JP5677835B2 - 血液型抗体スクリーニング - Google Patents
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Description
様々な前記特徴的抗体と特異的に結合することが可能な多数の血液型抗原を、基板上のあらかじめ定めた位置に個別に固定したマイクロアレイを提供し、
前記マイクロアレイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、
前記結合剤を固定した基板上の1つ以上の領域から、非結合の赤血球を実質的にすべて除去し、
前記マイクロアレイに結合した抗体の存在を検出し、これにより前記特徴的抗体が被験者の血液中に存在するかどうかを判断する、ステップからなる。
Rh式 C、D、E,c、e、CW;
Kell式 K、k、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb;
Duffy式 Fya、Fyb;
Kidd式 Jka、Jkb;
Lewis式 Lea、Leb;
MNS式 M、N、S、s、Mia、U;
P式 Pl、Tja;
Lutheran式 Lua、Lub;
Wright式 Wra;
Diego式 Dia、Dib;
Colton式 Cob;
Xg式 Xga。
対象抗原を発現しているヒト赤血球を、献血および/またはドナー検査サンプルから選択した。適切なドナー血液を各3mlずつ、別々の225mlファルコンチューブにピペットで滴下し、氷で冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を200mlまで加えた。この赤血球懸濁液を、そっと混ぜ合わせ、その後3000rpmで10分間、遠心分離した。上澄みを捨て、同じプロセスを、2回はPBSを用いて、1回はバッファ310(0.1M Na2HPO4、Na2HPO4を使用してpH7.3にしたもの)を用いて、計3回繰り返した。いずれの場合も、遠心分離された赤血球ペレットを、そっと再懸濁した。ヘマトクリット値(すなわち、赤血球が占める容積のパーセンテージ)が測定された。ヘマトクリット値は、>赤血球10%であった。必要に応じて、バッファ310を用いてヘマトクリット値を10%に調整した。10%の細胞懸濁液10mlをソルヴァル(Sorval 遠心分離機)のチューブに移し、ここに氷で冷した溶解バッファ(46.5mlのバッファ310を希釈して1Lの逆浸透水(RO)にしたもの)を加えて36mlにし、そっと混ぜ合わせた。これを、速度19000rpm、温度4℃で、15分間遠心分離した。溶血した上澄みを捨て、ペレットを再懸濁し、氷で冷やした溶解バッファ36mlでもう1度洗浄した。これを再び、速度19000rpm、温度4℃で、15分間、遠心分離した。普通の容器内の5mlのPBSにペレットをそっと再懸濁し、これを氷の上に保った。こうして得た赤血球ゴースト(すなわち、空の細胞膜)を、最大出力の50%で1分間超音波処理(Status 200 超音波処理機)してフラグメント化した。
RNA源: 赤血球細胞株K562は、グリコフォリンAおよびBを発現することが知られている。グリコフォリンAは血液型抗原M/Nを、グリコフォリンBは血液型抗原S/sを、それぞれキャリーする。K562を、10%の子牛血清で強化したRPMI培地で培養した。RNeasyミニキット(Qiagen社)をメーカーの指示に従って使用し、107個の細胞を用いてトータルRNAを分離した。AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene社)を使用し、RNAの一部を用いて20μlの反応液内で、cDNAの第1ストランドを合成した。その後0.5〜2μlを使用して、グリコフォリンA(GYPA)およびB(GYPB)のコード配列をPCR増幅した。この2つのタンパク質のN端末は同一であるため、同じフォワードプライマーを使用した(SacIIGYP AB fwl)。
SacIIGYP AB fwl:
CATCGACCGCGGGCCACCATGTATGGAAAAATAATCTTTGTAT、
EcoRIGYP A r:
GTTCGTGAATTCTCATTGATCACTTGTCTCTGG、
EcoRIGYP B r:
GTTCGTGAATTCTCATGCCTTTATCAGTCGGC。
プライマー各1μl(20pmoles/μl)、
水25μl以下、
Pfu Ultra Hot Start 2x Master ミックス (Stratagene社)25μl。
95℃/30秒、
54.5℃/30秒 35サイクル、
72℃/1分、
72℃/10分 1サイクル、
4℃ ホールド。
一般材料: ウシ血清アルブミン(最低限96%電気泳動)は、Sigma−Aldrich社(ドーセット、英国)から購入した。PBSタブレット(100mlにつき1タブレット)は、Scientific Laboratory Supplies社(ノッティンガム、英国)から購入するか、Alba Bioscience自社製のPBSを使用した。
スライドの浄化: スライドを、50gNaOH/250ml96%EtOH/200mlMilliQ精製水の中で、室温で2時間、そっとシェイクしながら浄化した。
ポリ−L−リジン: 100μlのポリ−L−リジン(0.1mg/mlを10%のPBS/RO水で希釈したもの)を各ウェルにピペット滴下し、室温に一晩放置した。自動ピペット洗浄器を使用し、100μlのRO水で2回、非結合のPLL溶液を洗い流し、前記と同様に遠心分離機にかけて乾燥させた。プレートを40℃のオーブンに5分間入れた。
前記のように表面をコーティングしたスライドを基板として使用した。スポットする膜フラグメントのサンプルを、PBSまたはその他の安定液剤内に準備した。
実施例4に従って準備した各マイクロアレイを、チャンバで覆った。被験者の血液サンプルを、PBS内で1/10に希釈した。その後、450μlの抗体溶液を、チャンバの小窓の1つからピペットでマイクロアレイのスライド上に滴下し、付属のシールで小窓を密閉した。スライドをスライドボックスに入れ、室温で1時間、混ぜ合わせた。
Genepix Personal 4100A Scannerまたは同様のスキャナを用いて、スライドをスキャンした。波長設定は、Cy3/FITC用のものを使用した。すべてのスライドを、10μmの画素サイズでスキャンし、BMPおよびTIFの両ファイルに保存した。
こうして得た結果を、図1〜図12に示す。
R1R1: D+ C+ E- c- e+、
R2R2: D+ C- E+ c+ e-、
rr: D- C- E- c+ e+。
赤血球 S/s 表現型:
R1R1: S-s+
R2R2: S-s+
rr: S+s-。
IgG:直接スポットした二次抗体の陽性対照。
二次抗体の陽性対照:直接スポットした抗D(ヒトIgM)および抗c(ヒトIgM)、
二次抗体の陰性対照:直接スポットした抗S(ヒトIgG)、
R1R1、R2R2およびrr細胞からの赤血球膜フラグメントに期待される反応性:
抗E(ヒトIgM):R2R2陽性、rrおよびR1R1陰性。
なお、陽性反応のカットオフ値は2とした。
PLL/抗D: 反応パターンに一貫性が見られなかった。原液では幾分かの反応性を示し、1/10希釈では全く反応せず、1/100希釈において最良の反応性を示した;
PLL/抗E: R2R2において、非常に低いS/N値を示した;
「サンブライト(登録商標)」/抗D: 反応パターンに幾分が矛盾が見られた;
「サンブライト(登録商標)」/抗E: R2R2の1/10、1/100希釈において良好な反応性良好な反応性を示した;
pADMAC/抗D: 一貫した反応パターンを見せた。プリントしたフラグメントの希釈度が増すにつれ、S/N値は増加した。これは、非特異的なバックグラウンドシグナルが、希釈されて消失したためと考えられる;
pDADMAC/抗E*: 上記と同様の反応を示した;
*ただし、R1R1の1/100希釈、1/2000二次抗体だけは、偽陽性反応を示した。
R1R1: K-、Fy(a-)、Jk(b-)、S-s+、M-、N+、
R2R2: K+k+、Fy(a+b+)、Jk(a-)、S+s+、M+、N-、
rr: K+、Fy(a+b-)、Jk(a+b+)、S+s-、M+、N-。
1,1;1,2および7,1は、MまたはN(グリコフォリンAのクローン遺伝子を含む)と反応することが期待される:
1,2は、あまり反応しないものと考えられる;
1,1は、抗Nモノクロナール抗体とよく反応する;
7,1は、抗Mモノクロナール抗体とよく反応する;
2,3および4,3は、抗MまたはN(グリコフォリンBのクローン遺伝子を含む)と、反応しないことが期待される。ただし、両遺伝子(M/N特異性を有する)のN端末は同一であるため、何らかの交差反応は起こりうる:
特に4,3は、何らかの交差反応を示す可能性がある。
K562−陽性対照: MNSを発現する赤血球系細胞株。ただし、使用される細胞数が少ないため、スポットされる膜フラグメントの密度はかなり低い;
PBS−陰性対照: バッファ。
Claims (35)
- 血液型抗体と結合可能な血液型抗原を有する細胞膜フラグメントを固定した固体基板を含む、血液型抗原に対する抗体を検出するためのアッセイであって、前記細胞膜フラグメントは、細胞溶解により細胞ゴーストを生成し、かつ、該細胞ゴーストをフラグメント化することにより得られたものであることを特徴とする、アッセイ。
- 前記細胞ゴーストのフラグメント化が超音波処理によりなされたものである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記細胞フラグメントは、洗浄されたものである、請求項1または2に記載のアッセイ。
- 前記細胞フラグメントは、前記細胞溶解の後、かつ、前記細胞ゴーストのフラグメント化の前に洗浄されたものである、請求項3に記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントのサイズが1μm以下である、請求項1〜4のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントのサイズが0.5μm以下である、請求項5に記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントのサイズが0.1〜0.5μmの範囲である、請求項6に記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントが、A、B、c、D、E、eおよびK抗原を有する、請求項1〜7のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントが、A(A1およびA2)、B、H、C、D、E,c、e、CW、K、k、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Lea、Leb、M、N、Mia、S、s、U、Pl、Lua、Lub、Wra、Cob、Xga、Tja、Dia、Dibなど、臨床的に意義のあるすべての抗原を有する、請求項8に記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントが赤血球から作られる、請求項1〜9のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントがプロテアーゼで前処理される、請求項1〜10のいずれかに記載のアッセイ。
- 試験材料の添加を示す陽性対照をさらに含む、請求項1〜11のいずれかに記載のアッセイ。
- プローブの作成に使用したバッファおよびブロッキング剤から選択される陰性対照を含む、請求項1〜12のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記基板が、膜フラグメントを担持し、効果的に抗原を発現させるためのコーティングを備える、請求項1〜13のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記コーティングの厚みが、1μm以上である、請求項14に記載のアッセイ。
- 前記コーティングの厚みが、1〜100μmである、請求項15に記載のアッセイ。
- 前記コーティングの厚みが、5〜20μmである、請求項16に記載のアッセイ。
- 前記コーティングの材料が親水性および水溶性である、請求項14〜17のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記コーティングが、ポリエチレングリコールを含むポリマーである、請求項14〜18のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記ポリエチレングリコールを含むポリマーが、オレイル−o−ポリ(エチレングリコール)−スクシニル−N−ヒドロキシ−スクシンミジルエステルである、請求項19に記載のアッセイ。
- 前記コーティングが第4級の窒素含有塩基性ポリマーを含む、請求項14〜18のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記第4級の窒素含有塩基性ポリマーが、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムである、請求項21に記載のアッセイ。
- 前記コーティングが、ポリペプチドを含む、請求項14〜18のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記ポリペプチドが、ポリ−L−リジンである、請求項23に記載のアッセイ。
- 前記コーティングが、シランである、請求項14〜18のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記シランが、3−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランである、請求項25に記載のアッセイ。
- 前記基板が、ガラスまたはプラスチック材料で形成されたプレートまたはビーズである、請求項1〜26のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記細胞膜フラグメントが、抗原スポットアレイ内の基板上に存在する、請求項1〜27のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記基板が、マルチウェルプレートであり、各ウェル内に抗原スポットアレイが存在する、請求項28に記載のアッセイ。
- 前記スポットが、直径1mm以下である、請求項28または29に記載のアッセイ。
- 前記スポットが、直径50〜1000μmである、請求項30に記載のアッセイ。
- 前記基板の膜フラグメントが固定されていない領域は、ブロッキング剤で処理される、請求項1〜31のいずれかに記載のアッセイ。
- 血液型検査、直接抗グロブリン試験(DAT)、梅毒スクリーニング、HIVスクリーニング、HCVスクリーニング、B型肝炎スクリーニング、HTLVスクリーニング、および血小板スクリーニングから選択された検査をさらに含む、請求項1〜32のいずれかに記載のアッセイ。
- 請求項1〜33のいずれかに記載したアッセイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、非結合の赤血球を除去し、前記基板に結合した抗体の存在を検出するというステップからなる、血液型抗原に対する抗体の存在を検査するための血液サンプル検査方法。
- 血液サンプル中の臨床的に意義のある血液型抗体を検出するのに適した血液検査方法であって、
様々な前記抗体と特異的に結合することが可能な複数の血液型抗原を発現する細胞膜フラグメントを、基板上のあらかじめ定めた位置に個別に固定したマイクロアレイであって、前記細胞膜フラグメントは、細胞溶解により細胞ゴーストを生成し、かつ、該細胞ゴーストをフラグメント化することにより得られたものであるマイクロアレイを提供し、
前記マイクロアレイに、被験者から採取した血液サンプルを接触させ、
前記結合剤を固定した1つ以上の領域から、非結合の赤血球を実質的にすべて除去し、および、
前記マイクロアレイに結合した抗体の存在を検出し、
これにより、被験者の血液中に前記抗体が存在するかどうかを判断する、
というステップからなる、血液検査方法。
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