WO2019180811A1 - 細胞観察装置及び細胞観察用プログラム - Google Patents

細胞観察装置及び細胞観察用プログラム Download PDF

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WO2019180811A1
WO2019180811A1 PCT/JP2018/011006 JP2018011006W WO2019180811A1 WO 2019180811 A1 WO2019180811 A1 WO 2019180811A1 JP 2018011006 W JP2018011006 W JP 2018011006W WO 2019180811 A1 WO2019180811 A1 WO 2019180811A1
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WO
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cell
image
determination result
list
cells
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Application number
PCT/JP2018/011006
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English (en)
French (fr)
Inventor
藤原　直也
Original Assignee
株式会社島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis

Definitions

  • the present invention relates to a cell observation apparatus for observing a cell state and a computer program for observing a cell, and more specifically, non-invasively the cell state in a process of culturing pluripotent stem cells (ES cells and iPS cells).
  • the present invention relates to a cell observation apparatus and a cell observation program suitable for determining whether there is a defect in culture or the like.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells
  • undifferentiated deviant cells cells that have deviated from an undifferentiated state (already differentiated cells or cells that are likely to be differentiated, hereinafter referred to as “undifferentiated deviant cells”) are generated every day. If it is confirmed and an undifferentiated departure cell is found, it must be removed quickly.
  • pluripotent stem cells are maintained in an undifferentiated state can be reliably determined by staining with an undifferentiated marker.
  • undifferentiated marker staining cannot be performed for determination of pluripotent stem cells for regenerative medicine.
  • it is determined whether the worker is an undifferentiated cell based on the morphological observation of the cell using a phase contrast microscope.
  • the phase contrast microscope is used because cells are generally transparent and difficult to observe with a normal optical microscope.
  • Non-Patent Document 1 recently, an apparatus for acquiring an observation image of a cell using a holographic technique has been put into practical use. As disclosed in Patent Documents 1 to 4 and the like, this apparatus performs clear data processing such as phase recovery and image reconstruction on hologram data obtained with a digital holographic microscope, thereby observing cells clearly.
  • a phase image (hereinafter referred to as “IHM phase image” since an in-line holographic microscope (IHM) is used) is created. Similar to the phase contrast microscopic image obtained by the phase contrast microscope, the transparent cells can be observed relatively clearly in this IHM phase image. Therefore, it is possible for the operator to determine whether or not the cell is an undifferentiated cell while viewing the IHM phase image.
  • each cell or cell colony is not yet removed. It is necessary to determine whether the cell is a differentiated cell or a cell colony containing it, or an undifferentiated cell or a cell colony containing only it. Usually, a large amount of cells exist in one culture vessel, and the cells are often cultured in a plurality of culture vessels having different culture conditions and the like. Therefore, the determination result data for each cell or each cell colony as described above is enormous.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and its main purpose is to understand the state and quality of cells at a glance even if the operator has little experience or skill based on the images obtained for the cells.
  • the object is to provide a cell observation apparatus that can be grasped and a computer program for cell observation.
  • the cell observation device made to solve the above problems is a cell observation device for observing cells in one or a plurality of containers, a) a determination image that is either a captured image obtained for the entire observation range of one or a plurality of containers or a partial observation range thereof, or an observation image obtained by a predetermined process based on data constituting the captured image.
  • a cell state determination unit that determines whether the whole or a part thereof is two or more cell states for each cell or cell colony detected on the image; b) In the determination result of the cell state by the cell state determination unit for the cell or cell colony in association with the position where the cell or cell colony is detected on the image which is the whole or a part of the image for determination.
  • a determination result image in which a corresponding mark is superimposed and a whole image in which information indicating an image range of the determination result image is superimposed on the photographed image or the observation image are arranged on the same screen and displayed.
  • a display processing unit to be displayed on the screen It is characterized by having.
  • the cell observation program according to the present invention which has been made to solve the above-mentioned problems, is a computer program used for observing cells in one or a plurality of containers. a) a determination image that is either a captured image obtained for the entire observation range of one or a plurality of containers or a partial observation range thereof, or an observation image obtained by a predetermined process based on data constituting the captured image.
  • a determination result image in which a mark corresponding to the determination result data is superimposed and an entire image in which information indicating the image range of the determination result image is superimposed on the captured image or the observation image are arranged on the same screen. Display processing steps to be displayed on the screen of the display unit, It is characterized by executing.
  • the type of cells to be observed in the present invention is not particularly limited, but is typically pluripotent stem cells including human iPS cells.
  • the two or more cell states may include at least an undifferentiated state and an undifferentiated departure state.
  • the determination image in the present invention is an image in which transparent cells can be observed relatively clearly.
  • the photographed image is a hologram image obtained by a holographic microscope
  • the observation image is any space of phase information, intensity information calculated by a predetermined calculation process based on hologram data, or information including both elements.
  • an observation image that is, a phase image may be used as the determination image.
  • a phase contrast microscopic image obtained with a phase contrast microscope can be used as a captured image.
  • the captured image may be used as a determination image as it is.
  • the holographic microscope may be any of an in-line type, an off-axis type, a phase shift type, etc., regardless of its system.
  • the cell state determination unit for example, for the entire phase image obtained based on the hologram data as described above, the region occupied by cells or cell colonies observed on the image is While distinguishing it from a background region such as a medium, it is determined whether each cell or cell colony has two or more cell states in an undifferentiated state or an undifferentiated deviation state, that is, the quality of the cell. Since the cell colony includes a plurality of cells, if at least one of them is determined to be in an undifferentiated departure state, the cell colony may be determined to be in an undifferentiated departure state.
  • the algorithm for determining such a cell state is not particularly limited. For example, machine learning in which the characteristics of each region of undifferentiated cells and undifferentiated cells are learned is useful.
  • the determination result of the cell state is obtained corresponding to the position information of each cell or each cell colony on the phase image, that is, the pixel position information.
  • the display processing unit receives the determination result, and a determination result image obtained by superimposing a mark corresponding to the determination result of the cell state in association with the position of the cell or the cell colony on the entire phase image or a part of the image. Get. That is, marks corresponding respectively to undifferentiated cells and undifferentiated cells may be determined, and the marks may be displayed in a superimposed manner at positions where each cell or each cell colony exists on the phase image.
  • the display processing unit superimposes information indicating the image range of the determination result image on the original hologram image or phase image.
  • a display screen in which the entire image and the determination result image are arranged on the same screen is formed and displayed on the screen of the display unit. Since this whole image is only for reference, it is preferable to use a reduced image of a captured image such as a hologram image.
  • the operator can see the determination result image displayed on the display unit without visually determining the state of each cell or each cell colony on the image, for example, undifferentiated cells and undifferentiated deviations. You can see at a glance where the cells are located. Also, by observing the entire image displayed in the same screen, the observation range appearing in the determination result image is any position and range in one container, or any of a plurality of containers It is possible to easily know which position and range of the container.
  • the marks corresponding to the determination results of different cell states such as the undifferentiated state and the undifferentiated deviation state may have different shapes, but the shape is the same, and the display color and grayscale on the gray scale are different. It is easy to understand if it is different.
  • the display processing unit creates a list indicating the cell state determination result in association with each cell or each cell colony based on the determination result by the cell state determination unit.
  • the list may be displayed on the same screen as the determination result image.
  • the display processing unit may create the list by narrowing down the cells or cell colonies included in the list to those having the cell state determination result specified by the condition input unit.
  • condition input unit for example, a list in which only cells or cell colonies determined to be undifferentiated departure cells can be displayed.
  • the device is capable of acquiring the photographed images of a plurality of containers capable of culturing cells independently, and the list includes each cell or each cell colony.
  • the condition input unit is for a user to specify a container to which a cell or cell colony included in the list belongs as one of the narrowing conditions,
  • the display processing unit may be configured to create the list by narrowing down the cells or cell colonies listed in the list to those belonging to the container specified by the condition input unit.
  • the list includes a check box capable of inputting a check mark by a user input operation for each cell or cell colony listed
  • the condition input unit is for a user to specify the presence or absence of a check mark in the check box as one of the narrowing conditions
  • the display processing unit may be configured to create the list by narrowing down the cells or cell colonies included in the list to those in the check mark state designated by the condition input unit.
  • the worker puts a check mark on what is focused on each cell or cell colony listed in the list or what he wants to confirm in detail later.
  • a list in which only cells or cell colonies with check marks are posted can be displayed later, and the operator can confirm it.
  • the list includes, as a display item, information on a confirmation result obtained by a user confirming a cell state determination result for each cell or cell colony
  • the condition input unit is for a user to specify information on the confirmation result as one of narrowing conditions
  • the display processing unit may be configured to create the list by narrowing down the cells or cell colonies listed in the list to those of the confirmation result information specified by the condition input unit.
  • the “confirmation result information” is, for example, information on the result of confirming that the determination result of the cell state automatically made is correct or incorrect, or whether it is correct or incorrect. Information indicating that it cannot be performed. According to this, for example, the worker himself or another person in charge displays a list in which only cells and cell colonies that are automatically judged to be erroneous in the cell state determination result are displayed. Then, it can be confirmed, or the cell removal operation can be performed based on the list.
  • the display processing unit is configured to instruct one of a column corresponding to a cell or a cell colony on the list and a mark on the determination result image via the input unit.
  • the other of the corresponding column on the list or the mark on the determination result image may be displayed so as to be distinguishable from the other column or mark.
  • the operator can confirm detailed information on the cell or cell colony at the position of interest on the determination result image on the list, or conversely, at which position the cell or cell colony of interest on the list is located. It can be easily confirmed on the image whether there is any.
  • any cell or cell colony in the container is in an undifferentiated deviation state without the operator himself / herself determining the cell state. Can be confirmed at a glance on the displayed image. Thereby, even a worker who lacks experience and skill can accurately grasp the state and quality of cells.
  • the operator can efficiently confirm only the determination result of the desired cells, so that not only the work efficiency is improved but also work errors and oversights are reduced. Accuracy, and thus productivity in cell culture can be improved.
  • the schematic block diagram of the cell observation apparatus which is one Example of this invention.
  • the flowchart which shows the work procedure in the observation operation of the cell state using the cell observation apparatus of a present Example, and the flow of a process.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a cell observation apparatus according to the present embodiment.
  • the cell observation apparatus of the present embodiment includes a microscope observation unit 10, a control / processing unit 20, and an input unit 30 and a display unit 40 that are user interfaces.
  • the microscopic observation unit 10 is an in-line holographic microscope, and includes a light source unit 11 including a laser diode and an image sensor 12, and a cell (or cell) is interposed between the light source unit 11 and the image sensor 12.
  • a culture plate 13 containing colonies 14 is arranged.
  • the control / processing unit 20 controls the operation of the microscopic observation unit 10 and processes data acquired by the microscopic observation unit 10, and includes an imaging control unit 21, a hologram data storage unit 22, and phase information calculation.
  • Unit 23 image reconstruction unit 24, reconstructed image data storage unit 25, cell state determination unit 26, determination result data storage unit 27, display condition setting unit 28, and display processing unit 29 Prepare as a block.
  • the display processing unit 29 includes a detailed image forming unit 291, an entire image forming unit 292, a cell list creating unit 293, etc. as lower functional blocks.
  • the entity of the control / processing unit 20 is a personal computer installed with predetermined software (computer program), a higher-performance workstation, or a high-performance computer connected to such a computer via a communication line.
  • the observation target is a human iPS cell.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a work procedure and a flow of processing in a cell state observation work using the cell observation apparatus of this embodiment
  • FIG. 3 is a conceptual diagram for explaining a photographing operation and an image reconstruction process.
  • FIG. 3 (a) is a schematic top view of the culture plate 13 used in the cell observation apparatus of this example.
  • the culture plate 13 is formed with six wells 13a having a circular shape when viewed from above, and cells are cultured in the wells 13a.
  • the entire culture plate 13, that is, the entire rectangular range including the six wells 13 a is the observation target region.
  • the microscopic observation unit 10 includes four sets of a light source unit 11 and an image sensor 12, and each set of the light source unit 11 and the image sensor 12 has a total of 4 etc. as shown in FIG. It is responsible for collecting the hologram data of the four divided areas 81 divided. That is, the four sets of the light source unit 11 and the image sensor 12 share the collection of hologram data over the entire culture plate 13.
  • the range in which one set of the light source unit 11 and the image sensor 12 can be photographed at a time includes the one well 13a in the four-divided range 81 as shown in FIGS. 3B and 3C.
  • the four light source units 11 and the four image sensors 12 are respectively arranged in the vicinity of four vertices of a rectangle having the same size as the four-divided range 81 in the XY plane including the light source unit 11 and the image sensor 12.
  • the holograms for four different imaging units 83 on the culture plate 13 are simultaneously acquired.
  • the operator When collecting hologram data for the culture plate 13, the operator first sets the culture plate 13 on which the cells 14 to be observed are cultured at a predetermined position of the microscopic observation unit 10, and identifies the culture plate 13. The execution of measurement is instructed after inputting information such as a number and measurement date and time from the input unit 30. Upon receiving this measurement instruction, the imaging control unit 21 controls each part of the microscopic observation unit 10 to perform imaging (step S1).
  • one light source unit 11 irradiates a predetermined area (one imaging unit 83) of the culture plate 13 with coherent light having a small angle spread of about 10 °.
  • the coherent light (object light 16) that has passed through the culture plate 13 and the cells 14 reaches the image sensor 12 while interfering with the light (reference light 15) that has passed through the region adjacent to the cells 14 on the culture plate 13.
  • the object light 16 is light whose phase has changed when passing through the cell 14.
  • the reference light 15 is light that does not pass through the cell 14 and therefore does not undergo phase change caused by the cell 14.
  • an interference image that is, a hologram
  • 2D light intensity distribution data hologram data
  • the four image sensors 12 acquire hologram data of regions corresponding to different imaging units 83 on the culture plate 13. Is done.
  • the light source unit 11 and the image sensor 12 are moved by a moving unit (not shown) by a distance corresponding to one imaging unit 83 in the X and Y directions in the XY plane. Are sequentially moved in steps.
  • measurement is performed with 180 imaging units 83 included in the four-divided range 81, and measurement of the entire culture plate 13 is performed with the four sets of light source units 11 and the entire image sensor 12.
  • the hologram data obtained by the four image sensors 12 of the microscopic observation unit 10 in this way is stored in the hologram data storage unit 22 together with attribute information such as measurement date and time.
  • the phase information calculation unit 23 sequentially reads out hologram data from the hologram data storage unit 22 and performs light wave propagation calculation processing, thereby performing phase information at each two-dimensional position. And the amplitude information is restored. Since the spatial distribution of these information is obtained for each imaging unit 83, if the phase information and amplitude information of all the imaging units 83 are obtained, the image reconstruction unit 24 performs observation based on the phase information and amplitude information.
  • a phase image of the entire target region, that is, an IHM phase image is formed (step S2).
  • the image reconstruction unit 24 reconstructs the IHM phase image of each imaging unit 83 based on the spatial distribution of the phase information calculated for each imaging unit 83. Then, by performing a tiling process (see FIG. 3D) for joining the IHM phase images in the narrow range, an IHM phase image of the observation target region, that is, the entire culture plate 13 is formed. Data constituting the IHM phase image is stored in the reconstructed image data storage unit 25. In the tiling process, an appropriate correction process may be performed so that the IHM phase images at the boundary of the imaging unit 83 are smoothly connected.
  • Patent Documents 3 and 4 For the calculation of phase information and image reconstruction as described above, a known algorithm disclosed in Patent Documents 3 and 4 may be used.
  • a known algorithm disclosed in Patent Documents 3 and 4 may be used.
  • IHM phase image cell outlines (boundaries) that are transparent and difficult to see with an optical microscope and patterns inside the cells are easily visible.
  • the reconstructed image obtained by normal processing is the highest resolution IHM phase image obtained in principle from the acquired hologram data, but not only that, but based on the highest resolution IHM phase image, binning processing, etc.
  • the IHM phase images having a plurality of resolutions with reduced resolution are created.
  • the data constituting the IHM phase images of various resolutions are stored in the reconstructed image data storage unit 25.
  • the display processing unit 29 reads out the reconstructed image data having the necessary resolution from the reconstructed image data storage unit 25 and should display it. Images can be formed quickly.
  • intensity information, pseudo phase information obtained by merging the phase information and the intensity information, and the like are also calculated, and the image reconstruction unit 24 reproduces a reproduced image (IHM)
  • An intensity image, an IHM pseudo phase image can also be created. These images may be used in place of the IHM phase image. Further, when creating an IHM phase image or the like based on the hologram data, it is possible to create an IHM phase image or the like at a plurality of focal positions.
  • the cell state determination unit 26 detects a cell or cell colony by identifying a boundary between the cell or cell colony and the background in the IHM phase image (or IHM intensity image or the like) created as described above. Further, whether each cell or cell colony is classified into one of two cell states, an undifferentiated state and an undifferentiated deviation state, is determined to determine whether the cell or cell colony is good or bad (step S3).
  • the cell state determination unit 26 has a discriminator that is constructed in advance by learning using a large number of teacher data, and using this discriminator, an undifferentiated cell in pixel units with respect to an input image. Identify whether it is a region, an undifferentiated departure cell region, or otherwise. A region that is not identified as either an undifferentiated cell region or an undifferentiated departure cell region can be regarded as a background region such as a medium. Therefore, the boundary (contour) of one cell or cell colony is found from the pixel identified as an undifferentiated cell region or an undifferentiated departure cell region, and an undifferentiated state (good product) or Classification into any of undifferentiated deviation states (defective products) can be performed.
  • One cell state determination result in the cell state determination unit 26 is obtained for each cell or cell colony, and the determination result is either an undifferentiated state or an undifferentiated deviation state.
  • Various algorithms for classification processing in the classifier used in the cell state determination unit 26 are conceivable.
  • the algorithm is not particularly limited.
  • a supervised machine learning method such as a support vector machine is used. It is particularly effective.
  • the cell state determination unit 26 obtains a cell state determination result (classification result) for each cell or cell colony observed on the IHM phase image (or IHM intensity image or the like). Individual cells and cell colonies can be specified by two-dimensional position information (pixel addresses) on the IHM phase image corresponding to the entire observation target region shown in FIG. Therefore, the cell state determination unit 26 assigns, for example, an identification number (ID) that is a serial number to each detected cell or cell colony, and determines cell position information and a cell state determination result in association with each identification number. The result is stored in the result data storage unit 27 (step S4).
  • ID identification number
  • the display processing unit 29 creates a cell determination result display screen 50 showing the cell state determination result based on the data stored in the determination result data storage unit 27, the reconstructed image data storage unit 25, and the hologram data storage unit 22. And it displays on the screen of the display part 40 (step S5).
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a cell determination result display screen
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a cell list in FIG. 4
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a condition designation screen displayed in response to a predetermined operation. is there.
  • the display processing unit 29 displays a cell determination result display screen 50 as shown in FIG. 4 on the screen of the display unit 40.
  • the cell determination result display screen 50 includes a detailed image display area 51 occupying a large area in the screen 50, a past image display area 54, a list display area 57, and an entire image display area 55. Yes.
  • a display image selection instruction unit 53 is provided in the upper part of the detailed image display area 51, and a check mark can be selected by selectively checking a plurality of check boxes arranged in the display image selection instruction unit 53. Are displayed in the detailed image display area 51.
  • the detailed image forming unit 291 acquires predetermined data from the determination result data storage unit 27 and the reconstructed image data storage unit 25, and each image in the cell state determination process, in this example, the IHM phase image is used.
  • a mark corresponding to the cell state determination result is superimposed on the coordinate position where the cell is detected, and a cell determination result image 52 on which the mark is superimposed is displayed in the detailed image display area 51.
  • the marks displayed in an overlapping manner have the same shape, and the display color is different from the mark indicating that the cell state determination result is an undifferentiated state and the mark indicating the undifferentiated deviation state.
  • a mark 52a is attached to a mark indicating an undifferentiated state
  • a mark 52b is attached to a mark indicating an undifferentiated departure state.
  • the mark with the reference numeral 52c will be described later. That is, the positions where the marks 52a, 52b and 52c are drawn on the cell determination result image 52 are the positions where the cells determined to be in the cell state indicated by the marks are detected.
  • the whole image forming unit 292 acquires data from the hologram data storage unit 22 and forms an image obtained by reducing the interference image of the entire observation target region. In this reduced image, the position of each well 13a on the culture plate 13 can be clearly observed. Further, a reduced image 56 in which a rectangular frame mark 56 a indicating the range of the cell determination result image 52 currently displayed in the detailed image display area 51 is superimposed on the reduced image is displayed in the entire image display area 55. indicate.
  • the detailed image forming unit 291 and the entire image forming unit 292 determine the position and size of the frame mark 56a on the reduced image 56 displayed in the entire image display region 55 and the cell determination displayed in the detailed image display region 51.
  • the range of the result image 52 is linked. Therefore, for example, when the operator changes the position and size of the frame mark 56a on the reduced image 56 displayed in the entire image display area 55 by operating the input unit 30, the detailed image forming unit 291 displays the frame.
  • the cell determination result image 52 is updated so as to correspond to the position and size of the mark 56a.
  • the detailed image forming unit 291 changes the position and size of the frame mark 56a according to the operation. Therefore, the worker can confirm at a glance which range and position of the cell determination result image 52 displayed in the detailed image display area 51 at that time in the entire observation target area. Further, when the cell determination result image 52 is enlarged or reduced, that is, when the magnification of the cell determination result image 52 is changed, the mark 52a superimposed on the image 52 is displayed according to the magnification. You may change the aspect of 52b, 52c.
  • the cell list creation unit 293 creates a cell list 58 as shown in FIG. 5 based on the data acquired from the determination result data storage unit 27 and displays it in the list display area 57.
  • this cell list 58 an item column 58b indicating the identification number of the well in which the cell is cultured in association with the identification number (ID) individually assigned to all the cells in the observation target region, An item column 58c indicating a state determination result, an item column 58d indicating a correct / incorrect evaluation result with respect to the determination result, and the like are provided, and information on each item is posted for each cell.
  • a check box field 58a in which a check mark can be set for each cell is prepared. In the example of FIG.
  • the determination result of the cell state is the item name “classification”, “undifferentiated” indicates an undifferentiated state, and “differentiated” indicates an undifferentiated deviation state. Further, in the item column 58c indicating the determination result of the cell state, rectangular marks having the same color as the display colors of the marks 52a and 52b on the cell determination result image 52 are described.
  • the operator can appropriately input a check mark in the check box field 58a corresponding to a cell that requires attention or a cell that seems to be worthy of attention.
  • the operator performs an input operation to the item field 58d indicating the correct / incorrect evaluation result with respect to the determination result or a check mark to the check box field 58a and clicks the “save” button 61, it is input.
  • the determined information is confirmed and stored in the determination result data storage unit 27.
  • the background color of the row changes to a color different from that of the other rows and is highlighted.
  • the mark corresponding to the highlighted line in the list 58 that is, the cell in the line.
  • the mark changes to a different color from the other marks and is highlighted.
  • reference numeral 52c is a highlighted mark. In the example of FIGS. 4 and 5, this mark is a mark corresponding to a cell whose identification number is “21”.
  • the operator can grasp at a glance where the cell selected on the cell list 58 is located on the cell determination result image 52. Conversely, when an operator selects and designates one mark on the cell determination result image 52 by a click operation or the like, a line in the list 58 in which cells corresponding to the mark are described is highlighted. Thereby, the operator can quickly confirm the detailed information about the cell at a specific position on the cell determination result image 52 in the cell list 58.
  • the cell list 58 when the cell determination result display screen 50 is displayed for the first time after the cell state determination processing is performed, all detected cells or cell colonies are listed.
  • the number is usually quite large, and in fact, the worker often wants to confirm only a specific one among them. Therefore, it is possible to narrow down the cells to be listed in the cell list 58 as follows.
  • condition designation screen 70 is a screen for designating conditions for narrowing down the cells displayed in the cell list 58.
  • a result designation area 70d is provided.
  • a plurality of check boxes are arranged in each of the designated areas 70a to 70d. By appropriately checking the check boxes, only cells that meet the conditions with the check marks are displayed in the cell list 58. Is done.
  • both “undifferentiated” and “differentiated” are checked, so that the cell state determination result is not narrowed down. Furthermore, since all of “OK”, “NG”, and “Undecided” are marked in the correct / incorrect input result designation area 70d, the correct / incorrect input results are not narrowed down.
  • the reduced images acquired in the past for the culture plates having the same identification number are displayed together with the measurement date and time in the past image display area 54. Then, when an operator selects and selects an arbitrary reduced image in the past image display area 54 and clicks the “change” button 62, the IHM phase image created based on the hologram data corresponding to the selected reduced image is displayed. And the display switches to the judgment result. Thereby, the image and list based on the past data regarding the same culture plate can also be confirmed.
  • an in-line holographic microscope is used as the microscopic observation unit 10.
  • other microscopes such as an off-axis (off-axis) type and a phase shift type can be used as long as the microscope can obtain a hologram.
  • it can be replaced by a holographic microscope of the type.
  • the present invention can be applied to a cell observation apparatus using a phase contrast microscope instead of using a holographic microscope for the microscopic observation unit 10.
  • a phase difference microscopic image may be used as the determination image that is the target of the cell state determination process.

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Abstract

本発明に係る細胞観察装置において、細胞状態判定部は、ホログラムデータに基づく位相算出処理及び画像再構成処理により作成した位相画像上で観察される細胞毎に未分化状態又は未分化逸脱状態のいずれかを判定する。表示処理部は、位相画像上に各細胞の状態判定結果を示すマークを重畳した細胞判定結果画像（５２）と、観察対象領域全体の画像の上に細胞判定結果画像（５２）の位置及び大きさを示す枠マーク（５６ａ）を重畳した縮小画像（５６）と、細胞毎の判定結果などの情報を掲載した細胞リスト（５８）と、を細胞判定結果表示画面（５０）上の異なる領域に配置して表示する。細胞リスト（５８）に表示される細胞は、ウェルの識別番号、細胞状態判定結果、判定結果に対する評価結果などの条件に従った絞り込みが可能である。これにより、作業者は細胞状態の判定結果を画像及びリストで確認しながら、細胞除去等の作業を効率良く行うことができる。

Description

細胞観察装置及び細胞観察用プログラム
　本発明は、細胞の状態を観察する細胞観察装置及び細胞観察用のコンピュータプログラムに関し、さらに詳しくは、多能性幹細胞（ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を培養する過程等において細胞の状態を非侵襲で判定したり培養に不具合がないか等を確認したりするのに好適な細胞観察装置及び細胞観察用プログラムに関する。
　再生医療分野では、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた研究が盛んに行われている。こうした多能性幹細胞を利用した再生医療の研究・開発においては、多能性を維持した状態の未分化の細胞を大量に培養する必要がある。そのため、適切な培養環境の選択と環境の安定的な制御が必要であるとともに、培養中の細胞の状態を高い頻度で確認する必要がある。例えば、細胞コロニー内の細胞が未分化状態から逸脱すると、この場合、細胞コロニー内にある全ての細胞は分化する能力を有しているために、最終的にはコロニー内の細胞全てが未分化逸脱状態に遷移してしまう。そのため、作業者（オペレータ）は培養している細胞中に未分化状態を逸脱した細胞（すでに分化した細胞や分化しそうな細胞、以下「未分化逸脱細胞」という）が発生していないかを日々確認し、未分化逸脱細胞を見つけた場合にはこれを迅速に除去する必要がある。
　多能性幹細胞が未分化状態を維持しているか否かの判定は、未分化マーカーによる染色を行うことで確実に行うことができる。しかしながら、染色を行った細胞は死滅するため、再生医療用の多能性幹細胞の判定には未分化マーカー染色を実施することができない。そこで、現在の再生医療用細胞培養の現場では、位相差顕微鏡を用いた細胞の形態的観察に基づいて、作業者が未分化細胞であるか否かを判定するようにしている。位相差顕微鏡を用いるのは、一般に細胞は透明であって通常の光学顕微鏡では観察しにくいためである。
　また、非特許文献１に開示されているように、最近では、ホログラフィ技術を用いて細胞の観察画像を取得する装置も実用化されている。この装置は、特許文献１～４等に開示されているように、デジタルホログラフィック顕微鏡で得られたホログラムデータに対し位相回復や画像再構成等のデータ処理を行うことで、細胞が鮮明に観察し易い位相像（インライン型ホログラフィック顕微鏡（In-line Holographic Microscopy：ＩＨＭ）を用いていることから、以下「ＩＨＭ位相像」という）を作成するものである。位相差顕微鏡で得られる位相差顕微画像と同様に、このＩＨＭ位相像でも透明である細胞を比較的明瞭に観察することができる。したがって、作業者がＩＨＭ位相像を見ながら、細胞が未分化細胞であるか否かを判定することも可能である。
　しかしながら、位相差顕微画像やＩＨＭ位相像を用いて細胞を或る程度鮮明に観察することはできるものの、作業者が目視で未分化等の細胞状態を正確に判定するにはかなり熟練や技量が必要である。そのため、そうした判定を担当できる作業者はかなり限られる。また、人間の判断に基づくために判定にばらつきが生じることは避けられない。また、熟練した作業者であっても目視での正確な判定には時間が掛かるため、大量の画像を処理することは難しい。そのため、こうした従来の手法は大学や研究機関での研究レベルであれば許容可能であるものの、多能性幹細胞を工業的に大量に培養するのには適さない。こうしたことから、画像上の細胞や細胞コロニーの状態を自動的に判定する技術が強く要望されている。
　また、上述したように培養中の細胞の中から未分化逸脱細胞を除去したり未分化逸脱細胞が存在する細胞コロニーを除去したりするためには、細胞又は細胞コロニーの一つ一つについて未分化逸脱細胞又はそれを含む細胞コロニーであるか、或いは未分化細胞又はそれのみを含む細胞コロニーであるかを判定する必要がある。通常、一つの培養容器内には大量の細胞が存在し、さらに培養条件等がそれぞれ異なる複数の培養容器で細胞を培養することも多い。そのため、上述したような細胞毎の又は細胞コロニー毎の判定結果データは膨大な量になる。こうしたことから、不所望の細胞や細胞コロニーを除去したり、或いは細胞状態の判定結果が適切であるか否かを確認したりする作業を作業者が効率良く進めるためには、個々の細胞や細胞コロニーの状態判定結果を分かり易く整理して、さらには本当に作業に必要な情報をのみを的確に選択して作業者に提示する必要がある。
国際特許公開第２０１７／２０３７１８号パンフレット 国際特許公開第２０１７／２０４０１３号パンフレット 国際特許公開第２０１６／０８４４２０号パンフレット 特開平１０－２６８７４０号公報
「細胞培養解析装置 CultureScanner CS-1」、［online］、株式会社島津製作所、［平成３０年２月１４日検索］、インターネット＜URL: https://www.an.shimadzu.co.jp/bio/cell/cs1/index.htm＞
　本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、細胞について得られた画像に基づいて経験や技量に乏しい作業者であっても細胞の状態や品質などを一目で把握することができる細胞観察装置、及び細胞観察用のコンピュータプログラムを提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞観察装置は、１又は複数の容器中の細胞を観察するための細胞観察装置であって、
　a)１又は複数の容器の全体又はその一部の観察範囲について得られた撮影画像若しくは該撮影画像を構成するデータに基づく所定の処理によって得られた観察画像のいずれかである判定用画像の全体又はその一部について、その画像上で検出された細胞毎又は細胞コロニー毎に２以上の細胞状態のいずれであるかを判定する細胞状態判定部と、
　b)前記判定用画像の全体又はその一部である画像上に、細胞又は細胞コロニーが検出された位置に対応付けてその細胞又は細胞コロニーについての前記細胞状態判定部による細胞状態の判定結果に対応するマークを重畳させた判定結果画像と、前記撮影画像又は前記観察画像の上に前記判定結果画像の画像範囲を示す情報を重畳させた全体画像とを、同一画面上に配置して表示部の画面上に表示させる表示処理部と、
　を備えることを特徴としている。
　また上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞観察用プログラムは、１又は複数の容器中の細胞を観察するために用いられるコンピュータプログラムであって、コンピュータに、
　a)１又は複数の容器の全体又はその一部の観察範囲について得られた撮影画像若しくは該撮影画像を構成するデータに基づく所定の処理によって得られた観察画像のいずれかである判定用画像の全体又はその一部について、その画像上で検出された細胞毎又は細胞コロニー毎に２以上の細胞状態のいずれであるかを判定した判定結果データを取得する判定結果データ取得ステップと、
　b)前記判定用画像の全体又はその一部である画像上に、細胞又は細胞コロニーが検出された位置に対応付けてその細胞又は細胞コロニーについて前記判定結果データ取得ステップで取得された細胞状態の判定結果データに対応するマークを重畳させた判定結果画像と、前記撮影画像又は前記観察画像の上に前記判定結果画像の画像範囲を示す情報を重畳させた全体画像とを、同一画面上に配置して表示部の画面上に表示させる表示処理ステップと、
　を実行させることを特徴としている。
　本発明における観察対象の細胞の種類は特に限定されないが、典型的にはヒトｉＰＳ細胞を含む多能性幹細胞である。この場合、前記２以上の細胞状態は未分化状態と未分化逸脱状態とを少なくとも含むものとするとよい。
　本発明における判定用画像は一般に透明である細胞が比較的明瞭に観察可能な画像である。例えば撮影画像はホログラフィック顕微鏡により得られたホログラム画像であり、観察画像は、ホログラムデータに基づく所定の演算処理により算出された位相情報、強度情報又はそれら両方の要素を含む情報のいずれかの空間分布を示す画像、即ち、位相画像、強度画像、又はそれらのマージ画像である。
　この場合、観察画像、即ち位相画像などを判定用画像とすればよい。また、撮影画像として位相差顕微鏡で得られる位相差顕微画像を用いることもでき、その場合、該撮影画像をそのまま判定用画像とすればよい。なお、上記ホログラフィック顕微鏡はその方式を問わず、インライン型、オフアクシス型、位相シフト型などのいずれでもよい。
　本発明に係る細胞観察装置において、細胞状態判定部は例えば、上述のようにホログラムデータに基づいて求められた位相画像の全体について、その画像上で観測される細胞又は細胞コロニーが占める領域をその培地等の背景領域と識別するとともに、その細胞又は細胞コロニー毎に未分化状態又は未分化逸脱状態の２以上の細胞状態のいずれであるか、つまりは細胞の良否を判定する。細胞コロニーは複数の細胞を含むから、その中の一つでも未分化逸脱状態であると判定されれば該細胞コロニーは未分化逸脱状態であると判定すればよい。こうした細胞状態を判定するためのアルゴリズムは特に問わないが、例えば未分化細胞、未分化逸脱細胞のそれぞれの領域の特徴を学習させた機械学習などが有用である。
　細胞状態判定部による判定によって、位相画像上の各細胞又は各細胞コロニーの位置情報つまりは画素位置情報に対応して細胞状態の判定結果が得られる。表示処理部は、この判定結果を受け、位相画像の全体又はその一部の画像の上に細胞又は細胞コロニーの位置に対応付けて細胞状態の判定結果に対応するマークを重畳させた判定結果画像を得る。即ち、未分化細胞、未分化逸脱細胞にそれぞれ対応するマークを決めておき、そのマークを位相画像上で各細胞又は各細胞コロニーが存在する位置に重ねて表示すればよい。また、表示処理部は、元のホログラム画像又は位相画像の上に上記判定結果画像の画像範囲を示す情報を重畳させる。そして、この全体画像と上記判定結果画像とを同一画面上に配置した表示画面を形成して表示部の画面上に表示させる。この全体画像はあくまでも参考用であるので、ホログラム画像等の撮影画像を縮小した画像とするとよい。
　これにより、作業者は自らが画像上で目視により各細胞又は各細胞コロニーの状態を判定することなく、表示部に表示されている判定結果画像を見ることで、例えば未分化細胞と未分化逸脱細胞とがそれぞれどの位置にあるのかを一目で知ることができる。また、同じ画面内に表示されている全体画像を見ることで、判定結果画像に現れている観察範囲が一つの容器内のいずれの位置及び範囲であるか、或いは複数の容器のうちのいずれの容器のいずれの位置及び範囲であるのかを容易に知ることができる。なお、未分化状態、未分化逸脱状態等の異なる細胞状態の判定結果に対応するマークは、それぞれそのマークの形状を異なるものとしてもよいが、形状は同一で表示色やグレイスケール上の濃淡を異なるものとすると分かり易い。
　また本発明に係る細胞観察装置において、好ましくは、前記表示処理部は、前記細胞状態判定部による判定結果に基づいて、各細胞又は各細胞コロニーに対応付けて細胞状態判定結果を示すリストを作成し、該リストを前記判定結果画像と同一画面上に表示する構成とするとよい。
　この構成によれば、判定結果画像として例えば位相画像の一部分しか表示していない場合であっても、その時点で表示されていない位相画像上の細胞や細胞コロニーに未分化逸脱状態のものが存在するかどうかなどをリストから知ることができる。また、判定結果画像上に表示することが難しい、細胞や細胞コロニー毎の他の情報についてもリストに掲載することで、作業者は個々の細胞や細胞コロニーについてより多くの情報をリストから知ることができる。
　また上記好ましい構成の一態様においては、前記リストに掲載される細胞又は細胞コロニーの細胞状態判定結果を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するための条件入力部を、さらに備え、
　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された細胞状態判定結果を有するものに絞り込んで該リストを作成するものとするとよい。
　この構成では、作業者が条件入力部から所定の入力指定を行うことで、例えば未分化逸脱細胞であると判定された細胞又は細胞コロニーのみが掲載されたリストを表示させることができる。
　また本発明の別の態様においては、それぞれ独立に細胞を培養することが可能な複数の容器について前記撮影画像を取得することが可能な装置であり、前記リストは、各細胞又は各細胞コロニーが属する容器を特定する容器識別情報を表示項目として含み、
　前記条件入力部は、前記リストに掲載される細胞又は細胞コロニーが属する容器を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり、
　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された容器に属するものに絞り込んで該リストを作成する構成とすることができる。
　これにより、例えば複数の培養容器を用い、その容器毎に互いに異なる培養条件で以て細胞を培養している場合に、特定の培養条件の下で培養している細胞又は細胞コロニーの細胞状態の判定結果のみをリストで確認することができる。
　また本発明のさらに別の態様では、前記リストは、掲載されている細胞毎又は細胞コロニー毎にユーザの入力操作によりチェックマークを入力することが可能なチェックボックスを含み、
　前記条件入力部は、前記チェックボックスへのチェックマークの有無を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり、
　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定されたチェックマーク状態のものに絞り込んで該リストを作成する構成とするよい。
　この構成では、作業者は例えば、リストに掲載されている細胞毎又は細胞コロニー毎に着目するものやあとで詳細に確認したいものなどにチェックマークを付す。それにより、チェックマークを付した細胞や細胞コロニーのみが掲載されているリストをあとで表示させ、作業者がそれを確認することができる。
　また本発明のさらに別の態様では、前記リストは、細胞毎又は細胞コロニー毎に細胞状態判定結果をユーザが確認した確認結果の情報を表示項目として含み、
　前記条件入力部は、前記確認結果の情報を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり、
　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された確認結果の情報のものに絞り込んで該リストを作成する構成としてもよい。
　ここで「確認結果の情報」とは、例えば作業者が、自動的になされた細胞状態の判定結果が正しい又は誤りであると確認した結果の情報、或いは、正しいか誤りであるかを未だ決定できないことを示す情報などである。これによれば、例えば、作業者は自分自身又は他の担当者が、自動的に行われた細胞状態の判定結果が誤りであると判断した細胞や細胞コロニーのみが掲載されているリストを表示させそれを確認したり、或いはそのリストに基づいて細胞の除去作業を実施したりすることができる。
　また本発明に係る細胞観察装置において、前記表示処理部は、前記リスト上の細胞又は細胞コロニーに対応する欄と前記判定結果画像上のマークのいずれか一方が入力部を介して指示されたときに、それに対応する前記リスト上の欄又は前記判定結果画像上のマークの他方をそれぞれ他の欄又はマークと識別が可能であるように強調して表示させる構成としてもよい。
　これによれば、作業者は判定結果画像上で着目する位置にある細胞や細胞コロニーの詳細な情報をリスト上で確認したり、逆に、リスト上で着目する細胞や細胞コロニーがどの位置にあるのかを画像上で確認したりすることが容易に行える。
　本発明によれば、例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を培養する現場において、作業者自身が細胞状態を判定することなく、容器中の細胞や細胞コロニーのいずれが未分化逸脱状態である可能性が高いのかを表示された画像上で一目で確認することができる。それにより、経験や技量に乏しい作業者であっても、細胞の状態や品質などを的確に把握することができる。特に、細胞を大量に培養するような現場においても、作業者は所望の細胞の判定結果のみを効率良く確認することができるので、作業効率の向上のみならず、作業ミスや見逃しを減らして作業の精度を向上させることができ、ひいては細胞培養における生産性の向上を図ることができる。
本発明の一実施例である細胞観察装置の概略構成図。 本実施例の細胞観察装置を利用した細胞状態の観察作業における作業手順及び処理の流れを示すフローチャート。 本実施例の細胞観察装置における撮影動作及び画像再構成処理を説明するための概念図。 本実施例の細胞観察装置における細胞判定結果表示画面の一例を示す図。 図４中の細胞リストを示す図。 細胞状態判定結果を確認する際に用いる条件指定画面を示す図。
　以下、本発明に係る細胞観察装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。
　図１は本実施例の細胞観察装置の概略構成図である。
　本実施例の細胞観察装置は、顕微観察部１０と、制御・処理部２０と、ユーザインターフェイスである入力部３０及び表示部４０と、を備える。
　本実施例において、顕微観察部１０はインライン型ホログラフィック顕微鏡であり、レーザダイオードなどを含む光源部１１とイメージセンサ１２とを備え、光源部１１とイメージセンサ１２との間に、細胞（又は細胞コロニー）１４を含む培養プレート１３が配置される。
　制御・処理部２０は、顕微観察部１０の動作を制御するとともに顕微観察部１０で取得されたデータを処理するものであって、撮影制御部２１と、ホログラムデータ記憶部２２と、位相情報算出部２３と、画像再構成部２４と、再構成画像データ記憶部２５と、細胞状態判定部２６と、判定結果データ記憶部２７と、表示条件設定部２８と、表示処理部２９と、を機能ブロックとして備える。表示処理部２９は下位の機能ブロックとして、詳細画像形成部２９１、全体画像形成部２９２、細胞リスト作成部２９３などを含む。
　通常、制御・処理部２０の実体は、所定のソフトウェア（コンピュータプログラム）がインストールされたパーソナルコンピュータやより性能の高いワークステーション、或いは、そうしたコンピュータと通信回線を介して接続された高性能なコンピュータを含むコンピュータシステムである。即ち、制御・処理部２０に含まれる各ブロックの機能は、コンピュータ単体又は複数のコンピュータを含むコンピュータシステムに搭載されているソフトウェアを実行することで実施される、該コンピュータ又はコンピュータシステムに記憶されている各種データを用いた処理によって具現化されるものとすることができる。
　本実施例の細胞観察装置では様々な細胞についての観察を行うことができるが、ここでは、観察対象がヒトｉＰＳ細胞であるものとする。ヒトｉＰＳ細胞を培養する際に必要な細胞観察を目的として細胞の観察画像を取得し、該観察画像から各細胞の状態（未分化状態、未分化逸脱状態等）を判定してその判定結果を表示する際の処理について説明する。
　図２は本実施例の細胞観察装置を用いた細胞状態の観察作業における作業手順及び処理の流れを示すフローチャート、図３は撮影動作及び画像再構成処理を説明するための概念図である。
　図３（ａ）は本実施例の細胞観察装置において使用される培養プレート１３の略上面図である。この培養プレート１３には上面視円形状である６個のウェル１３ａが形成されており、その各ウェル１３ａ内で細胞が培養される。ここでは、１枚の培養プレート１３全体、つまりは６個のウェル１３ａを含む矩形状の範囲全体が観察対象領域である。顕微観察部１０は光源部１１及びイメージセンサ１２の組を４組備えており、各組の光源部１１及びイメージセンサ１２はそれぞれ、図３（ａ）に示すように培養プレート１３全体を４等分した四つの４分割範囲８１のホログラムデータの収集を担う。つまり、４組の光源部１１及びイメージセンサ１２が培養プレート１３全体に亘るホログラムデータの収集を分担する。
　一組の光源部１１及びイメージセンサ１２が１回に撮影可能である範囲は、図３（ｂ）及び（ｃ）に示すように、４分割範囲８１の中の１個のウェル１３ａを含む略正方形状の範囲８２をＸ軸方向に１０等分、Ｙ軸方向に１２等分して得られる一つの撮像単位８３に相当する範囲である。一つの４分割範囲８１は１５×１２＝１８０個の撮像単位８３を含む。四つの光源部１１と四つのイメージセンサ１２はそれぞれ光源部１１及びイメージセンサ１２を含むＸ－Ｙ面内で、４分割範囲８１と同じ大きさである矩形の四つの頂点付近にそれぞれ配置されおり、培養プレート１３上の異なる四つの撮像単位８３についてのホログラムの取得を同時に行う。
　培養プレート１３についてのホログラムデータの収集に際し、作業者はまず、観察対象である細胞１４が培養されている培養プレート１３を顕微観察部１０の所定位置にセットし、該培養プレート１３を特定する識別番号や測定日時などの情報を入力部３０から入力したうえで測定実行を指示する。この測定指示を受けて撮影制御部２１は、顕微観察部１０の各部を制御して撮影を実行する（ステップＳ１）。
　即ち、一つの光源部１１は、１０°程度の微小角度の広がりを持つコヒーレント光を培養プレート１３の所定の領域（一つの撮像単位８３）に照射する。培養プレート１３及び細胞１４を透過したコヒーレント光（物体光１６）は、培養プレート１３上で細胞１４に近接する領域を透過した光（参照光１５）と干渉しつつイメージセンサ１２に到達する。物体光１６は細胞１４を透過する際に位相が変化した光であり、他方、参照光１５は細胞１４を透過しないので該細胞１４に起因する位相変化を受けない光である。したがって、イメージセンサ１２の検出面（像面）上には、細胞１４により位相が変化した物体光１６と位相が変化していない参照光１５との干渉像、つまりホログラムがそれぞれ形成され、このホログラムに対応する２次元的な光強度分布データ（ホログラムデータ）がイメージセンサ１２から出力される。
　上述したように、四つの光源部１１からは略同時に培養プレート１３に向けてコヒーレント光が出射され、四つのイメージセンサ１２では培養プレート１３上の異なる撮像単位８３に対応する領域のホログラムデータが取得される。一つの測定位置での測定が終了する毎に、光源部１１及びイメージセンサ１２は図示しない移動部により、Ｘ－Ｙ面内で一つの撮像単位８３に相当する距離だけＸ軸方向及びＹ軸方向にステップ状に順次移動される。これによって、４分割範囲８１に含まれる１８０個の撮像単位８３での測定が実施され、四組の光源部１１及びイメージセンサ１２全体で培養プレート１３全体の測定が実行されることになる。このようにして顕微観察部１０の四つのイメージセンサ１２で得られたホログラムデータは、測定日時等の属性情報とともに、ホログラムデータ記憶部２２に格納される。
　上述したような一連の測定（撮影）が終了すると、位相情報算出部２３はホログラムデータ記憶部２２からホログラムデータを順次読み出し、光波の伝播計算処理を行うことで２次元的な各位置における位相情報及び振幅情報を復元する。これら情報の空間分布は撮像単位８３毎に求まるから、全ての撮像単位８３の位相情報及び振幅情報が得られたならば、画像再構成部２４は、その位相情報や振幅情報に基づいて、観察対象領域全体の位相画像つまりはＩＨＭ位相像を形成する（ステップＳ２）。
　即ち、画像再構成部２４は撮像単位８３毎に算出された位相情報の空間分布に基づき各撮像単位８３のＩＨＭ位相像を再構成する。そして、その狭い範囲のＩＨＭ位相像を繋ぎ合わせるタイリング処理（図３（ｄ）参照）を行うことで、観察対象領域つまりは培養プレート１３全体についてのＩＨＭ位相像を形成する。そのＩＨＭ位相像を構成するデータは再構成画像データ記憶部２５に保存される。なお、タイリング処理の際には撮像単位８３の境界でのＩＨＭ位相像が滑らか繋がるように適宜の補正処理を行うとよい。
　上記のような位相情報の算出や画像再構成の際には、特許文献３、４等に開示されている周知のアルゴリズムを用いればよい。一般にＩＨＭ位相像では、透明であって光学顕微鏡では見えにくい細胞の輪郭（境界）やその内部の模様が見え易くなる。
　なお、通常の処理で得られる再構成画像は取得されたホログラムデータにより原理的に求まる最高解像度のＩＨＭ位相像であるが、それだけでなく、その最高解像度のＩＨＭ位相像を元に、ビニング処理等により解像度を落とした複数の解像度のＩＨＭ位相像を作成する。そして、こうした様々な解像度のＩＨＭ位相像を構成するデータを再構成画像データ記憶部２５に保存する。これにより、様々な解像度のＩＨＭ位相像をあとで選択的に表示する際に、表示処理部２９は必要な解像度の再構成画像データを再構成画像データ記憶部２５から読み出してきて、表示すべき画像を迅速に形成することができる。
　また、ホログラムデータに基づいて、位相情報のほかに、強度情報や、位相情報と強度情報とをマージした擬似位相情報なども併せて算出し、画像再構成部２４はこれらに基づく再生像（ＩＨＭ強度像、ＩＨＭ擬似位相像）を作成することもできる。これら画像はＩＨＭ位相像に代えて使用されることもある。また、ホログラムデータに基づいてＩＨＭ位相像等を作成する際には、複数の焦点位置におけるＩＨＭ位相像等をそれぞれ作成することができる。
　細胞状態判定部２６は上述のように作成されたＩＨＭ位相像（又はＩＨＭ強度像など）において、細胞又は細胞コロニーと背景との境界を識別することで細胞又は細胞コロニーを検出する。さらに細胞又は細胞コロニーそれぞれについて未分化状態と未分化逸脱状態という二つの細胞状態のいずれに分類されるのかを判定することで、細胞又は細胞コロニーの良否の判定を行う（ステップＳ３）。
　具体的には、細胞状態判定部２６は、予め多数の教師データを用いた学習によって構築された識別器を有し、この識別器を用いて、入力された画像に対し画素単位で未分化細胞領域、未分化逸脱細胞領域、又はそれ以外であるかを識別する。未分化細胞領域、未分化逸脱細胞領域のいずれであるとも識別されなかった領域は培地などの背景領域であるとみなせる。したがって、未分化細胞領域又は未分化逸脱細胞領域であると識別された画素から一つの細胞又は細胞コロニーの境界（輪郭）が判明し、その細胞毎又は細胞コロニー毎に未分化状態（良品）又は未分化逸脱状態（不良品）のいずれかへの分類を行うことができる。
　細胞状態判定部２６における細胞状態の判定結果は、細胞毎又は細胞コロニー毎に一つずつ得られ、その判定結果とは未分化状態又は未分化逸脱状態のいずれかである。なお、細胞状態判定部２６で使用される識別器における識別処理のアルゴリズムとしては様々なものが考えられ、ここではそのアルゴリズムは特に問わないが、例えばサポートベクターマシン等の教師あり機械学習の手法が特に有効である。
　上述したように細胞状態判定部２６ではＩＨＭ位相像（又はＩＨＭ強度像など）上で観察される細胞毎又は細胞コロニー毎に細胞状態の判定結果（分類結果）が得られる。また、個々の細胞や細胞コロニーは図３（ａ）に示した観察対象領域全体に対応するＩＨＭ位相像上の２次元的な位置情報（画素のアドレス）により特定することができる。そこで細胞状態判定部２６は、検出された細胞毎又は細胞コロニー毎に例えば連続番号である識別番号（ＩＤ）を割り当て、各識別番号に対応付けて細胞の位置情報と細胞状態判定結果とを判定結果データ記憶部２７に保存する（ステップＳ４）。
　表示処理部２９は、判定結果データ記憶部２７、再構成画像データ記憶部２５及びホログラムデータ記憶部２２に格納されているデータに基づいて、細胞状態判定結果を示す細胞判定結果表示画面５０を作成して表示部４０の画面上に表示する（ステップＳ５）。
　以下、この表示処理について詳しく説明する。図４は細胞判定結果表示画面の一例を示す図、図５は図４中の細胞リストの一例を示す図、図６は所定の操作に応じて表示される条件指定画面の一例を示す図である。
　作業者が入力部３０で所定の操作を行うと、表示処理部２９は図４に示したような細胞判定結果表示画面５０を表示部４０の画面上に表示する。この細胞判定結果表示画面５０には、該画面５０内で大きな面積を占める詳細画像表示領域５１と、過去画像表示領域５４と、リスト表示領域５７と、全体画像表示領域５５と、が設けられている。詳細画像表示領域５１の上部には表示画像選択指示部５３が設けられ、この表示画像選択指示部５３に配置されている複数のチェックボックスに択一的にチェックマークを入れることで、そのチェックマークに対応した画像が詳細画像表示領域５１に表示されるようになっている。
　細胞状態の判定結果を確認したい場合には、図４に示すように、「細胞範囲」のチェックボックスにチェックマークが付される。この場合、詳細画像形成部２９１は判定結果データ記憶部２７や再構成画像データ記憶部２５から所定のデータを取得し、細胞状態の判定処理に使用された画像、この例ではＩＨＭ位相像において各細胞が検出された座標位置にその細胞の状態判定結果に対応するマークを重畳し、該マークが重畳された細胞判定結果画像５２を詳細画像表示領域５１中に表示する。重畳して表示されるマークは同形状であり、細胞状態判定結果が未分化状態であることを示すマークと未分化逸脱状態であることを示すマークとは異なる表示色である。図４では、未分化状態を示すマークに符号５２ａ、未分化逸脱状態を示すマークに符号５２ｂを付してある。符号５２ｃが付されているマークについては後述する。即ち、この細胞判定結果画像５２上でマーク５２ａ、５２ｂ、５２ｃが描かれている位置がそれぞれマークで示される細胞状態であると判定された細胞が検出された位置である。
　全体画像形成部２９２は、ホログラムデータ記憶部２２からデータを取得し、観察対象領域全体の干渉像を縮小した画像を形成する。この縮小画像では培養プレート１３上の各ウェル１３ａの位置が明瞭に観察可能である。さらに、この縮小画像に、その時点で詳細画像表示領域５１中に表示している細胞判定結果画像５２の範囲を示す矩形状の枠マーク５６ａを重畳した縮小画像５６を全体画像表示領域５５中に表示する。
　詳細画像形成部２９１及び全体画像形成部２９２は、全体画像表示領域５５中に表示される縮小画像５６上の枠マーク５６ａの位置や大きさと、詳細画像表示領域５１中に表示している細胞判定結果画像５２の範囲とを連動させる。したがって、例えば作業者が入力部３０の操作により、全体画像表示領域５５中に表示されている縮小画像５６上で枠マーク５６ａの位置や大きさを変化させると、詳細画像形成部２９１はその枠マーク５６ａの位置及び大きさに対応するように細胞判定結果画像５２を更新する。また逆に、作業者が入力部３０の操作により、詳細画像表示領域５１中に表示されている細胞判定結果画像５２を拡大若しくは縮小、又は移動させる操作を行うと、詳細画像形成部２９１はその操作に応じて細胞判定結果画像５２を更新し、全体画像形成部２９２はその操作に応じて枠マーク５６ａの位置及び大きさを変化させる。そのため、作業者はそのときに詳細画像表示領域５１中に表示されている細胞判定結果画像５２が観察対象領域全体の中のどの位置のどの範囲であるのかを一目で確認することができる。また、細胞判定結果画像５２の拡大又は縮小されたとき、つまり細胞判定結果画像５２の倍率が変化されたときに、その倍率に応じて、該画像５２に重畳して表示されているマーク５２ａ、５２ｂ、５２ｃの態様を変化させてもよい。
　また細胞リスト作成部２９３は、判定結果データ記憶部２７から取得したデータに基づいて、図５に示すような細胞リスト５８を作成し、これをリスト表示領域５７中に表示する。この細胞リスト５８には、観察対象領域中の全ての細胞について個別に割り当てられた識別番号（ＩＤ）に対応付けて、その細胞が培養されているウェルの識別番号を示す項目の欄５８ｂ、細胞状態の判定結果を示す項目の欄５８ｃ、判定結果に対する正誤の評価結果を示す項目の欄５８ｄなどが設けられ、細胞毎にそれら各項目についての情報が掲載されている。また、細胞毎にチェックマークを設定可能なチェックボックス欄５８ａが用意されている。なお、図５の例では、細胞状態の判定結果は「分類」という項目名であり、「未分化」は未分化状態を、「分化」は未分化逸脱状態を示している。また、細胞状態の判定結果を示す項目の欄５８ｃには、細胞判定結果画像５２上のマーク５２ａ、５２ｂの表示色とそれぞれ同じ色の矩形状のマークが記載されている。
　上記ステップＳ３においてＩＨＭ位相像を用いて細胞状態の判定処理が実施されたあと、初めて細胞判定結果表示画面５０が表示される際には、細胞リスト５８におけるチェックボックス欄５８ａは全てチェックマークなしであり、判定結果に対する正誤の評価結果を示す項目の欄５８ｄは全て空欄である。作業者が細胞リスト５８を見て、そのリスト５８中の一つの行をクリック操作等により選択したうえで、正誤判定指示ボタン領域６０中の「ＯＫ」ボタンをクリック操作すると、選択されている行の「正誤」の欄５８ｄに「ＯＫ」が入力される。また、作業者が「ＮＧ」ボタンをクリック操作すると、選択されている行の欄５８ｄに「ＮＧ」が入力される。さらに、作業者が「未決」ボタンをクリック操作すると、選択されている行の欄５８ｄに「未決」が入力される。通常、判定結果に対する正誤の評価結果を示す項目の欄５８ｄにおける「ＯＫ」はその細胞の細胞状態判定結果が適切であることを意味し、「ＮＧ」はその細胞の細胞状態判定結果が不適切、つまり誤りであることを意味する。また「未決」は評価を試みたものの、ＯＫ又はＮＧのいずれであるのかの判断が下せなかったことを意味する。
　また、作業者は例えば、注意を要する細胞や着目に値すると思われる細胞に対応するチェックボックス欄５８ａにチェックマークを適宜入力することができる。こうして作業者が判定結果に対する正誤の評価結果を示す項目の欄５８ｄへの入力操作やチェックボックス欄５８ａへのチェックマークの入力を行ったうえで、「保存」ボタン６１をクリック操作すると、入力された情報が確定して判定結果データ記憶部２７に保存される。
　なお、細胞リスト５８上で作業者が一つの行、つまりは一つの細胞又は細胞コロニーをクリック操作により選択指示すると、その行の背景色が他の行とは異なる色に変わり強調表示される。そして同時に、細胞判定結果画像５２上に重畳して表示されているマーク５２ａ、５２ｂの中で、上記リスト５８中で強調表示された行に対応するマーク、つまりはその行中の細胞に対応するマークが他のマークとは異なる色に変わり強調表示される。図４では、符号５２ｃが強調表示されているマークである。図４、図５の例では、このマークは識別番号が「２１」である細胞に対応するマークである。
　これにより、作業者は細胞リスト５８上で選択した細胞が、細胞判定結果画像５２上でどこに位置しているのかを一目で把握することができる。また逆に、細胞判定結果画像５２上で一つのマークを作業者がクリック操作等により選択指示すると、そのマークに対応する細胞が記載されているリスト５８中の行が強調表示される。それにより、作業者は細胞判定結果画像５２上で特定の位置にある細胞についての詳細な情報を細胞リスト５８で迅速に確認することができる。
　細胞状態の判定処理が実施されたあとに初めて細胞判定結果表示画面５０が表示されるときの細胞リスト５８には、検出された全ての細胞又は細胞コロニーが掲載されている。しかしながら、通常、その数はかなり膨大であり、実際には、作業者はその中で特定のもののみを確認したい場合が多い。そこで、次のようにして細胞リスト５８に掲載する細胞を絞り込むことが可能である。
　作業者がリスト表示領域５７中の右上部に配置されている条件設定ボタン５９をクリック操作すると、表示条件設定部２８は、図６に示す条件指定画面７０をポップアップして細胞判定結果表示画面５０の上に表示させる。この条件指定画面７０は細胞リスト５８に表示される細胞を絞り込む条件を指定するための画面であり、チェックマーク有無指定領域７０ａ、ウェル指定領域７０ｂ、細胞状態判定結果指定領域７０ｃ、及び、正誤入力結果指定領域７０ｄ、が設けられている。指定領域７０ａ～７０ｄにはそれぞれ複数のチェックボックスが配置されており、該チェックボックスに適宜にチェックマークを入れることで、そのチェックマークが付された条件に適合する細胞のみが細胞リスト５８に表示される。
　図６の例では、チェックマーク有無指定領域７０ａにおいてチェック有りとチェック無しの両方にチェックマークが付されているので、細胞リスト５８のチェックボックス欄５８ａにおけるチェックマークの有無での絞り込みはなされない。また、ウェル指定領域７０ｂにおいては識別番号が「０２」及び「０５」である二つのウェルにのみチェックマークが付されているので、この二つのウェルに属する細胞のみへの絞り込みが行われる。そのため、例えば識別番号が「２」及び「５」であるウェル中の細胞の情報は細胞リスト５８に掲載されるが、識別番号が「１」、「３」、「４」及び「６」であるウェル中の細胞の情報は細胞リスト５８には掲載されない。また、細胞状態判定結果指定領域７０ｃにおいては「未分化」と「分化」の両方にチェックマークが付されているので、細胞状態判定結果での絞り込みはなされない。さらにまた、正誤入力結果指定領域７０ｄにおいては「ＯＫ」、「ＮＧ」、「未決」の全てにチェックマークが付されているので、正誤入力結果での絞り込みもなされない。
　即ち、図６の例では、各細胞が存在しているウェルについての絞り込みのみが実施され、それ以外の条件での絞り込みはなされない。もちろん、各指定領域７０ａ～７０ｄに設けられているチェックボックスに適宜にチェックマークを入れることで、様々な条件の組み合わせに適合した細胞のみに絞り込んで細胞リスト５８を表示させることができる。それにより、作業者は真に確認したい細胞のみに絞り込んで、各細胞の詳細な情報を効率良く確認することができる。
　また、細胞培養では一般に、毎日定期的に、或いはより短い時間間隔で、同じ培養プレートについての観察が繰り返される。そして、細胞の状態の時間的な変化を確認することも重要である。そこで、同じ識別番号を有する培養プレートについて過去に取得された縮小画像をその測定日時等と共に過去画像表示領域５４に一括して表示しておく。そして、作業者が過去画像表示領域５４において任意の縮小画像を選択指示したうえで「変更」ボタン６２をクリック操作すると、選択された縮小画像に対応するホログラムデータに基づいて作成されたＩＨＭ位相像や判定結果などに表示が切り替わる。これにより、同じ培養プレートに関する過去のデータに基づく画像やリストを確認することもできる。
　なお、図１に示した細胞観察装置では、制御・処理部２０において全ての処理を実施しているが、一般に、ホログラムデータに基づく位相情報の計算や画像の再構成処理には膨大な量の計算が必要である。また、細胞状態の判定処理の負荷も大きい。そこで、顕微観察部１０に接続されたパーソナルコンピュータを端末装置とし、この端末装置と高性能なコンピュータであるサーバとがインターネットやイントラネット等の通信ネットワークを介して接続されたコンピュータシステムを利用し、上記のような煩雑な計算や処理は高性能なコンピュータで行い、顕微観察部１０の制御や処理後のデータを用いた表示処理などを比較的低性能のパーソナルコンピュータで実行するように役割を分けるとよい。
　また上記実施例の細胞観察装置では、顕微観察部１０としてインライン型ホログラフィック顕微鏡を用いていたが、ホログラムが得られる顕微鏡であれば、オフアクシス（軸外し）型、位相シフト型などの他の方式のホログラフィック顕微鏡に置換え可能であることは当然である。
　また顕微観察部１０にホログラフィック顕微鏡を用いるのではなく位相差顕微鏡を用いた細胞観察装置にも本発明を適用することができる。この場合には、細胞状態の判定処理の対象である判定用画像として位相差顕微画像を用いればよい。
　また、上記実施例はあくまでも本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲でさらに適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
１０…顕微観察部
１１…光源部
１２…イメージセンサ
１３…培養プレート
１３ａ…ウェル
１４…細胞
１５…参照光
１６…物体光
２０…制御・処理部
２１…撮影制御部
２２…ホログラムデータ記憶部
２３…位相情報算出部
２４…画像再構成部
２５…再構成画像データ記憶部
２６…細胞状態判定部
２７…判定結果データ記憶部
２８…表示条件設定部
２９…表示処理部
２９１…詳細画像形成部
２９２…全体画像形成部
２９３…細胞リスト作成部
３０…入力部
４０…表示部
５０…細胞判定結果表示画面
５１…詳細画像表示領域
５２…細胞判定結果画像
５２ａ、５２ｂ、５２ｃ…マーク
５３…表示画像選択指示部
５４…過去画像表示領域
５５…全体画像表示領域
５６…縮小画像
５６ａ…枠マーク
５７…リスト表示領域
５８…細胞リスト
５８ａ…チェックボックス欄
５８ｂ…ウェルの識別番号を示す項目の欄
５８ｃ…細胞状態の判定結果を示す項目の欄
５８ｄ…判定結果に対する正誤の評価結果を示す項目の欄
５９…条件設定ボタン
６０…正誤判定指示ボタン領域
６１…「保存」ボタン
６２…「変更」ボタン
７０…条件指定画面
７０ａ…チェックマーク有無指定領域
７０ｂ…ウェル指定領域
７０ｃ…細胞状態判定結果指定領域
７０ｄ…正誤入力結果指定領域

Claims (11)

  1. 　１又は複数の容器中の細胞を観察するための細胞観察装置であって、
    　a)１又は複数の容器の全体又はその一部の観察範囲について得られた撮影画像若しくは該撮影画像を構成するデータに基づく所定の処理によって得られた観察画像のいずれかである判定用画像の全体又はその一部について、その画像上で検出された細胞毎又は細胞コロニー毎に２以上の細胞状態のいずれであるかを判定する細胞状態判定部と、
    　b)前記判定用画像の全体又はその一部である画像上に、細胞又は細胞コロニーが検出された位置に対応付けてその細胞又は細胞コロニーについての前記細胞状態判定部による細胞状態の判定結果に対応するマークを重畳させた判定結果画像と、前記撮影画像又は前記観察画像の上に前記判定結果画像の画像範囲を示す情報を重畳させた全体画像とを、同一画面上に配置して表示部の画面上に表示させる表示処理部と、
    　を備えることを特徴とする細胞観察装置。
  2. 　請求項１に記載の細胞観察装置であって、
    　前記全体画像は前記撮影画像を縮小した画像であることを特徴とする細胞観察装置。
  3. 　請求項１に記載の細胞観察装置であって、
    　観察対象の細胞はヒトｉＰＳ細胞を含む多能性幹細胞であり、前記２以上の細胞状態は未分化状態と未分化逸脱状態とを少なくとも含むことを特徴とする細胞観察装置。
  4. 　請求項１に記載の細胞観察装置であって、
    　前記撮影画像はホログラフィック顕微鏡により得られたホログラム画像であり、前記観察画像は、ホログラムデータに基づく所定の演算処理により算出された位相情報、強度情報又はそれら両方の要素を含む情報のいずれかの空間分布を示す画像であることを特徴とする細胞観察装置。
  5. 　請求項１に記載の細胞観察装置であって、
    　前記表示処理部は、前記細胞状態判定部による判定結果に基づいて、各細胞又は各細胞コロニーに対応付けて細胞状態判定結果を示すリストを作成し、該リストを前記判定結果画像と同一画面上に表示することを特徴とする細胞観察装置。
  6. 　請求項５に記載の細胞観察装置であって、
    　前記リストに掲載される細胞又は細胞コロニーの細胞状態判定結果を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するための条件入力部を、さらに備え、
    　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された細胞状態判定結果を有するものに絞り込んで該リストを作成することを特徴とする細胞観察装置。
  7. 　請求項６に記載の細胞観察装置であって、
    　それぞれ独立に細胞を培養することが可能な複数の容器について前記撮影画像を取得することが可能な装置であり、前記リストは、各細胞又は各細胞コロニーが属する容器を特定する容器識別情報を項目として含み、
    　前記条件入力部は、前記リストに掲載される細胞又は細胞コロニーが属する容器を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり、
    　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された容器に属するものに絞り込んで該リストを作成することを特徴とする細胞観察装置。
  8. 　請求項６に記載の細胞観察装置であって、
    　前記リストは、掲載されている細胞毎又は細胞コロニー毎にユーザの入力操作によりチェックマークを入力することが可能なチェックボックスを含み、
    　前記条件入力部は、前記チェックマークの有無を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり
    　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定されたチェックマーク状態のものに絞り込んで該リストを作成することを特徴とする細胞観察装置。
  9. 　請求項６に記載の細胞観察装置であって、
    　入力部から判定の正誤の情報の入力が可能であり、
    　前記リストは、細胞又は細胞コロニー毎に細胞状態判定結果をユーザが確認した確認結果の情報を項目として含み、
    　前記条件入力部は、前記確認結果の情報を絞り込み条件の一つとしてユーザが指定するものであり
    　前記表示処理部は、前記リストに掲載する細胞又は細胞コロニーを、前記条件入力部で指定された確認結果情報のものに絞り込んで該リストを作成することを特徴とする細胞観察装置。
  10. 　請求項５に記載の細胞観察装置であって、
    　前記表示処理部は、前記リスト上の細胞又は細胞コロニーに対応する欄と前記判定結果画像上のマークのいずれか一方が入力部を介して指示されたときに、それに対応する前記リスト上の欄又は前記判定結果画像上のマークの他方を他の欄又は他のマークと識別が可能であるように強調して表示させることを特徴とする細胞観察装置。
  11. 　１又は複数の容器中の細胞を観察するために用いられるコンピュータプログラムであって、コンピュータに、
    　a)１又は複数の容器の全体又はその一部の観察範囲について得られた撮影画像若しくは該撮影画像を構成するデータに基づく所定の処理によって得られた観察画像のいずれかである判定用画像の全体又はその一部について、その画像上で検出された細胞毎又は細胞コロニー毎に２以上の細胞状態のいずれであるかを判定した判定結果データを取得する判定結果データ取得ステップと、
    　b)前記判定用画像の全体又はその一部である画像上に、細胞又は細胞コロニーが検出された位置に対応付けてその細胞又は細胞コロニーについて前記判定結果データ取得ステップで取得された細胞状態の判定結果データに対応するマークを重畳させた判定結果画像と、前記撮影画像又は前記観察画像の上に前記判定結果画像の画像範囲を示す情報を重畳させた全体画像とを、同一画面上に配置して表示部の画面上に表示させる表示処理ステップと、
    　を実行させることを特徴とする細胞観察用プログラム。
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