ES2933904T3

ES2933904T3 - Nuevos derivados de adenina N9 sustituidos, composiciones farmacéuticas que los contienen y utilización de las mismas

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Publication number: ES2933904T3
Application number: ES18923938T
Authority: ES
Inventors: Oliver Iván Silió
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2023-02-14
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: WO2020002718A1; CN112272668B; US20210260081A1; CN112272668A; JP7196202B2; EP3816165B1; AR114879A1; US11992498B2; EP3816165A4; EP3816165A1; JP2021533083A

Abstract

La invención proporciona nuevos derivados de adenina N9 sustituidos, composiciones farmacéuticas que incluyen estos derivados y el uso de los nuevos derivados y de las composiciones farmacéuticas que los contienen como activadores de AMPK, siendo adecuados para la producción de medicamentos destinados al tratamiento de trastornos y enfermedades donde la activación de la AMPK juega un papel relevante.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos derivados de adenina N9 sustituidos, composiciones farmacéuticas que los contienen y utilización de las mismas

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a nuevos derivados de adenina N9 sustituidos, a composiciones farmacéuticas que incluyen estos derivados y los nuevos derivados y las composiciones farmacéuticas que los contienen para su uso como activadores de AMPK (AMP Activated Protein Kinase - Proteína Quinasa activada por Adenosina Monofosfato). Así, los derivados de la invención y las composiciones que los contienen son adecuadas para la producción de medicamentos destinados al tratamiento de trastornos y enfermedades donde la activación de la AMPK juega un papel relevante.

Antecedentes de la invención

La mayoría de los procesos celulares que consumen energía lo hacen impulsados por el paso de ATP a ADP. Cuando algún estrés hace que esta relación disminuya, aumenta el contenido intracelular de AMP lo que activa a la AMPK, por ejemplo durante el ejercicio, la isquemia y también en la diabetes, donde, a pesar de haber glucosa en la sangre, ésta no puede entrar a la célula y, por tanto, la célula resiente la falta de energía. Una vez activada, la AMPK fosforila un gran número de proteínas provocando el apagamiento de ciertas vías anabólicas que consumen energía, como la biosíntesis de macromoléculas, crecimiento y proliferación celular, mientras que enciende las vías que producen ATP como la glucólisis y la oxidación de ácidos grasos. Esto puede ser a través de la fosforilación de enzimas involucradas directamente en la regulación de las vías correspondientes, o a través de regular la expresión génica de la célula (S. Fragoso et al., “LA AMPK Y LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA”, REB 27(1): 3-8, 2008).

La activación de AMPK puede regular distintos procesos en la célula. Concretamente a nivel metabólico actúa sobre el metabolismo de ácidos grasos, de la glucosa, y de la síntesis de proteínas, entre otros. A nivel del metabolismo de ácidos grasos AMPK interviene incrementando la oxidación de lípidos e inhibiendo la síntesis de novo de estos. El incremento en la oxidación de lípidos tiene lugar en parte debido a que AMPK incrementa los niveles de PPAR-a, implicado en la transcripción de genes que codifican proteínas involucradas en la p-oxidación (Barish GD, et al., 2006. PPAR delta: a dagger in the heart of the metabolic syndrome. J Clin Invest. 116: 590-7]. Asimismo, se ha descrito que AMPK puede fosforilar directamente a PPAR-a aunque se desconoce la relevancia fisiológica de esta fosforilación. AMPK también actúa inhibiendo la síntesis de novo de ácidos grasos y lípidos tanto a nivel transcripcional como postraduccional. Así actúa disminuyendo la síntesis de enzimas implicadas en la lipogénesis, por medio de la regulación de los factores de transcripción SREBP y ChREBP (Kawaguchi T, et al., 2002, Mechanism for fatty acid "sparing" effect on glucose-induced transcription: regulation of carbohydrateresponsive element-binding protein by AMPactivated protein kinase. J Biol Chem. 277: 3829-35). También puede actuar directamente sobre enzimas de la síntesis de ácidos grasos. Fosforila a ACC1 en las Ser77 y Ser79, a ACC2 en las Ser219 y Ser221, y posiblemente a FASN inhibiéndolos (An Z, et al., 2007, Nicotine-induced activation of AMP-activated protein kinase inhibits fatty acid synthase in 3T3L1 adipocytes: a role for oxidant stress. J Biol Chem. 282: 26793-801). De esta forma tiene lugar una disminución en la lipogénesis, así como un incremento de la p-oxidación. A nivel del metabolismo de la glucosa, AMPK actúa incrementando la glucólisis, e inhibiendo la gluconeogénesis. Se ha descrito que regula la glucólisis actuando, por ejemplo, sobre GEF, el cual está implicado en la transcripción de Glut-4. AMPK fosforila a GEF de forma que este incrementa su afinidad por el promotor de Glut-4 y aumenta su nivel de transcripción (Holmes BF, et al., 2005, Regulation of muscle GLUT4 enhancer factor and myocyte enhancer factor 2 by AMP-activated protein kinase. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289:E1071-6; Screaton Ra , et al., 2004, The CREB coactivator TORC2 functions as a calcium- and cAMPsensitive coincidence detector. Cell. 119: 61-74; Jorgensen SB, et al., 2007, Role of AMPKalpha2 in basal, training-, and AlCAR-induced GLUT4 hexokinase II, and mitochondrial protein expression in mouse muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292: E331-9). Asimismo, AMPK también regula el metabolismo mitocondrial siendo su mayor efector el factor de transcripción PGC1a. AMPK directamente fosforila y activa este factor de transcripción el cual está implicado en la transcripción de genes implicados en la fosforilación oxidativa y la biogénesis mitocondrial.

La identificación de AMPK como una diana indirecta de medicamentos anti-diabéticos bien conocidos ha provocado en los últimos años el creciente desarrollo de activadores de AMPK más efectivos y específicos.

Así, la búsqueda de nuevos activadores de AMPK se ha reflejado en numerosas investigaciones, describiendo medicamentos considerados activadores indirectos de AMPK, inhibiendo la producción de ATP mitocondrial y alterando la proporción AMP:ATP en la célula, influyendo por tanto en el tratamiento de trastornos metabólicos(Hawley SA, et al., Use of cells expressing gamma subunit variants to identify diverse mechanisms of AMPK activation. Cell Metab 2010;11(6):554-65). Entre ellos se incluyen derivados de biguanida (por ejemplo metformina), tiazolidindionas y agentes fitoquímicos. También se han investigado activadores directos que se unen directamente a las tres subunidades (alfa, beta o gamma) de la holoenzima AMPK.

Así, por ejemplo en la US20060287356 A1 se describen derivados de tienopiridona como activadores directos de AMPK, en particular activando AMPK vía un mecanismo alostérico y por inhibición de la desfosforilación en treonina. En este caso, los efectos sobre la glucosa y el metabolismo lipídico observado en ratones tratados con estos derivados se producían principalmente por la estimulación de AMPK en el hígado.

En la WO2010103040 A1 se describe el compuesto 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribósido (AICAR) como activador de AMPK, que es metabolizado a ZMP, análogo de AMP, por la adenosina quinasa (AQ o AK en inglés). El ZMP se une a la subunidad gamma de AMPK y emula el efecto del AMP sobre la activación alostérica de la quinasa AMPK, con efectos antidiabéticos en modelos animales. Sin embargo, AICAR presenta una baja biodisponibilidad y su administración efectiva requiere de altas dosis de administración intravenosa debido principalmente a su escasa absorción gastrointestinal y a su rápida conversión en multitud de metabolitos no activos frente a AMPK.

En el caso del principio activo conocido Metformina, un derivado de biguanida, un activador indirecto de AMPK tal como se ha mencionado anteriormente, su administración conlleva el uso de altas dosis de principio activo y efectos secundarios no deseados, tales como acidosis láctica.

Se conoce WO2010/108051A2 que expone el uso de inhibidores de DGAT-I para tratar y/o prevenir el sobrepeso, la obesidad y diversas enfermedades y trastornos asociados con los mismos. También se pueden mejorar o evitar otras condiciones, como triglicéridos posprandiales altos o hipertrigliceridemia relacionada con la dieta, riesgo cardiovascular asociado con triglicéridos excesivos y resistencia a la insulina/intolerancia a la glucosa en pacientes con sobrepeso, diabetes u otros trastornos metabólicos de la glucosa como el síndrome X y/o la enfermedad de ovario poliquístico. También se proporcionan compuestos y composiciones adecuados para usar en los métodos descritos.

A la vista de lo anterior, sigue existiendo una necesidad de nuevos activadores de AMPK útiles en el tratamiento o la prevención de trastornos relacionados con la activación de AMPK, tales como patologías metabólicas, neurodegenerativas o neoplásicas relacionadas con la edad, en particular como agonistas de los dominios bateman (estructura formada por dos motivos CBS - cistationa-beta-sintasa) en tándem de la subunidad gamma de AMPK.

Los compuestos de la presente invención se diseñan como miméticos de AMP que se unen a los sitios de enlace de nucleótidos de la subunidad gamma. El AMPK tiene muchas dianas aguas abajo que afectan al metabolismo de la glucosa y del glucógeno y a la biosíntesis de lípidos y del colesterol que hacen de estos compuestos buenos candidatos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades metabólicas tales como hipercolesterolemia, obesidad, diabetes tipo 2 o el síndrome metabólico (también denominado síndrome X). Así, los compuestos de la presente invención son especialmente adecuado para el tratamiento y/o la prevención de este tipo de trastornos a dosis efectivas bajas, siendo su EC⁵⁰(concentración media efectiva máxima) muy inferior a la EC⁵⁰de los derivados AICAR o de los derivados de biguanida ya conocidos del estado de la técnica.

Descripción de la invención

Según un primer aspecto, la invención se refiere a derivados N9-[aril,heteroaril)fosfonatos de adenina como activadores de AMPK de la siguiente fórmula general (I)

donde

• R es un grupo arilo de 5 o 6 miembros de anillo o un grupo heteroarilo de 5 o 6 miembros de anillo, pudiendo el arilo o heteroarilo estar sustituido en sus posiciones libres con uno o más sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados de entre deuterio, un átomo de halógeno, -OH, -CH³, -CN, -OCH³, OCH²CH³, -CH²COOH, -CH²COOCH³, -COOH -COCH³, -COH.

• Ri y R²se seleccionan, independientemente entre sí, de entre H, un grupo alquilo(C1-22) lineal o ramificado, un grupo alquenilo (C2-22), un grupo alquinilo(C2-22), un grupo cicloalquilo(C3-7), un grupo alquil(C3-22)-COOH, un grupo aril(C5-6)-COOH, un aminoácido, preferentemente alanina, serina o arginina, un grupo glicerol, colina o esfingomielina; o se seleccionan, independientemente entre sí, de entre cationes de metales alcalinos o alcalinotérreos, en particular de sodio o magnesio, pudiendo ser también un catión de metal de transición o cualquier catión aceptable;

y donde

- “grupo arilo” se refiere a un grupo hidrocarburo aromático de 5 o 6 miembros de anillo, pudiendo el arilo no estar sustituido o estar mono o polisustituido, con sustituyentes iguales o diferentes, seleccionados independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de halógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo y ciclopropilo, deuterio e hidroxilo.

- “grupo heteroarilo” se refiere a un grupo hidrocarburo aromático de 5 o 6 miembros de anillo donde al menos uno de los carbonos del anillo se ha reemplazado por N, O, S, P o Se.

- el grupo fosfonilo

puede estar unido a cualquier átomo de carbono del anillo arilo o heteroarilo no sustituido con otro sustituyente, por ejemplo en las posiciones orto, meta o para respecto de la adenina en el caso de un heteroarilo de 6 miembros.

En el contexto de la presente invención, por grupo alquilo(C1-22), alquenilo(C2-22) o alquinilo(C2-22) se entienden grupos hidrocarburo alifáticos de 1 a 22 o en su caso de 2 a 22 átomos de carbono, en el caso de los alquenilos o alquinilos incluyendo al menos un enlace C=C o CeC respectivamente.

Compuestos preferentes de fórmula (I) son aquellos donde R es un grupo arilo seleccionado de entre fenilo o ciclopentadienilo, de las siguientes fórmulas (Ia-d), siendo R¹y R²tal como se han definido anteriormente:

Son igualmente preferentes los compuestos de fórmula (I) donde R es un grupo heteroarilo seleccionado de entre piridina, pirimidina, pirrolilo, pirazolilo, piranilo, furanilo, tiofenilo, fosfoloilo o selenofenilo, de las siguientes fórmulas (Ie-p), siendo R¹y R²tal como se han definido anteriormente:

De entre los compuestos de la invención, son particularmente preferentes N9-fenil-3-fosfonil-adenina, caso particular del compuesto (Ia) donde R¹y R²son ambos hidrógeno, N9-(2-furanil)-5-fosfonil-adenina, caso particular de los compuestos (Il) y (Im) donde R¹y R²son ambos hidrógeno y N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina, caso particular del compuesto (Ia) donde R¹y R²son ambos un grupo etilo.

La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos antes descritos en una cantidad terapéuticamente eficaz en combinación con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables, así como de dichas composiciones farmacéuticas para su uso en la producción de medicamento para el tratamiento y/o la prevención de trastornos y enfermedades donde la activación de la AMPK juega un papel relevante, por ejemplo de enfermedades metabólicas tales como hipercolesterolemia, obesidad, diabetes tipo 2 o síndrome metabólico (también denominado síndrome X), pero también para la función musculo-esquelética, la función endocrina, la homeostasis celular, la adaptación al estrés ambiental, así como para el tratamiento o la prevención de patologías dermatológicas que puedan ser controladas y/o revertidas por la activación de la holoenzima AMPK.

Entre las composiciones farmacéuticas según la invención se señalan particularmente aquellas adecuadas para la administración vía oral, parenteral, intramuscular e intravenosa, per o transcutánea, nasal, rectal, perlingual, ocular, respiratoria, y más específicamente aquellas en forma de comprimidos simples, comprimidos sublinguales, cápsulas duras, comprimidos perlinguales, cápsulas, pastillas, preparaciones inyectables, aerosoles, supositorios, cremas, pomadas o geles dérmicos.

En una forma de realización preferente, las composiciones de la invención se administran vía oral.

Además de los compuestos de la invención, las composiciones farmacéuticas según la invención contienen uno o más excipientes o vehículos seleccionados entre diluyentes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, estabilizantes, conservantes, absorbentes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, etc., seleccionándose estos excipientes en función de la forma de dosificación final de la composición farmacéutica.

A título de ejemplo no limitativo se pueden citar:

- como diluyentes: lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa microcristalina, glicerina;

- como lubricantes: sílice, talco, ácido esteárico y sus sales de magnesio y de calcio, polietilenglicol;

- como aglutinantes: silicato de aluminio y magnesio, almidón, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y polivinilpirrolidona;

- como disgregantes: agar, ácido algínico y su sal de sodio, mezclas efervescentes;

- como solubilizantes: ciclodextrinas, polivinilcaprolactama, acetato de polivinilo y polietilenglicol.

La posología útil varía según el sexo, la edad y el peso del paciente, la vía de administración, la naturaleza del trastorno y de eventuales tratamientos asociados, oscilando entre 1 pg y 1.000 mg de un compuesto según la invención por kg de peso corporal del sujeto a tratar, preferentemente entre 1 mg y 300 mg por kg de peso corporal, en una o varias tomas al día.

En el contexto de la invención, el sujeto a tratar es un sujeto mamífero humano o animal.

Por ejemplo, en el caso de una composición farmacéutica según la invención que incluye el derivado de adenina N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina, caso particular de los compuestos de fórmula (I) donde R es un grupo fenilo y R¹y R²son ambos un grupo etilo, en forma particulada junto con los excipientes adecuados, comprimida en un comprimido o cargada en una cápsula, para la administración vía oral, dicho compuesto de la invención se administra a la dosis citada anteriormente, liberándose en compuesto de la invención vía hidrólisis ácida en el pH ácido del estómago, además de ser absorbido el profármaco y ser activado intracelularmente vía enzimas esterasas y extracelularmente en el intestino delgado, así como por hidrólisis en medio acuoso fisiológico, aunque en menor medida.

En otro ejemplo de composición farmacéutica para la administración vía tópica en forma de pomada, por ejemplo para el tratamiento de patologías dermatológicas que puedan ser controladas y/o revertidas por la activación de la holoenzima AMPK, los compuestos de la invención se incluyen en dicha composición farmacéutica en un rango de concentración en peso de 0,1 mg/g de pomada a 2,0 mg/g de pomada, incluyendo la composición farmacéutica como excipientes adecuados cetil alcohol, agua destilada, estearato de glicerol, parafina líquida, polisorbato 60, polisorbato 80, propilenglicol y ascorbato sódico. En otro ejemplo de composición farmacéutica de administración vía tópica, el compuesto de la invención se disolvería en una mezcla de polietilenglicol 300, 1500 y 4000 y ascorbato sódico.

Como patologías dermatológicas que puedan ser controladas y/o revertidas por la activación de la holoenzima AMPK en la presente invención se contemplan, por ejemplo, Xeroderma pigmentosum y cáncer de piel, incluyendo pero no limitándose a melanoma y carcinoma basocelular, (Wu, C.L. et al., Role of AMPK in UVB-induced DNA damage repair and growth control. Oncogene 32, 2682-9 (2013)).

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, que ilustran adicionalmente la invención y no deben considerarse como limitativos de la misma, se describe un procedimiento de síntesis de un ejemplo de realización preferente del compuesto de fórmula (I), en particular de N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina, caso particular de los compuestos de fórmula (I) donde R es un grupo fenilo y R¹y R²son ambos un grupo etilo.

Síntesis general de los compuestos de fórmula (I)

El mecanismo general de síntesis se rige según un acoplamiento Chan-Lam mediado por una sal de cobre(II) en cantidades estequiométricas entre la adenina neutra y un ácido borónico de halo-arilo, por ejemplo ácido 3-bromofenilborónico o ácido 4-bromofenilborónico, tal como se describe en Yue, Y., et al., Copper-catalyzed crosscoupling reactions of nucleobases with arylboronic acids: An efficient access to N-arylnucleobases, European J. Org. Chem. 5154-5157 (2005). Al producto de acoplamiento purificado por cromatografía de columna, por ejemplo 9-(3-bromofenil)adenina y 9-(4-bromofenil)adenina, se le acopla una dialquil-fosfina en condiciones similares al acoplamiento Negishi con tetraquis(trifefilfosfina)-paladio(0) como catalizador, trietilamina como base y dimetilformamida anhidra como disolvente. Posteriormente los dos enlaces éster del fosfonato pueden hidrolizarse en medio ácido con ácido clorhídrico acuoso para obtener el correspondiente derivado de ácido fosfónico y a su vez posteriormente ser convertido en una sal, por ejemplo disódica, haciéndolo reaccionar con hidróxido sódico en medio acuoso.

Alternativamente, para generar derivados heteroarilo no bencílicos, se parte de 6-cloropurina y el ácido borónico de halo-heteroarilo correspondiente, tal como se describe en Morellato, L., et al., Synthesis of novel 9-aryl and heteroarylpurine derivatives via copper mediated coupling reaction, Tetrahedron Lett (2014) y se procede a acoplar la dialquil-fosfina deseada en condiciones similares al acoplamiento Negishi con tetraquis(trifefilfosfina)-paladio(0) como catalizador, trietilamina como base y dimetilformamida anhidra como disolvente.

Síntesis de N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina

El compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina se obtiene a partir de adenina siguiendo un proceso en dos etapas:

Etapa 1:3-bromofenil-N9-adenine

Esta etapa se adapta de Yue, Y., et al., Copper-catalyzed cross-coupling reactions of nucleobases with arylboronic acids: An efficient access to N-arylnucleobases, European J. Org. Chem. 5154-5157 (2005).

Brevemente, 5 mmol de adenina se añadieron a 500 ml de una mezcla metanol-agua 4:1 que contenía 5 mmol de acetato de cobre (II) monohidrato, 10 mmol de N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina y 10 mmol de ácido 3-bromofenilbórico. La mezcla se agitó bajo atmósfera de aire durante una hora a temperatura ambiente en un matraz de 1l. SE añadió a la solución contenida en el matraz metanol, la mezcla se filtró a través de celita y se evaporaron los disolventes. El sólido resultante se purificó por cromatografía flash empleando gel de sílice y una carga de CH²Cl²:MeOH 20:1 y CH²Cl²:MeOH 10:1 como eluyente. Se obtuvo el producto del título con una r = 0,25 en forma de sólido cristalino blanco. Rendimiento 50%. Pureza >98%.

Etapa 2: N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina

En un matraz redondo de 50 ml se cargaron 2 mmol de 3-bromofenil-N9-adenine, 3 mmol de trietilamina, 0,1 mmol de tetraquis(trifefilfosfina)paladio(0) y 3 mmol de fosfito de dietilo. A continuación se añadieron 10 ml de dimetilformamida anhidra y la mezcla se agitó durante una hora a 100°C. La dimetilformamida se evaporó y el sólido obtenido se purificó por cromatografía empleando gel de sílice y CH²Cl²:MeOH 10:1 como eluyente. El producto deseado N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina con una r = 0,20 se obtuvo en forma de un sólido cristalino de color blanco/beige. Rendimiento 90%. Pureza >98%. Punto de fusión 104°C.

Análisis espectroscópico:

IR (KBr), cm-1: 3297 ms, 3102 ms, 1676 s, 1599 s, 1487 ms, 1307 s, 1050 ms, 1022 s, 656 m, 562 m. (ms = medio fuerte, s = fuerte, m = medio)

1H-NMR (300 MHz, dmso-d6): 5 (ppm)=8,67 s (1H, H8adenina), 8,30 dd (1H, H1, J^p-^h=16,6 Hz, Jm=1,2 Hz), 8,23 s (1 H2ade CH), 8,17-8,14 m (1H, H2), 7,79-7,75 m (2H, H3+H4), 7,43 bs (2H, NH2), 4,08 dq (4H, CH2, JP-H = 15,3 Hz, JH-H = 7,2 Hz), 1,29-1,25 t (6H CH3, JH-H = 7,2 Hz) ppm.

HRMS (ESI) [M+H]+ [C15H18N5PO3+H]+: calculada m/z = 348,1218; encontrada m/z = 348,1220.

Ensayo de activación de AMPK

Células C2C12 de la línea celular de mioblastoma muscular de ratón (de Sigma-Aldrich) se sembraron a una densidad celular de 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en 200 pl de medio de crecimiento (DMEM con alto contenido en glucosa, 10% de suero fetal bovino (PBS), penicilina y estreptavidina). Las células se dejaron crecer hasta confluencia y el día del ensayo se incubaron con el compuesto de interés en 100 pl de medio de crecimiento a 37°C y 5% CO²en un incubador durante entre 1 y 24 horas. Todas las condiciones se ensayaron por cuadruplicado. Los compuestos se administraron disueltos en sulfóxido de dimetilo anhidro estéril a diferentes concentraciones. Como control positivo para la activación de AMPK se empleó una solución de adenosin-monofosfato (AMP) con una concentración final de 100 pl. Tras finalizar los tiempos correspondientes, se eliminó el medio y las células se lavaron cuidadosamente tres veces con PBS a temperatura ambiente y se empleó el kit Elisa de Abcam para cuantificar la proporción de a-AMPK fosforilado: a-AMPK total. Se siguieron las instrucciones del fabricante y se cuantificó la señal mediante un escáner Licor Odissey®. El compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina mostraba una actividad de AMPK más alta que el control positivo de AMP a concentraciones tan bajas como de 30 nanomolar después de 4 horas de incubación.

En concreto, el compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina demostró una actividad de AMPK superior al 500% de la obtenida con el control positivo de AMP a concentraciones tan bajas como de 30 nanomolar después de 4 horas de incubación. Aquellos compuestos con EC50 inferior a 1 micromolar y activación respecto al control AMP superior al 80% son considerados compuestos activos deseados. Los compuestos seleccionados como activadores de AMPK según los criterios anteriormente descritos son empleados en los ensayos de consumo de glucosa y ensayo de viabilidad celular MTT.

Ensayo de consumo de glucosa

Células C2C12 de la línea celular de mioblastoma muscular de ratón (de Sigma-Aldrich) se sembraron a una densidad celular de 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos blancos compatibles con el uso de un luminómetro. Las células se dejaron crecer durante 5 días en 200 pl/pocillo de medio de crecimiento (DMEM con alto contenido en glucosa, 10% de suero fetal bovino (PBS), penicilina y estreptavidina) en un incubador a 37°C y 5% de CO². El medio se cambió cada dos días. Entonces el medio se reemplazó por un medio de diferenciación (DMEM de bajo contenido en glucosa, 2% N-hidroxisuccinimida, penicilina y estreptavidina), dejando que las células se diferenciaran en miotubos durante tres días. El medio se cambió cada día. Un día antes del ensayo, las células se privaron de suero (DMEM de baja glucosa, penicilina y estreptavidina). A continuación, el medio se reemplazó por un medio DMEM sin glucosa y el compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina se incubó durante una hora a diferentes concentraciones, replicando las condiciones por cuadriplicado. El control positivo consistía en una solución de insulina humana 100 nanomolar (de Sigma). Se empleó un kit de consumo de glucosa de Promega siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit está basado en la captación intracelular de 2-desoxiglucosa como análogo químico de glucosa, acoplado a un ensayo enzimático luminométrico de luciferina, en relación a que los resultados obtenidos son proporcionales a la concentración intracelular de dicho análogo de glucosa.

La luminiscencia total se midió en un lector de placas luminométrico Biotek MX. El compuesto N9-(3-dietilfosfonil)feniladenina mostraba una actividad de consumo de glucosa análoga o superior a la de los controles de insulina a concentraciones tan bajas como de 30 nanomolar. Luminosidad como % del control para la N9-(3-dietilfosfonil)feniladenina (30 nanomolar): 125 ± 9%.

Ensayo MTT de viabilidad/proliferación celular

El ensayo redox MTT se basa en la reducción metabólica del bromuro a partir de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol (MTT) que se produce por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa, que colorea en azul el colorante formazano, permitiendo determinar la funcionalidad mitocondrial de las células tratadas.

Se sembraron células C2C12 a una densidad de 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos blancos compatible con el uso de un luminómetro. Se dejaron crecer las células durante 5 días en 200 pl/pocillo de un medio de crecimiento (DMEM de alta glucosa, 10% ^fB^s, penicilina y estreptavidina), reemplazándose el medio cada dos días. Posteriormente, el medio se reemplazó por un medio de diferenciación (DMEM de baja glucosa, 2% NHS, penicilina y estreptavidina) y se dejó que las células se diferenciaran en miotubos durante tres días, cambiándose el medio cada día. En todos los procesos, las células se incubaron a 37°C y 5% CO²en un incubador celular. El compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina se incubó durante 24 y 48 horas en DMEM de baja glucosa sin suero. Las concentraciones del compuesto incubado oscilaban entre 10 nanomolar y 1 milimolar. Como control positivo para la activación de AMP se empleó una solución de AMP con una concentración final de 100 pl. Tras la incubación se añadieron 10 pl del reactivo MTT (Abcam) a cada pocillo y, pasados 30 min, 45 min y 60 min de incubación, se midió la absorbancia a 490 nm en fotómetro con lector de placas Biotek TX. La lectura es una medida indirecta de la enzima NAD(P)H dependiente de las oxido-reductasas celulares.

El compuesto N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina mostró una señal significativamente mayor en comparación con los controles a concentraciones nanomolares. Luminosidad como % del control para la N9-(3-dietilfosfonil)fenil-adenina (30 nanomolar y 48 horas de incubación): 157 ± 5%.

Ejemplo de composición farmacéutica según la invención

Un ejemplo de composición farmacéutica para la formulación de un medicamento en una dosis diaria oral para un adulto humano incluye 20 mg de un compuesto según la invención en forma particulada comprimido junto con los siguientes excipientes: celulosa microcristalina, carboximetilalmidón sódico tipo A (derivado de patata), sílice coloidal anhidra y estearato de magnesio.

Claims

REIVINDICACIONES

donde

• R es un grupo arilo de 5 o 6 miembros de anillo o un grupo heteroarilo de 5 o 6 miembros de anillo, pudiendo el arilo o heteroarilo estar sustituido en sus posiciones libres con uno o más sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados de entre deuterio, un átomo de halógeno, -OH, -CH³, -CN, -OCH³, OCH²CH³, -CH2COOH, -CH2COOCH3, -COOH, -COCH3, -COH.

• R¹y R²se seleccionan, independientemente entre sí, de entre H, un grupo alquilo(C1 -22) lineal o ramificado, un grupo alquenilo (C2-22), un grupo alquinilo(C2-22), un grupo cicloalquilo(C3-7), un grupo alquil(C3-22)-COOH, un grupo aril(C5-6)-COOH, un aminoácido en su forma catiónica, preferentemente alanina, serina o arginina, un grupo glicerol, colina o esfingomielina; o se seleccionan, independientemente entre sí, de entre cationes de metales alcalinos o alcalinotérreos, en particular de sodio o magnesio pudiendo ser también un catión de metal de transición o cualquier catión aceptable;

entendiéndose:

- por “grupo arilo” un grupo hidrocarburo aromático de 5 o 6 miembros de anillo, pudiendo el arilo no estar sustituido o estar mono o polisustituido, con sustituyentes iguales o diferentes, seleccionados independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de halógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo y ciclopropilo, deuterio e hidroxilo;

- por “grupo heteroarilo” un grupo hidrocarburo aromático de 5 o 6 miembros de anillo donde al menos uno de los carbonos del anillo se ha reemplazado por N, O, S, P o Se,

- Que el grupo fosfonilo

puede estar unido a cualquier átomo de carbono del anillo arilo o heteroarilo no sustituido con otro sustituyente.
2.- Derivados de adenina N9 sustituidos según la reivindicación 1, donde R es un grupo arilo seleccionado de entre fenilo o ciclopentadienilo, de las siguientes fórmulas (Ia-d), siendo R¹y R²tal como se han definido en la reivindicación 1:
3.- Derivados de adenina N9 sustituidos según la reivindicación 1, donde R es un grupo heteroarilo seleccionado de entre piridina, pirimidina, pirrolilo, pirazolilo, piranilo, furanilo, tiofenilo, fosfoloilo o selenofenilo, de las siguientes fórmulas (le-p), siendo Ri y R²tal como se han definido en la reivindicación 1:
4. - Derivado de adenina N9 sustituido según las reivindicaciones 1
o 2, que es N9-fenil-3-fosfonil-ad
5. - Derivado de adenina N9 sustituido según las reivindicaciones 1
o 2, que es N9-(3-dietilfosfonil)fe
6.- Derivado de adenina N9 sustituido según las reivindicaciones 1 o 3, que es N9-(2-furanil)-5-fosfonil-adenina.
7.- Composiciones farmacéuticas que contienen al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

6 en combinación con uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.
8.- Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 7, donde el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 está presente en una dosis efectiva de entre 1 gg y 1.000 mg del compuesto por kg de peso corporal del sujeto a tratar.
9. - Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 8, donde el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 está presente en una dosis efectiva de entre 1 mg y 300 mg por kg de peso corporal.
10. - Composiciones farmacéuticas según las reivindicaciones 7 a 9, para su uso en la fabricación de un medicamento activador de AMPK.
11.- Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 10 para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de trastornos y enfermedades seleccionados de entre enfermedades metabólicas como hipercolesterolemia, obesidad, diabetes tipo 2 o síndrome metabólico, para la función musculo-esquelética, la función endocrina, la homeostasis celular, la adaptación al estrés ambiental, así como para el tratamiento o la prevención de patologías dermatológicas que puedan ser controladas y/o revertidas por la activación de la holoenzima

AMPK.