JP6708558B2 - 血液サンプルの交差適合 - Google Patents
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Description
全患者に対してABOおよびRhD血液型判定、うらABO式判定および不規則抗体スクリーニングを行うことは、輸血業務の検査室には慣用的である。これは、ABOおよびRhD適合性であり、かつ患者が抗体を有する血液型抗原を欠いている血液を提供するために行う;これによって患者によって破壊される輸血されたドナーのエリスロサイトの危険性を防ぐかまたは低減する。陽性の抗体スクリーニングの事象では、抗体を特定する検査を行って、存在する抗体(その存在は、既知の抗原刺激なしで、環境要因に起因して形成される、抗Aまたは抗Bのような規則的血液型抗体と異なって、予想されないので、不規則血液型抗体と呼ばれる場合が多い)を特定する。抗体のスクリーニングまたは特定には、不規則血液型抗体が関連する臨床的に重要な血液型抗原を保持する、特異的に選択したエリスロサイトサンプルのパネルに対して試験した患者の血漿/血清の使用を含む。
ドナーエリスロサイトユニットは、患者と同じABOおよびRh型として、かつ患者が抗体を有する血液型抗原については陰性であるように選択すべきである。これは、問題の抗原について陰性であるものを見出すためにドナーエリスロサイトユニットの血液型判定を包含することが多いが、輸血業務の慣用的な試験レジーム次第で、この試験は、ドナーユニット試験の時点で行っていてもよい。
エリスロサイトの表面上の抗原(血液型抗原を含む)の存在によって、例えば、非凝集タンパク質マイクロアレイを用いる血液型判定アッセイを含む、多くの免疫学的試験の基礎が形成され、ここでは固定された抗体は、エリスロサイトの表面上の抗原に結合し、そのように固定されたエリスロサイトの存在が検出される(J S Robb et al 2006)。抗体マイクロアレイ技術も用いて、細胞表面上の抗原の複雑な混合物を検出することによってエリスロサイトを表現型決定してもよい(C J Campbell et al 2006)。エリスロサイトによって発現される抗原は、両方とも、十分提示され、容易に接近可能となる傾向である糖抗原、および膜貫通タンパク質のエピトープであり、したがって、細胞表面に埋められて、より密接して保持され、これらは、抗体の正確な選択を用いて区別することに成功した、タンパク質ペプチド抗原である。
赤血球は、宿主免疫系に対して、それらの赤血球が、その宿主の赤血球上で見出されない抗原を発現する場合、それらの宿主免疫系に対して「外来」のように見える場合がある。この理由のせいで、血液は、輸血される前に注意深く交差適合されなければならない。例えば、ある程度の赤血球は、A型抗原を発現し、赤血球がA型血液抗原を発現する血液は、血液型「A」と呼ばれる。他の血液型としては「B」(ここでエリスロサイトは、「B」血液型抗原を発現する)、「AB」(ここでエリスロサイトは、AおよびBの両方の血液型抗原を発現する)、および「O」(ここでエリスロサイトは、「A」血液型抗原も「B」血液型抗原も発現しない)が挙げられる。下にさらに詳細に説明されるとおり、ドナー赤血球(エリスロサイト)とレシピエントとの間の不適合性は、赤血球上に存在する抗原に結合するレシピエントの血漿中の抗体の存在に依存する。不適合性の試験は、「交差適合性(crossmatching)」と呼ばれてもよい。
不適合性のドナー血液が輸血される場合、レシピエントの免疫系(特に「外来の」輸血された血液に存在する抗原に親和性を有する循環中の抗体)は、不適合な血液を「攻撃し」、輸血は失敗する場合がある。さらに、ドナー血液の大量破壊は、不適切なおよび/または肥大した免疫応答、ならびに凝固系のカスケードを誘発し得る。不適切な輸血後には、ショック、腎不全および死亡さえ生じ得る。
本発明者らは、抗体(タンパク質)で感作された赤血球(エリスロサイト)が、免疫学的アッセイを履行することが必要な処理工程を持ちこたえ得ることに注目した。実際、免疫学的アッセイおよび他の処理手順に供された、感作された赤血球(エリスロサイト)は、種々のインキュベーションおよび洗浄工程を通じて抗体で「感作された」(コーティングされた)ままである場合がある。上記を考慮して、感作のプロセスは、免疫学的交差適合性試験の基礎として活用され得る。
第1の血液サンプル由来の血漿または血清を用意する工程と;
血漿サンプルと、第2の血液由来の赤血球とを接触させて、血漿/赤血球混合物を得る工程と;
血漿/赤血球混合物を赤血球の感作を可能にする条件下でインキュベートする工程と;
液相から赤血球(そのある程度または全てが、感作されても、感作されなくてもよい)を分離する工程と;
感作された赤血球と、抗体に結合することができる因子とを接触させる工程と;
を含み、
液相からの感作された赤血球の分離は、遠心分離なしで生じ、かつ抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出によって、ドナー血液が意図されるレシピエントの血液と不適合であることが示される、方法を提供する。
本発明における使用のための血漿または血清は、任意の適切なまたは標準的な調製のプロトコールを用いて全血から調製してもよい。本発明のこの方法が血液を交差適合する方法である場合、血漿および/または血清は、輸血を受ける患者によって提供されてもよく、またはその患者に由来してもよい。使用のための血漿を調製するために、全血を抗凝結処理試験管内に収集してもよい。赤血球および血小板を、遠心分離によって取り除くかまたは分離して、得られた上清を血漿と命名する。本発明における使用のための血漿サンプルは、例えば、約10μL〜約1mLの体積を含んでもよい。例えば、約100μL、150μL、160μL、200μL、250μLまたは300μLの血漿を用いてもよい。使用のための血清を調製するために、全血を収集して、一定期間凝血させてもよい。再度、赤血球および血小板を遠心分離によって取り除き、得られた上清を血清と命名する。本発明の方法における使用のための血漿および/または血清は、使用前に適切な緩衝液または希釈液で希釈してもよい。血漿および/または血清は、使用のために、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9または1:10希釈として調製してもよい。適切な希釈液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)および/または低イオン強度溶液(low ionic strength solution)(LISS)を挙げてもよい。
典型的には、免疫学的(交差適合性を含む)アッセイにおける偽陰性の結果の出現は、頻繁な洗浄および/または遠心分離の工程によって防がれる。これによって、血漿/血清サンプルと、赤血球(感作された赤血球を生成するため)の供給源との間のインキュベーションの任意の最初の期間の後、血漿/血清に存在する任意の未結合の抗体であって、それらの抗体が、感作された赤血球を検出するために用いられる結合因子(例えば抗体)を中和し得る抗体は、アッセイの最終段階には持ち込まれないことが確実になる。洗浄工程によって、アッセイから未結合の抗体を除去することが容易になるが、遠心分離は、液相中の未結合の抗体の、それらの標的に結合するものからの分離に影響する。
本発明は、血液を交差適合するための鋭敏、特異的、正確かつ迅速なアッセイを提供するので、改善に相当し、このアッセイは、偽陽性および/または偽陰性の結果の率またはレベルを、先行技術の交差適合性アッセイおよび試験と同程度にさせるが、洗浄および/または遠心分離の工程の使用は減少している。
本発明の方法、および具体的には細胞混合物インキュベーション工程では、細胞ペレットを形成するか、または赤血球(そのうちある程度が、全てが感作されてもよく、または全く感作されなくてもよい)を、細胞混合物の液相およびなんらかの未結合の抗体から分離するための遠心分離の使用を回避する。そうではなく、赤血球は、経時的におよび/または重力のもとで、液相から分離して、沈降することが可能である。これによって、天然の赤血球ペレットまたはクランプの形成が生じ得る。一旦、赤血球のペレットが形成されて沈降すれば、使用者は、以下の作用のいずれかまたは両方を行ってもよい。上清を取り除いて、赤血球のみを残してもよく、そのうちのある程度は、細胞混合物インキュベーション工程の間、抗血液型抗原抗体によって感作されていってもよい。それに加えて、またはその代わりに、沈降したかまたはペレットにされた赤血球クランプまたはそのサンプルを除去してもよい。次いで、アッセイの残りは、上清の除去後に残っている赤血球、または赤血球混合物から取り除かれた赤血球のいずれかで行われる。
再懸濁されてもよい赤血球(そのうちある程度は感作されていてもよい)を、抗体と結合することができる因子と接触する。例えば、本発明のこの方法がヒトのサンプル(ヒトの血漿およびヒトのドナー血液)を用いて行われる場合、抗体に結合することができる結合因子は、ヒト抗体に結合できるはずである。本発明における使用のための結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメント(1つまたは複数の抗体アイソタイプに特異性を有する)であってもよい。例えば、単一の抗体アイソタイプ(例えば、免疫グロブリンG、M、A、EまたはD)に特異的な単一の抗体種または複数の異なる抗体(各々が異なる抗体アイソタイプに特異性を有する)。
特定の抗原に対する同種集団の抗体であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術によって得ることができる。これらとしては、限定するものではないが、Kohler and Milstein (1975), Nature 256:495-497;および米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72、Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)、ならびにEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal Anti-bodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)が挙げられる。
キメラ、一本鎖およびヒト化抗体はまた、本発明において結合因子として用いられてもよい。キメラ抗体の生成のための技術(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855、Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608、Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454、米国特許第4,816,567号)は、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングする工程を含み、それとともに適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子を用いてもよい。キメラ抗体とは、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
本発明における使用のための抗体フラグメント(このフラグメントは、特定のエピトープを認識する)は、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントは、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るF(ab’)2フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るFabフラグメントを含む。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な特定を可能にしてもよい。
本発明における使用に適切な全ての型の抗体(上記のものを含む)を、総称して、「抗体」と呼ぶものとする。
本発明における使用のための結合因子および/または抗体は、アレイにおける基板に結合されても、または固定されてもよい。本明細書において用いる場合、「アレイ」という用語は、結合したプローブ(例えば、結合因子および/または抗体)の一般的に順序付けされた配置であって、ガラスのような基板上の感作された赤血球(またはそうではなく、赤血球をコーティング/感作する抗体)に特異的に結合する配置を指す。
通常は、このアレイは、結合因子および/または抗体が結合される区切られた領域から規則的に間隔を空けられた一連の形態であってもよい。このような基板結合抗体アレイは、通常、「抗体チップ」と記載されてもよい。
本発明における使用のための「抗体チップ」を調製するために用いられる基板は、小さい平面の基板を含んでもよい。適切な平面の基板は任意の適切な大きさであってもよい。例えば、本発明における使用のための平面の基板は、長さが約5mm〜約100mm、および幅が約5mm〜約50mmのいずれであってもよい。例えば、適切な平面の基板は、約76mm×約26mmまたは約12.5mm×約7.9mmの大きさであってもよい。
結合因子/抗体のスポットまたはプリントされたスポットは、直径が1mm未満、例えば、直径500μmもしくは100μm未満、または直径約50μm〜約1000μmであり得る。この方式では、10秒〜1000秒の個々のおよび別個の結合因子/抗体スポットが、任意の所定の基板の表面上に提供され得る。
基板の表面に、本明細書に記載の種類の結合因子および/または抗体を固定するためには当該分野では種々の手順が周知である。例えば、静電気結合が、抗体を固定するために用いられてもよい。表面に結合因子または抗体を固定または結合するために用いられ得る他の方法としては、疎水性/親水性の相互作用、化学的相互作用、およびアミンカップリングが挙げられる。結合因子および抗体は、硫黄含有アミノ酸(システイン、メチオニン)を介して、または金含有基板上に以前に結合された結合因子と相互作用する官能基を含むアルカンチオールを介する結合を通じて、金含有基板上に直接吸着されてもよい。
例えば、適切なブロッキング剤は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(0.15Mの塩化ナトリウム、2.632Mのリン酸緩衝液ストック溶液(Quotient,Scotland)、pH7.0)中に、1(w/v)%のウシ血清アルブミン(BSA)(ID Bio,France)を含んでもよい。
上記の観点で、本発明の交差適合性の方法は、マイクロアレイフォーマットで行ってもよい。マイクロアレイ交差適合性のアッセイは、従来の交差適合性の試験に対する効率的かつ効果的な代用法である。さらにマイクロアレイ交差適合性アッセイは、血液処理に重要な他の試験(例えば、他のマイクロアレイ試験)(例えば、赤血球(エリスロサイト)の表面上の多数の抗原について血液型表現型判定試験を含む)に容易に組み込まれ得る。
捕捉された(結合している)感作された赤血球(エリスロサイト)の存在は、蛍光、化学発光複合体化抗体を活用し得る、例えば、二次標識検出のような、当該分野で公知の種々の技術によって検出され得る。
蛍光は、当該分野で公知の任意の適切な光検出器、例えば、分光光度計またはデジタル画像化デバイス、例えば、CCD画像センサー(CCDカメラの形態で)またはCMOSセンサーなどによって検出され得る。便宜上、解釈のための視覚的アウトプット、または解釈およびデータ処理の目的のための数値を考慮すると、スキャナーによって検出される赤血球(エリスロサイト)結合およびその強度を用いる単純なフラットベッドスキャナーを用いてもよい。
したがって、本発明では、結合された感作された赤血球(エリスロサイト)は、蛍光シグナルによって検出しても、または例えば、フラットベッドスキャナーを用いて、スキャン後の画像生成によって検出してもよい。
本発明のこの方法は1つまたは複数の対照を含んでもよい。例えば、陽性対照は、赤血球の添加を確認するために用いられ得る。陽性対照は、抗エリスロサイト抗体を含んでもよい。抗エリスロサイト抗体は、上記でさらに詳細に記載されるような基板上に固定されてもよく、および/またはスポット/プリントされてもよい。
本発明のさらに好ましい特徴および利点は、例示によって示される以下の詳細な例からわかる。
(例1)
タンパク質マイクロアレイの調製
Schottから入手したコーティングされたスライドを基板として用いた。スポットする結合因子抗体プローブサンプルは、50%グリセロール/50%PBS中で調製した。
このスライドを、12のサンプルJetspyderを備えるArrayjet Sprint Arrayer(Arrayjet)を用いてプリントした。各々のサンプルの複製を、50%のグリセロール/PBSの陰性対照スポットによって隔てられる各々のスライド上にプリントした(図1を参照のこと)。全てのスライドを、40〜60%の相対湿度内で、かつ環境温度(20〜23℃)でプリントした。プリントしたプローブを、30分間湿潤雰囲気で固定させた後に、暗野で少なくとも24時間2〜8℃のボックスの中に保管した。
さらなるアレイを、図2に示される、抗Aおよび抗B血漿の試験のためにプリントした。
実験における使用の前の細胞の洗浄
全ての細胞種をLISSに懸濁するか、またはLISS(低イオン強度生理食塩水(low ionic strength saline))中に洗浄した(他の希釈液を用いてもよく、これには、例えば、PBS、改変オルシーバー(Alsever)およびそれらのバリエーションが挙げられる)。さらに、細胞は、洗浄しなくてもよい(むしろ小体積の細胞は、直接LISS緩衝液中にドナーサンプル(おそらく遠心分離されている)から取り出してもよい)。洗浄を用いる場合、細胞を、Thermo Centra CL2遠心分離を用いて2分間3000rpmで3回遠心分離する(ここでは上清を各回で取り除いて、約4mLのPBSで置き換える)。最終の遠心分離後、LISS中で1回洗浄を行った後、その細胞をLISS中で2%HCTに再懸濁した。
異なるヘマトクリットの細胞を検出した実験に関しては、細胞を8%のHCTで調製した(160μLの得られた細胞ペレットを、1000μLのLISSに添加した)。次いで8%のHCT細胞をLISS中にさらに希釈して、必要なパーセンテージのヘマトクリットを達成した。
感作された細胞の間接的な凝集試験(従来の方法、基準技術)
細胞懸濁物の体積(40μLまたは80μL)を、試験管中で80μLのニートまたは希釈した血漿とともにインキュベートした。得られた混合物を、37℃の水浴中でインキュベートした。この例では、この混合物を30分または45分間インキュベートしたが、より短時間または長時間用いてもよい。これらの条件下では、赤血球が感作される。血漿が希釈された場合、希釈液は、赤血球懸濁液に用いられるものと同じであってもよい(他の適切な希釈液を用いてもよい)。
インキュベーション期間の後、細胞を、DiaCent 2000 Cellウォッシャー(PBSを用いて×4洗浄し、次いで1000gで遠心分離)でnWプログラムを用いて洗浄した。2滴のAHGを添加して、その試験管を最終的に遠心分離し(1000g、10秒)、細胞の凝集をライトボックスの上で読み取った。
細胞を感作する試験管技術
細胞懸濁液の体積(240μL − または血漿の体積と適合)を、480μLのニートまたは希釈した血漿とともにインキュベートした。血漿は、PBSまたはLISSのいずれかで希釈した。試験管は、37℃でインキュベートした(30分間または45分間−より長時間または短時間を用いてもよい)。インキュベーション期間の後、細胞を、DiaCent 2000 Cellウォッシャー(PBSを用いて×4洗浄し、最終的に遠心分離)を用いて洗浄した。次いで、細胞を240μLの2%のBSA/LISS中に再懸濁した後に、例7に記載のアレイに添加した。
細胞を感作するためのガラススライド技術(血漿/上清を除去することおよび再懸濁による未結合の抗体の除去)
ブランクのスライド(Schott,Glass B)を、Grace−Bio 16−wellマニフォールドにはめ込んだ。ブロッキング溶液(2%のBSA/PBS)を、約37℃に温め、スライドを、各々のウェルへの160μLのブロッキング溶液の添加によってブロックして、15分間Grant Bio Thermoshaker上で振盪(350rpm)しながら37℃でインキュベートした(プラスチックカバーをして)。ブロッキングの後、溶液を取り出して、80μLの(洗浄してもよい)細胞を、160μLの血漿とともにインキュベートした。スライドを、37℃で30分または45分間静止してインキュベートした。インキュベーション時間は、行われる実験に依存した。
インキュベーションの後、液体(または液相)の(実質的に)全体積を、各々のウェルの上の右側の角から迅速に除去した。
残りの細胞を、240μLの2%のBSA/LISS中に再懸濁した後に、例7に記載のアレイに添加した。
細胞を感作するためのプレート技術(血漿/上清からの感作されたエリスロサイトの除去、次いで再懸濁)
体積(40μL)の洗浄された細胞を、Grant Bio Thermoshakerを用いて37℃で30分間または45分間、U底の96ウェルプレート中で、80μLの血漿と静止してインキュベートした。総体積における変化を検討するために、80μLの細胞を160μLの血漿とともにインキュベートした。インキュベーション時間は、行われる実験に依存した。インキュベーション時間の後、ウェルの底から4μLの細胞ペレットを、100μLの2%BSA/LISSを含むセパレートのウェルに取り出した。その細胞を再懸濁した後、例7に記載のとおりアレイに添加した。
アレイの処理
プリントされたアレイスライドを、2〜8℃の保管から取り出して、Grace−Bioの16ウェルのマニフォールドにはめ込み、各々のウェル中のアレイの中央および直線配列の両方を確実にして、金属クリップを用いて固定し、Proplateトレイ(3スライド型)にはめ込んだ。スライドを、使用の直前まで2〜8℃の保管に戻した。ブロッキング溶液(2%のBSA/PBS)を、約37℃まで温めた。スライドを、160μLのブロッキング溶液を各々のウェルに添加することによってブロックして、37℃で、350rpmで、振盪しながらGrant Bio PHMP Thermoshakerで(プラスチックカバーをして)15分間インキュベートした。
ブロッキング後、溶液を取り出して、120μLの感作された細胞(例4〜6由来)を、各々の適切なウェルの左側にゆっくりピペッティングした。
スライドを、Grace−Bioマニフォールドから注意深く取り出して、スライドホルダーに移し、新鮮なPBSに浸した。スライドは、2〜8℃で10分間0.1%グルタルアルデヒド/PBS中への浸漬によって固定してもよく、またはさらに都合よくは、PBSは、吸引によって取り出して、分析は、フラットベッドスキャナーを用いて直接行う。この後に、水中での最終洗浄を続け、その後に、乾燥するまで遠心分離した。スライドを、スキャンするまでごみのない暗い場所で保管した。
データの抽出および解析
スライドを、フラットベッドスキャナーを用いてスキャンして、高解像度の画像を捕えて、16ビットのTIFFファイルとして保存した。
赤血球が抗体に結合したとき、黒いスポットが明らかになる。
数値データを、シグナル強度を定量し得る社内で作成したアルゴリズムを用いて、マイクロアレイから抽出した。
テキスト入力ファイルを、マイクロアレイカラムおよび列の位置を用いて自己作成して、各々のプローブの同一性および位置を決定した。これを用いて、マイクロアレイグリッド設定が一旦設定されれば、負荷されたアレイリストを作成した。一旦、グリッドおよびアレイのリストが作成されれば、データをテキストファイルに抽出した。このプロセスで、各々のスポットの中心から中央蛍光強度値、およびスライドの全体のバックグラウンド領域から中央バックグラウンド値を得た。この情報は、エクセルのワークシートに収集した。
一旦、最高のデータスキャンを、選択した場合、これは以下のとおり処理した。望ましくないデータをワークシートから取り除いて、マイクロアレイ上でスポットに1つの値のみを残した(各々のスポットについて、スポット強度値マイナスバックグラウンド値)。陰性対照の値を用いて、「ノイズ」値、平均に加えて陰性の2標準偏差(平均+2sd)を算出する。この値は、非特異的な結合(NSB)に相当する。各々のスポットの値を、陰性対照の平均+2sdで割って、シグナル対ノイズ比(S/N)を得る。1を超える値は、有意とみなすことができる。S/Nの中央値を、各々のサンプルの複製のスポットについて算出した。
マイクロソフトエクセルを用いて、処理したデータを必要に応じて解析した。データを分析するために、全体にわたって棒グラフを用いた。棒グラフ上のY軸は、サンプルについてのS/N中央値に相当する。
エラーバーが含まれる場合、各々のサンプルの標準誤差は以下のとおり算出された。各々のサンプルの複製の標準偏差を算出した(これは、S/N比または実際の値で行った)。標準偏差は、サンプルの複製の数の平方根で割って、標準誤差を得た。
タンパク質マイクロアレイは、上記の例1のとおり調製した。細胞を上記の例2のとおり実験前に洗浄した。感作された細胞の間接的な凝集試験(従来の方法:基準の技術)は、上記の例3のとおり行った。感作された細胞を調製するための「試験管技術」は、上記の例4のとおり行った。細胞を感作するための「ガラススライド技術」(血漿/上清の除去および再懸濁による未結合の抗体の除去(遠心分離/洗浄なし))は、上記の例5のとおり行った。アッセイは、上記の例7のとおり処理した。
データ抽出および解析
棒グラフ上のY軸が、陽性の対照(Z441)の結果に対して正規化され、パーセンテージとして算出されたサンプルについてのS/N中央値に相当することを除いて、もとの特許の例8のとおり。
Robb. J.S., Roy, D.J., Ghazal, P., Allan, J. and Petrik, J. (2006). “Development of non-agglutination microarray blood grouping” Transfusion Medicine. 16, 119-129.
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Issit, P.D. and Anstee, D.J. (1998) Applied Blood Group Serology. Fourth Edition. Montgomery Scientific Publications.
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕血液サンプルを交差適合させる方法であって、
第1の血液サンプル由来の血漿および/または血清を用意する工程と;
血漿および/または血清と、第2の血液サンプル由来の赤血球とを接触させて、血漿および/または血清/赤血球の混合物を得る工程と;
血漿および/または血清/赤血球の混合物を、赤血球の感作を可能にする条件下でインキュベートする工程と;
赤血球を液相から分離する工程と;
赤血球と、抗体に結合することができる因子とを接触させる工程と
を含み、
液相からの赤血球の分離が、遠心分離なしに生じ、抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出は、ドナーの血液が、意図したレシピエントの血液と不適合であることを示す、方法。
〔2〕血漿および/または血清が、全血から調製される、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕血漿および/または血清が、輸血を受ける患者から得られるか、その患者によって提供されるか、またはその患者由来である、前記〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕赤血球が、ドナー血液から得られるか、ドナー血液によって提供されるか、またはドナー血液由来である、前記〔1〕から〔3〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔5〕赤血球の感作が、血漿および/または血清に存在する抗体と赤血球の抗原との間の結合を通じて生じる、前記〔1〕から〔4〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔6〕抗原が、血液型抗原である、前記〔5〕に記載の方法。
〔7〕血漿および/または血清/赤血球の混合物が、約30〜40℃で、約10秒〜数時間の間インキュベートされる、前記〔1〕から〔6〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔8〕血漿および/または血清/赤血球の混合物が、約37℃で、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約25分間または約30分間インキュベートされる、前記〔1〕から〔7〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔9〕血漿および/または血清/赤血球の混合物が、細胞混合物の液相からの細胞混合物の赤血球成分の分離を可能にする条件下でインキュベートされる、前記〔1〕から〔8〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔10〕血漿および/または血清/赤血球の混合物が、赤血球の沈降を容易にしてペレットを形成する条件下でインキュベートされる、前記〔1〕から〔9〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔11〕液相からの赤血球の分離の工程が、遠心分離の使用を必要としない、前記〔1〕から〔10〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔12〕液相からの赤血球の分離の工程が、上清を除去して、赤血球のみを残す工程、および/またはペレットにした赤血球のサンプルを取り出す工程をさらに含む、前記〔1〕から〔11〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔13〕上清が、ピペッティング、デカント、および/またはアスピレーションによって除去される、前記〔12〕に記載の方法。
〔14〕抗体に結合することができる因子と接触させる前に、赤血球を適切な緩衝液中で再懸濁する、前記〔1〕から〔13〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔15〕抗体に結合することができる因子が、
(i)1つまたは複数の抗体アイソタイプに特異性を有する、抗体またはその抗原結合フラグメント;
(ii)低分子抗体模倣物;
(iii)アプタマー;
(iv)核酸リガンド;
(v)他の細胞由来の受容体;および
(vi)使用されてもよいレクチン
からなる群から選択される、前記〔1〕から〔14〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔16〕抗体に結合することができる因子が、基板に対してまたは基板上に結合しているか、または固定されている、前記〔1〕から〔15〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔17〕基板が、官能化および/またはコーティングされた基板である、前記〔16〕に記載の方法。
〔18〕基板が、
(i)官能化ポリマー;
(ii)グリシドキシプロピルトリエトキシシラン;
(iii)ポリ−l−リジン;
(iv)アミノプロピルシラン;
(v)カルボキシシラン;
(vi)ヒドロゲル;
(vii)ポリマー−ブラシ、官能化アルキルチオールの自己組織化単分子層;
(viii)シランベースのコーティング;および
(ix)疎水性連結および目的の生物学的分子に結合する能力を有する官能基を有する、シラン化合物
からなる群から選択される1つまたは複数の化合物で官能化および/またはコーティングされている、前記〔16〕または〔17〕に記載の方法。
〔19〕抗体に結合することができる因子が、アレイとして基板に結合または固定されている、前記〔1〕から〔18〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔20〕抗体に結合することができる因子が、スポッティングまたはプリンティングによって基板に適用される、前記〔19〕に記載の方法。
〔21〕基板を、抗体に結合することができる因子を備えていない基板の領域が非特異的結合部位として作用することを防ぐためのブロッキングプロトコールに供する、前記〔16〕から〔20〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔22〕官能化および/またはコーティングされた基板が、乾燥された基板としての使用のために保管される、前記〔17〕または〔18〕に記載の方法。
〔23〕マイクロアレイフォーマットで行われる、前記〔1〕から〔22〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔24〕1つまたは複数の他の試験および/またはマイクロアレイ試験と組み合わされる、前記〔1〕から〔23〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔25〕1つまたは複数の他の試験および/またはマイクロアレイ試験が、血液型の表現型判定試験および/または血液感染性の疾患の試験からなる群から選択される、前記〔24〕に記載の方法。
〔26〕感作された赤血球と、抗体に結合する因子との間の結合を可能にする条件下でのインキュベーション後、未結合の赤血球が洗浄によって除去される、前記〔1〕から〔25〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔27〕抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出が、二次的な標識検出技術、ならびに/または蛍光、化学発光複合体化抗体および/もしくは赤血球自己蛍光の使用を含む、前記〔1〕から〔26〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔28〕抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出が、蛍光シグナルおよび/または画像生成の使用を含む、前記〔1〕から〔27〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔29〕1つまたは複数の対照の使用をさらに含む、前記〔1〕から〔28〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔30〕対照が、赤血球の添加を確認するための陽性対照を含む、前記〔29〕に記載の方法。
Claims (15)
- 血液サンプルを交差適合させる方法であって、
第1の血液サンプル由来の血漿および/または血清を用意する工程と;
前記血漿および/または血清と、第2の血液サンプル由来の赤血球とを接触させて、血漿および/または血清/赤血球の混合物を得る工程と;
前記血漿および/または血清/赤血球の混合物を、赤血球の感作を可能にする条件下でインキュベートする工程と;
前記インキュベートされた赤血球を液相から分離する工程と;
前記分離された赤血球と、抗体に結合することができる因子とを接触させる工程と
を含み、
液相からの赤血球の分離が、遠心分離なしに重力のもとで生じ、抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出は、第2の血液サンプルが、第1の血液サンプルと不適合であることを示す、方法。 - 前記血漿および/または血清が、輸血を受ける患者から得られるか、その患者によって提供されるか、またはその患者由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記赤血球が、ドナー血液から得られるか、ドナー血液によって提供されるか、またはドナー血液由来である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記血漿および/または血清/赤血球の混合物が、(i)約30〜40℃で、約10秒〜数時間の間インキュベートされる、および/または(ii)約37℃で、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約25分間または約30分間インキュベートされる、および/または(iii)細胞混合物の液相からの細胞混合物の赤血球成分の分離を可能にする条件下でインキュベートされる、および/または(iv)赤血球の沈降を容易にしてペレットを形成する条件下でインキュベートされる、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 液相からの赤血球の分離の工程が、上清を除去して、赤血球のみを残す工程、および/またはペレットにした赤血球のサンプルを取り出す工程をさらに含む、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- 上清が、ピペッティング、デカント、および/またはアスピレーションによって除去される、請求項5に記載の方法。
- 抗体に結合することができる因子が、
(i)1つまたは複数の抗体アイソタイプに特異性を有する、抗体またはその抗原結合フラグメント;
(ii)低分子抗体模倣物;
(iii)アプタマー;
(iv)核酸リガンド;
(v)他の細胞由来の受容体;および
(vi)レクチン
からなる群から選択される、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。 - 抗体に結合することができる因子が、基板に対してまたは基板上に結合しているか、または固定されており、
基板が、官能化および/またはコーティングされた基板であってもよい、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。 - 基板が、
(i)官能化ポリマー;
(ii)グリシドキシプロピルトリエトキシシラン;
(iii)ポリ−l−リジン;
(iv)アミノプロピルシラン;
(v)カルボキシシラン;
(vi)ヒドロゲル;
(vii)ポリマー−ブラシ、官能化アルキルチオールの自己組織化単分子層;
(viii)シランベースのコーティング;および
(ix)疎水性連結および目的の生物学的分子に結合する能力を有する官能基を有する、シラン化合物
からなる群から選択される1つまたは複数の化合物で官能化および/またはコーティングされている、請求項8に記載の方法。 - 抗体に結合することができる因子が、アレイとして基板に結合または固定されている、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- 抗体に結合することができる因子が、スポッティングまたはプリンティングによって基板に適用される、請求項10に記載の方法。
- マイクロアレイフォーマットで行われ、および/または、1つまたは複数の他の試験および/またはマイクロアレイ試験と組み合わされ、
前記1つまたは複数の他の試験および/またはマイクロアレイ試験が、血液型の表現型判定試験および/または血液感染性の疾患の試験からなる群から選択されてもよい、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。 - 感作された赤血球と、抗体に結合する因子との間の結合を可能にする条件下でのインキュベーション後、未結合の赤血球が洗浄によって除去される、請求項1から12までのいずれか1項に記載の方法。
- 抗体に結合することができる因子に結合した感作された赤血球の検出が、二次的な標識検出技術、および/または、蛍光化学発光複合体化抗体および/または赤血球自己蛍光、および/または、蛍光シグナルおよび/または、画像生成の使用を含む、請求項1から13までのいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたは複数の対照の使用をさらに含み、
対照が、赤血球の添加を確認するための陽性対照を含んでもよい、請求項1から14までのいずれか1項に記載の方法。
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