JP6741066B2 - ホログラフィ観察方法及び装置 - Google Patents

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Description

本発明は、ホログラフィを用いて対象物体を観察する方法及び装置に関する。
iPS細胞を用いた再生医療技術等の進展に伴い、iPS細胞やその他の細胞を培養しつつ、それら細胞を観察し、細胞の分化状態等を適切に管理するための装置が求められるようになっている。そのような装置では、培養の過程で細胞の画像を取得し、その画像データに基づいて様々な計測及び解析を行う必要がある。細胞の観察を行う装置としては、位相差顕微鏡を用いて観察する装置があるが、１回に撮影できる領域が限られるため、全体を観察するためにはステップ・アンド・リピート方式で撮影位置を変えながら全体観察を行う必要がある。そうすると、撮影位置を移動する度に対象物に焦点を合わせる必要があり、全体の撮影に時間がかかるという問題がある。培養細胞の観察においては、細胞にダメージを与えないために、撮影はできるだけ短時間に済ませる必要がある。
そこで、ホログラフィを用いて細胞の撮影を行うホログラフィ観察装置が広く用いられるようになってきた。ホログラフィ画像（ホログラム）は、位相の揃った光束（コヒーレント光束）を2つに分割し、一方を対象物体に照射して通過又は反射させ、他方をそのままにして、両光束を結像面で干渉させることにより得られる。こうして得られたホログラムには対象物体の3次元的形状や光学的組成等の情報が含まれており、これに対して各種演算を行うことによりそれらを取り出すことができる。ホログラフィ観察装置では、撮影時に得た対象物体の3次元データを元に、画像再構成時に焦点合わせを行った対象物体付近の2次元画像データを得ることができ、撮影時の焦点合わせが不要であるため、上記位相差顕微鏡を用いる場合に比べて高速な全体観察が可能になるという特長を有している。なお、本願明細書において「光束」という文言は断面が2次元的な広がりを持つ光を意味する。
ホログラフィ観察装置は、図１に示すように観察対象物体Ａで反射した光束を用いるものと、図２のように観察対象物体Ａを透過した光束を用いるものがある（非特許文献２）。いずれのタイプのものでも、光源からのコヒーレント光束は観察対象物体Ａで反射され、又は透過する際に、その観察対象物体Ａの光学的構造に応じた位相の変化を受ける。このように位相変位を受けた光束と、そのような位相変位を受けない参照光束をイメージセンサ上で干渉させることにより、ホログラムが得られる。
特開２０１３−９２６０３号公報 特開２０００−２１６４８５号公報
図３に模式的に示すように、観察を行う光路上には、観察対象物体の他に様々な物体が存在する。例えば、細胞を生きたまま観察しようとする場合、細胞を容器内で培地中に浮遊させたり、ガラス板上に載置したりして観察を行うが、この場合、光路上には観察対象物体である細胞の他に、容器やガラス板等が存在する。コヒーレント光束の位相変位は観察対象物体だけでなく、光路上にある他の物体によっても発生するため、図３において非観察対象物体Ｂ（先の例では容器など）によって発生した位相変位による干渉が、観察対象物体Ａ（細胞）により発生する、本来必要とされる位相変位から生じる干渉像に影響を及ぼすと画像ノイズが生じ、観察対象物体Ａのホログラムの画質を劣化させることとなる。そのため、良好な観察画像を得るためには、観察対象物体以外の物体（非観察対象物体）によって発生する位相変位の影響をできるだけ排除し、観察対象物体によって発生する位相変位から生じる干渉像のみを検出することが望ましい。
本発明が解決しようとする課題は、観察対象物体以外での位相変位の影響を抑制して、観察対象物体のみについてできるだけ解像度の高いホログラムを得ることのできるホログラフィ観察方法及び装置を提供することである。
上記課題を解決するために成された本発明に係るホログラフィ観察方法は、
交流成分を重畳した電流により半導体レーザ光源を駆動することにより生成した光束、又は、所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束を、観察対象物体に照射し、観察対象物体を透過又は反射した光束と、参照光束とを干渉させることによりホログラムを形成し、該ホログラムを画像処理することにより観察対象物体に関する情報を得ることを特徴とするものである。
交流成分を重畳した電流により半導体レーザ光源を駆動すると、重畳される交流成分の振幅及び周波数に応じたスペクトル幅を有し、変動のない一定の直流電流で半導体レーザ光源を駆動することにより生成される半導体レーザ光束に比べてコヒーレント性の低い光が得られる。また、スーパールミネッセントダイオード（SLD）光源からも、所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有し、直流電流で半導体レーザ光源を駆動することにより生成される半導体レーザ光束よりもコヒーレント性が低い光束が得られる。上記所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束とは、このようなSLD光源等の光源から発せられる光束をいう。直流電流で駆動される半導体レーザ光源から生成されるようなスペクトル幅の小さい（すなわち、単一波長の）コヒーレント光束を用いてホログラムを形成する場合、該コヒーレント光束を発する光源から遠くであってもコヒーレント性は保持されるため、長い距離に亘って参照光束との干渉が生じ得る（可干渉距離が長い）。従って、観察対象物体のみならず、それ以外の非観察対象物体（例えば、細胞を観察しようとする場合、それを収容する容器、その容器の蓋およびその他の光学部品、等）による位相変位の結果もホログラムに含まれるようになる。それに対し、本発明において用いる所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレンス性を有する光束は、そのコヒーレンス性が低いほど可干渉距離が短くなる。そのため、観察対象物体における位相変位の結果のみをホログラムに反映させ（含め）、それ以外の非観察対象物体による位相変位の結果を反映させない（含めない）ようにすることができるようになる。なお、本願明細書では、このように所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光を擬コヒーレント光とも呼ぶ。本発明において用いる擬コヒーレント光は、半導体レーザ光のような高コヒーレント光との対比で低コヒーレント光と呼ばれることもある。
上記所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度の各々は、観察対象物体の大きさや光学的特性に応じて適切な値が存在するが、それは予め実験を行うことにより容易に決定することができる。なお、一例は後述する。
上述のとおり、本発明において用いる光束（擬コヒーレント光束）を形成する方法の一つは、半導体レーザ光源として半導体レーザダイオード（半導体レーザ）を使用し、それを駆動する電流源に交流信号を重畳する方法である。シングルモードレーザの場合、半導体レーザダイオードは基本的に一定の直流電流で駆動するが、その場合、スペクトル幅の非常に狭い、コヒーレント性の高い光束が得られる（図４(a)）。それに対し、その駆動直流電流に交流電流を重畳すると、一定の条件下で、発生する光束のスペクトルは幅を持つようになる。
このスペクトルの様相は、重畳する交流成分の周波数により異なる。例えば、重畳する交流成分の周波数が、100MHz〜500MHz程度の高周波数である場合、図４(b1)に示すように、スペクトルが離散的に広がった様相を呈する（特許文献１、２）。このようなスペクトルの広がりが形成される理由は次のように考えられる。すなわち、シングルモードレーザの半導体レーザダイオードは、通常通り一定の直流電流で駆動した場合であっても、電流が流れ始めた直後（電流が流れ始めてから数ナノ秒間程度）は、中心モードによる発光と、±１次、±２次のサイドモードによる発光が生じており（すなわち、マルチモードの発光状態が形成されており）、その結果、図４(b1)に示されるような離散的に広がったスペクトル分布となる。しかし、一定の直流電源で駆動し続けると、サイドモードはすぐに減衰して中心モードのみによる発光（縦モードシングル発光）だけが残った状態となる。一方、このようなシングルモードレーザの半導体レーザダイオードを、100MHz〜500MHz程度の高周波数の交流成分を重畳した電流で駆動した場合、半導体レーザダイオードが縦モードシングル発光の状態で安定する前に電流が変化するため、サイドモードによる発光が維持され、結果として、図４(b1)に示されるように離散的に広がったスペクトル分布での発光が維持されることになる。
一方、重畳する交流成分の周波数が、50kHz〜300kHz程度の低周波数である場合、発光波長が時間的に変動することが確認されている。このような変動は、低周波数の交流成分が重畳されることにより、電流、共振器内部の屈折率、温度分布、等が時間的に変動することに起因して起こるものと考えられる。重畳される交流成分の周波数が、イメージセンサ（すなわち、観察対象物体を透過又は反射した光束の干渉像を取得するイメージセンサ）の読み出し周波数よりも十分大きい（好ましくは、1000倍程度）場合、この変動の周期は撮影の際に時間的に平均され、スペクトルのピーク幅が広がる（ブロードなスペクトルが得られる）とみなすことができる。
このように、高周波数の交流成分あるいは低周波数の交流成分のどちらであっても、それを重畳することでスペクトル幅を広げることが可能である。ただし、上記の通り、その広がりの態様は高周波数の交流成分と低周波数の交流成分で異なるため、両者を組み合わせることでスペクトル幅を効果的に広げることができる。すなわち、高周波数の交流成分を重畳した電流で駆動されることにより図４(b1)に示されるような離散的に広がったスペクトル分布の発光を形成している半導体レーザダイオードにおいて、その駆動電流に、低周波数の交流成分をさらに重畳すると、離散的に存在する各ピークのピーク幅が広がり、結果として、スペクトルは、図４(c)に示すように、連続的に広がった様相を呈するようになる。このように、高周波数の交流成分と低周波数の交流成分の両方を重畳することで、スペクトル幅を十分に広げることができる。
ここで、図４(a)に示されるようなスペクトルを呈している半導体レーザダイオードから、離散的に広がったスペクトルの光束を得る手法は、駆動電流に高周波数の交流成分を重畳するものに限らない。すなわち、半導体レーザダイオードから出射される光の一部を、例えば光学部品等を用いて反射させることにより半導体レーザダイオードに戻す（すなわち、戻り光を形成する）ことによっても、半導体レーザダイオードから離散的に広がったスペクトルの光束を得ることができる。この構成においては、半導体レーザダイオードと該光学部品の間に共振状態が形成される（すなわち、半導体レーザダイオードの内部だけでなく外部にも共振器が形成される）。これによって、半導体レーザダイオードは、その内部と外部で異なる発振周波数を有するものとなり、その結果、マルチモードでの発振が生じ、図４(b2)に示されるような離散的に広がったスペクトルを呈するようになると考えられる。
戻り光は、例えば、半導体レーザから出射される光の光軸上に、入射した光の少なくとも一部を反射させる反射面を有する反射部材を配置することにより形成することができる。ここにおいて、該反射部材の角度（反射面と光軸がなす角度）によって、戻り光の光量を制御することができる。ただし、戻り光の光量によっては、半導体レーザのレーザ共振器ゲイン、損失、電流動作点、半導体レーザおよび光ファイバの端面のフレネル反射率、戻り光によるレーザ共振器とのマッチング、等に影響が生じる可能性があるため、該反射部材の角度とこれら影響をうけるパラメータとの組合せによる調整により、戻り光の最適値を決定することが好ましい。
戻り光が形成されることにより図４(b2)に示されるような離散的に広がったスペクトル分布の発光を形成している半導体レーザダイオードにおいて、その駆動電流に、低周波数の交流成分を重畳すると、離散的に存在する各ピークのピーク幅が広がり、結果として、スペクトルは、図４(c)に示すように、連続的に広がった様相を呈するようになる。この構成によると、高周波数の交流成分を重畳しなくともスペクトル幅を十分に広げることができるので、高周波数の交流成分を得るための複雑な回路構成や高価な部品が不要となる。
以上の通り、交流成分を重畳した電流で半導体レーザ光源を駆動することで、前記所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束（擬コヒーレント光束）が得られるところ、重畳する交流成分の周波数を適宜に選択することによって、擬コヒーレント光束のスペクトル幅を十分に広げることができる。また、重畳する交流成分の振幅を大きくすることによっても、擬コヒーレント光束のスペクトル幅を広げることができる。スペクトル幅が広がると、コヒーレント性が低下して可干渉距離が短くなる。従って、観察対象物体、及び光路上に存在する非観察対象物体の大きさ（厚さ）や光学的特性（例えば屈折率）に合わせて重畳する交流信号の周波数及び振幅を適宜に変更することにより、容器等による位相変位の影響を排除し、観察対象物体による位相変位のみをホログラムに反映させることができるようになる。
また、前記所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束（擬コヒーレント光束）は、上述のとおり、例えばスーパールミネッセントダイオード（SLD）を用いることによっても得ることができる。また、そのような特性を持つ一部の発光ダイオード（LED）も本発明に係るホログラフィ観察装置の光源として用いることができる。SLDや一部のLEDは、所定のスペクトル幅を有し、レーザ光に比べて可干渉距離が短い光を発する。一般にSLDやLEDから発せられる光のスペクトル幅や可干渉距離は固定であるため、観察対象物体の大きさや光学的特性に応じて決められる可干渉距離に合致するSLDやLEDを選択する必要はあるものの、交流信号を重畳する必要がなく光源から発せられる光をそのまま使用することができるため、ホログラフィ観察装置を簡素かつ安価に構成することができる。
本発明に係る方法は、ホログラフィを形成する方法に依らず適用することができる。
例えば、インライン型ホログラフィの場合、本発明に係る方法を用いたホログラフィ観察装置の一態様は、
a) 半導体レーザ光源と
b) 前記半導体レーザ光源に交流成分を重畳した駆動電流を供給する電流源と、
c) 前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を観察対象物体に透過又は反射させ、該観察対象物体の異なる位置で透過又は反射した光を干渉させる照射光学系と、
d) 前記観察対象物体を透過又は反射した光束の干渉像を取得するイメージセンサと
を備えるものとなる。
また、インライン型ホログラフィの場合、本発明に係る方法を用いたホログラフィ観察装置の別の一態様は、
a) 所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束を発する光源と、
b) 前記光束を観察対象物体に透過又は反射させ、該観察対象物体の異なる位置で透過又は反射した光を干渉させる照射光学系と、
c) 前記観察対象物体を透過又は反射した光束の干渉像を取得するイメージセンサと
を備えるものとなる。
オフアクシス型ホログラフィの場合、本発明に係るホログラフィ観察装置の一態様は、
a) 半導体レーザ光源と
b) 前記半導体レーザ光源に交流成分を重畳した電流を供給する電流源と、
c) 前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を2分割し、一方を観察対象物体に透過又は反射させる照射光学系と、
c) 前記観察対象物体を透過又は反射した光束と、2分割された他方の光束であって前記観察対象物体を透過又は反射しない光束との干渉像を取得するイメージセンサと
を備えるものとなる。
また、オフアクシス型ホログラフィの場合、本発明に係るホログラフィ観察装置の別の一態様は、
a) 所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束を発する光源と、
b) 前記光束を2分割し、一方を観察対象物体に透過又は反射させる照射光学系と、
c) 前記観察対象物体を透過又は反射した光束と、2分割された他方の光束であって前記観察対象物体を透過又は反射しない光束との干渉像を取得するイメージセンサと
を備えるものとなる。
これらいずれの型のホログラフィ観察装置も、動作原理は上記の通りであり、可干渉距離の短い擬コヒーレント光束を用いることにより、観察対象物体における位相変位の結果のみが反映され（観察対象物体の情報のみを含み）、それ以外の物体による位相変位の結果が反映されない（含まれない）ホログラムを得ることができる。上記の通り、所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する光束を発する光源には、例えばスーパールミネッセントダイオード（SLD）、或いは、所定のスペクトル幅を有する光束を発生する一部の発光ダイオード（LED）を用いることができる。
また、本発明は、上記の各ホログラフィ観察装置を備えた細胞画像観察装置、及び、例えば上記の各ホログラフィ観察装置に好適に用いられる光源部にも向けられている。
本発明に係るホログラフィ観察方法及び装置では、観察用光束として、所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定のコヒーレント性を有する、可干渉距離の短い擬コヒーレント光束を使用する。これにより、観察対象物体における位相変位の結果のみをホログラムに反映させ（含め）、それ以外の物体による位相変位の結果を反映させない（含めない）ようにすることができるようになり、非観察対象物体によるノイズを排除し、観察対象物体のみについて解像度の高いホログラムを得ることができる。
観察対象物体からの反射光を用いるオフアクシス型ホログラフィ観察装置の一構成例。 観察対象物体からの透過光を用いるオフアクシス型ホログラフィ観察装置の一構成例。 従来のホログラフィ観察装置における問題を説明する図。 半導体レーザ光源を直流電流で駆動した場合の発光スペクトル(a)、半導体レーザ光源の駆動電流に高周波数の交流信号を重畳した場合の発光スペクトル(b1)、半導体レーザ光源への戻り光が形成された場合の発光スペクトル(b2)、半導体レーザ光源の駆動電流に低周波数の交流信号を重畳した場合の発光スペクトル(c)。 本発明に係るホログラフィ観察装置の一実施例であるインライン型ホログラフィ観察装置の要部構成図。 本実施例のホログラフィ観察装置の光源部の構成図。 駆動電流に交流信号を重畳した場合のコヒーレント光束の可干渉距離の変化を説明する図。 本発明に係るホログラフィ観察装置により得られた観察画像について説明する図。 本発明に係るホログラフィ観察装置の変形例において用いる光源部の構成図。 本発明に係るホログラフィ観察装置の変形例であるオフアクシス型ホログラフィ観察装置の要部構成図。 本発明に係るホログラフィ観察装置の別の変形例において用いる光源部の構成図。
以下、本発明に係るホログラフィ観察方法及び装置の実施例について、図面を参照して説明する。本実施例のホログラフィ観察装置は、いわゆるインライン型ホログラフィ観察装置であり（インライン型ホログラフィ観察装置については非特許文献１、２参照）、培養プレート上で培養されたiPS細胞やES細胞等の細胞の観察画像を取得するために用いられる。
＜１．装置構成＞
本実施例のホログラフィ観察装置の要部構成を図５に示す。ホログラフィ観察装置１は、光源部２、イメージセンサ４、及び制御部５を備えている。光源部２から発せられる微小角度（約10度）の広がりを持つ擬コヒーレント光束は、培養プレート３上の細胞に照射される。細胞及び培養プレート３を透過した擬コヒーレント光束内の光は、培養プレート３上の細胞の隣接位置を透過した光と干渉しつつイメージセンサ４に到達する。図５には図示しないが、光源部２から発せられる光束のスポットサイズを細胞全体に照射するために適宜の照射光学系が用いられる。
制御部５は、記憶部５０を備え、また機能ブロックとして光源部２の動作を制御する光源制御部５１と、演算処理部５２を備えている。演算処理部５２は、イメージセンサ４で取得されたホログラムデータ（イメージセンサ４の検出面で形成された擬コヒーレント光束の二次元強度分布データ）から数値演算により位相情報を求め、細胞の観察画像を作成する。記憶部５０には、半導体レーザダイオード２４に供給する電流の大きさと擬コヒーレント光束の強度の関係、及び、交流信号の振幅及び周波数と擬コヒーレント光束の可干渉距離の関係に関連する情報である、擬コヒーレント光束特性情報が予め保存されている。交流信号の振幅及び周波数と擬コヒーレント光束の可干渉距離の関係については後述する。また、制御部５には入力部６と表示部７が接続されている。演算処理部５２により作成された観察画像は表示部７に表示される。
光源部２は、図６に示すように、半導体レーザダイオード２４と、該半導体レーザダイオード２４に駆動電流を供給する駆動電流供給部２０とを備えている。また、駆動電流供給部２０は、直流電圧を生成する直流電圧生成部２１、交流電圧を生成して前記直流電圧に重畳する交流電圧生成部２２、及び電圧／電流変換部２３を備えている。光源制御部５１は、擬似コヒーレント光束の強度や可干渉距離に関する使用者の入力指示と記憶部５０に保存された擬コヒーレント光束特性情報に基づき、直流電圧生成部２１により生成する直流電圧の大きさを決定して半導体レーザ光束の強度を調整し、また交流電圧生成部２２により生成する交流電圧の振幅及び周波数の値を決定して半導体レーザ光束の可干渉距離を調整する。
＜２．交流信号の振幅及び周波数＞
上述のとおり、本実施例のホログラフィ観察装置１では培養プレート３上の細胞を観察する。使用者が細胞の推定厚さ（一般に、数十から百μm程度）と培養プレート３の厚さ（一般に、約1mm程度）の値を入力すると、光源制御部５１は擬コヒーレント光束特性情報に基づいて、生成される擬コヒーレント光束の可干渉距離が観察対象物体（細胞）の厚さ（例えば、数十から百μm）よりも長く、光路上に存在する非観察対象物体（培養プレート３）の厚さ（例えば、約1mm）よりも短くなるように交流信号の振幅及び周波数を決定する。ただし、この周波数は、イメージセンサ４の信号読み出し周波数よりも十分に高い周波数（例えばイメージセンサ４の信号読み出し周波数の1000倍の周波数）に設定される。本実施例では、光路上に存在する非観察対象物体が培養プレート３のみであるため、培養プレート３の厚さを入力したが、試料を収容する容器やガラス板などが光路上に存在する場合には、使用者はそれらの厚さも入力する。あるいは非観察対象物体のうち、最も薄い物体の厚さを入力する。ここでは細胞と培養プレート３の厚さのみを入力する構成としたが、観察対象物体等が厚い場合には屈折率によって光学的距離が大きく変わるため、厚さに加えて屈折率も入力し、擬コヒーレント光束の可干渉距離が観察対象物体の光学的厚さ（物理的厚さと屈折率の積）よりも長く、非観察対象物体の光学的厚さよりも短くなるように構成することが好ましい。
ここで、交流信号の振幅と擬コヒーレント光束の可干渉距離の関係を説明する。半導体レーザダイオードにはTHORLABS社のシングルモードレーザ（LP642-SF20）を用いた。図７(a)は、直流電流のみにより半導体レーザダイオードを駆動したときの可干渉距離を示す測定結果である。図の横軸は左方に向かって半導体レーザ光出射端からの距離を示し、縦軸は当該距離における振幅（干渉強度）を示す。この測定では半導体レーザ光出射端から約8cmの距離までしか測定していないが、この距離までは十分な大きさの干渉ピークを確認することができていることから、可干渉距離は数m程度あるものと考えられる。
図７(b)は、上記半導体レーザダイオードの駆動電流に交流信号（周波数100kHz、直流に対する振幅30%）を重畳したときの可干渉距離を示す図であり、図７(c)は半導体レーザ光出射端近傍の拡大図である。図７(b)では、可干渉距離が半導体レーザ光の出射端から約4mmまでと減少しており、また干渉強度が大幅に低下するとともに干渉に伴うピークの大半が消失している。また、本発明者が交流信号の振幅の大きさを変化させつつ可干渉距離を測定した結果、半導体レーザダイオードの駆動電流に重畳する交流信号の振幅が大きくなるほど半導体レーザ光束の可干渉距離が短くなることを確認した。これは、重畳する交流信号の振幅を大きくするほど光束のスペクトル幅が広がり、その結果、コヒーレント性が低下して可干渉距離が短くなるためであると考えられる。
さらに、交流信号の周波数と擬コヒーレント光束の可干渉距離の関係を説明する。ここでも、半導体レーザダイオードにはTHORLABS社のシングルモードレーザ（LP642-SF20）を用いた。この半導体レーザダイオードはそれ固有の特性により、直流電流のみにより駆動した場合にも、図４(b1)のような離散的に広がったスペクトル分布を呈しており、この半導体レーザダイオードの駆動電流に、周波数が100kHzの交流信号を重畳することで、図４(c)に示す発光スペクトルが得られた。上述したとおり、50kHz〜300kHz程度の低周波数の交流信号を重畳することにより、発振スペクトルがブロード化されて光束のスペクトル幅が広がったものと考えられる。スペクトル幅が広がることにより、コヒーレント性が低下して可干渉距離が短くなる。
ただし、上述したとおり、駆動電流に重畳する交流信号の周波数は、イメージセンサ４の信号読み出し周期よりも十分短い周期で半導体レーザ光を変調できる周波数（すなわち、イメージセンサ４の信号読み出し周波数よりも十分に高い周波数）であることが好ましく、イメージセンサ４の信号読み出し周波数の1000倍程度であることが特に好ましい。例えば、上述した一般的なイメージセンサの場合、信号読み出し周期は33ms（読み出し周波数30Hz）であるので、上述した50kHz〜300kHzの低周波数の交流信号を十分好適に用いることができる。
観察対象物体と、光路上に位置する非観察対象物体の厚さ（及び屈折率）を勘案して適宜の振幅及び周波数の交流電圧を生成し、直流電圧に重畳して半導体レーザダイオード２４を駆動することにより、所望の可干渉距離のレーザ光束（擬コヒーレント光束）を得ることができる。
＜３．観察画像の比較＞
従来のホログラフィ観察装置では、可干渉距離が数メートル、あるいはそれ以上であるコヒーレント光束を用いていたため、培養プレート３による位相変位に起因する干渉縞が細胞の観察画像に重畳し、これにより画質が劣化していた。図８(a)は、従来のホログラフィ観察方法（装置）により642nmのコヒーレント光束を照射し取得した、培養プレート３のみ（培地や細胞なし）の観察画像である。この観察画像には、画像全体にわたって培養プレート３の位相変位に起因する不要な干渉縞が重畳していることが見て取れる。
図８(b)は、本実施例のホログラフィ観察方法（装置）において、周波数100kHz、振幅（駆動直流電流に対する振幅の大きさ）24%の交流電圧を直流電圧に重畳して上記半導体レーザダイオードを駆動し、中心スペクトル642nmの擬コヒーレント光束を照射して取得した、培養プレート３のみ（培地や細胞なし）の観察画像である。図８(a)及び(b)のいずれにおいても、読み出し周期33ms（読み出し周波数30Hz）のイメージセンサを用いた。図８(b)の観察画像では、培養プレート３に起因する不要な干渉縞が大幅に低減されていることが分かる。
＜４．変形例＞
上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。
＜４−１．交流成分の周波数に関する変形例＞
上記実施例において駆動電流に重畳する交流成分の周波数（具体的には、直流電圧に重畳する交流電圧の周波数）は、50kHz〜300kHzの低周波数に限定されない。例えば1MHz〜数百MHz（好ましくは、100MHz〜500MHz）の高周波数の交流成分を重畳してもよいし、これらの低周波数成分と高周波数成分の両方を重畳してもよい。
シングルモードで発振する一般的な半導体レーザダイオードは、直流電流で駆動すると図４(a)に示されるタイプの発光スペクトルを呈することが多い。このような半導体レーザダイオードを、100MHz〜500MHzの高周波数の交流成分を重畳した電流で駆動すると、その発光スペクトルは、図４(b1)に示されるようなものとなる。すなわち、100MHz〜500MHzという高周波数の交流成分を重畳することによって、その発光スペクトルは、離散的に広がった様相を呈するようになる。
このように離散的に広がったスペクトル分布の発光を形成している半導体レーザダイオードにおいて、その駆動電流に、さらに、50kHz〜300kHz程度の低周波数の交流成分を重畳すると（すなわち、100MHz〜500MHzの高周波数成分と50kHz〜300kHzの低周波数成分が重畳された交流成分を重畳すると）、離散的に存在する各ピークのピーク幅が広がり、その発光スペクトルは、図４(c)に示されるように、連続的に広がった様相を呈するようになる。このように、高周波数成分と低周波数成分が重畳された交流成分を駆動電流に重畳することで、スペクトル幅を十分に広げることができる。
このように、高周波数の交流成分及び低周波数の交流成分の一方（或いは両方）を重畳することでスペクトル幅を広げることが可能であり、該周波数を適宜に選択することで所望の可干渉距離を得ることができる。これにより、不要な干渉縞の重畳を低減した観察画像を得ることができる。
＜４−２．高周波成分の重畳の代替手法＞
図４(a)に示されるタイプの発光スペクトルを呈する半導体レーザダイオードから、離散的に広がったスペクトルの光束を得る手法の一つは、上述したとおり、駆動電流に高周波数の交流成分を重畳することであるが、別の手法も存在する。図９には、別の手法に係る光源部２aの構成例が示されている。この光源部２aにおいては、半導体レーザダイオード２４から出射された光は、コリメートレンズ８１にて平行光にされた上で、フォーカスレンズ８２でフェルール８３に集光され、光ファイバ８４で導かれて、培養プレート３上の細胞に照射される（図５参照）。ここで、フェルール８３は、その先端が、入射した光の一部を反射させる反射面８３０により形成されており、該反射面８３０が、半導体レーザダイオード２４から出射された光の光軸上に配置されている。また、反射面８３０は、その法線と該光軸とが0ではない所定の角度θを成すような姿勢で配置されている。すなわち、反射面８３０の法線と該光軸とが一致しないような姿勢で配置されている。
ここで、所定の角度θとは、反射面８３０で反射された光の一部が、半導体レーザダイオード２４に戻るような（すなわち、戻り光が形成されるような）角度である。この角度θが小さいほど半導体レーザダイオード２４に戻る光が多くなるが、半導体レーザダイオード２４に戻る光が多すぎると半導体レーザダイオード２４が戻り光により損傷される虞がある。一方で、この角度θが大きくなるにつれて半導体レーザダイオード２４に戻る光が少なくなり、ある角度を超えると半導体レーザダイオード２４に光が全く戻らない。一例として、該角度θを、0°より大きくかつ7°以下の範囲とすることで、半導体レーザダイオード２４から出射された光の10〜90％が半導体レーザダイオード２４に戻るようにすることができる。
ただし、半導体レーザダイオード２４に戻る光の光量によっては、半導体レーザダイオード２４のレーザ共振器ゲイン、損失、電流動作点、半導体レーザダイオード２４および光ファイバ８４の端面のフレネル反射率、戻り光により形成されるレーザ共振器とのマッチング、等の各パラメータに影響が生じる可能性があるため、上記の角度θとこれら影響をうける各パラメータとの組合せによる調整により、戻り光の最適値を決定することが好ましい。
具体的には例えば、まずは、半導体レーザダイオード２４のレーザ共振器ゲインおよびマッチングインピーダンス、駆動電流量、半導体レーザダイオード２４および光ファイバ８４の端面のフレネル反射率、等を、半導体レーザダイオード２４の動作点が最適となるように予め租調整し、その後、最適な（あるいは許容範囲におさまるような）光量の戻り光が形成され、かつ、上記の各パラメータも最適な（あるいは許容範囲におさまるような）値となるように、角度θ等を微調整することが好ましい。
なお、戻り光を形成するための反射面８３０は、必ずしもフェルール８３の先端で構成される必要はなく、フェルール８３とは別にミラー等の光学部品を設けて、該ミラーで戻り光を形成してもよい。
シングルモードで発振する一般的な半導体レーザダイオード２４に対して、上記の構成により戻り光が形成される構成とすると、その発光スペクトルは、図４(b2)に示されるようなものとなる。すなわち、戻り光を形成することによって、そのスペクトルは、離散的に広がった様相を呈するようになる。このときのスペクトル幅は、上記の角度θに応じて変化する。すなわち、該角度θを調整することによって、任意のスペクトル幅を形成することができる。
また、上述したとおり、このように離散的に広がったスペクトル分布の発光を形成している半導体レーザダイオードにおいて、その駆動電流に、さらに、50kHz〜300kHz程度の低周波の交流成分を重畳すると、離散的に存在する各ピークのピーク幅が広がり、その発光スペクトルは、図４(c)に示されるように、連続的に広がった様相を呈するようになる。
この変形例によると、高周波数の交流信号を得るための複雑な回路構成や高価な部品が不要となるので、より簡素な回路構成を採ることができ、装置を安価に構成することができる。
＜４−３．ホログラフィ観察装置の構成に関する変形例＞
上記実施例ではインライン型のホログラフィ観察装置としたが、オフアクシス型ホログラフィ観察装置においても、上記実施例と同様に観察対象物体等の大きさに応じた可干渉距離の擬コヒーレント光束を用いることにより、観察対象物体以外の影響を低減した観察画像を得ることができる。
図１０に変形例であるオフアクシス型ホログラフィ観察装置１aの要部構成を示す。光源部２、培養プレート３、イメージセンサ４、制御部５、入力部６、及び表示部７は上記実施例と同じであるため同一の符号を付して説明を省略する。このホログラフィ観察装置１aでは、光源部２から発せられる所定のスペクトル幅及び所定のスペクトル強度を有することで所定の可干渉距離を有する擬コヒーレント光束を、第１ハーフミラー４１により細胞に照射する測定光束と、細胞には照射しない参照光束に分割する。第１ハーフミラー４１で反射された測定光束は、第１ミラー４２で反射され、続いて培養プレート３上の細胞に照射される。また、第１ハーフミラー４１を透過した参照光束は第２ミラー４５で反射される。細胞を透過した測定光束と、第２ミラー４５で反射された参照光束は、第２ハーフミラー４４により合成されて干渉し、イメージセンサ４で測定される。なお、図１０のオフアクシス型ホログラフィ観察装置１aは透過光を利用するものであるが、反射光を利用するものについても本発明を適用することができる。
＜４−４．光源部２に関する変形例＞
また、上記実施例では、半導体レーザダイオード２４の駆動電流に交流信号を重畳することにより、レーザ光束の可干渉距離を短くして擬コヒーレント光束を得たが、これに代えて、所定のスペクトル幅を有し半導体レーザダイオードに比べて可干渉距離が短い光を発生させるスーパールミネッセンスダイオード（SLD）や発光ダイオード（LED）を用いることもできる。この場合には、観察対象物体及び光路上に位置する非観察対象物体の大きさや光学的特性に合わせて適宜の可干渉距離を有するSLDやLEDを使用することにより、上記実施例と同様の効果を得ることができる。
また、上記実施例では、１つの半導体レーザダイオード２４とその駆動電流供給部２０のみを有する光源部２を用いたが、発振波長が異なる複数の半導体レーザダイオードと、各半導体レーザダイオードを駆動する駆動部を備えた光源、あるいは発振波長が異なる複数のSLD及び／又はLEDを用いることもできる。
図１１に、発振波長が異なる複数の半導体レーザダイオードを用いる場合の光源部２bの構成を示す。この光源部２bは、互いに異なる波長の光を発する4種類の半導体レーザダイオード２４１〜２４４と、各半導体レーザダイオード２４１〜２４４に駆動電流を供給する駆動電流供給部２０１〜２０４を備えている。また、駆動電流供給部２０１〜２０４は、それぞれ、直流電圧を生成する直流電圧生成部２１１〜２１４、交流電圧を生成して前記直流電圧に重畳する交流電圧生成部２２１〜２２４、及び電圧／電流変換部２３１〜２３４を備えている。光源部２bは、さらに、直流電圧生成部２１１〜２１４に送信する直流信号を生成する直流信号生成部２５、交流電圧生成部２２１〜２２４に供給する交流信号を生成する交流信号生成部２６、及び直流電圧生成部２１１〜２１４に供給するタイミング信号を生成する照明タイミング信号発生部２７を備えている。
この光源部２bでは、直流信号生成部２５から各直流電圧生成部２１１〜２１４に送信する直流信号の大きさにより、各半導体レーザダイオード２４１〜２４４から発せられる擬コヒーレント光束の（平均）強度を制御する。また、交流信号生成部２６から各交流電圧生成部２２１〜２２４に送信する交流信号の周波数及び振幅により、各半導体レーザダイオード２４１〜２４４から発せられる擬コヒーレント光束の可干渉距離を制御する。前述の通り、交流信号の周波数はイメージセンサの読み出し周波数よりも十分に高い周波数（例えば約1000倍の周波数）に設定され、可干渉距離は観察対象物体の大きさや光学的特性に応じた適切な長さ（例えば数百μm）に設定される。
照明タイミング信号生成部２７は、直流電圧生成部２１１〜２１４に順番にタイミング信号を送信する。各駆動電流供給部２０１〜２０４では、直流電圧生成部２１１〜２１４にタイミング信号が送信されると、該直流電圧生成部２１１〜２１４で生成した直流信号に交流信号生成部２２１〜２２４で生成した交流信号を重畳して電圧／電流変換部２３１〜２３４に送信し、半導体レーザダイオード２４１〜２４４に駆動電流を供給する。これにより、観察対象物体に、異なる波長の擬コヒーレント光束が順に照射され、各波長の擬コヒーレント光束による観察対象物体のホログラフィ像が得られる。
観察対象物体に照射された擬コヒーレント光束の干渉の態様は、該光束の波長によって異なる。従って、上記のように波長が異なる4種類の擬コヒーレント光束を観察対象物体に照射し、波長に応じて異なる4種類のホログラフィ像が得られる。こうして得た4種類のホログラフィ像を用いて観察対象物体の画像を再構成することにより、1種類の波長の光束のみを用いる場合よりも高い分解能で観察対象物体の画像を得ることができる。
１、１a…ホログラフィ観察装置
２、２a、２b…光源部
２０、２０１〜２０４…駆動電流供給部
２１、２１１〜２１４…直流電圧生成部
２２、２２１〜２２４…交流電圧生成部
２３、２３１〜２３４…電圧／電流変換部
２４、２４１〜２４４…半導体レーザダイオード
２５…直流信号生成部
２６…交流信号生成部
２７…照明タイミング信号生成部
３…培養プレート
４…イメージセンサ
５…制御部
５０…記憶部
５１…光源制御部
５２…演算処理部
６…入力部
７…表示部
４１…第１ハーフミラー
４２…第１ミラー
４４…第２ハーフミラー
４５…第２ミラー
８１…コリメートレンズ
８２…フォーカスレンズ
８３…フェルール
８３０…反射面
８４…光ファイバ

Claims (10)

  1. 半導体レーザ光源と、
    前記半導体レーザ光源に交流成分を重畳した駆動電流を供給する電流源と、
    前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を観察対象物体に透過又は反射させ、該観察対象物体の異なる位置で透過又は反射した光を干渉させる照射光学系と、
    前記観察対象物体を透過又は反射した光束の干渉像を取得するイメージセンサと、
    前記半導体レーザ光源から出射された光束の一部を前記半導体レーザ光源に戻す戻り光形成部であって、入射した光の少なくとも一部を反射させる反射面を有し、該反射面が、前記半導体レーザ光源から出射された光束の光軸上であって、該反射面の法線と前記光軸とが一致しないような姿勢で配置された反射部材を備える戻り光形成部と
    を備えることを特徴とするホログラフィ観察装置。
  2. 半導体レーザ光源と
    前記半導体レーザ光源に交流成分を重畳した駆動電流を供給する電流源と、
    前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を2分割し、一方を観察対象物体に透過又は反射させる照射光学系と、
    前記観察対象物体を透過又は反射した光束と、2分割された他方の光束であって前記観察対象物体を透過又は反射しない光束との干渉像を取得するイメージセンサと
    前記半導体レーザ光源から出射された光束の一部を前記半導体レーザ光源に戻す戻り光形成部であって、入射した光の少なくとも一部を反射させる反射面を有し、該反射面が、前記半導体レーザ光源から出射された光束の光軸上であって、該反射面の法線と前記光軸とが一致しないような姿勢で配置された反射部材を備える戻り光形成部と
    を備えることを特徴とするホログラフィ観察装置。
  3. 前記交流成分の周波数が50kHz〜300kHzであることを特徴とする請求項１又は２に記載のホログラフィ観察装置。
  4. 前記交流成分に、さらに100MHz〜500MHzの周波数成分を重畳することを特徴とする請求項３に記載のホログラフィ観察装置。
  5. 前記交流成分の周波数が100MHz〜500MHzであることを特徴とする請求項１又は２に記載のホログラフィ観察装置。
  6. 半導体レーザ光源と、
    前記半導体レーザ光源に、周波数が50kHz〜300kHzである交流成分及び周波数が100MHz〜500MHzである交流成分を重畳した駆動電流を供給する電流源と、
    前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を観察対象物体に透過又は反射させ、該観察対象物体の異なる位置で透過又は反射した光を干渉させる照射光学系と、
    前記観察対象物体を透過又は反射した光束の干渉像を取得するイメージセンサと、
    前記半導体レーザ光源から出射された光束の一部を前記半導体レーザ光源に戻す戻り光形成部と
    を備えることを特徴とするホログラフィ観察装置。
  7. 半導体レーザ光源と
    前記半導体レーザ光源に、周波数が50kHz〜300kHzである交流成分及び周波数が100MHz〜500MHzである交流成分を重畳した駆動電流を供給する電流源と、
    前記駆動電流により駆動された前記半導体レーザ光源から発せられる光束を2分割し、一方を観察対象物体に透過又は反射させる照射光学系と、
    前記観察対象物体を透過又は反射した光束と、2分割された他方の光束であって前記観察対象物体を透過又は反射しない光束との干渉像を取得するイメージセンサと
    を備えることを特徴とするホログラフィ観察装置。
  8. 前記交流成分の周波数が、前記イメージセンサの信号読み出し周波数よりも大きいことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のホログラフィ観察装置。
  9. 請求項１から８のいずれかに記載のホログラフィ観察装置を備えた細胞画像観察装置。
  10. 半導体レーザ光源と、
    前記半導体レーザ光源から出射された光束の一部を前記半導体レーザ光源に戻す戻り光形成部、
    を備え、
    前記戻り光形成部が、
    入射した光の少なくとも一部を反射させる反射面を有し、該反射面が、前記半導体レーザ光源から出射された光束の光軸上であって、該反射面の法線と前記光軸とが一致しないような姿勢で配置された反射部材、
    を備えることを特徴とする光源部。
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