JP6697861B2 - 新規なnadph酸化酵素活性化剤及びその製造方法、並びにnadph酸化酵素の活性化方法 - Google Patents
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Description
〔1〕
下記式(1)又は(3)で表される化合物又はその塩を含む、NADPH酸化酵素活性化剤であって、
前記NADPH酸化酵素が、ヒトDUOX1又はヒトDUOX2である、剤。
(上記式(1)及び(3)中、Rは、各々独立して、水素原子、炭素原子数1〜10の置換基、アルカリ金属を示す。)
〔2〕
前記式1で表される化合物がピロロキノリンキノンジナトリウムである、〔1〕に記載の剤。
〔3〕
NADPH酸化酵素であるヒトDUOX1又はヒトDUOX2を活性化させる剤の製造のための、下記式(1)又は(3)で表される化合物又はその塩の使用。
(上記式(1)及び(3)中、Rは、各々独立して、水素原子、炭素原子数1〜10の置換基、アルカリ金属を示す。)
本実施形態のNADPH酸化酵素活性化剤は、下記式(1)、(2)、又は(3)で表される化合物又はその塩を含む。
上記式(1)中、Rが全て水素原子である化合物は、酸化型ピロロキノリンキノンという。該酸化型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩;カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
上記式(2)で表される化合物又はその塩は、ピロロキノリンキノンの誘導体である。R’で示される炭素原子数1〜10の置換基としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、エトキシ基、ケトアルキル、ヒドロキシアルキルが挙げられる。この中でも、安定性の観点から、アセチル基、ケトアルキル基が好ましい。なお、R’で示される炭素原子数1〜10の置換基は、炭素原子以外に酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。
上記式(3)中、Rが全て水素原子である化合物は、酸価型ピロロキノリンキノンが還元されてできた還元型ピロロキノリンキノンという。還元型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩;カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
ピロロキノリンキノンの製造方法としては、特に限定されないが、例えば、有機化学的に合成する方法又は発酵法が挙げられる。このなかで発酵法とは、例えば、メタノール資化性を有し、かつピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを使用して培養することによりPQQを製造する方法である。
本実施形態は、NADPH酸化酵素活性化剤の製造のための、上記化合物又はその塩の使用を含む。
(a)哺乳動物において病態が生じることを予防するステップ、具体的にはそのような哺乳動物が病態を罹患しやすいが、罹患しているとまだ診断されていない場合;
(b)病態を抑制するステップ、例えばその進行を止めるステップ;及び/又は
(c)病態を軽減するステップ、例えば病態の退行を所望の終点に至るまで生じさせるステップ、を含む哺乳動物における病態の処置を含む。治療は、疾患の症状の回復(例えば疼痛又は不快感の緩和)も含み、そのような回復は、疾患に直接効果を与える又は与えない場合がある(例えば原因、伝染、発現など)。
本実施形態のNADPH酸化酵素活性化方法は、上記式(1)、(2)、及び(3)で表される化合物又はその塩を使用する。
PQQフリー体32gを、30℃程度に加温したN,N−ジメチルホルムアミド300gに溶解させた。この溶液に炭酸カリウム30gを加え、硫酸ジメチル350gを混合すると30分後に溶液温度が50℃に上昇した。溶液温度が室温に下がったところで、炭酸カリウム30gをさらに混合した。この溶液を3日間室温で攪拌し、水1L中に得られた溶液を加え、2NHCl30gを混合した。溶液を濾過し、ろ物(PQQTME)をイソプロパノールで洗浄した。NMRの結果を以下に示す。
1H−NMR (CDCl3):3.98ppm,4.01ppm,4.18ppm,7.49ppm,8.90ppm
特開平5−70458に記載の方法を改良してモノメチルPQQを得た。具体的には、PQQTME4gをアセトニトリル400gに混合し、K2CO35.5gを含む水400g溶液をこれに加えた。その後、2日間室温で混合し、得られた溶液に濃塩酸12.5gを加え、続いてエバポレーターでアセトニトリルを除去した。溶液中に析出した固体をろ過し、減圧乾燥して4.07gの固体を得た。NMRの結果を以下に示す。得られた固体のNMRは、文献(特開平5−70458)と一致した。
1H−NMR (dmso−d6):3.87(Me)pmm,7.27pmm,8.61pmm
PQQジナトリウム塩(三菱瓦斯化学製BioPQQ)3.0gと水1.2Lとを混合して水溶液を調製した。他方、アスコルビン酸30gと水120gと2N塩酸2.5gとを混合し、温度を12℃にした。ここに水溶液を2時間かけて攪拌しながら加えた。混合終了後、20℃で18時間攪拌した。得られた溶液に2N塩酸2.5gを混合し、1時間攪拌した。その後水溶液中に析出した固体を濾過し、2N塩酸5mL,50%エタノール,水8mLで洗った。減圧乾燥を室温20時間行い、下記式(6)で表される還元型ピロロキノリンキノンの含水結晶3.35g得た。
細胞としてはヒトfibrosarcomaであるHT1080を用いた。過酸化水素の測定にはペルオキシダーゼ存在下で過酸化水素と反応し蛍光性のResorufinとなるAmplex red試薬(Life Technologies)を使用した。各遺伝子を安定的に発現する細胞株やAmplex redを用いた過酸化水素測定方法に関しては非特許文献3および4を元に実験を行った。試薬培地はナカライテスク特級を用いた。
〔実施例A1:ピロロキノリンキノンジナトリウム10μMでのNADPH酸化酵素発現細胞〕
線虫のNADPH酸化酵素であるDual Oxidaseの遺伝子BLI−3と、BLI−3と結合しその活性化に必要であるテトラスパニンをコードするtsp−15遺伝子と、Dual Oxidase 活性化蛋白質をコードするdoxa−1遺伝子を共発現させたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)にピロロキノリンキノンジナトリウム10μMを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が11.8μM発生していた,一方、これらの遺伝子群を発現していないHT1080細胞(non−trf)では、過酸化水素が2.2μM発生していた。
実施例A1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)に添加物は加えず、過酸化水素発生量を行った。その結果、過酸化水素が1.9μM発生していた。
実施例1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)にイミダゾロキノン10μMを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が2.5μM発生していた。
実施例A1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)にピロロキノリンキノンジナトリウム50μMを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が12.4μM発生していた。一方、これらの遺伝子群を発現していないHT1080細胞(non−trf)では、過酸化水素が3.4μM発生していた。
実施例A1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)に、ピロロキノリンキノンジナトリウム50μMと、NADPH酸化酵素阻害剤(DPI)とを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が0.9μM発生していた。
実施例A1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)にピロロキノリンキノン0.1〜2.5μMを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。
NADPH酸化酵素であるDual Oxidaseの遺伝子BLI−3と、BLI−3と結合しその活性化に必要であるdoxa−1遺伝子、を発現させたHT1080細胞(DOX/BLI)を用意した。HT1080細胞(DOX/BLI)にピロロキノリンキノンジナトリウム0〜50μMを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。また、比較例A3として、ピロロキノリンキノンジナトリウムを添加していない細胞の過酸化水素発生量を測定し、比較例A4として、ピロロキノリンキノンジナトリウムに代えてイミダゾロキノン0〜50μMを添加した細胞の過酸化水素発生量を測定した。その結果を図1に示す。このHT1080細胞(DOX/BLI)においても、ピロロキノリンキノンジナトリウムは過酸化水素の発生を促進することがわかった。
〔実施例B1〜4、比較例B1:時間変化の影響〕
実施例1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)を使用して、ピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度に応じた過酸化水素発生量の時間変化、及び、ピロロキノリンキノンジナトリウムとNADPH酸化酵素阻害剤(DPI)とを添加したときの過酸化水素発生量の時間変化を測定した。その結果を図2に示す。図2に示すとおり、非常に短時間で過酸化水素の発生が起こっていることがわかった。これはNADPH酸化酵素の活性をピロロキノリンキノンが直接増加させている可能性が高いことを示している。酵素の活性化方法としてはその酵素の発現量を上げる方法もあるが、本実施形態では、PQQが直接、酵素機能を上げていることがわかる。
ヒト由来のDual Oxidase1とその活性化に必要なDual Oxidase Activator 1遺伝子を発現したHT1080細胞(D1A1)を用意した。同時にDual Oxidase2と、その活性化に必要なDual Oxidase Activator 2遺伝子と、を発現したHT1080細胞(D2A2)も用意した。HT1080細胞(D1A1)及びHT1080細胞(D2A2)それぞれに対して、ピロロキノリンキノン0〜50μMを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。また、ピロロキノリンキノン又はイミダゾロキノンと、NADPH酸化酵素阻害剤(DPI)とを添加した細胞の過酸化水素発生量、及び、ピロロキノリンキノンに代えてイミダゾロキノン0〜50μMを添加した細胞の過酸化水素発生量を測定した。その結果を図3に示す。この結果からもわかるように、ピロロキノリンキノンは濃度依存的に過酸化水素を発生させており、ヒトの遺伝子でもNADPH酸化酵素を活性化させていることがわかる。
実施例1で用いたHT1080細胞(TSP/DOX/BLI)を使用して、ピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度に応じた過酸化水素発生量の時間変化、及び、ピロロキノリンキノンジナトリウムとタンパク質合成阻害剤(シクロヘキシミド、CHX)10μg/mlを添加したときの過酸化水素発生量の時間変化を測定した。その結果を図4に示す。図4に示すとおり、タンパク質合成阻害剤により過酸化水素産生促進は阻害されないことから、ピロロキノリンジナトリウムは新規タンパク合成を促進しているのではないことが示唆される。
〔実施例E1−3、比較例E1−2:PQQ誘導体によるNADPH酸化酵素の活性化〕
実施例1で用いたBLI−3の細胞(TSP/DOX/BLI)にPQQ誘導体10μM又はアスコルビン酸若しくはイミダゾロキノン(IPQ)10μMを添加して、過酸化水素発生量を測定した結果を表1に示す。表1に示すとおり、PQQ誘導体においてもNADPH酸化酵素の活性化が認められた。
Claims (3)
- 下記式(1)又は(3)で表される化合物又はその塩を含む、NADPH酸化酵素活性化剤であって、
前記NADPH酸化酵素が、ヒトDUOX1又はヒトDUOX2である、剤。
(上記式(1)及び(3)中、Rは、各々独立して、水素原子、炭素原子数1〜10の置換基、アルカリ金属を示す。) - 前記式1で表される化合物がピロロキノリンキノンジナトリウムである、請求項1に記載の剤。
- NADPH酸化酵素であるヒトDUOX1又はヒトDUOX2を活性化させる剤の製造のための、下記式(1)又は(3)で表される化合物又はその塩の使用。
(上記式(1)及び(3)中、Rは、各々独立して、水素原子、炭素原子数1〜10の置換基、アルカリ金属を示す。)
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