌変異株は、細菌の進化の解明に用いることもできる。

また、作製された細菌耐性株は、抗生物質のスクリーニング等に用いることができる。
特に、近年臨床現場での薬剤（治療薬）乱用による薬剤耐性菌の出現が問題となっているので、該細菌耐性株を用いて、細菌が薬剤耐性を獲得するメカニズムや該薬剤に対して高耐性となるメカニズムの解明や、新たな治療方法の開発を行うことができる。

（Ａ）ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示したグラフである。（Ｂ）ＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示すグラフである。ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（左）ＭＲ３、（右）ＶＲ３本発明で作製した細菌変異株に対して行ったポピュレーション解析の結果を示すグラフである。（Ａ）親株がＭＲ３である細菌変異株、（Ｂ）親株がＭＲ７である細菌変異株（Ａ）ＶＲ７（ＯＸＡ＋）に対するＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（Ｂ）ＯＸＡの濃度と、ＯＸＡとＶＣＭとの相乗効果との関係を示すグラフである。（Ｃ）ＯＸＡ存在下／非存在下におけるポピュレーション解析の結果を示すグラフである。（Ａ）本発明で作製した細菌変異株を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（Ｂ）本発明で作製した細菌変異株の細胞壁の厚さを測定した結果を示すグラフである。低ＭＩＣ値群と高ＭＩＣ値群間の、変異遺伝子の比較を行った図である。

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

本発明の細菌変異株の作製方法は、下記（ａ）の工程を含有する、薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株の作製方法であり、下記（ａ）の工程を少なくとも５回以上繰り返すことを特徴とする。
（ａ）細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株を選択する工程

上記作製方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。以下、工程（ａ）について説明する。

＜工程（ａ）＞
工程（ａ）においては、細菌をアルキル化剤で変異原処理し、得られた細菌変異株から薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株を選択する。

本発明で用いられる細菌については特に制限がなく、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌等が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、枯草菌、乳酸菌、ブドウ球菌、放線菌等が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌、酢酸菌、緑膿菌等が挙げられる。
病原菌（病原性細菌）を用いることが、臨床現場での薬剤耐性菌の研究の観点から好ましい。病原菌の例として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する場合がある）等の黄色ブドウ球菌、腸管病原性大腸菌等の大腸菌、結核菌、コレラ菌、レジオネラ菌、ミュータンス菌、インフルエンザ菌、百科咳菌、肺炎菌等が挙げられる。黄色ブドウ球菌を使用することがより好ましく、ＭＲＳＡを用いることが特に好ましい。

本発明で用いられるアルキル化剤は、細菌のＤＮＡに突然変異を誘発させるものであればよい。例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等が挙げられる。アルキル化剤としては、メタンスルホン酸エチルを使用することが好ましい。

工程（ａ）における変異原処理とは、細菌のＤＮＡに突然変異を誘発させる処理のことを指す。また、本発明における細菌変異株とは、変異原処理により突然変異が誘発された細菌を指す。
本発明においては、アルキル化剤を用いて公知の手段により、細菌を変異原処理し、細菌変異体を得ることができる。例えば、本明細書の実施例のように、アルキル化剤が存在する培地で細菌を一定時間培養することにより、細菌変異株を得ることができる。

本発明で用いられる薬剤Ａは、例えば、目的の細菌で耐性を取得させたい薬剤を使用することができる。薬剤Ａは抗生物質が好ましく、例えば、オキサシリン等のβラクタム系抗生物質；バンコマイシン等のグリコペプチド系抗生物質；アルベカシン等のアミノグリコシド系抗生物質；リネゾリド等のオキサゾリジノン系抗生物質；セファゾリン等のセフェム系抗生物質；等が挙げられる。特に、バンコマイシンを使用することが好ましい。

工程（ａ）における「薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株を選択する」とは、公知の手段により行うことができる。例えば、本願明細書の実施例のように、薬剤Ａを含有する培地で細菌を一定時間培養することにより薬剤Ａに対する耐性菌を選択する（得る）ことができる。

本発明において、上記（ａ）工程は少なくとも５回以上繰り返すことを要件とする。本明細書の実施例に示すように、細菌が薬剤に対してより高耐性になる点から、少なくとも１０回以上繰り返すことが好ましく、少なくとも１５回以上繰り返すことがより好ましく、少なくとも２０回以上繰り返すことが特に好ましい。

また、本発明は、上記（ａ）工程を複数回繰り返した後、得られた細菌変異株から薬剤Ｂに対して耐性を有する細菌変異株を選択し、更に上記（ａ）工程を複数回繰り返すことにより、薬剤Ａ及び薬剤Ｂに対して耐性を有する細菌変異株を作製することができる。

上記薬剤Ａ及び薬剤Ｂに対して耐性を有する細菌変異株の作製方法において、上記（ａ）工程は、合計５回以上行うことを要件とする。
すなわち、薬剤Ｂに対して耐性を有する細菌変異株を選択（以下、「薬剤Ｂ選択」と略記する場合がある）する前に行う工程（ａ）の回数をｍ回、薬剤Ｂ選択後に行う工程（ａ）の回数をｎ回とすると、以下の３つの要件を満たす必要がある。
（１）ｍ≧２、（２）ｎ≧２、（３）ｍ＋ｎ≧５
好ましくはｍ≧５及びｎ≧５であり、より好ましくはｍ≧７及びｎ≧７、特に好ましくはｍ≧１０及びｎ≧１０である。また、好ましくはｍ＋ｎ≧１０、より好ましくはｍ＋ｎ≧１５、特に好ましくはｍ＋ｎ≧２０である。

本発明で用いられる薬剤Ｂは、例えば、目的の細菌で耐性を取得させたい薬剤を使用することができる。薬剤Ｂは抗生物質が好ましく、例えば、オキサシリン等のβラクタム系抗生物質；バンコマイシン等のグリコペプチド系抗生物質；アルベカシン等のアミノグリコシド系抗生物質；リネゾリド等のオキサゾリジノン系抗生物質；セファゾリン等のセフェム系抗生物質；等が挙げられる。薬剤Ｂは、２種類以上の薬剤に対して耐性を有する細菌変異株を作製する等の点から、薬剤Ａとは異なる作用機序を有する抗生物質を使用することが好ましい。βラクタム系抗生物質を使用することがより好ましく、オキサシリンを使用することが特に好ましい。

「薬剤Ｂに対して耐性を有する細菌変異株を選択する」方法は、上記の「薬剤Ａに対して耐性を有する細菌変異株を選択する」と同様に、公知の手段により行うことができる。例えば、本願明細書の実施例のように、薬剤Ｂを含有する培地で細菌を一定時間培養することにより薬剤Ｂに対する耐性菌を選択する（得る）ことができる。

また、本発明である抗生物質のスクリーニング方法は、上記作製方法によって作製された細菌変異体を用いることを特徴とする。

上記スクリーニング方法によって、特定の薬剤に対して耐性を有する菌に効果がある抗生物質を探索することができる。
例えば、本明細書の実施例において、ライソシンＥ（ＮＩＴＥＢＰ−８７０から生産される抗生物質）は、薬剤Ａ（バンコマイシン）に対して耐性を有する細菌変異株に対して効果があったことより、ライソシンＥはバンコマイシン耐性菌に対しての、代替化学療法の１つとして使用することができると考えられる（表４）。

抗生物質に対して耐性を獲得するメカニズムの解明は、臨床での治療方法の開発や進化の解明等に重要である。
本発明（後述の実施例）では、高ＶＣＭ耐性を有する黄色ブドウ球菌の作製に取り組み、実験室株及び臨床株を用いて作製した変異株の表現型を検証した。異なる起源（親株）それぞれから、高ＶＣＭ耐性変異株を実験室レベルで作製したのは本発明が最初である。

人為的にバンコマイシン耐性株を作製すると、多くの菌株はＭＲＳＡとしての本来の性質が欠損し、オキサシリン（以下、「ＯＸＡ」と略記する場合がある）及び他のβラクタム系抗生物質に対して感受性を有するようになることが報告されている（このような現象をシーソー効果（seesaw effect）という）。
本明細書の実施例及び検討例においても、ＭＲＳＡを親株としてＥＭＳによる変異原処理及びバンコマイシン耐性菌の選択（以下、「ＥＭＳ／ＶＣＭ選択」と略記する）を行ったところ、ＯＸＡのＭＩＣ値が減少していた。シーソー効果が起こる詳細なメカニズムはまだ解明されていない。

ＶＣＭ及びβラクタム系抗生物質両方に対して耐性を有する菌株は、臨床現場で問題となる感染を引き起こすと予想されるが、この菌株の表現型等の特徴はこれまでに知られていない。そこで、ＶＣＭ及びＯＸＡ両方に対して高い耐性を示す菌株を作製し、その菌株の特徴を調べた。
ＶＣＭ及びＯＸＡ両方に対して耐性を有する変異株について、アレベカシン、リネゾリド及びリファンピシンのような異なる抗菌メカニズムを有する抗生物質には感受性を有していた（表４）。更に、このＶＣＭ耐性株はライソシンＥに対しても感受性を有していた。
一方で、本発明（後述の実施例）で作製したＶＣＭ耐性株ＶＲ７は、親株と比較してダプトマイシンに対して耐性を有するようになっていた。ＶＣＭ及びダプトマイシン両方に対して耐性を有するＶＩＳＡは報告されている。

菌株によって抗生物質に対する感受性が異なるにも関わらず、ＯＸＡ及びＶＣＭ、又は、セファゾリン（以下、「ＣＦＺ」と略記する場合がある）及びＶＣＭを組み合わせて使用すると、高ＶＣＭ耐性変異株でＶＣＭのＭＩＣ値が低下した（表５）。
ＶＩＳＡにおいて、ＯＸＡ及びＶＣＭ、又は、ＣＦＺ及びＶＣＭを組み合わせて使用すると、ＶＣＭのＭＩＣ値が低下することは報告されている。また、当該報告において、βラクタム系抗生物質が、細胞壁の肥厚化を阻害し、不活性細胞壁ターゲット（non-active cell wall targets）によりＶＣＭの隔離を阻害している可能性が示唆されている。

親株に比べて本発明で作製したＶＲ３及びＶＲ７の細胞壁は約２倍厚くなっていたにも関わらず（図５）、ＶＣＭ及びβラクタム系抗生物質を組み合わせて使用すると、ＶＣＭのＭＩＣ値は低下した（表５）。
ＧＥＮとＶＣＭを組み合わせて使用した場合、ＶＣＭ感受性は上がらなかったので、ＶＣＭは特異的にβラクタム系抗生物質と相乗作用することがわかった。
以上のことは、臨床現場における抗生物質の選択に注意を要することを示している。臨床現場に存在するＶＩＳＡよりも更に高ＶＣＭ耐性を有する病原菌が将来出現するための備えとして、本発明で作製されたＶＣＭ耐性株を用いて、代替治療方法の探索方法をすることができる。

また、ゲノム配列解析により、本実施例で作製したＶＣＭ耐性株において、５０〜１７２の変異が起こっている遺伝子が存在することを発見した。これまでに、ＥＭＳ処理のみの突然変異誘発により、約５〜１０の変異が起こることは報告されている。
本発明の検討例では、非コード領域（タンパク質をコードしていない領域）の変異状況については観察していないにも関わらず、２０倍以上の変異が誘発されていることがわかった。以下に示す推算により、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択によって、３変異株以上で、変異が起こっていたオーバーラップ遺伝子の数がＥＭＳ処理のみに比べて多くなっていた。

ＥＭＳのみの処理による変異が起こった数はこれまでの報告から１０であるとし、黄色ブドウ球菌は３０００遺伝子を保有していることから、３００個に１個の割合で変異が起こっているとする（すべての変異が、オーバーラップが存在しないコード領域で起こっていると仮定した場合）。
ＥＭＳ／ＶＣＭ選択は、ＥＭＳ単独処理に比べて２０倍多く変異が観察されたので、１５個に１個の割合で変異が起こっているとする。
その場合、３、４又は５の独立した株で同じ遺伝子に変異が起こっている確率は、それぞれ（１／１５）^３、（１／１５）^４、（１／１５）^５となる。一方、ＥＭＳ単独処理の場合の確率はそれぞれ、１未満となる（０．９、０．０６、０．００４）。
以上の推算及びＶＣＭ耐性に関与しているとされる遺伝子についての報告より、各ＶＣＭ耐性株で共通して変異が見られた遺伝子がＶＣＭ耐性に関与していると考えられる。

これまでにＶＣＭ耐性に関与する遺伝子の探索の研究は進められているが、どの遺伝子に変異が起こるかによって高ＶＣＭ耐性を獲得するかはまだ解明されていない。
そこで、本発明（の実施例）で得られた、親株がそれぞれ異なるＶＣＭ耐性株を用いて、低ＭＩＣ値群と高ＭＩＣ値群間で、変異状況を比較した（図６）。
その結果、（ｉ）低ＭＩＣ値群では変異が起こっているが、高ＭＩＣ値群では変異が起こっていない遺伝子が多く検出されたこと、（ii）高ＭＩＣ値群間で変異が起こっていた遺伝子が完全に一致しなかったことから、高ＶＣＭ耐性となるメカニズムは、１つだけではないことがわかった。

４つの高ＭＩＣ値株すべてで共通ではなかったが、４つの菌株中３つの菌株で変異が起こっていた３つの遺伝子を同定した。これらの３つの遺伝子についてはこれまでＶＣＭ耐性に関与していることは報告されていない。
ａｕｓＡ遺伝子はａｕｒｅｕｓｉｍｉｎｅと呼ばれる黄色ブドウ球菌におけるペプチドの二次代謝に関与する物質をコードしている。ｓｄｒＣは細菌表面に接着する物質をコードし、細菌毒性に関与していることが報告されている。ＳＡ１５８４はリゾホスホリパーゼＬ２をコードし、この酵素は大腸菌でリン脂質のターンオーバーに関与していることが報告されている。
黄色ブドウ球菌において、細胞質膜のリン脂質を別の物質に変換すると、ＶＣＭを含む抗生物質に対して耐性を有することが報告されている。上記３つの遺伝子は黄色ブドウ球菌に必須の遺伝子ではないので、得られたＶＣＭ耐性株で成長速度が遅くなること及び代謝の変化は、これらの３つの遺伝子が直接起因している可能性は低いと考えられる。

更に、ｇｒａＳ、ｗａｌＫ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣのようなＶＩＳＡで既に報告されている遺伝子についても、本実施例で作製したＶＣＭ耐性株で変異が起こっていることを確認した（表６）。
また、本実施例で作製した高ＶＣＭ耐性株の表現型は、ｗａｌＫ又はｒｐｏＢに変異が起こっているＶＩＳＡ株と共通の特徴を有していた（細胞壁の肥厚化及び増殖異常）。ＶＩＳＡ表現型に関与している遺伝子に変異が発見されたことより、ＶＩＳＡよりも高ＶＣＭ耐性である菌が将来出現する可能性が考えられる。

ＥＭＳ等のアルキル化剤処理により突然変異が誘発されるメカニズム等は解明されていないが、宿主に進入する細菌は、抗生物質の投与のみならず免疫システム及び変異及び選択が促進されることによる様々なストレス等により、連続的な攻撃にさらされている。高ＶＣＭ耐性が誘導される進化の過程を明らかにするために、ＶＩＳＡと関連がある遺伝子及びＶＣＭ耐性に関与している可能性がある遺伝子等に注目することによって遺伝子変異及び耐性獲得との関連を分析することは必要である。

ＶＣＭの乱用が、近い将来ＶＣＭ高耐性菌の出現を導く恐れがある。本発明（の実施例及び検討例）により、ｖａｎＡ遺伝子転移とは別の、変異蓄積により、親株に関わらず、黄色ブドウ球菌に高ＶＣＭ耐性を獲得させることができると考えられる。本発明で作製された高ＶＣＭ耐性変異株を研究に使用することで、ＶＣＭが効かなくなる状況に備えることができる。

以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。

＜＜アルキル化剤処理及び薬剤耐性株の選択＞＞
アルキル化剤としてメタンスルホン酸エチル（以下、「ＥＭＳ」と略記する場合がある）を使用した。黄色ブドウ球菌（８種類のＭＲＳＡ及び４種類のＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌））をそれぞれ０．１％ＥＭＳ存在下で培養した。一晩培養後、ＥＭＳが存在しない培地に播種した。その後、薬剤を含有する寒天培地を用いて薬剤耐性菌を選択した。

＜＜ポピュレーション解析＞＞
ＢＨＩ培地（brain heart infusion broth）で培養し、一晩培養した培養液をＯＤ_５７６が０．３になるように希釈し、８、１６、２４、又は２８μｇ／ｍＬの薬剤（ＶＣＭ）を含む寒天培地に播いた。７２時間３７℃でインキュベーション後、プレート中のコロニー数を数えた。

実施例１
［黄色ブドウ球菌臨床株からのＶＣＭ耐性変異株の選択］
まず、ＲＮ４２２０（メチシリン感受性実験室株）を親株として、連続突然変異誘発（ｓｅｒｉａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によるＶＣＭ耐性株を得ることを試みた。ＥＭＳ処理及びＶＣＭ耐性株選択（以下、「ＥＭＳ／ＶＣＭ選択」と略記する場合がある）により得られた変異株について、ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ａに示す。

図１Ａの横軸はＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。
その結果、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数が多くなるほど、ＶＣＭのＭＩＣ値が上昇することがわかった（図１Ａ、◇印）。

次に、日本においてそれぞれ異なる地域で単離された臨床ＭＲＳＡ株及びＭＳＳＡ株に対してＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った。結果を表１、図１Ａ及び図２に示す。

図１Ａの結果、親株に関わらず、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、全ての変異株においてＶＣＭのＭＩＣ値が上昇していた。

図２はＥｔｅｓｔ（登録商標、ビオメリュー社）を用いてＭＩＣ値の測定を行った結果である。３７℃で７２時間インキュベーション後にＭＩＣ値を測定した。左がＭＲ３（親株）、右がＶＲ３（ＶＲ３−ＥＭＳ２１、変異株）の結果である。
図２の結果より、微量希釈法以外の測定法でも、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株について、ＶＩＣのＭＩＣ値が上昇していたことがわかった。

また、１０回以上のＥＭＳ／ＶＣＭ選択後、ＭＲＳＡ由来変異株において、オキサシリン（ＯＸＡ）の感受性が増大していた（ＭＩＣ値が２μｇ／ｍＬ以下だった）。この結果は、ＶＣＭ耐性株の選択により、本来ＭＲＳＡが有する性質（βラクタム抗生物質に対する耐性）が欠損したことを意味し、既に報告されている結果と一致している（Sieradzki et al，1999）。

また、ＯＸＡ含有寒天培地におけるＶＣＭ耐性株の表現型の特徴を調べる過程において、ＯＸＡ感受性株の中に、ＯＸＡ耐性株が存在していることがわかった。そこで、得られた変異株を、５０μｇ／ｍＬのＯＸＡが存在する培地に移して、ＯＸＡ耐性株を単離（ＯＸＡ選択）し、更にその中からＶＣＭ耐性株の単離（ＥＭＳ／ＶＣＭ選択）を続けた。ＯＸＡ選択後にＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株についてＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ｂ及び表２に示す。

図１Ｂの横軸はＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。

表２中のＭＩＣ値は３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法を用いて測定した。「ＶＣＭ」はバンコマイシン、「ＯＸＡ」はオキサシリンを示す。表２中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＲ１〜ＶＲ８については、それぞれＥＭＳ／ＶＣＭ選択の途中で、ＯＸＡ選択を行っており、ＶＲ−ＭＳ９及びＶＲ−４２２０はＯＸＡ選択を行っていない。
表２の結果、合計１９〜２６回のＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、ＶＣＭとＯＸＡ両方に対して高い耐性を有するＭＲＳＡ由来変異株が得られた。ＭＳＳＡ（ＭＳ９、ＭＳＳＡ１、Ｎｅｗｍａｎ、及びＲＮ４２２０）を親株とした場合も、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により分離した変異株において、ＶＣＭのＭＩＣ値が高かった（表２）。この結果は、ＭＲＳＡのＳＣＣｍｅｃ領域がＶＣＭ耐性表現型獲得に不要である可能性を示している。臨床分離株ＭＲ３由来である、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株ＶＲ３（ＥＭＳ／ＶＣＭ選択を２１回行ったことにより得られた変異株）に対するＶＣＭのＭＩＣ値は３２μｇ／ｍＬ、ＯＸＡのＭＩＣ値は２５６μｇ／ｍＬ以上であった（図２、表２）。

検討例１
［ポピュレーション解析］
これまでの研究により、ＶＩＳＡとして臨床分離されたＭｕ３及びヘテロ型ＶＩＳＡとして臨床分離されたＭｕ５０の中は、ＶＣＭに対してヘテロ耐性を有する細菌が含まれることが報告されている（Hiramatsu，K.，et al，1997）。そこで、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択中に分離した、ＶＣＭのＭＩＣ値が４又は８μｇ／ｍＬのＶＣＭ低感受性変異株を用いてヘテロ型が存在するか検証した。以下、本実施例・検討例において、ＭＲ３を「ＭＲ３−ＥＭＳ０」、ＭＲ７を「ＭＲ７−ＥＭＳ０」、ＶＲ３を「ＶＲ３−ＥＭＳ２１」、ＶＲ７を「ＶＲ７−ＥＭＳ２３」と示す場合がある。また、ＭＲ３又はＭＲ７を親株としてＥＭＳ／ＶＣＭ選択を６回又は１０回行ったものを、それぞれ「ＶＲ３−ＥＭＳ６」、「ＶＲ３−ＥＭＳ１０」、「ＶＲ７−ＥＭＳ６」、「ＶＲ７−ＥＭＳ１０」と示す。結果を図３に示す。

図３Ａは親株がＭＲ３である変異株のポピュレーション解析の結果、図３Ｂは親株がＭＲ７である変異株のポピュレーション解析の結果である。各図の横軸はバンコマイシンの濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は形成されたコロニー数（ｌｏｇ_１０）を示す。
ＶＲ３−ＥＭＳ２１変異株及びＶＲ７−ＥＭＳ２３変異株からは、それぞれＭＩＣ値が２８μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬのコロニーが得られた（図３Ａ及びＢ）。また、ＶＲ３−ＥＭＳ６、ＶＲ３−ＥＭＳ１０、ＶＲ７−ＥＮＳ６及びＶＲ７−ＥＭＳ１０株に対するＶＣＭのＭＩＣ値は、それぞれ中程度（低感受性）のＶＣＭ耐性を示した（図３Ａ及びＢ）。更にヘテロ型ＶＣＭ耐性株は、Ｍｕ３株及びＭｓ５０株と同様に、ＶＲ３−ＥＭＳ１０及びＶＲ７−ＥＭＳ１０変異株でも観察された（図３Ａ及びＢ）。

更に、ＶＣＭ含有寒天培地に形成されたコロニーの表現型についても調べた。ＶＲ３−ＥＭＳ２１株を播いたＶＣＭを含有する培地（８、１６、又は２８μｇ／ｍＬ）から３つのコロニーをそれぞれ単離し、ＶＲ７−ＥＭＳ２３株を播いたＶＣＭを含有する培地（８、１６、又は２４μｇ／ｍＬ）からそれぞれ３つのコロニーを単離した。単離した菌株に対するＶＣＭのＭＩＣ値を、４８時間インキュベーション後、微量希釈法により測定した。その結果、ＭＩＣ値は単離した６つの菌株の何れについても３２μｇ／ｍＬであった。この結果より、これらの菌株はＶＣＭに対して耐性を有することが確認された。
以上より、黄色ブドウ球菌臨床分離株からＥＭＳ／ＶＣＭ選択を繰り返すことにより高いＶＣＭ耐性を示す変異株を獲得することができることがわかった。

検討例２
［倍加時間の比較］
実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７）を用いて、親株（ＭＲ３及びＭＲ７）との表現型の違いを観察した。
まず、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）の比較を行った。結果を表３に示す。

ＭＩＣ値は３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法を用いて行った。倍加時間は薬剤が存在しない培地で菌株を培養し、指数関数的増加時期において、菌数が２倍になる時間をＯＤ_６００の測定値を用いて計算した。
表３より、ＶＲ３を含むＶＣＭ耐性変異株は、親株と比べて倍加時間が長くなっていった。

検討例３
［ＶＣＭ耐性株における抗生物質の感受性］
実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７）について、ＭＲＳＡ感染治療に用いられる抗生物質（アレベカシン（ＡＢＫ）、リネゾリド（ＬＮＺ）、ダプトマイシン（ＤＡＰ）、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）及びリファンピシン（ＲＦＰ））の感受性を検証した。また近年本発明者らによって同定された、細胞膜中のメナキノンを標的としているライソシンＥ（ＬＹＥ）（Hamamoto，H et al，in press)についても感受性を検証した。結果を表４に示す。

３７℃で２４時間インキュベーション後、微量希釈法によりＭＩＣ値を測定した。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。
表４の結果より、実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７株）は、ＶＲ７に対するダプトマイシンのＭＩＣ値を除いて、親株に対するＭＩＣ値とほぼ同じＭＩＣ値を示していた。これらの結果より、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択を繰り返すことによる高レベルのＶＣＭ耐性獲得には多剤耐性表現型は伴わないことがわかった。

また、表４の結果より、ライソシンＥはＶＲ３、ＶＲ７、親株いずれについても効果があった。よって、ライソシンＥはＶＣＭ耐性株に対して、代替化学療法の１つとして使用することができることがわかった。ライソシンＥは細菌の細菌膜に存在するメナキノンと相互作用し、細胞溶解を引き起こすことがわかっている。このような抗菌メカニズムは他の抗生物質の作用機序とは異なる。以上の結果は、ライソシンＥはＶＣＭ及び他の抗生物質とは異なる、新規の抗菌ターゲットを有することを示している。

検討例４
［βラクタム系抗生物質とＶＣＭとの相乗作用］
これまでに、臨床分離されたＶＩＳＡ株について、ＶＣＭはβラクタム抗生物質と相互作用する可能性があることが報告されている（Werth，B.J．et al，2013）。そこで、実施例１で得られたＶＣＭ耐性株において、βラクタム系抗生物質とＶＣＭとの相乗効果がみられるか検証した。結果を図４及び表５に示す。

表５は３７℃で２４時間インキュベーション後、微量希釈法によりＶＣＭのＭＩＣ値を測定した。「ＶＣＭ＋ＯＸＡ」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＣＦＺ」は２μｇ／ｍＬのＣＦＺを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＧＥＮ」は０．２５μｇ／ｍＬ（ＭＲ３及びＶＲ３）又は８μｇ／ｍＬ（ＭＲ７及びＶＲ７）のＧＥＮを含む培地を用いたときの結果を示す。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。

表５の結果より、亜致死量（回復不能の濃度）のＯＸＡを添加することによって、ＶＲ３及びＶＲ７で、ＶＣＭの感受性が上がっていた。また、２μｇ／ｍＬのＯＸＡ存在下における、ＶＲ３及びＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値を微量希釈法によって測定した結果、それぞれ親株と変わらなかった。ＯＸＡと同じくβラクタム系抗生物質であるセファゾリンでも同様に、ＶＣＭ耐性株に対するＶＣＭの感受性が増加したが、アミノ配糖体系抗生物質であるゲンタマイシンでは変化がなかった。

図４Ａは２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有するミューラーヒントン寒天培地を用い、Ｅｔｅｓｔ（登録商標）によりＭＩＣ値を測定した結果である。図の写真は３７℃で７２時間インキュベーション後の結果であり、ＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値の結果である。
微量希釈法以外の測定法でも、ＯＸＡの存在下でのＶＣＭ耐性株のＶＣＭ感受性が上昇することを確認した。

図４ＢはＯＸＡ存在下で２４時間インキュベーション後に、微量希釈法によりＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果である。横軸はＯＸＡの濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）である。◆はＭＲ７（親株）、○はＶＲ７（変異株）の結果を示す。
ＶＲ７に対するＶＣＭ感受性は、ＯＸＡの濃度が０．１２５μｇ／ｍＬ以上の場合では、用量依存的に増加していた。

図４ＣはＯＸＡ存在／非存在下のポピュレーション解析の結果を示すグラフである。ＭＲ７又はＶＲ７を、ＶＣＭを含有するＢＨＩ寒天培地に播き、３７℃７２時間インキュベーション後のコロニー数を測定した。グラフ中の「ＯＸＡ−」はＯＸＡを含まない培地を用いた場合、「ＯＸＡ＋」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有する培地を用いた場合を示す。
ＯＸＡ存在下におけるＶＲ７のポピュレーション解析を行った結果、ＯＸＡの存在により劇的に、ＶＣＭに対して感受性を有する変異株が増えていた。

以上の結果より、本発明により作製されたＶＣＭ耐性菌において、βラクタム系抗生物質がＶＣＭと相乗的に作用している可能性が考えられる。

検討例５
［細胞壁の観察］
これまでに、ＶＩＳＡの細胞壁が厚いことが報告されている（Cui，L． et al，2000）。そこで、透過型電子顕微鏡を用いて、実施例１で得られた変異株の細胞壁の構造を観察した。結果を図５に示す。

各株（ＭＲ３、ＶＲ３、ＭＲ７、ＶＲ７）を対数増殖期中期（ＯＤ_５７６において０．５から０．６）まで培養し、グルタルアルデヒドで固定し、細胞壁の観察を行った。
図５Ａは各株（ＭＲ３、ＶＲ３、ＭＲ７、ＶＲ７）の透過型電子顕微鏡による写真（スケールバーの長さは２００ｎｍを示す）である。
図５Ｂは各株の細胞壁の厚さの測定結果である。データはｎ＝３０〜４１の菌数におけるｍｅａｎ±ＳＤを示す。統計的優位性は多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓｍｕｌｔｉｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｅｓｔ）による一元配置分散分析法を用いて系統ごとに解析した。

親株であるＭＲ３（ＭＲ３−ＥＭＳ０）及びＭＲ７（ＭＲ７−ＥＭＳ０）の細胞壁の厚さに比べて（それぞれの平均の厚さは２８．９±２．２ｎｍ、２３．５±２．５ｎｍ）、ＶＲ３−ＥＭＳ２１とＶＲ７−ＥＭＳ２３の細胞壁の厚さはそれぞれ平均５１．５±５．４ｎｍ、４６．６±３．９ｎｍであった（図５Ａ及びＢ）。更に、ＭＲ３及びＭＲ７の細胞壁は滑らかであった一方、本発明により作製された変異株の細胞壁は荒く、毛羽立っていた（図５Ａ）。ＶＲ３−ＥＭＳ２１の細胞壁の厚さはＭＲ３−ＥＭＳ０と比べて１．８倍、ＶＲ７−ＥＭＳ２３の細胞壁の厚さはＭＲ７−ＥＭＳ０に比べて２．０倍厚くなっていた（図５Ｂ）。
また、親株がＭＲ３である菌株間のＰ値はいずれも０．００１未満であった。親株がＭＲ７である菌株間のＰ値は、ＶＲ７−ＥＭＳ６及びＶＲ７−ＥＭＳ１０間は０．０５未満であったが、それ以外は０．００１未満であった（図５Ｂ）。
以上の結果より、変異蓄積により、ＶＣＭ耐性と共に細胞壁の肥厚化が誘導された可能性が考えられる。

検討例６
［ＶＣＭ耐性株における変異遺伝子の同定］
ＶＣＭ耐性に関与している可能性がある遺伝子を探索するために、７つのＭＲＳＡ及びその変異株（ＭＲ／ＶＲ１、２、３、４、５、７、８）、及びＲＮ４２２０及びその変異株（ＲＮ４２２０及びＶＲ−４２２０）について、次世代シークエンサーを用いて全ゲノム配列解析を行った。
それぞれのＭＲＳＡ株について、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ：ｍｕｌｔｉ−ｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ）を行い、５つの株（ＭＲ１、３、５、７、８）についてはＳＴ５と分類し、残りの２つの株（ＭＲ２、４）はＳＴ８と振り分けた。ＭＲＳＡ株であるＮ３１５及びＵＳＡ３００はそれぞれ、ＳＴ５及びＳＴ８の代表的な菌株であるので、この２つの菌株のゲノム配列を参照ゲノム（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｍｏｍｅ）として使用した。各々のゲノム配列を参照ゲノム配列と比較して、各セット（親株とその変異株）間のコード領域の違いを検証した。

その結果、親株と比較して、ＶＲ耐性株において５０〜１７２の遺伝子に変異があることを確認した（ＥＭＳ処理のみでは約１０の変異が観察されることが既に報告されている）。このことは、コード領域にあたり平均２〜７の変異がＥＭＳ／ＶＣＭ選択により誘導されたことを意味する。

表６は、３以上のＶＣＭ耐性株で共通して検出された変異遺伝子をまとめたものである。「Ｘ」は変異遺伝子が検出されたことを示す。「Ｒｅｆ列」について、「Ｙｅｓ」はこれまでの報告でＶＣＭ耐性に関連があると示唆された遺伝子を示し、「Ｎｏ」はこれまでの報告でＶＣＭ耐性に関連があると示唆されたことがない遺伝子を示す。「Number of mutated strains列」は、「変異が確認された菌株の数」を示す。
表６中、１つの遺伝子（ＳＡ０６１５；ｇｒａＳ）は８変異株中５つの変異株で、変異が起こっていることが確認された。ＶＣＭ耐性に関与している遺伝子として報告されているＳＡ０５００（ｒｐｏＢ）及びＳＡ０５０１（ｒｐｏＣ）を含む７つの遺伝子について、８変異株中４つの変異株で変異が起こっていた。更に、臨床ＶＩＳＡにおいて変異が起こっていたことが報告されているＳＡ００１８（ｗａｌＫ）を含む６つの遺伝子について、３つの変異株で変異が起こっていた。

次に、低ＭＩＣ値群（ＶＣＭのＭＩＣ値が８μｇ／ｍＬ、ＶＲ１、２、５）及び高ＭＩＣ値群（ＶＣＭのＭＩＣ値が３２μｇ／ｍＬ、ＶＲ３、４、７、ＶＲ−ＲＮ４２２０）間での変異パターンを比較した。結果を図６に示す。

図６より、高ＭＩＣ値群中で変異が起こっていた３２３遺伝子中、４６遺伝子は低ＭＩＣ値群でも変異が起こっていたが、残りの２７７遺伝子は高ＭＩＣ値群でのみ変異が起こっていた。ＶＣＭ耐性に関与しているとこれまでに報告されていない３つの遺伝子（ＳＡ０１７３（ａｕｓＡ）、ＳＡ０５１９（ｓｄｒＣ）及びＳＡ１５８４（リゾホスホリパーゼＬ２をコードする））について、３つの高ＭＩＣ値株で変異が見られた。また、ＶＣＭ耐性に関与していると報告されている１７遺伝子（例：ｗａｌＫ、ｐｂｐ４、ｇｒａＳ）は、２つの高ＭＩＣ値株で変異が観察された。以上の結果から、高ＭＩＣ値群で特異的に変異が確認された遺伝子が、黄色ブドウ球菌において高ＶＣＭ耐性表現型の獲得に関与している可能性があることが考えられる。

本発明である細菌変異株の作製方法を利用し、細菌の進化の解明や細菌が薬剤に対して高耐性となるメカニズム解明等の基礎研究や、臨床現場での新たな治療方法の開発等の応用研究が可能となり、医薬品業界等に広く利用されるものである。

Claims

下記（ａ）の工程を含有する、ＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上である、バンコマイシンに対して耐性を有する黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法であって、
下記（ａ）の工程を少なくとも５回以上繰り返した後、βラクタム系抗生物質が存在する培地を用いて得られた細菌変異株からβラクタム系抗生物質に対しても耐性を有する細菌変異株を選択し、更に下記（ａ）の工程を少なくとも５回以上繰り返すことにより、バンコマイシン及びβラクタム系抗生物質に対して耐性を有する細菌変異株を作製することを特徴とするバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
（ａ）細菌をアルキル化剤で変異原処理し、バンコマイシンが存在する培地を用いて得られた細菌変異株からバンコマイシンに対して耐性が上がった細菌変異株を選択する工程
上記（ａ）工程において、親株である細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である請求項１に記載のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
ｖａｎＡ遺伝子を転移させずに耐性を獲得させる請求項１又は請求項２に記載のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
上記βラクタム系抗生物質がオキサシリンである請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
上記（ａ）工程を少なくとも１０回以上繰り返した後、得られた細菌変異株からβラクタム系抗生物質に対して耐性を有する細菌変異株を選択し、更に上記（ａ）工程を１０回以上繰り返す請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
上記アルキル化剤がメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）である請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の作製方法。
請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の作製方法によってバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）を作製し、作製されたバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）を用いることを特徴とする抗生物質のスクリーニング方法。