JP6715374B2 - Htpゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良 - Google Patents
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Description
本願は、2015年12月7日に出願された米国仮出願第62/264,232号、2016年4月27日に出願された米国非仮出願第15/140,296号、および2016年7月29日に出願された米国仮出願第62/368,786号の優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、すべての目的のために、すべての記載、参照、図面および特許請求の範囲を含むその全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
これらのタイプのプログラムに供された工業用株における変異の蓄積は、かなり大きなものとなり得、性能改善の速度における最終的な停滞に至り得る。
化を表す予測モデルに試験入力(test input)を適用するステップであって、試験入力
は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;(c)予測モデルに少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;(d)これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;(e)候補微生物株の第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;(f)これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;(g)(2)選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに(1)選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を予測モデルの訓練セットに加えるステップと;(h)少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで、(b)〜(g)を繰り返すステップとによって候補微生物株の設計を反復して改善することを教示する。一部の場合では、予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み、試験入力の後続の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、候補微生物株の先に選択された第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット(HTP)方法であって、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のHTP方法。
(項目2)
前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、SNPスワップ微生物株ライブラリー、開始/停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目3)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目4)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目5)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目6)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目7)
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つの方法を利用することを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目8)
前記最初の複数の微生物が、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目9)
前記最初の複数の微生物が、S1Gen1で表される工業生産株微生物、およびSnGennで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目10)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
d.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
(項目11)
前記参照微生物株のゲノムが撹乱されて、前記第2の微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目12)
前記第2の微生物株のゲノムが撹乱されて、前記参照微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目13)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目14)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目15)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該個々の微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目16)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目17)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目18)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目19)
前記親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、前記工業用微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目20)
前記工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、前記親系統微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目21)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
d.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
(項目22)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目23)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目22に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
(項目24)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
d.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
を含む、方法。
(項目25)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目26)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目25に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
(項目27)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるためのハイスループット(HTP)ゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー、および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目28)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目29)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目30)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目31)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目32)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目33)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目34)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目35)
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目36)
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目37)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目38)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目39)
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目40)
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目41)
候補微生物株の設計を反復して改善するためのコンピューター実装方法であって、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
を含む、方法。
(項目42)
(b)〜(g)を繰り返すステップが、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が、性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返すことを含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目41に記載の方法。
(項目45)
上位性効果に少なくとも部分的に基づく前記第1のサブセットの前記選択が、
該第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
を含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
候補微生物株の設計を反復して改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目48)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、項目47に記載のシステム。
(項目49)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目47に記載のシステム。
(項目50)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目47に記載のシステム。
(項目51)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目50に記載のシステム。
(項目52)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目51に記載のシステム。
(項目53)
候補微生物株の設計を反復して改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目54)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目55)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目56)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目57)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目56に記載のコンピューター可読媒体。
(項目58)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目59)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのコンピューター実装方法であって、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
を含む、方法。
(項目60)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目59に記載の方法。
(項目61)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目62)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目61に記載のシステム。
(項目63)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目64)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目63に記載のコンピューター可読媒体。
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
は「微生物(microbe)」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使
用され、これらに限定されないが、2つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト/表および図面の「微生物(microorganism)」または「細胞生物」ま
たは「微生物(microbe)」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な1つもしくは複数の場所または部位を意味する。
年)補遺30、セクション7.718、表7.71に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、MacVector(Oxford Molecular Ltd、Oxford、U.K.)、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software、Pennsylvania)、およびAlignX(Vector NTI、Invitrogen、Carlsbad、CA)である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するSequencher(Gene Codes、Ann Arbor、Michigan)である。
91巻:10747〜10751頁;Stemmer(1994年)、Nature、370巻:38
9〜391頁;Crameriら(1997年)、Nature Biotech.、15巻:436〜438
頁;Mooreら(1997年)、J. Mol. Biol.、272巻:336〜347頁;Zhangら
(1997年)、PNAS、94巻:4504〜4509頁;Crameriら(1998年)、Nature、391巻:288〜291頁;ならびに米国特許第5,605,793号および同
第5,837,458号を参照。
年)、EMBO J.、4巻:2411〜2418頁;De Almeidaら(1989年)、Mol. Gen. Genetics、218巻:78〜86頁)、よって、所望の発現レベルおよびパターン
をディスプレイする系(line)を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、DNAのサザン分析、mRNA発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内のDNAおよびRNAの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートDNAまたはRNA、ペプチドコンジュゲートDNAまたはRNA、リポソームコンジュゲートDNAなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、mRNAまたはタンパク質(前駆体または成熟)の産生を指す。
株改良の伝統的な手法は、2つのタイプの手法:指向株操作およびランダム変異誘発に広く分類され得る。
組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。さらに、2つの異なる株系統由来の有益な変異を潜在的に組み合わせることができ、それにより、単一の株系統をそのままで変異させることから入手可能であり得るものよりもさらなる改善可能性がもたらされる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それらは、本開示の方法を使用して回避される。
遺伝子設計&微生物操作:一式のHTP分子ツールおよびHTP遺伝子設計ライブラリーを利用する株改良の系統的なコンビナトリアル手法
Scale Production of Engineered Nucleotide Sequences」という表題の、係属中の米国特許出願第15/140,296号に記載されている。
一部の実施形態では、本開示は、全宿主株表現型に対する有益な効果(例えば、収率または生産性)を生じさせるのに最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
possibility)の範囲を拡張することができる。
を含むマルチステッププロセスである。
2.SNPスワップ:SNPスワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
Nuclear Polymorphism nucleotide mutation)(すなわち、SNP)の系統的な導
入または除去を伴う(それが名称「SNPスワッピング」の由来である)。
3.開始/停止コドン交換:開始/停止コドン微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
、24巻:216〜218頁)。他の実施形態では、本開示は、TAG(UAG)停止コドンの使用を教示する。
4.Stopスワップ:最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
頁)。真核生物では、伸長速度も、オルタナティブスプライシングに影響を与えることによって遺伝子発現パターンを決定する場合がある(Cramer P.ら、1997年、「Functional association between promoter structure and transcript alternative splicing.」、Proc Natl Acad Sci U S A.、1997年10月14日;94巻(2
1号):11456〜60頁)。遺伝子上の終結の失敗は、プロモーターのPol IIへのアクセシビリティを低減することによって下流遺伝子の発現を損なわせ得る(Greger
IH.ら、2000年、「Balancing transcriptional interference and initiation
on the GAL7 promoter of Saccharomyces cerevisiae.」、Proc Natl Acad Sci U S A.、2000年7月18日;97巻(15号):8415〜20頁)。このプロセスは、転写干渉として公知であり、下等真核生物において特に関連しており、その理由は、これらが密集した遺伝子を有することが多いためである。
真核生物における転写機構の終結
原核生物における転写の終結
ターミネータースワッピング(STOPスワップ)
5.配列最適化:最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
6.上位性マッピング − 有益な遺伝子統合(genetic consolidation)を可能にする予測的分析用ツール
(その全体が本明細書に参照により組み込まれている)。
6号に記載されている通り、インタープリター204、実行エンジン207、発注エンジン(order placement engine)208、およびファクトリー210を介して、LIMSシステム200は、入力された発現によって指定された微生物株を生成する。
、2010年1月22日、425〜431頁(その全体が本明細書に参照により組み込まれている)に記載されている通り、変異応答プロファイルのこのようなクラスタリングは、細胞の根本的な機能的な機構のおおよそのマッピングに関係する。すなわち、一緒にクラスター化する変異は、根本的な生物学的プロセスまたは代謝経路に関係付けられる傾向がある。このような変異は、「機能群」と本明細書で呼ばれる。この方法の重要な知見は、2つの変異が同じ生物学的プロセスまたは経路によって働く場合、観察される効果(特に観察される利益)は、重複し得ることである。反対に、2つの変異が遠位機構によって働く場合、有益な効果が重複する可能性は低い。
、およびファクトリー210のすべて、またはある組合せ)を使用して、これらの選択された変異を有する微生物株を設計することができる(4208)。諸実施形態では、本明細書で以下に、かつ他の場所で記載する通り、上位性効果を、予測モデルに組み入れる、またはそれと併せて使用して株選択を重み付けまたは選別することができる。
遺伝子設計に受け入れられる生物体
glutamicum FERM−P 6463、Corynebacterium glutamicum FERM−P 6464、Corynebacterium glutamicum DM58−1、Corynebacterium glutamicum DG52−5、Corynebacterium glutamicum DSM5714、およびCorynebacterium glutamicum DSM12866などである。
び他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
する株;マイクロタイタープレート中で効率的に再生する株、より速く再生する株および/またはポリヌクレオチド(例えば、DNA)分子を効率的に取り込む株、低粘度の培養物、例えば、培養において、単一クローンの単離を防止し、かつ/または培養物の粘性を上昇させるほどもつれていない菌糸を産生する細胞などを産生する株、ランダム組込みが低減された(例えば、障害のある非相同末端接合経路)株、またはこれらの組合せであり得る。
遺伝子設計&HTP微生物操作プラットフォームにおいて利用するための遺伝的多様性プールの生成
既存の野生型株からの多様性プールの利用
既存の工業用株バリアントからの多様性プールの利用
変異誘発を介した多様性プールの創製
)、プロカルバジン(PRC)、トリエチレンメラミン(TEM)、アクリルアミドモノマー(AA)、クロラムブシル(CHL)、メルファラン(MLP)、シクロホスファミド(CPP)、硫酸ジエチル(DES)、エチルメタンスルホネート(EMS)、メチルメタンスルホネート(MMS)、6−メルカプトプリン(6−MP)、マイトマイシン−C(MMC)、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、3H2O、およびウレタン(UR)を含めた任意の変異誘発剤を使用することができる(例えば、Rinchik、1991年;Markerら、1997年;およびRussell、1990年を参照)。追加の変異誘発剤は、http://www.iephb.nw.ru/〜spirov/hazard/mutagen_lst.htmlに
記載されているものを含めて当業者に周知である。
およびカゼインキナーゼI(米国特許第6,060,296号)が挙げられる。
多様性を生成するための単一遺伝子座変異
catalytic function by ProSAR-driven enzyme evolution.」、Nature Biotechnology、25巻(3号)、338〜343頁)。
幅された材料は、本願の後の部分に記載されているアセンブリーまたはリアセンブリーPCR反応にかけられる。
プロモーターラダー
ターミネーターラダー
ーター、TTadc転写ターミネーター、ならびに酵母認識終結配列、例えば、Matα(α−因子)転写ターミネーター、生来のα−因子転写終結配列、ADR1転写終結配列、ADH2転写終結配列、およびGAPD転写終結配列が挙げられる。転写ターミネーター配列の非網羅的なリストは、iGEMレジストリにおいて見出すことができ、これは、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能である。
Corynebacterium glutamicum transcriptome using an improved RNAseq technique」、Pfeifer-Sancarら、BMC Genomics、2013年、14巻:888頁)に開示さ
れたアノテートされたCorynebacterium glutamicumターミネーターの使用を教示する。他の実施形態では、本開示は、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能であるiGEMレジストリにおいて見出される転写ターミネーター配列の使用を教示する。本開示の転写ターミネーター配列の非網羅的なリストを以下の表1.1に提供する。
細胞培養および発酵
2巻、Academic Press, Inc.、San Diego、CA;ならびにFreshney(1994年)、Culture of Animal Cells、a Manual of Basic Technique、3版、Wiley-Liss、New
York、およびそれに引用された参考文献;DoyleおよびGriffiths(1997年)、Mammalian Cell Culture:Essential Techniques、John Wiley and Sons、NY;Humason
(1979年)、Animal Tissue Techniques、4版、W.H. Freeman and Company;
ならびにRicciardelleら、(1989年)、In Vitro Cell Dev. Biol.、25巻:1016〜1024頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら(1992年)、Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems、John Wiley & Sons, Inc.、New York、N.Y.;GamborgおよびPhillips(編)(1995年)、Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual、Springer-Verlag(Berlin Heidelberg N.Y.);Jones編(1984年)、Plant Gene Transfer and Expression Protocols、Humana Press、Totowa、N.J.、ならびにPlant Molecular Biology(19
93年)、R. R. D. Croy編、Bios Scientific Publishers、Oxford、U.K. ISBN 0 12 198370 6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks(編)、The Handbook of Microbiological Media(1993年)、CRC Press、Boca Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich, Inc(St Louis、Mo.)からのLife Science Research Cell Culture Catalogue(「Sigma-LSRCCC」)、および例えば、やはりSigma-Aldrich, Inc(St Louis、Mo.)からのThe Plant
Culture Catalogue and supplement(「Sigma-PCCS」)などの入手可能な市販の文
献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C.、USA、1981年)に存在する。
スクリーニング
産物回収および定量
07年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、73巻:1331頁に記載の細胞内タンパ
ク質の精製を参照)。
Handbook、Humana Press、NJ;HarrisおよびAngal(1990年)、Protein Purification Applications: A Practical Approach、IRL Press at Oxford、Oxford、England;HarrisおよびAngal Protein Purification Methods:A Practical Approach
、IRL Press at Oxford、Oxford、England;Scopes(1993年)、Protein Purification: Principles and Practice、3版、Springer Verlag、NY;JansonおよびRyden(1998年)、Protein Purification: Principles, High Resolution Methods
and Applications、2版、Wiley-VCH、NY;ならびにWalker(1998年)、Protein
Protocols on CD-ROM、Humana Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
フィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、2つの抗体を使用することによって検体を検出する。第1の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される(この抗体は、以下で標識抗体と呼ばれる)。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、アブソーバーに向けて毛管現象によって流れ、このアブソーバーは、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に結合している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第2の抗体(これは、以下でタッピング抗体(tapping antibody)と呼ばれる)によって認識お
よび捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
シーケンシング
たはComplete Genomicsシーケンシング、例えば、Drmanacら、Science、327巻:78〜81頁(2010年)などにおける)、ビーズ結合鋳型または粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ(454、例えば、Marguliesら、Nature、437巻:
376〜380頁(2005年)、またはイオントレントシーケンシング、米国特許公開2010/0137143号もしくは同第2010/0304982号を用いてなど)、微細加工膜(SMRTシーケンシング、例えば、Eidら、Science、323巻:133〜138頁(2009年)を用いてなど)、またはビーズアレイ(SOLiDシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、例えば、Kimら、Science、316巻:1481〜1414頁(2007年)を用いるような)を挙げることができる。
した)に、かつ製造者の指示(例えば、TruSeq(商標)試料調製キットおよびデータシート、Illumina,Inc.、San Diego、Calif.、2010年)に;かつさらに、参照により組み込まれている以下の参考文献:米国特許第6,090,592号;同第6,300,070号;同第7,115,400号;およびEP0972081B1に記載されている通り、個々の鋳型分子が固体表面上で空間的に単離され、その後これらがブリッジPCRによって並行して増幅されて別個のクローン集団またはクラスターを形成し、次いでシーケンシングされる。
ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測
予測的株設計
株設計モデルへの入力
予測的株設計モデルを生み出すのに次に使用される最初の線形回帰モデルにおいて利用される選択されたHTP遺伝子設計ライブラリーからの遺伝子変化のセット
線形回帰を用いた構築された株の性能のランク付け
の最初の3列)からのSNPスワップを指す。最後の3列は、プロモータースワップであり、この場合、pcgXXXXは、特定のプロモーターを表し、最後の3文字は、プロモーターが適用されている遺伝子を表す。遺伝子は、中央代謝に関連している。プロモーターは、Corynebacterium glutamicum由来である(したがって「cg」表示)。利用されるプロモーターについてのさらなる情報は、プロモーターP1〜P8を列挙する表1、および本願の配列表に見出すことができる。さらに、各プロモーターP1〜P8についての詳細な情報は、2015年12月7日に出願され、「Promoters from Corynebacterium glutamicum」という表題の米国仮出願第62/264,232号に見出すことができ、これは、参照により本明細書に組み込まれている。参照の容易さのために、以下の表において、pcg3121=P8;pcg0755=P4;およびpcg1860=P3である。
予測的設計モデル化
構成の生成
新しい株設計の性能の予測
二次フィーチャのフィルタリング
既存の株との密接な関係
変化の多様性
予測された性能の多様性
反復株設計最適化
・入出力変数、例えば、入力として遺伝子変化および出力として性能フィーチャの訓練セットを生成する(3302)。生成は、先の遺伝子変化およびこれらの遺伝子変化を組み入れている微生物株の対応する測定された性能に基づいて分析装置214によって実施することができる。
・訓練セットに基づいて初期モデル(例えば、線形回帰モデル)を開発する(3304)。これは、分析装置214によって実施することができる。
・設計候補株を生成する(3306)
○一実施形態では、分析装置214は、変化の組合せの形態でバックグラウンド株に行われる遺伝子変化の数を固定することができる。これらの変化を表すために、分析装置214は、インタープリター204に、変化のこれらの組合せを表す1つまたは複数のDNAの仕様を提供することができる。(これらの遺伝子変化またはこれらの変化を組み入れる微生物株は、「試験入力」と呼ばれる場合がある)。インタープリター204は、1つまたは複数のDNAの仕様を解釈し、エグゼキューションエンジン207は、DNAの仕様を実行してこれらの変化について個々の候補設計株を表す分解された出力を有するDNAの仕様をポピュレートする。
・モデルに基づいて、分析装置214は、各候補設計株の予期される性能を予測する(3308)。
・分析装置214は、最高の予測された性能を有する限られた数の候補設計、例えば100を選択する(3310)。
○上位性マッピングに関して本明細書の他の場所で記載したように、分析装置214は、例えば、上位性効果について上位の設計を選別し、または予測モデル内に、上位性を計算に入れることによって上位性などの二次効果について説明することができる。
・発注エンジン208によって作成された工場注文に基づいて選別された候補株を構築する(ファクトリー210で)(3312)。
・分析装置214は、選択された株の実際の性能を測定し、これらの優れた実際の性能に基づいて限られた数のこれらの選択された株を選択し(3314)、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加える(3316)。線形回帰の例において、設計変化およびこれらの関連した性能のセットを表4中の新しい行として加える。
・次いで分析装置214は、新しい設計候補株の生成に戻って反復し(3306)、停止条件が満たされるまで反復し続ける。停止条件は、例えば、性能測定基準、例えば、収率、増殖速度、または力価を満たす少なくとも1つの微生物株の測定された性能を含み得る。
照。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
015年11月、Dahlら、Multi-task Neural Networks for QSAR Predictions、コンピューターサイエンス学科、トロント大学、2014年6月(arXiv:1406.1231 [stat.ML])に記載されているものが使用され得る。これらの文献のすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。本開示の実施形態に適用可能な機械学習技法は、他の参考文献の中でも、Libbrechtら、Machine learning applications in genetics and genomics、Nature Reviews: Genetics、16巻、2015年6月、Kashyapら、Big Data Analytics in Bioinformatics: A Machine Learning Perspective、Journal of Latex Class Files、13巻、9号、2014年9月、Prompramoteら、Machine Learning in Bioinformatics、Bioinformatics Technologiesの第5章、117〜153頁、Springer Berlin Heidelberg、2005年にも見出すことができ、これらのすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。
反復予測的株設計:例
時に株内に入れた)。ここでは、候補は、所望の数の変化の関数として単に見なされない。代わりに、分析装置214は、出発点として、高性能測定基準を有すると分かっている先に設計された株(「シード株」)のコレクションを選択した。分析装置214は個々に、遺伝子変化をシード株のそれぞれに適用した。導入された遺伝子変化は、シード株内に既に存在するものを含まなかった。様々な技術的、生物学的、または他の理由で、ある特定の変異、例えば、opca_4が明示的に要求され、または例えば、dss_422が明示的に除外された。166の入手可能なシード株およびモデルによって特徴付けられた336の変化を使用して、6239の新規候補株を設計した。
式中、yieldは、候補株について予測された収率を表し、
max(yields)は、すべての候補株に対する最大収率を表し、
prodは、候補株についての生産性を表し、
max(prods)は、すべての候補株に対する最大収率を表す。
サービスとしてのゲノム設計および操作
ゲノム自動化
HTPロボットシステム
遺伝子設計予測に基づくHTP微生物株操作:例示的なワークフロー
のものなどの使用を教示する。
特異的DNAオリゴヌクレオチドを構築する
1037〜1041頁(2005年);および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、18巻、3813〜3821頁(1990年)を参照)。
inside-out synthesis)(TBIO)を使用して一緒に繋ぐことができる(Czarら、Trends in Biotechnology、27巻、63〜71頁(2009年)を参照)。PCAでは、所望のより長い産物の全長にまたがるオリゴヌクレオチドが、複数のサイクル(典型的には約55サイクル)においてアニールおよび伸長されて完全長産物を最終的に達成する。LCRは、リガーゼ酵素を使用して2つのオリゴヌクレオチドを繋ぎ、これらはともにアニールされて第3のオリゴヌクレオチドになる。TBIO合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の5’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の3’末端における逆方向鎖と相同である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸次伸長される。
特注プラスミドアセンブリング/クローニング
プロトプラスト形成法
プラストの数および形質転換効率を最適化することができる。例えば、接種量の変動、接種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝液組成、希釈比、溶菌酵素処理中の緩衝液組成、使用される溶菌酵素のタイプおよび/または濃度、溶菌酵素とのインキュベーションの時間、プロトプラスト洗浄手順および/または緩衝液、実際の形質転換中のプロトプラストおよび/またはポリヌクレオチドおよび/または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメータ、最大で得られる形質転換体までの形質転換後の手順が存在し得る。
プロトプラスト形質転換方法
filamentous fungi, technology and products、Butterworth-Heinemann(199
2年)、BennettおよびLasure(編)、More Gene Manipulations in fungi、Academic Press(1991年)、Turner :Puhler(編)、Biotechnology、完全に改訂された
第2版、VHC(1992年)protoplast fusion に記載されたもの、ならびにEP63
5574Bに記載されたCa−PEG媒介プロトプラスト形質転換を含めて、任意の当技術分野で公知のものであり得る。代替として、糸状菌宿主細胞またはこれらに由来するプロトプラストの形質転換は、電気穿孔、例えば、ChakrabortyおよびKapoor、Nucleic Acids Res.、18巻:6737頁(1990年)によって記載された電気穿孔など、Ag
robacterium tumefaciens媒介形質転換、例えば、Christiansenら、Curr. Genet.、29巻:100〜102頁(1995年);Durandら、Curr. Genet.、31巻:158〜161頁(1997年);およびBarcellosら、Can. J. Microbiol.、44巻:1137〜1141頁(1998年)に記載されたものなどのDNAの微
粒子導入、または細胞の「磁気微粒子銃(magneto-biolistic)」トランスフェクション
、例えば、米国特許第5,516,670号および同第5,753,477号に記載されたものなどによっても実施することができる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用される形質転換手順は、本明細書に提供されるハイスループットおよび/または自動化を受けやすいもの、例えば、PEG媒介形質転換などである。
宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはTi媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる(Christie, P.J.およびGordon, J.E.、2014年、「The Agrobacterium Ti Plasmids」、Microbiol SPectr.、2014年;2巻(6号);10.1128頁を参照)。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が挙げられる(Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I.、1986年、「Basic Methods in Molecular Biology」)。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic Acids Res.、27巻:69〜74頁(1992年);Itoら、J. Bacterol.、153巻
:163〜168頁(1983年);ならびにBeckerおよびGuarente、Methods in Enzymology、194巻:182〜187頁(1991年)を参照。一部の実施形態では、形
質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
選択された配列のループアウト
Sci.、15巻(2号)、2773〜2793頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、(Tearら、2014年、「Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli.」、Appl. Biochem. Biotech.、175巻:1858〜1867頁)に記載されている。本明細書に提供される方法
で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
された標的領域内に挿入される(例えば、相同組換え、CRISPR、または他の遺伝子編集技法を介して)。一実施形態では、シングルクロスオーバー相同組換えが、図3に表したものなどの環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがルーピングおよび欠失を予定しているDNAの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる(例えば、図4;選択遺伝子に対する耐性の欠如を参照)。
この目次により、本出願の実施例または開示の範囲を制限する意図は全くない。
CorynebacteriumのHTP形質転換およびSNPライブラリー創製の実証
A.形質転換ベクターのクローニング
B.E.coli中へのアセンブルされたクローンの形質転換
C.Corynebacterium中へのアセンブルされたクローンの形質転換
D.選択マーカーのループアウト
E.要約
HTPゲノム操作−工業用微生物株を再建/改良するための、SNPライブラリーのインプリメンテーション
A.多様性プール中のSNPの同定
B.SNPスワッピングの分析
C.SNPの有益な組合せを決定するための、上位性マッピングの利用
(実施例3)
HTPゲノム操作−Corynebacterium中でのリシンの産生における株性能を改善するための、SNPスワップライブラリーのインプリメンテーション
A.HTP操作およびハイスループットスクリーニング
C.タンク培養のバリデーション
(実施例4)
HTPゲノム操作−工業用微生物株を改良するための、プロモータースワップライブラリーのインプリメンテーション
A.プロモータースワッピングのための標的の同定
B.プロモーターラダーの創製
C.ラダーからのプロモーターと標的遺伝子との関連性
D.株のHTPスクリーニング
(実施例5)
HTPゲノム操作−リシンの産生に関して、株性能を改善するためのPROスワップライブラリーのインプリメンテーション
A.プロモータースワップ
B.HTP操作およびハイスループットスクリーニング
(実施例6)
上位性マッピング−変異の有益な統合を予測するためのアルゴリズムツール
glutamicumのゲノム中に操作した(機能類似性の関係については、図15および図16Aを参照されたい)。
(実施例7)
HTPゲノム操作−Proスワップ変異の統合および多因子のコンビナトリアル試験
A.PROスワップ株操作のための統合のラウンド
(実施例8)
HTPゲノム操作−工業用宿主株を改善するための、ターミネーターライブラリーのインプリメンテーション
A.DNA構築物のアセンブリー
B.E.coli中へのアセンブルされたクローンの形質転換
C.Corynebacterium中へのアセンブルされたクローンの形質転換
D.Corynebacterium中の個々のターミネーター構築物の評価
(実施例9)
HTPツールセットと従来のUV変異との比較
A.UV変異
B.プロモータースワップ
C.UVおよびプロモータースワップライブラリーの評価
(実施例10)
真核生物におけるHTP操作法の適用
A.Aspergillus nigerのプロトプラストの形成および形質転換
B.形質転換体の自動化されたスクリーニング
C.SNPの組込みのための共形質転換−SNPの設計
D.共形質転換による、SNPの組込み
(実施例11)
HTPゲノム操作−真核生物Aspergillus niger ATCC11414においてクエン酸の産生を改善するための、HTP SNPライブラリー株改良プログラムのインプリメンテーション
A.天然のA.niger株バリアントに由来するSNPについての遺伝子設計ライブラリーのライブラリーの同定
B.原因となる対立遺伝子の交換
C.成功した組込みについてのスクリーニング
本開示が企図する他の主題を、以下の番号を付けた実施形態において示す。
1.
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット(HTP)方法であって、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のHTP方法。
2.
前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、SNPスワップ微生物株ライブラリー、開始/停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つを含む、実施形態1に記載のゲノム操作のHTP方法。
3.
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
4.
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
5.
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
6.
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
7.
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つの方法を利用することを含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
8.
前記最初の複数の微生物が、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
9.
前記最初の複数の微生物が、S1Gen1で表される工業生産株微生物、およびSnGennで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のゲノム操作のHTP方法。
10.
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
11.
前記参照微生物株のゲノムが撹乱されて、前記第2の微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、実施形態10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
12.
前記第2の微生物株のゲノムが撹乱されて、前記参照微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、実施形態10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
13.
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態10〜12のいずれか1つに記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
14.
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態10〜12のいずれか1つに記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
15.
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって
、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該個々の微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
15.1.
同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、実施形態15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建または改善するための方法。
16.
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、参照微生物株と第2の微生物株との間のすべての同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態15〜15.1のいずれか1つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建または改善するための方法。
17.
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態15〜15.1のいずれか1つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
18.
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態15〜17のいずれか1つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
19.
前記親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、前記工業用微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、実施形態15〜18のいずれか1つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
20.
前記工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、前記親系統微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、実施形態15〜18のいずれか1つに記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
21.
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
22.
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
23.
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態22に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
23.1.
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップにおいてスクリーニングされた個々の微生物株中に存在するすべての遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態22に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
24.
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
を含む、方法。
25.
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、
ステップと
を含む、方法。
26.
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、実施形態25に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
26.1.
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップにおいてスクリーニングされた個々の微生物株に存在するすべての遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、実施形態25に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
27.
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるためのハイスループット(HTP)ゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー、および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
28.
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
29.
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
30.
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
31.
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
32.
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
33.
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
34.
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
35.
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
36.
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
37.
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
38.
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
39.
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
40.
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
41.
候補微生物株の設計を反復して改善するためのコンピューター実装方法であって、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
を含む、方法。
42.
(b)〜(g)を繰り返すステップが、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が、性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返すことを含む、実施形態41に記載の方法。
43.
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態41に記載の方法。
44.
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態41に記載の方法。
45.
上位性効果に少なくとも部分的に基づく前記第1のサブセットの前記選択が、
該第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
を含む、実施形態44に記載の方法。
46.
前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさらに含む、実施形態45に記載の方法。
47.
候補微生物株の設計を反復して改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
48.
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、実施形態47に記載のシステム。
49.
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態47に記載のシステム。
50.
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態47に記載のシステム。
51.
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態50に記載のシステム。
52.
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態51に記載のシステム。
53.
候補微生物株の設計を反復して改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
54.
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、実施形態53に記載のコンピューター可読媒体。
55.
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、実施形態53に記載のコンピューター可読媒体。
56.
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、実施形態53に記載のコンピューター可読媒体。
57.
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態56に記載のコンピューター可読媒体。
58.
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、実施形態53に記載のコンピューター可読媒体。
59.
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのコンピューター実装方法であって、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
を含む、方法。
60.
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態59に記載の方法。
61.
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
62.
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態61に記載のシステム。
63.
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
64.
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、実施形態63に記載のコンピューター可読媒体。
*****
参照による組込み
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
Claims (19)
- 改善された表現型性能を有するように宿主細胞を操作するためのハイスループット方法であって、
a.1つ以上の遺伝子変化入力変数と、1つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
i.前記1つ以上の遺伝子変化入力変数は、宿主細胞に導入された1つ以上の遺伝子変化を表し、
ii.前記1つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された1つ以上の遺伝子変化に関連する1つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
b.前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
c.前記1つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補宿主細胞のプールを、in silicoで生成するステップと、
d.前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補宿主細胞のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
i.少なくとも1つの設計候補宿主細胞は、ゲノム配列中に、ステップ(a)の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、
ii.前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ(a)の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいており、前記遺伝子変化のいずれに関連するさらなる機能的情報も必要としない、ステップと、
e.前記設計候補宿主細胞のサブセットを、それらの予測される表現型性能に基づいて選択するステップと、
f.前記設計候補宿主細胞の前記サブセットからの宿主細胞を製造し、それによって、操作された宿主細胞を生み出すステップと、
g.in vitroアッセイにおいて、前記操作された宿主細胞の表現型性能を測定するステップと、
h.(a)の訓練データセットに、i.前記操作された宿主細胞に導入された1つ以上の遺伝子変化を表す1つ以上の遺伝子変化入力変数と、ii.前記操作された宿主細胞の前記表現型性能尺度を表す1つ以上の測定された表現型性能出力変数とを加えるステップと
を含む、方法。 - (a)〜(h)が、操作された宿主細胞が所望のレベルの改善された表現型性能を呈するまで繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 前記予測機械学習モデルが、上位性効果を組み込んでいる、請求項1に記載の方法。
- 前記予測機械学習モデルが、以下:線形回帰、カーネルリッジ回帰、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン(SVM)、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット過程、強化ベースの学習、クラスターに基づく学習、階層的クラスタリング、遺伝的アルゴリズム、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを組み込んでいる、請求項1に記載の方法。
- 前記予測機械学習モデルが、教師付き、半教師付き、または教師なしである、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子変化が、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド配列挿入、ヌクレオチド配列欠失、およびヌクレオチド配列置換からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子変化が、内在性標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダーからの1つ以上の異種プロモーターを含み、前記プロモーターラダーは、異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 改善された表現型性能を有するように微生物株を操作するためのハイスループット方法であって、
a.1つ以上の遺伝子変化入力変数と、1つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
i.前記1つ以上の遺伝子変化入力変数は、微生物株に導入された1つ以上の遺伝子変化を表し、
ii.前記1つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された1つ以上の遺伝子変化に関連する1つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
b.前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
c.前記1つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補微生物株のプールを、in silicoで生成するステップと、
d.前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補微生物株のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
i.少なくとも1つの設計候補微生物株は、ゲノム配列中に、ステップ(a)の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、
ii.前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ(a)の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいており、前記遺伝子変化のいずれに関連するさらなる機能的情報も必要としない、ステップと、
e.前記設計候補微生物株のサブセットを、それらの予測される表現型性能に基づいて選択するステップと、
f.前記設計候補微生物株の前記サブセットからの微生物株を製造し、それによって、操作された微生物株を生み出すステップと、
g.in vitroアッセイにおいて、前記操作された微生物株の表現型性能を測定するステップと、
h.それらの測定された表現型性能に基づいて前記操作された微生物株のサブセットを選択するステップと、
i.(a)の訓練データセットに、
i.前記操作された微生物株のサブセットに導入された1つ以上の遺伝子変化を表す1つ以上の遺伝子変化入力変数と、
ii.前記操作された微生物株のサブセットの前記表現型性能尺度を表す1つ以上の測定された表現型性能出力変数とを加えるステップと、
j.操作された微生物株が、所望のレベルの改善された表現型性能を呈するまでステップ(a)〜(i)を繰り返すステップと
を含む、方法。 - 前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記改善された表現型性能が、リシンまたはクエン酸の増加した、またはより効率的な産生である、請求項9に記載の方法。
- 改善された表現型性能を有するように宿主細胞を操作するためのハイスループット方法であって、
a.1つ以上の遺伝子変化入力変数と、1つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
i.前記1つ以上の遺伝子変化入力変数は、1つ以上のライブラリーの適用を通じて宿主細胞に導入された1つ以上の遺伝子変化を表し、
ii.前記1つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された遺伝子変化に関連する1つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
b.前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
c.前記1つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補宿主細胞のプールを、in silicoで生成するステップと、
d.前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補宿主細胞のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
i.少なくとも1つの設計候補宿主細胞は、ゲノム配列中に、ステップ(a)の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、
ii.前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ(a)の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいており、前記遺伝子変化のいずれに関連するさらなる機能的情報も必要としない、ステップと、
e.操作された宿主細胞を生み出すのに使用するための前記設計候補宿主細胞のサブセットを提供するステップと、
f.ステップ(e)の操作された宿主細胞を製造するステップと
を含む、方法。 - 前記1つ以上のライブラリーが、プロモータースワップライブラリー、SNPスワップライブラリー、開始/停止コドンライブラリー、最適化配列ライブラリー、ターミネータースワップライブラリー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項
12に記載の方法。 - 前記予測機械学習モデルが、上位性効果を組み込んでいる、請求項12に記載の方法。
- 前記予測機械学習モデルが、以下:線形回帰、カーネルリッジ回帰、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン(SVM)、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット過程、強化ベースの学習、クラスターに基づく学習、階層的クラスタリング、遺伝的アルゴリズム、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを組み込んでいる、請求項12に記載の方法。
- 前記予測機械学習モデルが、教師付き、半教師付き、または教師なしである、請求項12に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子変化が、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド配列挿入、ヌクレオチド配列欠失、およびヌクレオチド配列置換からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子変化を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記1つ以上の遺伝子変化が、内在性標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダーからの1つ以上の異種プロモーターを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
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