JP6723614B1

JP6723614B1 - Autophagy regulator

Info

Publication number: JP6723614B1
Application number: JP2019032463A
Authority: JP
Inventors: 太一原
Original assignee: TENSHINDO CO., LTD.
Current assignee: TENSHINDO CO., LTD.
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2020-07-15
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: JP2020132611A

Abstract

【課題】新たなオートファジー調節剤の提供。【解決手段】発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とするオートファジー調節剤。【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new autophagy regulator. An autophagy regulator containing fermented garlic or an extract thereof as an active ingredient. [Selection diagram] None

Description

本発明は、植物由来のオートファジー調節剤に関する。 The present invention relates to a plant-derived autophagy regulator.

細胞内のタンパク質や細胞内小器官（オルガネラ）は、不要となったら、あるいは必要に応じ、オートファジーによって分解され、その成分は細胞内で再利用される。オートファジーの活動は、通常状態の細胞では低レベルであるが、細胞が飢餓や低酸素等のストレス環境にさらされると、活発化する。オートファジーは、細胞質成分やオルガネラを包み込んだオートファゴソームと呼ばれる小胞が、リソソームと融合してオートリソソームを形成し、包み込んだ内容物を分解するプロセスで進行する。このようなオートファジーは癌、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等の種々の疾患だけでなく、老化や運動機能にも関与していることが知られている。
かかる観点から、オートファジーを誘導又は抑制する成分の探索が行なわれ、梅肉エキス（特許文献１）、アマチャ、イチョウ、コガネバナ、テンニンカ、サクラ、ラン等の植物抽出物（特許文献２）、霊芝抽出物（特許文献３）、センダン抽出物（特許文献４）等にオートファジー誘導作用があることが報告されている。 Intracellular proteins and organelles are decomposed by autophagy when they are no longer needed or when necessary, and their components are reused in cells. Autophagy activity is low levels in cells in normal conditions but is activated when cells are exposed to stress environments such as starvation and hypoxia. Autophagy is a process in which vesicles called autophagosomes encapsulating cytoplasmic components and organelles fuse with lysosomes to form autolysosomes and decompose the encapsulated contents. It is known that such autophagy is involved not only in various diseases such as cancer, neurodegenerative disease, cardiovascular disease, lung disease, and infectious disease, but also in aging and motor function.
From such a viewpoint, a search for a component that induces or suppresses autophagy is performed, and plant extracts such as plum extract (Patent Document 1), armature, ginkgo, Scutellaria, tenninka, cherry, orchid (Patent Document 2), spirits, etc. It has been reported that turf extract (Patent Document 3), Sendan extract (Patent Document 4) and the like have an autophagy-inducing action.

特開２００７−１４３４５２号公報JP, 2007-143452, A 特開２０１３−９９３０５号公報JP, 2013-99305, A 特表２０１６−５０１８６１号公報Japanese Patent Publication No. 2016-501861 特開２０１８−１８８４８０号公報JP, 2018-188480, A

しかしながら、前記のオートファジー調節剤の作用は十分でなく、医薬、食品、化粧料等に応用可能な新たなオートファジー調節剤の開発が望まれている。従って、本発明の課題は、新たなオートファジー調節剤を提供することにある。 However, the action of the above-mentioned autophagy regulator is not sufficient, and development of a new autophagy regulator applicable to medicines, foods, cosmetics and the like is desired. Therefore, an object of the present invention is to provide a new autophagy regulator.

そこで本発明者は、種々の植物由来成分のオートファジーに対する作用を検討してきたところ、ニンニク抽出物ではなく、発酵ニンニク又はその抽出物に優れたオートファジー調節作用があり、医薬、食品又は化粧料等として有用であることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventor has studied the action of various plant-derived components on autophagy, and not a garlic extract, but a fermented garlic or an extract thereof having an excellent autophagy-regulating action, and a drug, a food, or a cosmetic. As a result, they have found that they are useful as such and completed the present invention.

すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔５〕を提供するものである。 That is, the present invention provides the following inventions [1] to [5].

〔１〕発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とするオートファジー調節剤。
〔２〕発酵ニンニクが、乳酸菌発酵ニンニク又は酵母発酵ニンニクである〔１〕記載のオートファジー調節剤。
〔３〕発酵ニンニクが、酵母発酵ニンニクである〔１〕又は〔２〕記載のオートファジー誘導剤。
〔４〕発酵ニンニクが、乳酸菌発酵ニンニクである〔１〕又は〔２〕記載のオートファジー抑制剤。
〔５〕発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とする、オートファジー調節医薬組成物、オートファジー調節化粧料組成物又はオートファジー調節食品組成物。 [1] An autophagy regulator containing fermented garlic or an extract thereof as an active ingredient.
[2] The autophagy regulator according to [1], wherein the fermented garlic is lactic acid bacterium fermented garlic or yeast fermented garlic.
[3] The autophagy inducer according to [1] or [2], wherein the fermented garlic is yeast fermented garlic.
[4] The autophagy inhibitor according to [1] or [2], wherein the fermented garlic is lactic acid bacterium fermented garlic.
[5] An autophagy-regulating pharmaceutical composition, an autophagy-regulating cosmetic composition, or an autophagy-regulating food composition containing fermented garlic or an extract thereof as an active ingredient.

本発明のオートファジー調節剤は、優れたオートファジー誘導又は抑制作用を有し、摂取性も良好であり、オートファジーが低下又は異常に活性化することによる種々の疾患の予防、治療や皮膚の各種の症状の改善を目的とする医薬、食品、化粧料として有用である。 The autophagy regulator of the present invention has an excellent autophagy-inducing or inhibitory action, has good ingestibility, and prevents or treats various diseases caused by autophagy being reduced or abnormally activated. It is useful as a medicine, food, and cosmetic for the purpose of improving various symptoms.

オートファジーの模式図とプロセスを示す。The schematic diagram and process of autophagy are shown. 乳酸菌発酵ニンニク末のオートファジー抑制作用を示す。The lactic acid bacterium fermented garlic powder has an autophagy inhibitory effect. 酵母発酵ニンニク末のオートファジー誘導作用を示す。It shows the autophagy-inducing action of yeast-fermented garlic powder.

本発明のオートファジー調節剤の有効成分は、発酵ニンニク又はその抽出物である。 The active ingredient of the autophagy regulator of the present invention is fermented garlic or its extract.

原料として用いるニンニクは、アリウム・サチバム（Allium sativum）の全草・地上部又は鱗茎を用いるのが好ましく、鱗茎を用いるのがより好ましい。本発明においては、ニンニク又はその抽出物を直接用いるのではなく、発酵ニンニク又はその抽出物を用いるのが、優れたオートファジー調節効果を得る観点及び摂取性の観点から重要である。 As the garlic used as a raw material, it is preferable to use the whole plant/aboveground part or bulb of Allium sativum, and it is more preferable to use bulb. In the present invention, it is important to use fermented garlic or an extract thereof instead of directly using garlic or an extract thereof, from the viewpoint of obtaining an excellent autophagy-regulating effect and the ingestibility.

発酵ニンニクとしては、乳酸菌発酵ニンニク及び酵母発酵ニンニクが挙げられるが、酵母発酵ニンニクを用いるのが、優れたオートファジー誘導効果を得る点から好ましい。一方、乳酸菌発酵ニンニクは、オートファジー抑制効果を得る点で好ましい。
ニンニクの発酵に用いられる乳酸菌としては、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、リューコノストック属(Leuconostoc)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)に属する乳酸菌が挙げられるが、ラクトバシラス属(Lactobacillus)に属する乳酸菌がより好ましい。また、ニンニクの発酵に用いられる酵母としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（シゾサッカロミケス属）、コウジカビとしてAspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus awamori、Aspergillus glaucus、Penicillium roqueforti、枯草菌としてBacillus属等が挙げられるが、Saccharomyces cerevisiaeがより好ましい。 Examples of the fermented garlic include lactic acid bacterium fermented garlic and yeast fermented garlic. It is preferable to use yeast fermented garlic from the viewpoint of obtaining an excellent autophagy inducing effect. On the other hand, lactic acid bacterium fermented garlic is preferable from the viewpoint of obtaining an autophagy suppressing effect.
Lactobacillus used for fermentation of garlic, Lactobacillus (Lactobacillus), Enterococcus (Enterococcus), Lactococcus (Lactococcus), Pediococcus (Pediococcus), Leuconostoc (Leuconostoc), Streptococcus (Streptococcus). , Lactic acid bacteria belonging to the genus Bifidobacterium, but more preferably lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus. As yeasts used for fermentation of garlic, budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces genus), Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus awamori, Aspergillus glaucus, Penicillium roqueforti, and withered. Examples include the genus Bacillus, but Saccharomyces cerevisiae is more preferable.

発酵ニンニクは、例えばニンニクを８０℃以上に加熱処理した後、乳酸菌又は酵母を用いて発酵することにより得ることができる。まず、加熱処理としては、８０℃以上であれば雑菌の増殖を抑制できるが、８５℃以上が好ましく、８０℃〜１２０℃がより好ましい。また加熱処理時間は、５分〜１時間が好ましく、５分〜３０分で十分である。発酵は、乳酸菌又は酵母を添加し、３０〜４０℃で２日〜５日行うのが好ましい。なお、発酵には、グルコース等の糖類を添加して行うのが好ましい。発酵の進行は、ニンニク特有の臭いの変化及びｐＨの低下（ｐＨ６以下への低下）によって確認することができる。 Fermented garlic can be obtained, for example, by heat-treating garlic at 80° C. or higher and then fermenting it with lactic acid bacteria or yeast. First, as the heat treatment, if the temperature is 80°C or higher, the growth of various bacteria can be suppressed, but the temperature is preferably 85°C or higher, more preferably 80°C to 120°C. The heat treatment time is preferably 5 minutes to 1 hour, and 5 minutes to 30 minutes is sufficient. The fermentation is preferably carried out at 30 to 40° C. for 2 to 5 days with the addition of lactic acid bacteria or yeast. The fermentation is preferably carried out by adding a saccharide such as glucose. The progress of fermentation can be confirmed by the change in odor peculiar to garlic and the decrease in pH (reduction to pH 6 or lower).

得られた発酵ニンニクは、そのままでも使用できるが、粉砕処理して粉末として使用することもでき、抽出物として使用することもできる。発酵ニンニク抽出物としては、発酵ニンニクから水、熱水、アルコール等の有機溶媒で抽出した抽出物が挙げられる。抽出手段は、特に限定されず、発酵ニンニク又はその粉砕物に、水等の溶媒を添加して溶媒中に溶解した成分を採取すればよい。溶媒抽出にあたって、加熱等を行ってもよく、ソックスレー抽出等を採用してもよい。 The obtained fermented garlic can be used as it is, but can also be pulverized and used as a powder, or can be used as an extract. Examples of the fermented garlic extract include an extract obtained by extracting fermented garlic with an organic solvent such as water, hot water or alcohol. The extraction means is not particularly limited, and a solvent such as water may be added to the fermented garlic or a crushed product thereof to collect the components dissolved in the solvent. When extracting the solvent, heating or the like may be performed, or Soxhlet extraction or the like may be adopted.

発酵ニンニク又はその抽出物は、後記実施例に示すように、優れたオートファジー調節作用を有し、オートファジー活性が低下又は異常に活性化することに起因する疾患や症状に対する予防又は改善剤として有用である。ここで、オートファジー活性が低下することに起因する疾患としては癌、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等が挙げられる。また、オートファジー活性が低下することに起因する症状については、肌荒れ、しわ形成等が挙げられる。一方、オートファジー活性が異常に活性化している疾患としては、感染症、癌、膵炎等との関連が挙げられる。
従って、本発明のオートファジー調節剤は、オートファジー調節医薬組成物、オートファジー調節化粧料組成物又はオートファジー調節食品組成物として使用することができる。 Fermented garlic or an extract thereof, as shown in the Examples below, has an excellent autophagy-regulating action, as a preventive or ameliorating agent for diseases or symptoms caused by reduced or abnormal activation of autophagy activity. It is useful. Here, examples of diseases caused by a decrease in autophagy activity include cancer, neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, lung diseases, infectious diseases and the like. In addition, examples of symptoms caused by a decrease in autophagy activity include rough skin and wrinkle formation. On the other hand, examples of diseases in which the autophagy activity is abnormally activated include associations with infectious diseases, cancer, pancreatitis and the like.
Therefore, the autophagy controlling agent of the present invention can be used as an autophagy controlling pharmaceutical composition, an autophagy controlling cosmetic composition or an autophagy controlling food composition.

これらのオートファジー調節剤及び組成物中に、発酵ニンニク又は抽出物は、乾燥固形分量として０．００１〜５０質量％含有させるのが好ましく、０．００１〜２０質量％含有させるのがより好ましい。 Fermented garlic or extract is contained in these autophagy regulators and compositions in an amount of preferably 0.001 to 50% by mass, more preferably 0.001 to 20% by mass, as a dry solid content.

本発明のオートファジー調節剤又はその組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロ−ス、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ−スなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチト−ルやソルビト−ルなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコ−ル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、１，３−ブタンジオ−ル等の多価アルコ−ル類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、各種の製剤化に適した手段により行うことができる。また、本発明のオートファジー調節剤の形態としては、錠剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、顆粒、ドリンク剤、乳液、化粧水、クリーム、育毛剤等が好ましい。 In formulating the autophagy regulator or the composition thereof of the present invention, any components used in formulating ordinary foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like can be contained. Examples of such an optional component include an orally administrable composition, for example, an excipient such as lactose or sucrose, a binder such as starch, cellulose, gum arabic, or hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose. Sodium, disintegrating agents such as carboxymethyl cellulose calcium, soybean lecithin, surfactants such as sucrose fatty acid ester, sweeteners such as multi-toluate and sorbitol, acidulants such as citric acid, phosphates, etc. Buffers, film-forming agents such as shellac and zein, talc, lubricants such as waxes, light anhydrous silicic acid, glidants such as dry aluminum hydroxide gel, diluents such as physiological saline and glucose aqueous solution, Preferable examples include flavoring agents, coloring agents, bactericides, preservatives, and fragrances. For transdermal compositions, hydrocarbons such as squalane, petrolatum, microcrystalline wax, jojoba oil, carnauba wax, esters such as octyldodecyl oleate, triglyceride such as olive oil, beef tallow, and palm oil. , Stearic acid, oleic acid, retinoic acid and other fatty acids, oleyl alcohol, stearyl alcohol, octyldodecanol and other higher alcohols, sulfosuccinate and polyoxyethylene alkylsulfate sodium anion interface Activators, amphoteric surfactants such as alkyl betaine salts, cationic surfactants such as dialkyl ammonium salts, sorbitan fatty acid esters, fatty acid monoglycerides, polyoxyethylene adducts thereof, polyoxyethylene alkyl ethers, poly Nonionic surfactants such as oxyethylene fatty acid ester, polyhydric alcohols such as polyethylene glycol, glycerin and 1,3-butanediol, thickening/gelling agents, antioxidants, ultraviolet absorbers , A colorant, a preservative, a powder and the like can be contained. The production can be performed according to a conventional method by a means suitable for various preparations. Further, the form of the autophagy regulator of the present invention is preferably tablets, soft capsules, hard capsules, granules, drinks, emulsions, lotions, creams, hair restorers and the like.

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

製造例１（ニンニク粉末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、粉末を得た（収量３０％）。 Production Example 1 (garlic powder)
100 g of raw garlic peel was made into a paste using a mixer and then heated to 75 to 85°C for 30 minutes. Then, it was freeze-dried for 48 hours with a freeze dryer to obtain a powder (yield 30%).

製造例２（乳酸菌発酵ニンニク末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、乳酸菌（bacillus coagulans）を白金耳で植菌し、グルコースを添加し、３５℃で約３日間発酵させた。８５℃に３０分加熱して発酵停止した後、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、乳酸菌発酵ニンニク末を得た（収量約３０ｇ）。 Production Example 2 (lactic acid bacteria fermented garlic powder)
100 g of raw garlic peel was made into a paste using a mixer and then heated to 75 to 85°C for 30 minutes. Next, lactic acid bacteria (bacillus coagulans) were inoculated with a platinum loop, glucose was added, and fermentation was carried out at 35° C. for about 3 days. After heating at 85° C. for 30 minutes to stop fermentation, freeze-drying was performed for 48 hours by a freeze dryer to obtain lactic acid bacterium fermented garlic powder (yield about 30 g).

製造例３（酵母発酵ニンニク末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、酵母（saccharomyces cerevijiae）を白金耳で植菌しグルコースを添加し、３５℃で約３日間発酵させた。８５℃に３０分加熱して発酵停止した後、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、酵母ニンニク末を得た（収量３０ｇ）。 Production Example 3 (yeast-fermented garlic powder)
100 g of raw garlic peel was made into a paste using a mixer and then heated to 75 to 85°C for 30 minutes. Then, yeast (saccharomyces cerevijiae) was inoculated with a platinum loop, glucose was added, and fermentation was carried out at 35° C. for about 3 days. After heating at 85° C. for 30 minutes to stop the fermentation, it was freeze-dried for 48 hours in a freeze dryer to obtain yeast garlic powder (yield 30 g).

試験例（オートファジー調節効果）
（方法）オートファジーはリソソームにより細胞質内のタンパク質や細胞内小器官を分解するシステムである。オートファジーのプロセスは、（１）オートファジーの誘導と隔離膜の形成、（２）オートファゴソームの形成、（３）リソソームとの融合、（４）内容物の分解のステップにより進行する。オートファゴソーム形成に関わるＬＣ３は翻訳後プロセシングされてＬＣ３−Ｉとして細胞質に拡散する。ＬＣ３−Ｉが、リン脂質分子の１つフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に共有結合するとＬＣ３−ＩＩとなり、隔離膜／オートファゴソーム膜に繋ぎ止められる。そのため、オートファゴソーム量と相関するＬＣ３−ＩＩ量の測定が世界中で使われている。ＬＣ３−ＩＩ量の測定がオートファジーの誘導や分解の評価に用いられている。オートファジーが誘導されオートファゴソームが形成されると、ＬＣ３−ＩＩ量は増加する。一方、オートファジーによる分解が進むと、オートファゴソーム内のＬＣ３−ＩＩが分解されるため、ＬＣ３−ＩＩ量は減少する。そのため、オートファジー誘導と分解を正確に評価するために、リソソーム阻害処理の有無でのＬＣ３−ＩＩ量の比較によりオートファジーの誘導と分解への影響を判断する。ＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１はオートファゴソームとリソソームの融合を阻害することで、オートファゴソームからオートリソソームへの進行を阻害することで、内容物の分解を抑制する。阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩ量が増加する場合には、オートファジーによる分解が促進していると判断できる。阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩ量に影響が見られない場合は、オートファジーによる分解が促進していないと判断できる。また、ある成分がオートファジー分解を阻害する場合にもＬＣ３−ＩＩ量は増加するが、オートファゴソームからオートリソソームへの分解が阻害されているため、リソソーム阻害剤処理によってＬＣ３−ＩＩ量がさらに増加することはない。図１にオートファジーの模式図とプロセスを示す。 Test example (autophagy adjustment effect)
(Method) Autophagy is a system that decomposes proteins in the cytoplasm and organelles by lysosomes. The process of autophagy proceeds by steps of (1) induction of autophagy and formation of a separator, (2) formation of autophagosomes, (3) fusion with lysosomes, and (4) decomposition of contents. LC3 involved in autophagosome formation is post-translationally processed and diffuses into the cytoplasm as LC3-I. When LC3-I covalently binds to one of the phospholipid molecules, phosphatidylethanolamine (PE), it becomes LC3-II and is tethered to the sequestration/autophagosome membrane. Therefore, the measurement of the amount of LC3-II that correlates with the amount of autophagosome is used all over the world. Measurement of the amount of LC3-II is used to evaluate the induction and degradation of autophagy. When autophagy is induced and autophagosomes are formed, the amount of LC3-II increases. On the other hand, as the degradation by autophagy proceeds, LC3-II in the autophagosome is degraded, and the amount of LC3-II decreases. Therefore, in order to accurately evaluate the induction and degradation of autophagy, the effect on the induction and degradation of autophagy is determined by comparing the amount of LC3-II with and without lysosomal inhibition treatment. Bafilomycin A1 inhibits the fusion of autophagosomes and lysosomes, and thus inhibits the progression from autophagosomes to autolysosomes, thereby suppressing the degradation of the contents. When the amount of LC3-II increases due to the treatment with the inhibitor, it can be determined that the decomposition by autophagy is promoted. When the amount of LC3-II is not affected by the treatment with the inhibitor, it can be determined that the decomposition by autophagy is not promoted. The amount of LC3-II also increases when a certain component inhibits autophagy degradation, but since the degradation from autophagosomes to autolysosomes is inhibited, LC3-II amount is further increased by treatment with a lysosomal inhibitor. There is nothing to do. Figure 1 shows a schematic diagram and process of autophagy.

試料粉末１ｇを滅菌水５ｍｌにて４℃、２４時間水抽出し、遠心分離及びフィルター滅菌した後、ニンニク発酵エキスとして用いた。ヒト線維芽細胞であるＯＵＭＳ３６Ｔ−１細胞は１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。ニンニク発酵エキスを終濃度１％、５％、１０％となるように添加し、ＯＵＭＳ３６Ｔ−１細胞をＶ型ＡＴＰａｓｅ特異的阻害剤（リソソームの酸性化を阻害することでリソソームとオートファゴソームの融合やリソソーム酵素による分解を阻害する）の有無で４時間培養した。その細胞抽出液の抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロット法によりＬＣ３の動態を検討した。 1 g of the sample powder was extracted with 5 ml of sterilized water at 4° C. for 24 hours, subjected to centrifugal separation and filter sterilization, and then used as a garlic fermentation extract. OUMS36T-1 cells, which are human fibroblasts, were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS at 37° C. in the presence of 5% CO ₂ . Fermented garlic extract was added to a final concentration of 1%, 5%, or 10%, and OUMS36T-1 cells were added to a V-type ATPase-specific inhibitor (the fusion of lysosomes and autophagosomes by inhibiting acidification of lysosomes and It was cultured for 4 hours with or without (inhibition of degradation by lysosomal enzymes). The kinetics of LC3 was examined by immunoblotting using an anti-LC3 antibody in the cell extract.

（結果）
ＬＣ３−Ｉ，−ＩＩ量を抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロットにより検討した結果を図２に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｔｒｌ，ｌａｎｅ１）は１０％ＦＣＳＤＭＥＭで培養した細胞のライセートである。
ヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー誘導・分解の典型的なパターンを確認するために、オートファジーを誘導することが分かっているＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ、アミノ酸飢餓条件に相当する）で処理を行いＬＣ３の動態に及ぼす影響を検討した（Ｌａｎｅ３，４）。
オートファジー誘導と分解への影響を評価するために、各サンプルとリソソーム阻害剤としてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１を同時に添加して培養した（Ｌａｎｅ２，４，８，９，１０）。
Ｌａｎｅ１−４に、細胞のリソソーム阻害剤処理やアミノ酸飢餓によるＬＣ３の動態を検討した結果を示す。
Ｌａｎｅ１，２：細胞をリソソーム阻害剤で処理した結果。オートファジーによる分解行程であるオートリソソーム形成が阻害されることによりオートファゴソームが蓄積するためＬＣ−ＩＩ量が増加する。
Ｌａｎｅ１，３：ＨＢＳＳ処理によりオートファジーが誘導した結果、ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの転換が起こり、ＬＣ３−Ｉの減少とＬＣ３−ＩＩのわずかな増加が観察される。Ｌａｎｅ３のＬＣ３−ＩＩの増加がＬａｎｅ２ほど顕著ではない理由は、ＨＢＳＳ処理ではオートファジー分解によりＬＣ−ＩＩが分解されていると考えられる。
Ｌａｎｅ３，４：アミノ酸飢餓処理におけるオートファジー分解を評価した結果。リソソーム阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩが増加することから、オートファジーによる分解が促進していると評価できる。
Ｌａｎｅ５，６，７：細胞をニンニク乳酸菌発酵水抽出産物で処理した結果。濃度依存的なＬＣ３−ＩＩ量の増加が認められる。
オートファジーの誘導もしくは分解の抑制の可能性が考えられる。
Ｌａｎｅ７，８−１０：Ｌａｎｅ７で認められたＬＣ３−ＩＩの増加は、リソソーム阻害剤処理によって影響が認められない。よって、ニンニク乳酸菌発酵水抽出産物はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジーを阻害していると評価できる。 (result)
The results of examining the amount of LC3-I and -II by immunoblotting using an anti-LC3 antibody are shown in FIG.
Control (Ctrl, lane1) is a lysate of cells cultured in 10% FCS DMEM.
To confirm a typical pattern of autophagy induction/degradation of human fibroblast OUMS36T-1, in HBSS (Hanks' Balanced Salt solution, which corresponds to amino acid starvation conditions), which is known to induce autophagy. The treatment was carried out to examine the effect on the kinetics of LC3 (Lane 3, 4).
In order to evaluate the influence on autophagy induction and degradation, each sample and Bafilomycin A1 as a lysosomal inhibitor were added at the same time and cultured (Lane 2, 4, 8, 9, 10).
In Lanes 1 to 4, the results of examining the kinetics of LC3 by treatment of cells with a lysosomal inhibitor and amino acid starvation are shown.
Lane1,2: Results of treating cells with lysosomal inhibitors. Inhibition of autolysosome formation, which is the process of degradation by autophagy, causes autophagosomes to accumulate, increasing the amount of LC-II.
Lane1,3: HBSS treatment induced autophagy, resulting in the conversion of LC3-I to LC3-II with a decrease in LC3-I and a slight increase in LC3-II. The reason why the increase in LC3-II of Lane3 is not so remarkable as that of Lane2 is considered that LC-II is decomposed by autophagy decomposition in HBSS treatment.
Lanes 3, 4: Results of evaluating autophagy degradation in amino acid starvation treatment. Since LC3-II is increased by the treatment with the lysosomal inhibitor, it can be evaluated that the degradation by autophagy is promoted.
Lane 5, 6, 7: Results of treating cells with garlic lactic acid bacterium fermentation water extract product. A concentration-dependent increase in the amount of LC3-II is observed.
Induction of autophagy or suppression of degradation may be possible.
Lane7, 8-10: The increase in LC3-II observed in Lane7 is not affected by lysosomal inhibitor treatment. Therefore, it can be evaluated that the garlic lactic acid bacterium fermented water extract product inhibits the autophagy of human fibroblast OUMS36T-1.

ＬＣ３−Ｉ，−ＩＩ量を抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロットにより検討した結果を図３に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｔｒｌ，ｌａｎｅ１）は１０％ＦＣＳＤＭＥＭで培養した細胞のライセートである。
ヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー誘導・分解の典型的なパターンを確認するために、オートファジーを誘導することが分かっているＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ、アミノ酸飢餓条件に相当する）で処理を行いＬＣ３の動態に及ぼす影響を検討した（Ｌａｎｅ３，４）。
オートファジー誘導と分解への影響を評価するために、各サンプルとリソソーム阻害剤としてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１を同時に添加して培養した（Ｌａｎｅ２，４，８，９，１０）。
Ｌａｎｅ１−４に、細胞のリソソーム阻害剤処理やアミノ酸飢餓によるＬＣ３の動態を検討した結果を示す。
Ｌａｎｅ１，２：細胞をリソソーム阻害剤で処理した結果。オートファジーによる分解行程であるオートリソソーム形成が阻害されることによりオートファゴソームが蓄積するためＬＣ−ＩＩ量が増加する。
Ｌａｎｅ１，３：ＨＢＳＳ処理によりオートファジーが誘導した結果、ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの転換が起こり、ＬＣ３−Ｉの減少とＬＣ３−ＩＩのわずかな増加が観察される。Ｌａｎｅ３のＬＣ３−ＩＩの増加がＬａｎｅ２ほど顕著ではない理由は、ＨＢＳＳ処理ではオートファジー分解によりＬＣ−ＩＩが分解されていると考えられる。
Ｌａｎｅ３，４：アミノ酸飢餓処理におけるオートファジー分解を評価した結果。リソソーム阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩが増加することから、オートファジーによる分解が促進していると評価できる。
Ｌａｎｅ５，６，７：細胞をニンニク酵母発酵水抽出産物で処理した結果。ＬＣ３−ＩＩ量の増加は認められない。
Ｌａｎｅ５−１０：ニンニク酵母発酵水抽出産物のＬＣ−ＩＩ量（Ｌａｎｅ５−７）がリソソーム阻害剤処理によって増加した（Ｌａｎｅ８−１０）。その増加量は、飢餓時のリソソーム阻害処理に匹敵するものであった（Ｌａｎｅ４との比較）。よって、ニンニク酵母発酵水抽出産物はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー分解を促進していると評価できる。Ｌａｎｅ５−７でＬＣ−ＩＩ量がｌａｎｅ１の通常培養条件の細胞に比べ減少している原因は、オートファジーによる分解が促進していることによる可能性が示唆される。 The results of examining the amount of LC3-I and -II by immunoblotting using anti-LC3 antibody are shown in FIG.
Control (Ctrl, lane1) is a lysate of cells cultured in 10% FCS DMEM.
To confirm a typical pattern of autophagy induction/degradation of human fibroblast OUMS36T-1, in HBSS (Hanks' Balanced Salt solution, which corresponds to amino acid starvation conditions), which is known to induce autophagy. The treatment was carried out to examine the effect on the kinetics of LC3 (Lane 3, 4).
In order to evaluate the influence on autophagy induction and degradation, each sample and Bafilomycin A1 as a lysosomal inhibitor were added at the same time and cultured (Lane 2, 4, 8, 9, 10).
In Lanes 1 to 4, the results of examining the kinetics of LC3 by treatment of cells with a lysosomal inhibitor and amino acid starvation are shown.
Lane1,2: Results of treating cells with lysosomal inhibitors. Inhibition of autolysosome formation, which is the process of degradation by autophagy, causes autophagosomes to accumulate, increasing the amount of LC-II.
Lane1,3: HBSS treatment induced autophagy, resulting in the conversion of LC3-I to LC3-II with a decrease in LC3-I and a slight increase in LC3-II. The reason why the increase in LC3-II of Lane3 is not so remarkable as that of Lane2 is considered that LC-II is decomposed by autophagy decomposition in HBSS treatment.
Lanes 3, 4: Results of evaluating autophagy degradation in amino acid starvation treatment. Since LC3-II is increased by the treatment with the lysosomal inhibitor, it can be evaluated that the degradation by autophagy is promoted.
Lanes 5, 6, 7: Results of treating cells with garlic yeast fermented water extract. No increase in the amount of LC3-II is observed.
Lane5-10: LC-II amount (Lane5-7) of the garlic yeast fermented water extract product was increased by the lysosomal inhibitor treatment (Lane8-10). The increased amount was comparable to the lysosomal inhibition treatment during starvation (compared to Lane4). Therefore, it can be evaluated that the garlic yeast fermented water extract product promotes autophagy degradation of human fibroblast OUMS36T-1. It is suggested that the cause of the decrease in the amount of LC-II in Lane5-7 compared to the cells in the normal culture condition of lane1 may be that the degradation by autophagy is promoted.

Claims

An autophagy-inducing agent comprising Saccharomyces cerevisiae fermented garlic powder or its water extract as an active ingredient.

An autophagy- inducing pharmaceutical composition, an autophagy- inducing cosmetic composition or an autophagy- inducing food composition, which comprises Saccharomyces cerevisiae fermented garlic powder or an aqueous extract thereof as an active ingredient.