JP2021533083A

JP2021533083A - 新規置換ｎ９−アデニン誘導体、これを含有する医薬組成物、およびその使用

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Publication number: JP2021533083A
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Abstract

本発明は、ＡＭＰＫ活性化が重要な役割を果たす障害および疾患の治療薬の生産に好適である、新規の置換Ｎ９−アデニン誘導体、これらの誘導体を含有する医薬組成物、ならびにこの新規誘導体およびＡＭＰＫ活性化剤としてこれを含有する医薬組成物の使用を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、新規の置換Ｎ９−アデニン誘導体、これらの誘導体を含有する医薬組成物、ならびにこの新規誘導体の使用およびＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）活性化剤としてこれを含有する医薬組成物の使用に関する。したがって、本発明の誘導体、およびこれを含有する組成物は、ＡＭＰＫ活性化が重要な役割を果たす障害および疾患の治療を目的とする薬剤の製造に好適である。

エネルギーを消費する細胞プロセスの大部分は、ＡＴＰをＡＤＰに変換することによって推進される。ストレスを受けてこの関係性が低下すると、例えば運動中、虚血時、また糖尿病など、血液中にグルコースがあるにもかかわらず細胞内に取り込まれないために細胞のエネルギーが不足すると、ＡＭＰの細胞内含有量が増加し、ＡＭＰＫが活性化される。ＡＭＰＫは一旦活性化されると、多数のタンパク質をリン酸化して、高分子生合成、細胞成長および増殖といった特定のエネルギー消費同化経路の非活性化を引き起こすと同時に、解糖や脂肪酸酸化などのＡＴＰ産生経路を活性化する。これは、対応する経路の調節に直接関与する酵素のリン酸化を介する、または細胞の遺伝子発現の調節を介することで可能となる（非特許文献１）。

ＡＭＰＫ活性化は細胞内のさまざまなプロセスを調節できる。特に代謝水準において、中でも脂肪酸、グルコース、およびタンパク質合成の代謝に作用する。脂肪酸の代謝水準では、ＡＭＰＫは脂質の酸化を増加させ、そのデノボ合成を抑制することによって介入する。ＡＭＰＫは、β酸化に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写に関与するＰＰＡＲ−αのレベルを増加させるため、脂質酸化の増加は部分的に生じる（非特許文献２）。同様に、ＡＭＰＫがＰＰＡＲ−αを直接リン酸化できることが報告されているものの、このリン酸化の生理的関連性はわかっていない。またＡＭＰＫは、翻訳と翻訳後の両方のレベルで脂肪酸および脂質のデノボ合成を抑制することによっても作用する。つまり、転写因子ＳＲＥＢＰとＣｈＲＥＢＰの調節により、脂肪形成に関与する酵素の合成を減少させることによって作用する（非特許文献３）。また、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳＮ）にも直接作用できる。Ｓｅｒ７７およびＳｅｒ７９でＡＣＣ１を、Ｓｅｒ２１９およびＳｅｒ２２１でＡＣＣ２をリン酸化し、また場合によってはこれらを抑制することによってＦＡＳＮをリン酸化する（非特許文献４）。こうして脂肪形成が減少し、さらにβ−酸化が増加する。グルコース代謝のレベルで、ＡＭＰＫは解糖の増加および糖新生の抑制によって作用する。例えば、Ｇｌｕｔ−４の転写に関与するＧＥＦに作用することによって解糖を調節することが報告されている。ＡＭＰＫはＧｌｕｔ−４プロモーターに対する親和性を高め、その転写レベルを向上させるという方法でＧＥＦをリン酸化する（非特許文献５〜７）。同様にＡＭＰＫは、転写因子ＰＧＣ１αを主要なエフェクターとするミトコンドリア代謝も調節する。ＡＭＰＫは、酸化的リン酸化およびミトコンドリア新生に関与する遺伝子の転写に関与するこの転写因子を直接リン酸化し、活性化する。

周知の抗糖尿病薬の間接的な標的としてＡＭＰＫが同定され、近年、より効果的で特異的なＡＭＰＫ活性化剤の開発が増加している。

そのため、多くの研究で新たなＡＭＰＫ活性化剤の探索が行われており、ＡＭＰＫの間接的な活性化剤とみなされる薬剤、つまりミトコンドリアＡＴＰの生成を阻害し、細胞内のＡＭＰ：ＡＴＰ比を変化させることで代謝障害の治療に影響を及ぼす薬剤について説明されている（非特許文献８）。例えば、ビグアナイド誘導体（例えばメトホルミン）、チアゾリジンジオン、および植物性化学物質などである。ＡＭＰＫホロ酵素の３種類のサブユニット（α、β、γ）に直接結合する直接活性化剤も研究されている。

例えば特許文献１は、直接ＡＭＰＫ活性化剤としてチエノピリドン誘導体について、特にアロステリック機構を介し、トレオニンにおける脱リン酸化を阻害することによりＡＭＰＫを活性化するステップについて記載している。この場合、誘導体で処理したマウスで観察されたグルコースおよび脂質の代謝への影響は、主に肝臓でＡＭＰＫを刺激することによってもたらされた。

特許文献２は化合物５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）をＡＭＰＫの活性化剤として記載している。これはアデノシンキナーゼ（ＡＫ）によって代謝され、ＡＭＰ類似体であるＺＭＰになる。ＺＭＰはＡＭＰＫγサブユニットに結合し、ＡＭＰＫキナーゼのアロステリック活性化に対するＡＭＰの作用を模倣し、動物モデルにおいて抗糖尿病作用を有する。しかしながら、ＡＩＣＡＲはバイオアベイラビリティが低く、また主に消化管吸収が低いうえに、ＡＭＰＫに対して活性を持たない多数の代謝産物に急速に変換されることから、効果的な投与には高用量を静脈内投与する必要がある。

上述したＡＭＰＫの間接的な活性化剤、つまりビグアナイド誘導体である既知の活性成分メトホルミンの場合、投与の際に高用量の活性成分が使用され、乳酸アシドーシスなどの望ましくない副作用が生じる。

こうしたことから、特に、ＡＭＰＫγサブユニットのタンデムにおけるＢａｔｅｍａｎドメインのアゴニスト（２つのＣＢＳ［シスタチオンβ合成酵素］モチーフによって形成された構造）として、加齢に伴う腫瘍性病態、神経変性病態、または代謝病態などＡＭＰＫ活性化関連障害の治療または予防において有用な新たなＡＭＰＫ活性化剤がなおも求められている。

米国特許出願公開第２００６／０２８７３５６号明細書国際公開第２０１０／１０３０４０号

Ｓ．Ｆｒａｇｏｓｏｅｔａｌ．，"ＡＭＰＫＡＮＤＥＮＥＲＧＹＨＯＭＥＯＳＴＡＳＩＳ"，ＲＥＢ，２００８,２７（１）：３−８ＢａｒｉｓｈＧＤ，ｅｔａｌ．，"ＰＰＡＲｄｅｌｔａ：ａｄａｇｇｅｒｉｎｔｈｅｈｅａｒｔｏｆｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ"，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２００６，１１６：５９０−７ＫａｗａｇｕｃｈｉＴ，ｅｔａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｆａｔｔｙａｃｉｄ "ｓｐａｒｉｎｇ" ｅｆｆｅｃｔｏｎｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｂｙＡＭＰａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ"，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２，２７７：３８２９−３５ＡｎＺ，ｅｔａｌ．，"Ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｓｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅｉｎ３Ｔ３Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：ａｒｏｌｅｆｏｒｏｘｉｄａｎｔｓｔｒｅｓｓ"，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００７，２８２：２６７９３−８０１ＨｏｌｍｅｓＢＦ，ｅｔａｌ．，"ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｓｃｌｅＧＬＵＴ４ｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒａｎｄｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２ｂｙＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ"，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，２８９：Ｅ１０７１−６ＳｃｒｅａｔｏｎＲＡ，ｅｔａｌ．，"ＴｈｅＣＲＥＢｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒＴＯＲＣ２ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｃａｌｃｉｕｍ− ａｎｄｃＡＭＰｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ"，Ｃｅｌｌ，２００４，１１９：６１−７４ＪｏｒｇｅｎｓｅｎＳＢ，ｅｔａｌ．，"ＲｏｌｅｏｆＡＭＰＫａｌｐｈａ２ｉｎｂａｓａｌ，ｔｒａｉｎｉｎｇ−，ａｎｄＡＩＣＡＲ−ｉｎｄｕｃｅｄＧＬＵＴ４ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅＩＩ，ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｍｕｓｃｌｅ"，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００７，２９２：Ｅ３３１−９ＨａｗｌｅｙＳＡ，ｅｔａｌ．，"ＵｓｅｏｆｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇａｍｍａｓｕｂｕｎｉｔｖａｒｉａｎｔｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｄｉｖｅｒｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＡＭＰＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎ"，ＣｅｌｌＭｅｔａｂ，２０１０；１１（６）：５５４−６５Ｗｕ，ＣＬｅｔａｌ．，"ＲｏｌｅｏｆＡＭＰＫｉｎＵＶＢ−ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡｄａｍａｇｅｒｅｐａｉｒａｎｄｇｒｏｗｔｈｃｏｎｔｒｏｌ"，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１３，３２，２６８２−９Ｙｕｅ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，"Ｃｏｐｐｅｒ−ｃａｔａｌｙｚｅｄｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓｗｉｔｈａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃａｃｉｄｓ：ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｃｃｅｓｓｔｏＮ−ａｒｙｌｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ"，ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，２００５，５１５４−５１５７Ｍｏｒｅｌｌａｔｏ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｎｏｖｅｌ９−ａｒｙｌａｎｄｈｅｔｅｒｏａｒｙｌｐｕｒｉｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｖｉａｃｏｐｐｅｒｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｕｐｌｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ"，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ，２０１４

本発明の化合物は、γサブユニットのヌクレオチド結合部位に結合するＡＭＰ模倣物として設計される。ＡＭＰＫはグルコースおよびグリコーゲンの代謝、ならびに脂質およびコレステロールの生合成に影響を与える多くの下流標的を有する。このためこれらの化合物は、高コレステロール血症、肥満、２型糖尿病、またはメタボリックシンドローム（シンドロームＸとも呼ばれる）といった代謝疾患の治療および／または予防の有力な候補となっている。したがって本発明の化合物は、低い有効量で、つまり技術水準から既知であるＡＩＣＡＲ誘導体またはビグアナイド誘導体のＥＣ_５０（半数効果濃度）よりもはるかに低いＥＣ_５０で、この種の障害を治療および／または予防するのに特に適している。

第１の態様に従って、本発明は次の一般式（Ｉ）のＡＭＰＫ活性化剤であるアデニンＮ９−［アリール、ヘテロアリール］ホスホン酸誘導体に関する：

上式で、
・Ｒが、５もしくは６員環アリール基または５もしくは６員環ヘテロアリール基であり、アリールまたはヘテロアリールが、その自由位置で、ジュウテリウム、ハロゲン原子、−ＯＨ、−ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、−ＣＯＨから選択される、１つまたは複数の、同一または異なる置換基で置換されている可能性があり、
・Ｒ_１およびＲ_２が、Ｈ、直鎖もしくは分岐の（Ｃ１−２２）アルキル基、（Ｃ２−２２）アルケニル基、（Ｃ２−２２）アルキニル基、（Ｃ３−７）シクロアルキル基、（Ｃ３−２２）−ＣＯＯＨアルキル基、（Ｃ５−６）−ＣＯＯＨアリール基、アミノ酸、好ましくはアラニン基、セリン基もしくはアルギニン基、グリセロール基、コリン基、もしくはスフィンゴミエリン基から互いに独立して選択される；またはこれらが、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属カチオン、特にナトリウムもしくはマグネシウムから互いに独立して選択され、かつ遷移金属カチオンもしくは任意の許容可能なカチオンであることもでき、
かつこのとき：
− 「アリール基」が５または６員環芳香族炭化水素基であり、アリールが、ハロゲン原子、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびシクロプロピル、ジュウテリウムおよびヒドロキシルからなる群から独立して選択される、同一または異なる置換基で、非置換または一置換または多置換されている可能性があり、
− 「ヘテロアリール基」が、少なくとも１つの環炭素がＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、またはＳｅで置き換えられている５または６員環芳香族炭化水素基であり、
− ホスホニル基

が、例えば６員ヘテロアリールの場合、アデニンに対してオルト位、メタ位、またはパラ位で、別の置換基で置換されていないアリールまたはヘテロアリール環の任意の炭素原子と結合することができる。

本発明の文脈において、用語アルキル（Ｃ１−２２）基、アルケニル（Ｃ２−２２）基、またはアルキニル（Ｃ２−２２）基は、１〜２２個、または場合によっては２〜２２個の炭素原子の脂肪族炭化水素基であり、アルケニルまたはアルキニルの場合、それぞれ少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合またはＣ≡Ｃ結合を含むと理解される。

式（Ｉ）の好ましい化合物は、Ｒが、以下の式（Ｉａ〜ｄ）の、フェニルまたはシクロペンタジエニルから選択されるアリール基であり、Ｒ_１およびＲ_２が上記で定義するとおりである：

Ｒが、以下の式（Ｉｅ〜ｐ）の、ピリジン、ピリミジン、ピロリル、ピラゾリル、ピラニル、フラニル、チオフェニル、ホスホロイル（ｐｈｏｓｐｈｏｌｏｙｌ）、またはセレノフェニルから選択されるヘテロアリール基であり、Ｒ_１およびＲ_２が上記で定義するとおりである式（Ｉ）の化合物も同様に好ましい：

本発明の化合物のうち特に好ましいのは、Ｎ９−フェニル−３−ホスホニル−アデニン、つまりＲ_１およびＲ_２がともに水素である化合物（Ｉａ）の特定の例であり、Ｎ９−（２−フラニル）−５−ホスホニル−アデニン、つまりＲ_１およびＲ_２がともに水素である化合物（Ｉｌ）および（Ｉｍ）の特定の例であり、Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニン、つまりＲ_１およびＲ_２がともにエチル基である化合物（Ｉａ）の特定の例である。

また本発明は、治療有効量の上述の化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含有する医薬組成物に関し、さらに、ＡＭＰＫ活性化が重要な役割を果たす障害および疾患、例えば、高コレステロール血症、肥満、２型糖尿病、もしくはメタボリックシンドローム（シンドロームＸとも呼ばれる）などの代謝疾患の治療ならびに／または予防に、筋骨格機能、内分泌機能、細胞恒常性、環境ストレスに対する適応に、ならびにＡＭＰＫホロ酵素活性化によって管理および／または逆行させることができる皮膚科病態の治療または予防に有用な薬剤の生産のための該医薬組成物の使用にも関する。

本発明による医薬組成物のうち、特に言及されるのは、経口、非経口、筋肉内および静脈内、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経鼻、直腸、舌下、点眼、呼吸器投与に好適な医薬品、より具体的には、単純な錠剤、舌下錠（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌｔａｂｌｅｔまたはｐｅｒｌｉｎｇｕａｌｔａｂｌｅｔ）、硬カプセル、カプセル、トローチ、注射、噴霧剤、座薬、皮膚クリーム、軟膏、またはゲルの形態の医薬品である。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は経口投与される。

本発明による医薬組成物は、本発明の化合物に加えて、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、防腐剤、吸収剤、着色剤、甘味料、香料などから選択される１つまたは複数の賦形剤または担体を含有し、これらの賦形剤は、医薬組成物の最終的な剤形に基づいて選択される。

非限定的な例として、以下が挙げられる：
− 希釈剤として：乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、グリセリン；
− 潤滑剤として：シリカ、タルク、ステアリン酸ならびにそのマグネシウム塩およびカルシウム塩、ポリエチレングリコール；
− 結合剤として：ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン；
− 崩壊剤として：寒天、アルギン酸およびそのナトリウム塩、発泡性混合物；
− 可溶化剤として：シクロデキストリン、ポリビニルカプロラクタム、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレングリコール。

有用な投与量は、患者の性別、年齢、体重、投与経路、障害の性質、および任意の関連治療によって異なり、１日１回または複数回用量として、治療対象の体重１ｋｇ当たり本発明による化合物１μｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜３００ｍｇである。

本発明の文脈において、治療対象はヒトまたは哺乳動物である。

例えば、Ｒがフェニル基であり、Ｒ_１およびＲ_２がともにエチル基である化合物（Ｉ）の特定の例であるアデニン誘導体Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンを含む本発明による医薬組成物の場合、本発明の該化合物は、経口投与用に適切な賦形剤とともに圧縮して錠剤化またはカプセルに充した特定の形態で、前述の用量で投与され、本発明の化合物が、胃の酸性ｐＨで酸加水分解により放出され、さらにプロドラッグにより吸収され、エステラーゼ酵素を介して細胞内で、小腸では細胞外で、またわずかではあるが、生理学的水性媒体中で加水分解によって活性化される。

軟膏の形態で局所投与するための、例えばＡＭＰＫホロ酵素活性化によって管理および／または逆行させることができる皮膚科病態を治療するための医薬組成物の別の実施例において、本発明の化合物は、軟膏１ｇ当たり０．１ｍｇから２．０ｍｇの重量濃度で該医薬組成物に含まれ、医薬組成物は、好適な賦形剤として、セチルアルコール、蒸留水、ステアリン酸グリセロール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、およびアスコルビン酸ナトリウムを含む。局所投与用医薬組成物の別の実施例において、本発明の化合物は、ポリエチレングリコール３００、１５００、および４０００、ならびにアスコルビン酸ナトリウムの混合物に溶解することになる。

本発明において、ＡＭＰＫホロ酵素活性化によって管理および／または逆行させることができる皮膚科病態として検討されるものに、例えば色素性乾皮症、ならびにメラノーマおよび基底細胞がんを含むがこれらに限定されない皮膚がんがある（非特許文献９）。

実施例
以下の実施例において、式（Ｉ）の化合物、特にＮ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンの好ましい実施形態の一例の合成手順について記述し、本発明をさらに説明していくが、これは本発明を限定するものと解釈してはならない。この式（Ｉ）の化合物の特定の例において、Ｒがフェニル基であり、Ｒ_１およびＲ_２がともにエチル基である。

式（Ｉ）の化合物の一般的な合成
一般的な合成機構は、非特許文献１０に記載されるように、中性アデニンとハロアリールボロン酸、例えば３−ブロモフェニルボロン酸または４−ブロモフェニルボロン酸の間で化学量論量の銅（ＩＩ）塩によって媒介されるＣｈａｎ−Ｌａｍカップリングによって制御される。カラムクロマトグラフィー精製によりカップリング生成物、例えば９−（３−ブロモフェニル）アデニンおよび９−（４−ブロモフェニル）アデニンを得るために、ジアルキルホスフィンを、根岸カップリングに類似した条件下で、触媒としてテトラキス（トリフェニルホスフィン（ｔｒｉｆｅｆｉｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ））−パラジウム（０）、塩基としてトリエチルアミン、および溶媒として無水ジメチルホルムアミドを用いてカップリングさせる。その後で、ホスホン酸塩の２つのエステル結合を、塩酸水溶液を用いて酸性媒体中で加水分解させて、対応するホスホン酸誘導体を得た後、続いて、塩、例えば二ナトリウムに変換し、水性媒体中で水酸化ナトリウムと反応させることができる。

別法として、非特許文献１１に記載されるように、６−クロロプリンおよび対応するハロヘテロアリールボロン酸を、非ベンジル型ヘテロアリール誘導体を生成するために使用する基礎とし、次いで、所望のジアルキルホスフィンを、根岸カップリングに類似した条件下で、触媒としてテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）、塩基としてトリエチルアミン、および溶媒として無水ジメチルホルムアミドを用いてカップリングさせる。

Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンの合成

化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは以下の２ステップ工程に従ってアデニンから得る：
ステップ１：３−ブロモフェニル−Ｎ９−アデニン
このステップは非特許文献１０を適用する。

簡潔に説明すると、５ｍｍｏｌのアデニンを、５ｍｍｏｌの酢酸銅（ＩＩ）一水和物、１０ｍｍｏｌのＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチルエンジアミン、および１０ｍｍｏｌの３−ブロモフェニルホウ酸を含有する５００ｍＬのメタノール：水（４：１）混合液に添加した。混合液は１Ｌフラスコで室温、空気雰囲気下で１時間攪拌した。フラスコ内の溶液にメタノールを添加し、混合液をセライトでろ過したのち、溶媒を蒸発させた。得られた固形物は、シリカゲルを用い、溶離液としてＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（２０：１）およびＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（１０：１）を添加してフラッシュクロマトグラフィーで精製した。ｒ＝０．２５の表題生成物を白色結晶性固体として得た。収率５０％。純度＞９８％。

ステップ２：Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニン
２ｍｍｏｌの３−ブロモフェニル−Ｎ９−アデニン、３ｍｍｏｌのトリエチルアミン、０．１ｍｍｏｌのテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）、および３ｍｍｏｌの亜リン酸ジエチルを５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。次いで、１０ｍＬの無水ジメチルホルムアミドを添加し、混合液を１００℃で１時間攪拌した。ジメチルホルムアミドを蒸発させ、得られた固形物を、シリカゲルと溶離液としてＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（１０：１）を用いてクロマトグラフィーで精製した。ｒ＝０．２０の所望の生成物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンを白色／ベージュ結晶性固体として得た。収率９０％。純度＞９８％。融点１０４℃。

分光分析：
ＩＲ（ＫＢｒ）、ｃｍ^−１：３２９７ｍｓ、３１０２ｍｓ、１６７６ｓ、１５９９ｓ、１４８７ｍｓ、１３０７ｓ、１０５０ｍｓ、１０２２ｓ、６５６ｍ、５６２ｍ（ｍｓ＝中強、ｓ＝強、ｍ＝中）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝８．６７ｓ（１Ｈ、Ｈ８_アデニン）、８．３０ｄｄ（１Ｈ、Ｈ１、Ｊ_ＰＨ＝１６．６Ｈｚ、Ｊ_ｍ＝１．２Ｈｚ）、８．２３ｓ（１Ｈ２_ａｄｅＣＨ）、８．１７−８．１４ｍ（１Ｈ、Ｈ２）、７．７９−７．７５ｍ（２Ｈ、Ｈ３＋Ｈ４）、７．４３ｂｓ（２Ｈ、ＮＨ２）、４．０８ｄｑ（４Ｈ、ＣＨ２、ＪＰ−Ｈ＝１５．３Ｈｚ、ＪＨ−Ｈ＝７．２Ｈｚ）、１．２９−１．２５ｔ（６ＨＣＨ３、ＪＨ−Ｈ＝７．２Ｈｚ）ｐｐｍ．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋［Ｃ_１５Ｈ_１８Ｎ_５ＰＯ_３＋Ｈ］^＋：計算ｍ／ｚ＝３４８．１２１８；測定ｍ／ｚ＝３４８．１２２０。

ＡＭＰＫ活性化アッセイ
マウス筋芽細胞腫細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のＣ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートの２００μＬの増殖培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトアビジン）に１０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞はコンフルエンスまで増殖させ、アッセイの日に、１００μＬの増殖培地で関心の化合物とともにインキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２で１〜２４時間インキュベートした。全条件を４回くり返して試験した。化合物は、さまざまな濃度の滅菌無水ジメチルスルホキシドに加えて溶解した。ＡＭＰＫ活性化の陽性対照として、終濃度が１００μＬのアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）溶液を用いた。対応する回数の後、培地を除去し、室温でＰＢＳを用いて細胞を慎重に３回洗浄し、ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ社）を用いてリン酸化α−ＡＭＰＫ：総α−ＡＭＰＫの比を定量化した。メーカーの指示に従い、ＬｉｃｏｒＯｄｉｓｓｅｙ（登録商標）スキャナーを用いて信号を定量化した。４時間インキュベートした後、化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは、３０ナノモルという低濃度でＡＭＰ陽性対照よりも高いＡＭＰＫ活性を示した。

具体的には、化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは、４時間インキュベートした後、３０ナノモルという低濃度でＡＭＰ陽性対照を用いて得られる活性の５００％よりも高いＡＭＰＫ活性を示した。ＥＣ５０が１マイクロモル未満で、ＡＭＰ対照に対する活性化が８０％超であるこれらの化合物は、所望の活性化合物と考えられる。上述の基準に従ってＡＭＰＫ活性化剤として選択される化合物を、グルコース消費試験およびＭＴＴ細胞生存試験に用いる。

グルコース消費試験
マウス筋芽細胞腫細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のＣ２Ｃ１２細胞を、照度計の使用に対応したホワイト９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞は２００μＬ／ウェルの増殖培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトアビジン）で３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで５日間増殖させた。培地は２日ごとに交換した。その後、培地を分化培地（低グルコースＤＭＥＭ、２％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペニシリン、およびストレプトアビジン）に交換し、３日間にわたって細胞を筋管に分化させた。培地は毎日交換した。試験の前日に細胞を血清飢餓状態にした（低グルコースＤＭＥＭ、ペニシリン、およびストレプトアビジン）。次いで、培地を、グルコースを含まないＤＭＥＭ培地に交換し、化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンをさまざまな濃度で１時間インキュベートし、各条件を４回くり返した。陽性対照は１００ナノモルのヒトインスリン溶液（Ｓｉｇｍａ）であった。Ｐｒｏｍｅｇａのグルコース消費キットをメーカーの指示に従って使用した。キットは、グルコースの化学的類似体である２−デオキシグルコースの細胞内取り込みに基づき、ルシフェリン・ルシフェラーゼ（発光酵素）アッセイと組み合わせたもので、得られた結果が該グルコース類似体の細胞内濃度に比例するという事実に関連する。

ＢｉｏｔｅｋＭＸ発光プレートリーダーで総発光を測定した。化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは、３０ナノモルという低濃度でインスリン対照と比べて同等以上のグルコース消費活性を示した。Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンに対する対照の輝度（％）（３０ナノモル）：１２５±９％。

ＭＴＴ細胞生存／増殖アッセイ
ＭＴＴレドックスアッセイは、ミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼによって生成される３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾール（ＭＴＴ）の臭化物の代謝還元に基づき、ホルマザン色素（青色）の呈色により、処理した細胞のミトコンドリア機能を決定できる。

Ｃ２Ｃ１２細胞を、照度計の使用に対応したホワイト９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞は２００μＬ／ウェルの増殖培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトアビジン）で５日間増殖させ、培地は２日ごとに交換した。その後、培地を分化培地（低グルコースＤＭＥＭ、２％ＮＨＳ、ペニシリン、およびストレプトアビジン）に交換し、３日間にわたって細胞を筋管に分化させ、培地は毎日交換した。すべての工程において、細胞は細胞インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは血清を含まない低グルコースＤＭＥＭで２４時間および４８時間インキュベートした。インキュベートした化合物の濃度は１０ナノモルから１ミリモルの範囲であった。ＡＭＰ活性化の陽性対照として、終濃度が１００μＬのＡＭＰ溶液を用いた。インキュベーション後、１０μＬのＭＴＴ試薬（Ａｂｃａｍ社）を各ウェルに添加し、インキュベーションの３０分後、４５分後、および６０分後に、４９０ｎｍの吸光度をＢｉｏｔｅｋＭＸ発光プレートリーダーを用いて光度計で測定した。読み取りは、細胞の酸化還元酵素に依存するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酵素の間接的な測定となる。

化合物Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンは、ナノモル濃度で、対照と比べて有意に高い信号を示した。Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンに対する対照の輝度（％）（３０ナノモル、４８時間インキュベーション）：１５７±５％。

本発明による医薬組成物の例
ヒト成人を対象として１日経口用量で薬剤を処方するための医薬組成物の一例に、本発明による化合物２０ｍｇを賦形剤（微結晶性セルロース、カルボキシメチルスターチナトリウムのタイプＡ（ジャガイモ由来）、無水コロイドシリカ、およびステアリン酸マグネシウム）とともに圧縮粒子形態にしたものがある。

Claims

次の一般式（Ｉ）を有するＡＭＰＫ活性化剤である置換Ｎ９−アデニン誘導体であって：

上式で、
・Ｒが、５もしくは６員環アリール基または５もしくは６員環ヘテロアリール基であり、アリールまたはヘテロアリールが、その自由位置で、ジュウテリウム、ハロゲン原子、−ＯＨ、−ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、−ＣＯＨから選択される、１つまたは複数の、同一または異なる置換基で置換されている可能性があり、
・Ｒ_１およびＲ_２が、Ｈ、直鎖もしくは分岐の（Ｃ１−２２）アルキル基、（Ｃ２−２２）アルケニル基、（Ｃ２−２２）アルキニル基、（Ｃ３−７）シクロアルキル基、（Ｃ３−２２）−ＣＯＯＨアルキル基、（Ｃ５−６）−ＣＯＯＨアリール基、カチオン性アミノ酸、好ましくはアラニン基、セリン基もしくはアルギニン基、グリセロール基、コリン基、もしくはスフィンゴミエリン基から互いに独立して選択される；またはこれらが、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属カチオン、特にナトリウムもしくはマグネシウムから互いに独立して選択され、かつ遷移金属カチオンもしくは任意の許容可能なカチオンであることもでき、
このとき以下のように理解される：
− 「アリール基」が５または６員環芳香族炭化水素基であり、アリールが、ハロゲン原子、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびシクロプロピル、ジュウテリウムおよびヒドロキシルからなる群から独立して選択される、同一または異なる置換基で、非置換または一置換または多置換されている可能性があり、
− 「ヘテロアリール基」が、少なくとも１つの環炭素がＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、またはＳｅで置き換えられている５または６員環芳香族炭化水素基であり、
− ホスホニル基

が、別の置換基で置換されていないアリールまたはヘテロアリール環の任意の炭素原子と結合することができる置換Ｎ９−アデニン誘導体。
Ｒが、以下の式（Ｉａ〜ｄ）の、フェニルまたはシクロペンタジエニルから選択されるアリール基であり、Ｒ_１およびＲ_２が請求項１に定義するとおりである、請求項１に記載の置換Ｎ９−アデニン誘導体。
Ｒが、以下の式（Ｉｅ〜ｐ）の、ピリジン、ピリミジン、ピロリル、ピラゾリル、ピラニル、フラニル、チオフェニル、ホスホロイル、またはセレノフェニルから選択されるヘテロアリール基であり、Ｒ_１およびＲ_２が請求項１に定義するとおりである、請求項１に記載の置換Ｎ９−アデニン誘導体。
Ｎ９−フェニル−３−ホスホニル−アデニンである、請求項１または２に記載の置換Ｎ９−アデニン誘導体。
Ｎ９−（３−ジエチルホスホニル）フェニル−アデニンである、請求項１または２に記載の置換Ｎ９−アデニン誘導体。
Ｎ９−（２−フラニル）−５−ホスホニル−アデニンである、請求項１または３に記載の置換Ｎ９−アデニン誘導体。
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含有する医薬組成物。
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物が、治療対象の体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１，０００ｍｇの有効投与量で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物が、体重１ｋｇ当たり１〜３００ｍｇの有効投与量で存在する、請求項８に記載の医薬組成物。
ＡＭＰＫ活性化薬の製造に使用するための、請求項７〜９のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
高コレステロール血症、肥満、２型糖尿病、もしくはメタボリックシンドロームなどの代謝疾患から選択される障害および疾患の治療ならびに／または予防のため、筋骨格機能、内分泌機能、細胞恒常性、環境ストレスに対する適応のため、ならびにＡＭＰＫホロ酵素活性化によって管理および／または逆行させることができる皮膚科病態の治療または予防のための薬剤の製造に使用する、請求項１０に記載の医薬組成物。