WO2014142291A1 - フルオレン化合物の水和物、およびその結晶 - Google Patents

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隆尚 本村
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Definitions

  • the present invention is a fluorene compound hydrate and a crystal thereof. More specifically, it has pyruvate dehydrogenase kinase (pyruvate dehydrogenase kinase / PDHK) inhibitory action, diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes, etc.), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactemia , Diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, cataract, etc.), heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomyopathy, myocardial ischemia, myocardial infarction, angina, lipid abnormalities , Atherosclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, chronic obstructive pulmonary disease, cerebral ischemia, stroke, mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, pulmonary hypertension, or Alzheimer's disease Hydrated fluorene compounds having useful properties and excellent stability, and On the crystal.
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP is produced by the oxidation of high energy metabolic fuels such as glucose or free fatty acids.
  • acetyl CoA is produced by oxidation of glucose through the glycolysis pathway or ⁇ -oxidation of free fatty acids.
  • the enzyme that plays a commanding role in regulating acetyl CoA production from glucose is PDH.
  • PDH catalyzes the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH simultaneously with the oxidation of pyruvate to acetyl CoA and carbon dioxide (eg, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • PDH is a multi-enzyme complex consisting of three enzyme components (E1, E2 and E3) located in the mitochondrial matrix and several subunits.
  • E1, E2 and E3 perform NADH generation by decarboxylation of pyruvic acid, generation of acetyl CoA and reduction of NAD, respectively.
  • Two types of enzymes having a regulatory role are bound to PDH.
  • One is PDHK, which is a protein kinase that exhibits specificity for PDH. Its role is to phosphorylate and inactivate the E1 ⁇ subunit of the complex.
  • the other is PDH phosphatase, a specific protein phosphatase that activates PDH through dephosphorylation of the E1 ⁇ subunit.
  • the percentage of PDH in the active (dephosphorylated) state is determined by the balance of kinase activity and phosphatase activity.
  • Kinase activity is regulated by the relative concentration of metabolic substrates.
  • the kinase activity is activated by an increase in each ratio of NADH / NAD, acetyl CoA / CoA, and ATP / adenosine diphosphate (ADP), and is inhibited by pyruvic acid (for example, Non-Patent Document 3).
  • PDHK2 is expressed in a wide range of tissues including liver, skeletal muscle, and adipose tissue involved in sugar metabolism. Furthermore, PDHK2 is relatively sensitive to activation by increasing NADH / NAD and acetyl CoA / CoA and inhibition by pyruvate, suggesting that it is involved in short-term glucose metabolism regulation (eg, Non-patent document 4).
  • PDHK1 is highly expressed in cardiac muscle, skeletal muscle, pancreatic ⁇ cells, and the like. Furthermore, PDHK1 is induced in the ischemic state through activation of hypoxia-inducible factor (HIF) 1, suggesting that it is involved in ischemic diseases and cancerous diseases (for example, Non-patent document 5).
  • HIF hypoxia-inducible factor
  • Type 1 diabetes In diseases such as insulin-dependent (type 1) diabetes and non-insulin-dependent (type 2) diabetes, lipid oxidation increases and glucose utilization decreases at the same time. This decrease in glucose utilization contributes to hyperglycemia. Since PDH activity is reduced in a state where oxidative glucose metabolism is reduced such as type 1 and type 2 diabetes and obesity, a decrease in glucose utilization in type 1 and type 2 diabetes is associated with a decrease in PDH activity. (For example, Non-Patent Documents 6 and 7). In addition, type 1 and type 2 diabetes have increased gluconeogenesis in the liver, which also contributes to hyperglycemia. Decreasing PDH activity increases pyruvic acid, resulting in increased availability of lactic acid as a gluconeogenic substrate in the liver.
  • Non-Patent Documents 8 and 9 Activation of PDH by PDHK inhibition is thought to increase the rate of glucose oxidation.
  • the utilization of glucose in the living body is enhanced, and gluconeogenesis in the liver is suppressed, so that it is expected that hyperglycemia in type 1 and type 2 diabetes can be improved (for example, Non-Patent Document 10). 11, 12).
  • Non-patent Document 13 14 Another factor involved in diabetes is impaired insulin secretion, which is known to involve a decrease in PDH activity and induction of PDHK1, 2 and 4 in pancreatic ⁇ cells (eg, Non-patent Document 13, 14).
  • persistent hyperglycemia due to diabetes is known to cause complications such as diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, and diabetic nephropathy.
  • Thiamine and ⁇ -lipoic acid contribute to the activation of PDH as a coenzyme.
  • These or thiamine derivatives and ⁇ -lipoic acid derivatives have been shown to have promising effects in the treatment of diabetic complications. Accordingly, PDH activation is expected to improve diabetic complications (eg, Non-Patent Documents 15 and 16).
  • adenosine monophosphate activated kinase is activated and phosphorylated during ischemia to inactivate acetyl CoA carboxylase.
  • a drug that activates PDH by inhibiting PDHK is thought to decrease lactate production by enhancing pyruvate metabolism. Therefore, it is considered useful for the treatment of hyperlactic acidemia such as mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy or sepsis (for example, Non-Patent Document 20).
  • Non-Patent Document 21 In cancer cells, the expression of PDHK1 or 2 is increased. In cancer cells, ATP production due to oxidative phosphorylation in mitochondria is reduced, and ATP production via anaerobic glycolysis in the cytoplasm is increased. When PDH is activated by PDHK inhibition, oxidative phosphorylation in mitochondria is enhanced, and production of active oxygen is increased, which is expected to induce apoptosis of cancer cells. Therefore, activation of PDH by PDHK inhibition is considered useful for treatment of cancerous diseases (for example, Non-Patent Document 21).
  • Pulmonary hypertension is a disease characterized by increased blood pressure due to increased cell proliferation of the pulmonary artery and partial contraction of the pulmonary artery.
  • PDH of pulmonary arterial cells in pulmonary hypertension is activated, oxidative phosphorylation in mitochondria is enhanced, and production of active oxygen is increased, thereby inducing apoptosis of pulmonary arterial cells. Therefore, activation of PDH by PDHK inhibition is considered useful for treatment of pulmonary hypertension (for example, Non-Patent Document 22).
  • Alzheimer's disease energy production and glucose metabolism in the cerebrum are decreased, and PDH activity is also decreased.
  • PDH activity decreases, the production of acetyl CoA decreases.
  • Acetyl-CoA is used for ATP production in the electron transport system via the citric acid cycle.
  • Acetyl CoA is a raw material for synthesizing acetylcholine, which is one of neurotransmitters.
  • a decrease in brain PDH activity in Alzheimer's disease is thought to cause neuronal cell death due to a decrease in ATP production.
  • synthesis of acetylcholine which is a transmitter, is suppressed, and it is considered that the memory ability is reduced.
  • Non-Patent Documents 23 and 24 Activation of brain PDH in Alzheimer's disease is expected to enhance energy production and acetylcholine synthesis. Therefore, activation of PDH by PDHK inhibition is considered useful for treatment of Alzheimer's disease (for example, Non-Patent Documents 23 and 24).
  • Dichloroacetic acid a drug having PDH activation action
  • diabetes myocardial ischemia, myocardial infarction, angina pectoris, heart failure, hyperlactic acidemia, cerebral ischemia, stroke, peripheral arterial disease, chronic obstructive pulmonary disease, It has been shown to have promising effects in the treatment of cancerous diseases and pulmonary hypertension (for example, Non-Patent Documents 10, 18, 20, 22, 25, 26, 27).
  • PDHK inhibitors are used in diseases associated with impaired glucose utilization, such as diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes, etc.), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acid, diabetes It is considered useful for the treatment or prevention of complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, cataract, etc.).
  • PDHK inhibitors are also used for diseases in which the supply of energy substrates to tissues is restricted, such as heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomyopathy, myocardial ischemia, myocardial infarction, angina pectoris, dyslipidemia, atheroma It may be beneficial for the treatment or prevention of systemic sclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, chronic obstructive pulmonary disease, cerebral ischemia and stroke. Furthermore, PDHK inhibitors are considered to be useful for the treatment or prevention of mitochondrial diseases, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, pulmonary hypertension and the like.
  • PDHK inhibitors are used for diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes, etc.), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, Diabetic nephropathy, cataract, etc.), heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomyopathy, myocardial ischemia, myocardial infarction, angina, dyslipidemia, atherosclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, It may be beneficial for the treatment or prevention of chronic obstructive pulmonary disease, cerebral ischemia, stroke, mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, pulmonary hypertension, or Alzheimer's disease.
  • Dichloroacetate enhances performance and reduces blood lactate during maximal cycle exercise (10): 1090-4.
  • Flavin DF Non-Hodgkin's Lymphoma Reversal with Dichloroacetate. J Oncol. Hindawi Publishing Corporation Journal of OncologyVolume 2010, Article ID 414726, 4 pages doi: 10.1155 / 2010/414726.
  • a compound represented by [2] A crystal of the compound according to [1] above, [3] The diffraction angles 2 ⁇ (°) in powder X-ray diffraction are 6.9 ⁇ 0.2, 10.2 ⁇ 0.2, 15.5 ⁇ 0.2, 15.8 ⁇ 0.2, and 16 Crystals of the compound of the above-mentioned [1] having a diffraction peak including 6 ⁇ 0.2, [4] The diffraction angle 2 ⁇ (°) in powder X-ray diffraction has diffraction peaks including about 6.9, about 10.2, about 15.5, about 15.8 and about 16.6.
  • a method for preventing and / or treating a disease selected from the group consisting of myopathy, cancer and pulmonary hypertension [18] Use of the compound or crystal according to any one of [1] to [9] above for producing a PDHK inhibitor, [19] Diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, Cataract), heart
  • Crystals of the [26] The compound according to the above [1], which is a crystal according to any one of the above [23] to [25], wherein the purity of the crystal is 70% or more, [27] A pharmaceutical composition comprising the compound or crystal according to any one of [23] to [26] above, and a pharmaceutically acceptable carrier, [28] The pharmaceutical composition according to the above [27], which is a granule, fine granule, powder, capsule or tablet, [29] A PDHK inhibitor comprising the compound or crystal according to any one of [23] to [26] above, and a pharmaceutically acceptable carrier, [30] Diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes), insulin resistance syndrome, comprising the compound or crystal according to any of the above [23] to [26] and a pharmaceutically acceptable carrier, Metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, cataract), heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomy
  • a method for preventing and / or treating a disease selected from the group consisting of myopathy, cancer and pulmonary hypertension [33] Use of the compound or crystal according to any one of [23] to [26] above for producing a PDHK inhibitor, [34] Diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, Cataract), heart
  • the diffraction angles 2 ⁇ (°) in powder X-ray diffraction are 11.8 ⁇ 0.2, 13.2 ⁇ 0.2, 14.3 ⁇ 0.2, 16.6 ⁇ 0.2, and 19 Crystals of the compound of the above-mentioned [44] having a diffraction peak comprising .8 ⁇ 0.2, [47]
  • the diffraction angle 2 ⁇ (°) in powder X-ray diffraction has diffraction peaks comprising about 11.8, about 13.2, about 14.3, about 16.6, and about 19.8.
  • crystals of the compound according to [48] The compound according to [44] above, wherein the diffraction angle 2 ⁇ (°) in powder X-ray diffraction has diffraction peaks including 11.8, 13.2, 14.3, 16.6 and 19.8.
  • Crystals of the [49] The crystal according to any one of [45] to [48], wherein an extrapolation start temperature in differential scanning calorimetry is 62.3 ⁇ 5.0 ° C.
  • an extrapolation start temperature in differential scanning calorimetry is 62.3 ⁇ 5.0 ° C.
  • FIG. 1 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-1.
  • FIG. 2 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-2.
  • FIG. 3 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystals of Example 1-3.
  • FIG. 4 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystals of Example 1-4.
  • FIG. 5 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-5.
  • FIG. 6 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-6.
  • FIG. 7 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-7.
  • FIG. 8 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-8.
  • FIG. 9 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-9.
  • FIG. 10 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 1-10.
  • FIG. 11 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-1.
  • FIG. 12 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-2.
  • FIG. 13 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-3.
  • FIG. 14 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-4.
  • FIG. 15 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-5.
  • FIG. 16 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-6.
  • FIG. 17 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-7.
  • FIG. 18 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-8.
  • FIG. 19 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-9.
  • FIG. 20 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Example 2-10.
  • FIG. 21 shows DSC thermal analysis data of the crystal of Example 1-1.
  • FIG. 22 shows DSC thermal analysis data of the crystals of Example 1-3.
  • FIG. 23 shows DSC thermal analysis data of the crystal of Example 2-1.
  • FIG. 24 shows the differential thermothermal gravimetric simultaneous measurement data of the crystal of Example 1-1.
  • FIG. 25 shows simultaneous differential thermothermal weight measurement data of the crystals of Example 1-2.
  • FIG. 26 shows simultaneous differential thermothermal weight measurement data of the crystal of Example 2-1.
  • FIG. 27 is water adsorption / desorption isotherm data of the crystals of Example 1-1 (no preliminary drying).
  • FIG. 28 shows moisture adsorption / desorption isotherm data for the crystals of Example 1-1 (with preliminary drying).
  • FIG. 29 is water adsorption / desorption isotherm data of the crystals of Example 1-2 (no preliminary drying).
  • FIG. 30 is moisture adsorption / desorption isotherm data of the crystals of Example 1-2 (with preliminary drying).
  • FIG. 31 shows moisture adsorption / desorption isotherm data of the crystals of Example 2-1 (no preliminary drying).
  • FIG. 32 is water adsorption / desorption isotherm data of the crystals
  • One of the present invention is a dihydrate of Compound B (hereinafter sometimes referred to as Compound (Bh)).
  • Compound (Bh) One embodiment is the following chemical formula.
  • One of the crystals of the present invention is, for example, an amorphous form of Compound A (including solvates (including hydrates)) or other crystals of Compound A (including solvates (including hydrates)). Can be produced by crystal transition.
  • one of the crystals of the present invention is, for example, an amorphous form of Compound B (including solvates (including hydrates)) or other crystals of Compound B (solvates (such as hydrates)). Can be produced by crystal transition.
  • a crystal analysis method by X-ray diffraction is generally used.
  • examples of the method for determining the crystal form include a mechanical method and an optical method (for example, FT-Raman spectrum, solid-state NMR spectrum).
  • thermal analysis differential scanning calorimetry, differential scanning calorimetry (DSC)), infrared absorption spectral analysis, and the like of crystals can also be measured according to ordinary methods.
  • the “form I crystal” of the compound (Ah) is a compound having a powder X-ray diffraction pattern in which a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction appears at 10.2 °.
  • the crystal of (I) is meant.
  • diffraction peaks at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction are (1) 6.9, 10.2, 13.6, 13 .8, 14.0, 15.5, 15.8, 16.6, 17.1, 18.2, 18.6, 18.8, 20.7, 22.1 and 22.6 °, (2) 6.9, 10.2, 13.6, 15.5, 15.8, 16.6, 18.6, 18.8, 20.7 and 22.1 °, (3) 6.9, 10.2, 15.5, 15.8, 16.6 and 18.6 °, or (4) 6.9, 10.2, 13.6, 13.8 and 14.0 °
  • the “form I crystal” of the compound (Ah) in the present invention preferably has a characteristic diffraction peak of 6.9, 10.2, 15.5, 15 at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction.
  • the “form I crystal” of the compound (Ah) in the present invention more preferably has a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction of 6.9, 10.2, 13.6, It is a crystal of the compound (Ah) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 15.5, 15.8, 16.6, 18.6, 18.8, 20.7 and 22.1 °.
  • the “form V” of the compound (Ah) has a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction of 6.9, 10.2, 13.6, 15. It means crystals of compound (Ah) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 8 and 16.6 °.
  • the “V-form crystal” of the compound (Ah) in the present invention more preferably has a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction of 6.9, 10.2, 13.6, It is a crystal of the compound (Ah) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 15.5, 15.8, 16.6, 18.5, 20.6, 22.1 and 22.7 °.
  • the “IVb crystal” of the compound (Bh) has a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction of 11.8, 13.2, 14.3, 16. It means crystals of the compound (Bh) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 6 and 19.8 °.
  • a diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction is (1) 6.6, 11.8, 13.2, 13.9, 14.3, 15.4, 16.6, 17.1, 19.2, 19.8, 21.7, 21.9 22.2, 24.0 and 24.1 °, (2) 11.8, 13.2, 13.9, 14.3, 16.6, 19.8, 21.7, 21.9, 22.2 and 24.1 °, (3) 11.8, 13.2, 13.9, 14.3, 16.6 and 19.8 °, (4) 11.8, 13.2, 14.3, 16.6 and 19.8 °, or (5) Means a crystal of the compound (Bh) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 6.6, 11.8, 13.2, 13.9 and 14.3 °.
  • the “IVb crystal” of the compound (Bh) in the present invention more preferably has a characteristic diffraction peak at a diffraction angle 2 ⁇ (°) measured by powder X-ray diffraction of 11.8, 13.2, 13.9, It is a crystal of the compound (Bh) having a powder X-ray diffraction pattern appearing at 14.3, 16.6, 19.8, 21.7, 21.9, 22.2 and 24.1 °.
  • the diffraction peak value at the diffraction angle 2 ⁇ (°) may cause some measurement error depending on the measurement equipment or measurement conditions. Specifically, the measurement error may be within a range of ⁇ 0.2, preferably ⁇ 0.1, more preferably ⁇ 0.06. Further, the diffraction peak value including the measurement error may be expressed with “about”.
  • the compound (Ah) or compound (Bh) in the present invention, or a crystal thereof (hereinafter, these may be collectively referred to as “the compound of the present invention”) is also characterized by thermal analysis.
  • the enthalpy of the endothermic peak is about 79.2 J / g, and the extrapolated onset temperature is 88.7 ⁇ 5.0 ° C.
  • the enthalpy of the endothermic peak is about 124.3 J / g
  • the extrapolation start temperature is 62.3 ⁇ 5.0 ° C. It is.
  • the “extrapolated onset temperature” is defined by JIS K 7121 (Plastic transition temperature measurement method).
  • the extrapolated baseline on the low temperature side toward the high temperature side and the melting peak It means the temperature at the intersection of the tangent lines drawn at the point where the low-temperature curve slope on the leading edge is maximized.
  • the crystals of the compound (Ah) of the present invention may be either I-type crystals or V-type crystals, or may be mixed crystals containing I-type crystals and / or V-type crystals.
  • Compound I (Ah) which is a hemihydrate of Compound A, is preferably Form I or Form V. In some respects, Form I of compound (Ah) is more preferred.
  • the crystal of the compound (Bh) of the present invention may be an IVb crystal or a mixed crystal containing an IVb crystal.
  • the IVb crystal of Compound (Bh) which is the dihydrate of Compound B, is preferable in terms of being a stable crystal, and the compound ( Bh) type IVb crystals are more preferred.
  • crystal purity means the ratio (purity) of the compound (Ah) in a specific crystal form to the total amount of the compound (Ah) crystals.
  • the “crystal purity” means the ratio (purity) of the compound (Bh) in a specific crystal form to the total amount of the compound (Bh) crystals.
  • the purity of the crystal of the present invention can be determined by a known method such as powder X-ray diffraction measurement or thermal analysis.
  • the purity of the crystal or mixed crystal of the present invention is not necessarily 100% purity, but 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, most preferably 98% or more. It is preferable that the purity is within this range in order to guarantee the quality as a pharmaceutical product.
  • the compounds of the present invention may be labeled with one or more isotopes (eg, 3 H, 2 H, 14 C, 35 S, etc.).
  • a deuterium converter obtained by converting any one or two or more 1 H of the compound (Ah) to 2 H (D) is also included in the compound of the present invention.
  • a deuterium converter obtained by converting any one or two or more 1 H of the compound (Bh) into 2 H (D) is also encompassed in the compound of the present invention.
  • “Pharmaceutical composition” includes a mixture of one or more pharmaceutically active ingredients and one or more pharmaceutically acceptable carriers, such as tablets, capsules, granules, fine granules, powders, troches, syrups. Oral preparations such as emulsions and suspensions, or parenteral preparations such as external preparations, suppositories, injections, eye drops, nasal preparations, and pulmonary preparations. An oral preparation is preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by appropriately mixing an appropriate amount of the compound or crystal of the present invention with at least one pharmaceutically acceptable carrier or the like according to a method known per se in the technical field of pharmaceutical preparations. Manufactured.
  • the content of the compound or crystal of the present invention in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, dosage, etc., and is, for example, 0.1 to 100% by weight of the whole composition. Preferably, it is 0.1 to 70% by weight.
  • the “pharmaceutically acceptable carrier” examples include various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials, such as excipients, disintegrants, binders, fluidizers, lubricants and the like in solid preparations. Or a solvent, a solubilizing agent, a suspending agent, an isotonic agent, a buffering agent, a soothing agent and the like in a liquid preparation. Furthermore, additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like are used as necessary.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, corn starch, dextrin, microcrystalline cellulose, crystalline cellulose, carmellose, carmellose calcium, carboxymethyl starch sodium, low substituted hydroxypropyl
  • examples include cellulose and gum arabic.
  • disintegrant examples include carmellose, carmellose calcium, carmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, croscarmellose sodium, crospovidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, crystalline cellulose and the like.
  • binder examples include hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, povidone, crystalline cellulose, sucrose, dextrin, starch, gelatin, carmellose sodium, gum arabic and the like.
  • fluidizing agent examples include light anhydrous silicic acid, magnesium stearate and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, talc and the like.
  • solvent examples include purified water, ethanol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, olive oil and the like.
  • dissolution aid examples include propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • suspending agent examples include benzalkonium chloride, carmellose, hydroxypropylcellulose, propylene glycol, povidone, methylcellulose, glyceryl monostearate and the like.
  • isotonic agent examples include glucose, D-sorbitol, sodium chloride, D-mannitol and the like.
  • buffering agent examples include sodium hydrogen phosphate, sodium acetate, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Examples of the soothing agent include benzyl alcohol.
  • preservative examples include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, sodium dehydroacetate, sorbic acid and the like.
  • antioxidant examples include sodium sulfite and ascorbic acid.
  • colorant examples include food coloring (eg, food red No. 2 or 3, food yellow No. 4 or 5, etc.), ⁇ -carotene and the like.
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be applied not only to humans but also to mammals other than humans (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, pigs, cows, horses, sheep, monkeys, etc.). Can also be administered orally or parenterally (eg, topical, intramuscular, subcutaneous, rectal, intravenous, etc.).
  • the dose varies depending on the administration subject, disease, symptom, dosage form, administration route, etc.
  • the dose when administered orally to an adult patient is the compound of the present invention which is an active ingredient As a rule, it is usually in the range of about 1 mg to 1 g per day. These amounts can be administered once to several times.
  • the compound of the present invention has an activity of inhibiting pyruvate dehydrogenase kinase (PDHK, ie, PDHK1 and / or PDHK2) and can effectively activate pyruvate dehydrogenase (PDH).
  • PDHK pyruvate dehydrogenase kinase
  • PDH pyruvate dehydrogenase kinase
  • the compounds of the present invention are diabetic, insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications, heart failure, cardiomyopathy, myocardial ischemia, myocardial infarction, angina pectoris, dyslipidemia , Atherosclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, chronic obstructive pulmonary disease, cerebral ischemia, stroke, mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, pulmonary hypertension or Alzheimer's disease It can be used as an active ingredient.
  • Diabetes is, for example, type 1 diabetes and type 2 diabetes.
  • Diabetes complications include, for example, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, and cataract.
  • Heart failure is, for example, acute heart failure or chronic heart failure.
  • “Inhibiting PDHK” means that PDHK function is inhibited and its activity is lost or attenuated.
  • the “inhibiting PDHK” is preferably “inhibiting human PDHK”.
  • the “PDHK inhibitor” is preferably a “human PDHK inhibitor”.
  • “Inhibiting PDHK1” means to inhibit or reduce the activity of PDHK1 and, for example, to inhibit the function of PDHK1 based on the conditions of Test Example 1 described later. To do.
  • the “inhibiting PDHK1” is preferably “inhibiting human PDHK1”.
  • the “PDHK1 inhibitor” is preferably a “human PDHK1 inhibitor”. More preferably, it is “PDHK1 inhibitor in human target organ”.
  • “Inhibit PDHK2” means to inhibit or reduce the activity of PDHK2 and, for example, to inhibit the function of PDHK2 based on the conditions of Test Example 1 described below. To do.
  • the “inhibiting PDHK2” is preferably “inhibiting human PDHK2”.
  • the “PDHK2 inhibitor” is preferably a “human PDHK2 inhibitor”. More preferably, it is “PDHK2 inhibitor in human target organ”.
  • Activating PDH means activating PDH such as a target organ (eg, liver, skeletal muscle, adipose tissue, heart, brain) or cancer.
  • “Reducing blood sugar level” means lowering the glucose concentration in blood (including serum or plasma), preferably lowering the high blood sugar level. More preferably, it means reducing the blood glucose level to a therapeutically effective human normal value.
  • “Reducing the lactic acid level” means lowering the lactic acid concentration in blood (including serum or plasma), preferably lowering the high lactic acid level. More preferably, it means reducing the lactic acid level to a therapeutically effective human normal value.
  • the compound of the present invention can be used (hereinafter also referred to as combination) in combination with one or more other drugs (hereinafter also referred to as concomitant drugs) in a general manner practiced in the pharmaceutical field. it can.
  • the administration timing of the compound of the present invention and the concomitant drug is not limited, and these may be administered as a combination drug to the administration subject, or both preparations may be administered simultaneously or at regular intervals.
  • you may use as a pharmaceutical characterized by being a kit which consists of the pharmaceutical composition of this invention, and a concomitant drug.
  • the dose of the concomitant drug may be determined according to the dose used clinically, and can be appropriately selected depending on the administration subject, disease, symptom, dosage form, administration route, administration time, combination and the like.
  • the administration form of the concomitant drug is not particularly limited as long as the compound of the present invention and the concomitant drug are combined.
  • concomitant drugs include diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes), insulin resistance syndrome, metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetes Nephropathy, cataract), heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomyopathy, myocardial ischemia, myocardial infarction, angina, dyslipidemia, atherosclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, chronic obstruction Therapeutic agents and / or preventive agents for congenital lung disease, cerebral ischemia, stroke, mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, pulmonary hypertension or Alzheimer's disease, etc. It can be used in combination with a compound.
  • diabetes therapeutic and / or preventive agent examples include insulin preparations, sulfonylurea hypoglycemic agents, metformin, DPP-4 inhibitors, thiazolidine derivatives, GLP-1 receptor agonists, and the like.
  • a protective group is introduced into a functional group as necessary, and deprotection is performed in a post-process; the functional group is treated as a precursor in each step, and converted into a desired functional group at an appropriate stage.
  • Efficient production may be carried out by changing the manufacturing method and the order of steps.
  • post-reaction treatment may be performed by a commonly performed method, and isolation and purification may be performed as necessary by crystallization, recrystallization, distillation, liquid separation, silica gel chromatography, preparative HPLC, etc.
  • the powder X-ray diffraction analysis was measured using a powder X-ray diffractometer (X'Pert Pro, manufactured by Spectris). Differential scanning calorimetry is performed by differential scanning calorimetry (DSC) apparatus (DSC-60A, manufactured by Shimadzu Corporation) or simultaneous X-ray powder diffraction and differential scanning calorimetry (XRD-DSC) apparatus (XRD: RINT-2100; DSC). : DSC8230, manufactured by Rigaku Corporation). The moisture adsorption / desorption test was performed using a moisture balance measuring device (SGA-100, manufactured by VTI).
  • thermothermal gravimetric simultaneous measurement was measured using a TG-DTA measuring apparatus (TGA / SDTA851 e / SF, manufactured by METTLER TOLEDO). Elemental analysis was performed using an elemental analyzer (Vario ELIII, manufactured by Elemental). The melting point was measured using a melting point measuring device (Yanaco MP-500D, produced by Yanagimoto Seisakusho).
  • Percent% indicates volume% for solvents used in chromatography and weight% for others. Other abbreviations used in the text have the following meanings. s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet m: multiplet br: broad J: coupling constant CDCl 3 : deuterated chloroform DMSO-D 6 : deuterated dimethyl sulfoxide 1 H NMR: proton nuclear magnetic resonance HPLC: high performance liquid chromatography Graphic 1 H-NMR spectrum was measured in CDCl 3 or DMSO-D 6 using tetramethylsilane as an internal standard, and all ⁇ values were shown in ppm.
  • the reaction vessel was removed from the oil bath and water (125 ml) was added to the reaction mixture.
  • the mixture was directly stirred at room temperature for 1 hour and then filtered through celite.
  • the filtrate was transferred to a separatory funnel and separated.
  • the aqueous layer was extracted with toluene and combined with the organic layer.
  • the organic layer was washed twice with water (125 ml), dried over anhydrous magnesium sulfate, and filtered.
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 41.8 g of the title compound.
  • the obtained solid was used for the next reaction without further purification.
  • Step 6 Salt of [(9R) -4-chloro-2-fluoro-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-yloxy] acetic acid and (1R) -1- (1-naphthyl) ethylamine
  • Step 7 [(9R) -4-Chloro-2-fluoro-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-yloxy] acetic acid
  • Acetic acid (2.86 ml) was added to the reaction mixture, the temperature was raised to room temperature, t-butyl alcohol (96 ml) was added, and the mixture was subsequently stirred at 100 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was ice-cooled, 2N hydrochloric acid (367 ml) was added, and the mixture was returned to room temperature and stirred overnight.
  • the reaction solution was transferred to a separatory funnel and extracted three times with toluene (180 ml). The combined organic layers were washed successively with water (180 ml), 1N aqueous sodium hydroxide solution (180 ml), water (180 ml) and saturated brine (180 ml).
  • the obtained organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered.
  • the residue obtained by concentrating the filtrate under reduced pressure was mixed with ethanol (37 ml), tetrahydrofuran (37 ml) and 2N aqueous sodium hydroxide solution (37 ml), and the mixture was stirred at 60 ° C. for 3 hours.
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, water (180 ml) was added, transferred to a separatory funnel and extracted twice with toluene (180 ml).
  • the organic layer was washed twice with water (180 ml) and once with saturated brine (180 ml).
  • the obtained organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered.
  • Fluorine compound (4-chloro-2-fluoro-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-ol) derived from compound 100AA and the compound (4-chloro-2-fluoro) obtained in the above step 8 -9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-ol) was determined by HPLC analysis using an optically active column.
  • Step 10 2- ⁇ 4-[(9R) -2-Fluoro-9-hydroxy-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-4-yl] -1H-pyrazol-1-yl ⁇ ethyl propionate
  • Step 11 2- ⁇ 4-[(9R) -2-fluoro-9-hydroxy-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-4-yl] -1H-pyrazol-1-yl ⁇ -3-hydroxy-2- Methyl propionic acid
  • Step 12 2- ⁇ 4-[(9R) -2-fluoro-9-hydroxy-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-4-yl] -1H-pyrazol-1-yl ⁇ -2-methyl-propane- 1,3-diol (compound A)
  • Example 1-1 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in water (0.20 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form I crystal (34 mg) of Compound A 0.5 hydrate (Compound (Ah)). Melting point 91-99 ° C.
  • Method 1 (without preliminary drying) : About 10 mg of I-form crystals are weighed in a quartz cell, and the weight change rate is measured when equilibrium is reached at a temperature of 25 ° C. and a relative humidity using a moisture balance measuring device (SGA-100, manufactured by VTI). did.
  • Test conditions Test temperature: 25 ° C Equilibrium condition: Weight change rate is 0.03% or less in 5 minutes Maximum equilibration time: 180 minutes Change in relative humidity: Increase from 5% to 95% at 5% intervals, then increase from 95% to 5% 5 It was lowered at% intervals.
  • Method 2 (with pre-drying) : About 10 mg of Form I crystal was weighed in a quartz cell, dried using a moisture balance measuring device (SGA-100, manufactured by VTI) at 60 ° C. in a dry nitrogen stream, and each relative humidity at 25 ° C. The rate of change in weight when equilibrium was reached was measured below. Test conditions Test temperature: 25 ° C Equilibrium condition: Weight change rate is 0.03% or less in 5 minutes Maximum equilibration time: 180 minutes Change in relative humidity: Increase from 5% to 95% at 5% intervals, then increase from 95% to 5% 5 It was lowered at% intervals.
  • SGA-100 moisture balance measuring device
  • the moisture adsorption / desorption test was performed under two conditions of “with pre-drying (drying before test)” and “without pre-drying (drying before test)”, and each of humidification and drying was repeated once.
  • pre-drying 60 ° C. under a dry nitrogen stream
  • the weight decreased by 2.15%
  • the rate of decrease was 2.09% of the theoretical water content of compound (Ah). Matched well. Therefore, it was estimated that all water of crystallization was distilled off by preliminary drying.
  • humidifying to 10% relative humidity after drying an increase in weight of 2.44% was observed, and it is considered that 0.5 equivalent of water re-absorbed by humidification.
  • Example 1-2 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% aqueous methanol (0.10 ml) and stirred at room temperature for 1 hour. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain a V-form crystal (40 mg) of Compound A 0.5 hydrate (Compound (Ah)). Melting point 90-100 ° C.
  • Powder X-ray diffraction analysis was performed on the V-form crystals of compound (Ah) under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-3 Compound A (957 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% ethanol water (2.0 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at 50 ° C. to obtain Form IX crystals (831 mg) of 0.3 to 0.4 hydrate of Compound A. Melting point 89-97 ° C. With respect to Form IX, powder X-ray diffraction analysis and thermal analysis were carried out under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern and DSC curve of Form IX are shown in FIGS. 3 and 22, respectively.
  • Example 1-4 Compound A (20 mg) obtained in Example 1 was suspended in 33 v / v% aqueous methanol (0.15 ml) and allowed to stand at room temperature for 5 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form II crystal (19 mg) of Compound A 0.5 hydrate. Form II crystals were crystal habits of Form I crystals. Melting point 89-121 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on Form II crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-5 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% ethanol water (0.10 ml) and stirred at room temperature for 1 hour. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form III crystals (36 mg) of an ethanol solvate of Compound A. Melting point 66-83 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on Form III crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-6 Compound A (1.00 g) obtained in Example 1 was suspended in 29 v / v% methanol water (7.0 ml), stirred at 50 ° C. for 45 minutes, and then stirred overnight at room temperature. The precipitated solid was collected by filtration to obtain Form IV crystals (1.05 g) of a methanol solvate of Compound A. Melting point 89-95 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on Form IV crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-7 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% aqueous isopropanol (0.10 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form VI crystals (44 mg) of an isopropanol solvate of Compound A. Melting point 69-102 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on the VI form crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-8 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% aqueous acetone (0.10 ml) and stirred at room temperature for 4 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form VII (38 mg) of an acetone solvate of Compound A. Melting point 79-98 ° C. For the crystal form VII, powder X-ray diffraction analysis was carried out under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-9 Compound A (50 mg) obtained in Example 1 was suspended in 30 v / v% aqueous acetic acid (0.10 ml) and stirred at room temperature for 1 hour. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form VIII crystals (40 mg) of an acetic acid solvate of Compound A. Melting point 59-75 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on Form VIII under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 1-10 The IX form crystal (50 mg) of Compound A obtained in Example 1-3 was suspended in toluene (0.20 ml) and stirred at room temperature for 6 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form I + X crystals (34 mg) of Compound A hydrate. Melting point 93-99 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on the I + X form crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • potassium carbonate (18 g) was added to 4-chloro-2-methyl-9H-fluoren-9-one (100 g) mixed with dimethylformamide (500 ml).
  • Trimethyl (trifluoromethyl) silane (78 ml) was added dropwise to this mixture over 80 minutes, and the mixture was further stirred at room temperature for 1 hour.
  • cesium fluoride (87 g) was added at room temperature, then ethyl bromoacetate (63 ml) was added dropwise over 15 minutes, and the mixture was further stirred at room temperature for 4 hours.
  • Water 500 ml was added to the reaction mixture, and the aqueous layer was extracted twice with toluene (500 ml).
  • Step 5-1 Preparation of seed crystals [4-Chloro-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-yloxy] acetic acid (0.400 g) mixed with isopropyl ether (16 ml) to (1R) -1- Phenylethylamine (0.058 ml) was added. The mixture was stirred at room temperature for 1 hour and 40 minutes. This suspension was filtered, and the obtained filtrate was dried under reduced pressure to obtain 0.240 g of a solid. This solid (0.210 g) was suspended in ethyl acetate (4.2 ml) and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Step 5-2 [1-Chloro-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-yloxy] acetic acid (191.60 g) mixed with methyl isobutyl ketone (575 ml) was added to (1R) -1-phenylethylamine ( 34.81 ml) was added. Seed crystals were added to this mixture, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 3 days. This suspension was filtered, and the resulting solid was washed with methyl isobutyl ketone (192 ml) and dried under reduced pressure to obtain 71.10 g of the title compound.
  • Step 7 (9R) -4-Chloro-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-ol
  • Triethylamine (14.1 ml) was added to [(9R) -4-chloro-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-9-yloxy] acetic acid (30 g) mixed with dimethylformamide (90 ml). And stirred at 0 ° C. A solution of diphenylphosphoryl azide (20.0 ml) in dimethylformamide (60 ml) was added dropwise over 20 minutes, and the mixture was further stirred at 0 ° C. for 2 hours. To this reaction mixture was added t-butyl alcohol (75 ml), followed by stirring at 100 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was ice-cooled, 2N hydrochloric acid (300 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • Water (100 ml) was added to the mixture and transferred to a separatory funnel, and the aqueous layer was extracted twice with toluene (300 ml, 200 ml).
  • the combined organic layers were washed successively with water (200 ml) twice, 1N aqueous sodium hydroxide solution (150 ml) twice, and saturated brine (150 ml) once.
  • anhydrous sodium sulfate and silica gel (6 g), and the mixture was stirred at room temperature.
  • Step 9 ⁇ 4-[(9R) -9-hydroxy-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-4-yl] -1H-pyrazol-1-yl ⁇ t-butyl acetate
  • the obtained residue was suspended in a mixed solution of hexane and ethyl acetate (hexane / ethyl acetate mixing ratio 2: 1, 120 ml), and the solid was filtered to obtain 17.8 g of the title compound.
  • Step 10 3-hydroxy-2-hydroxymethyl-2- ⁇ 4-[(9R) -9-hydroxy-2-methyl-9- (trifluoromethyl) -9H-fluoren-4-yl] -1H-pyrazole-1- Il ⁇ propionic acid
  • Example 2-1 Compound B (30.2 g) obtained in Example 2 was suspended in 30 v / v% methanol water (200 ml), stirred at 50 ° C. for 4 hours, and then stirred at room temperature for 4 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain IVb crystals (28.7 g) of Compound B dihydrate (Compound (Bh)). Melting point 96-104 ° C.
  • Example 1-1 the moisture adsorption / desorption test was performed on the IVb crystal under the same conditions as in Example 1-1.
  • pre-drying 60 ° C. under a dry nitrogen stream
  • the weight decreased by 7.75%
  • the decrease rate agreed well with 7.66% of the theoretical water content of compound (Bh). Therefore, it was estimated that all water of crystallization was distilled off by the preliminary drying.
  • humidifying to 50% relative humidity after drying a weight increase of 7.93% was observed, and it is considered that 2 equivalents of water re-absorbed by humidification.
  • Example 2-2 Compound B (200 mg) obtained in Example 2 was suspended in chloroform (4.0 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound Ib crystal (227 mg). Melting point 88-111 ° C. Powder X-ray diffraction analysis was performed on the Ib crystal under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-3 Compound B (20 mg) obtained in Example 2 was suspended in diethyl ether (0.20 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound IIb crystal (13 mg). Powder X-ray diffraction analysis was performed on the type IIb crystals under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-4 Compound B (20 mg) obtained in Example 2 was suspended in 1,2-dichloroethane (0.10 ml) and stirred at room temperature overnight. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound IIIb crystals (23 mg). Powder X-ray diffraction analysis was performed on the IIIb crystal under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-5 Form IVb (50 mg) of the compound (Bh) obtained in Example 2-1 was suspended in propionitrile (0.050 ml) and stirred at room temperature for 4 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Vb + IVb form crystals (9 mg) of Compound B. Powder X-ray diffraction analysis was performed on the Vb + IVb crystal under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-6 Compound B (200 mg) obtained in Example 3 was dissolved in propionitrile (0.20 ml), and Vb + IVb crystals of Compound B obtained in Example 2-5 were inoculated and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. I put it. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound VI VIb crystals (201 mg). Powder X-ray diffraction analysis was performed on the VIb crystal under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-7 Compound B (200 mg) obtained in Example 2 was dissolved in trimethylacetonitrile (0.20 ml), and Vb + IVb crystals of Compound B obtained in Example 2-5 were inoculated, then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. did. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound VIIb crystals (215 mg). The powder VIIb crystal was subjected to powder X-ray diffraction analysis under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-8 Compound B (50 mg) obtained in Example 2 was dissolved in 2-butanol (0.050 ml), and after inoculation with Form Ib of Compound B obtained in Example 2-2, the mixture was stirred at room temperature for 7 days. did. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound VIIIb crystals (16 mg). The powder VIIIb crystal was subjected to powder X-ray diffraction analysis under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-9 Compound B (50 mg) obtained in Example 2 was dissolved in 3-methyl-1-butanol (0.050 ml) and inoculated with Form Ib of Compound B obtained in Example 2-2. For 7 days. The precipitated solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Compound IXb crystals (17 mg). For the IXb crystal, powder X-ray diffraction analysis was carried out under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Example 2-10 Compound B type Ib crystals (50 mg) obtained in Example 2-2 were suspended in heptane (0.20 ml) and stirred at room temperature for 7 days. The solid was collected by filtration and dried under reduced pressure at room temperature to obtain Form Xb (24 mg) of Compound B. Powder X-ray diffraction analysis was performed on the Xb crystal under the same conditions as in Example 1-1. The powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
  • Examples of the preparation of the present invention include the following preparations. However, the present invention is not limited by these formulation examples.
  • Example 1 Manufacture of capsules
  • Example 1-1 Compound (Ah)
  • Microcrystalline cellulose 10mg 3) Lactose 19mg
  • Magnesium stearate 1mg 1), 2), 3) and 4) are mixed and filled into gelatin capsules.
  • Example 1-1 (Compound (Ah)) crystals 10 g 2) Lactose 50g 3) Corn starch 15g 4) Carmellose calcium 44g 5) Magnesium stearate 1g
  • the total amount of 1), 2) and 3) and 30 g of 4) are kneaded with water, and after vacuum drying, the particles are sized.
  • 14 g of 4) and 1 g of 5) are mixed with the sized powder, and tableted with a tableting machine. In this way, 1000 tablets containing 10 mg of the crystals of Example 1-1 (compound (Ah)) per tablet are obtained.
  • Formulation Example 4 Manufacture of tablets
  • the total amount of 1), 2) and 3) and 30 g of 4) are kneaded with water, and after vacuum drying, the particles are sized.
  • 14 g of 4) and 1 g of 5) are mixed with the sized powder, and tableted with a tableting machine. In this way, 1000 tablets containing 10 mg of the crystals of Example 2-1 (compound (Bh)) per tablet are obtained.
  • Test Example 1 In vitro PDHK activity inhibitory action PDHK activity inhibitory action was indirectly evaluated by conducting a kinase reaction in the presence of a test compound and then measuring the remaining PDH activity.
  • PDHK1 activity inhibitory action In the case of human PDHK1 (hPDHK1, Genebank accession number L42450.1), a 1.3 kbp fragment encoding this protein was isolated from human liver cDNA by polymerase chain reaction (PCR). A modified hPDHK1 cDNA having a FLAG-Tag sequence added to the N-terminus was prepared by PCR and cloned into a vector (pET17b-Novagen). The recombinant construct was transformed into E. coli (DH5 ⁇ -TOYOBO). Recombinant clones were identified and plasmid DNA was isolated and analyzed for DNA sequence. One clone with the expected nucleic acid sequence was selected for expression work.
  • the pET17b vector containing the modified hPDHK1 cDNA was transformed into E. coli strain BL21 (DE3) (Novagen). E. coli was grown at 30 ° C. until an optical density of 0.6 (600 nmol / L) was reached. Protein expression was induced by the addition of 500 ⁇ mol / L isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside. E. coli was cultured at 30 ° C. for 5 hours and then collected by centrifugation. The E. coli paste resuspension was crushed with a microfloudizer. FLAG-Tag addition protein was separated by FLAG affinity gel (Sigma).
  • Elution fractions containing FLAG-Tag adduct protein are pooled and 20 mmol / L HEPES-NaOH, 150 mmol / L sodium chloride, 0.5 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% ethylene glycol, 0.1% pluronic. Dialyzed against F-68 (pH 8.0) and stored at -80 ° C. In the assay, the enzyme concentration of hPDHK1 was set to a minimum concentration that exhibited suppression of PDH activity exceeding 90%.
  • Buffer 50 mmol / L 3-morpholinopropanesulfonic acid (pH 7.0), 20 mmol / L dipotassium hydrogen phosphate, 60 mmol / L potassium chloride, 2 mmol / L magnesium chloride, 0.4 mmol / L EDTA, 0.2%
  • Pluronic F-68, 2 mmol / L dithiothreitol 0.05 U / mL PDH (pig heart PDH complex, Sigma P7032) and 1.0 ⁇ g / mL hPDHK1 were mixed and incubated at 4 ° C. overnight.
  • PDH / hPDHK1 complex was prepared.
  • the test compound was diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • PDH / hPDHK1 complex 20 ⁇ L, test compound 1.5 ⁇ L and 3.53 ⁇ mol / L ATP (diluted with buffer) 8.5 ⁇ L were added to a 96-well half-area UV transmission microplate (Corning 3679), and 45 at room temperature.
  • the PDHK reaction was performed for a minute.
  • DMSO was added to control wells instead of the test compound.
  • 1.5 ⁇ L of DMSO was added to the blank well for measuring the maximum rate of the PDH reaction instead of the test compound, and hPDHK1 was removed.
  • PDHK2 activity inhibitory action In the case of human PDHK2 (hPDHK2, Genebank accession number NM_002611), based on the hPDHK2 cDNA clone (pReceiver-M01 / PDK2-GeneCopoia), a modified hPDHK2 cDNA with a FLAG-Tag sequence added to the N-terminus by PCR It was prepared and cloned into a vector (pET17b-Novagen). The recombinant construct was transformed into E. coli (DH5 ⁇ -TOYOBO). Recombinant clones were identified and plasmid DNA was isolated and analyzed for DNA sequence. One clone with the expected nucleic acid sequence was selected for expression work.
  • the pET17b vector containing the modified hPDHK2 cDNA was transformed into E. coli strain BL21 (DE3) (Novagen). E. coli was grown at 30 ° C. until an optical density of 0.6 (600 nmol / L) was reached. Protein expression was induced by the addition of 500 ⁇ mol / L isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside. E. coli was cultured at 30 ° C. for 5 hours and then collected by centrifugation. The E. coli paste resuspension was crushed with a microfluidizer. FLAG-Tag addition protein was separated by FLAG affinity gel.
  • Elution fractions containing FLAG-Tag added protein are pooled and 20 mmol / L HEPES-NaOH, 150 mmol / L sodium chloride, 0.5 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% ethylene glycol, 0.1% pluronic. Dialyzed against F-68 (pH 8.0) and stored at -80 ° C. In the assay, the enzyme concentration of hPDHK2 was set to the minimum concentration that most inhibited PDH.
  • Buffer 50 mmol / L 3-morpholinopropanesulfonic acid (pH 7.0), 20 mmol / L dipotassium hydrogen phosphate, 60 mmol / L potassium chloride, 2 mmol / L magnesium chloride, 0.4 mmol / L EDTA, 0.2% PDU / hPDHK2 complex was prepared by mixing 0.05 U / mL PDH and 1.6 ⁇ g / mL hPDHK2 in Pluronic F-68, 2 mmol / L dithiothreitol) and incubating overnight at 4 ° C. Test compounds were diluted with DMSO.
  • the compound (Ah) or crystal thereof, or the compound (Bh) or crystal thereof of the present invention exhibits PDHK inhibitory action and is excellent in stability, diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes etc.), insulin resistance syndrome , Metabolic syndrome, hyperglycemia, hyperlactic acidemia, diabetic complications (diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, cataract, etc.), heart failure (acute heart failure, chronic heart failure), cardiomyopathy, myocardial illness , Myocardial infarction, angina pectoris, dyslipidemia, atherosclerosis, peripheral arterial disease, intermittent claudication, chronic obstructive pulmonary disease, cerebral ischemia, stroke, mitochondrial disease, mitochondrial encephalomyopathy, cancer, It is useful as a medicament for the prevention or treatment of pulmonary hypertension and Alzheimer's disease.

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Abstract

式（Ｊ）： で表される化合物またはその結晶、あるいは 式（Ｑ）： で表される化合物またはその結晶。

Description

フルオレン化合物の水和物、およびその結晶
　本発明は、フルオレン化合物の水和物、およびその結晶である。より詳細には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ／ＰＤＨＫ）阻害作用を有し、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の予防または治療剤として有用であり、かつ、安定性に優れた性質を有するフルオレン化合物の水和物、およびその結晶に関する。
　組織内において、エネルギーを使う反応、例えば、生合成、能動輸送、筋肉の収縮等ではアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解により、エネルギーが供給される。ＡＴＰはグルコースまたは遊離脂肪酸のようなエネルギーの多い代謝燃料の酸化により生成される。筋肉のような酸化的組織において、ＡＴＰの大部分はクエン酸サイクルに入るアセチルＣｏＡから生じる。アセチルＣｏＡは解糖経路によるグルコースの酸化または遊離脂肪酸のβ酸化によって生成される。グルコースからのアセチルＣｏＡ産生を調節する司令的役割を果たす酵素はＰＤＨである。ＰＤＨはピルビン酸からアセチルＣｏＡおよび二酸化炭素への酸化と同時に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のＮＡＤＨへの還元を触媒する（例えば、非特許文献１、２）。
　ＰＤＨは、ミトコンドリアマトリックスに局在する３つの酵素成分（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）といくつかのサブユニットからなる多重酵素複合体である。Ｅ１、Ｅ２およびＥ３は、それぞれ、ピルビン酸の脱炭酸、アセチルＣｏＡの生成およびＮＡＤの還元によるＮＡＤＨの生成を行う。
　ＰＤＨには、調節的役割をもつ２種類の酵素が結合している。一つはＰＤＨＫであり、ＰＤＨに特異性を示すプロテインキナーゼである。その役割は、複合体のＥ１αサブユニットをリン酸化して不活性化することである。他の一つはＰＤＨホスファターゼであり、Ｅ１αサブユニットの脱リン酸化を介してＰＤＨを活性化する特異的なプロテインホスファターゼである。活性（脱リン酸化）状態のＰＤＨの割合は、キナーゼ活性とホスファターゼ活性のバランスにより決定される。キナーゼ活性は、代謝基質の相対濃度により調節を受ける。例えば、キナーゼ活性は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ、アセチルＣｏＡ／ＣｏＡおよびＡＴＰ／アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の各比率の上昇により活性化し、ピルビン酸で阻害される（例えば、非特許文献３）。
　哺乳類の組織においては４種のＰＤＨＫアイソザイムが同定されている。なかでも、ＰＤＨＫ２は、糖代謝に関与する肝臓、骨格筋、脂肪組織を含む広範囲な組織に発現している。さらに、ＰＤＨＫ２は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤやアセチルＣｏＡ／ＣｏＡの上昇による活性化およびピルビン酸による阻害への感受性が比較的高いことから、短期的な糖代謝調節に関与することが示唆される（例えば、非特許文献４）。
　また、ＰＤＨＫ１は、心筋、骨格筋、膵β細胞等に多く発現している。さらに、ＰＤＨＫ１は、虚血状態において、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）1の活性化を介して発現が誘導されることから、虚血性疾患や癌性疾患に関与することが示唆される（例えば、非特許文献５）。
　インスリン依存性（１型）糖尿病および非インスリン依存性（２型）糖尿病等の疾患では、脂質の酸化が亢進し、同時にグルコースの利用が低下する。このグルコース利用低下が高血糖を呈する一因となる。１型および２型糖尿病、肥満のような酸化的グルコース代謝が低下した状態においてＰＤＨ活性は低下していることから、１型および２型糖尿病におけるグルコース利用の低下にはＰＤＨ活性の低下が関与することが示唆される（例えば、非特許文献６、７）。
　また、１型および２型糖尿病では肝臓における糖新生が亢進しており、このことも高血糖を呈する一因となる。ＰＤＨ活性の低下はピルビン酸を上昇させ、その結果、肝臓における糖新生基質としての乳酸利用能が増大する。このことから、１型および２型糖尿病における糖新生の亢進にＰＤＨ活性の低下が関与する可能性がある（例えば、非特許文献８、９）。
　ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化すると、グルコース酸化速度が増加すると考えられる。その結果、生体のグルコース利用が亢進し、また、肝臓における糖新生が抑制されることで、１型および２型糖尿病における高血糖を改善することができると期待される（例えば、非特許文献１０、１１、１２）。
　糖尿病に関与する別の因子はインスリン分泌障害であり、これには膵β細胞におけるＰＤＨ活性の低下やＰＤＨＫ１、２および４の誘導が関与することが知られている（例えば、非特許文献１３、１４）。
　また、糖尿病による持続的な高血糖は糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の合併症を起こすことが知られている。チアミンやα－リポ酸は補酵素としてＰＤＨの活性化に寄与する。これら、もしくは、チアミン誘導体やα－リポ酸誘導体は糖尿病合併症の治療に有望な効果を有することが示されている。従って、ＰＤＨの活性化は、糖尿病合併症を改善することができると期待される（例えば、非特許文献１５、１６）。
　虚血状態では、酸素供給が限られるため、グルコースおよび脂肪酸両方の酸化が低下し、組織における酸化的リン酸化によって産生されるＡＴＰ量が減少する。十分な酸素がない状態では、ＡＴＰレベルを維持しようとして嫌気的解糖が亢進する。その結果、乳酸の増加および細胞内ｐＨの低下が起こる。エネルギーを消費してイオンの恒常性を維持しようとするが、異常に低いＡＴＰレベルおよび細胞の浸透性崩壊の結果、細胞死が起こる。加えて、アデノシン一リン酸活性化キナーゼが虚血中に活性化されてリン酸化することで、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを不活化する。組織のマロニルＣｏＡレベルが低下することで、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ－Ｉ活性が上昇し、アシルＣｏＡのミトコンドリア内への輸送が促進されるため、脂肪酸酸化がグルコース酸化よりも有利となる。グルコースの酸化は、脂肪酸の酸化より消費される酸素１分子あたりのＡＴＰ産生量が高い。よって、虚血状態では、ＰＤＨを活性化することによりエネルギー代謝をグルコース酸化優位に移行させると、ＡＴＰレベルを維持する能力が高まると考えられる（例えば、非特許文献１７）。
　また、ＰＤＨを活性化すると、解糖を経て生成したピルビン酸が酸化され、乳酸産生が低下するので、虚血組織におけるプロトン負荷の正味の低下が起こると考えられる。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、虚血性疾患、例えば、心筋虚血において、保護的に作用することが期待される（例えば、非特許文献１８、１９）。
　ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化する薬剤は、ピルビン酸代謝を亢進させることにより、乳酸産生を減少させると考えられる。従って、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症または敗血症のような高乳酸血症に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２０）。
　癌細胞では、ＰＤＨＫ１または２の発現が上昇している。また、癌細胞では、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生が低下し、細胞質における嫌気的解糖系を介したＡＴＰ産生が増加している。ＰＤＨＫ阻害によりＰＤＨを活性化すると、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化が亢進し、活性酸素の産生が高まることで、癌細胞のアポトーシスが誘導されると期待される。よって、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は癌性疾患治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２１）。
　また、肺高血圧症は肺動脈の細胞増殖が亢進し、肺動脈が部分的に縮小することにより血圧が高くなることを特徴とする疾患である。肺高血圧症における肺動脈細胞のＰＤＨを活性化すると、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化が亢進し、活性酸素の産生が高まることで、肺動脈細胞のアポトーシスを誘導することが期待される。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、肺高血圧症に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２２）。
　アルツハイマー病では大脳におけるエネルギー産生及びグルコース代謝が低下し、また、ＰＤＨ活性が低下している。ＰＤＨ活性が低下するとアセチルＣｏＡの産生が低下する。アセチルＣｏＡはクエン酸回路を介して電子伝達系でＡＴＰ産生に利用される。また、アセチルＣｏＡは神経伝達物質の一つであるアセチルコリンを合成する原料である。よって、アルツハイマー病における脳ＰＤＨ活性の低下は、ＡＴＰ産生の低下によって神経細胞死を引き起こすと考えられる。また、コリン作動性神経において、その伝達物質であるアセチルコリン合成が抑制され、記憶力の低下等を引き起こすと考えられる。アルツハイマー病において脳のＰＤＨを活性化すると、エネルギー産生及びアセチルコリン合成の亢進が期待される。従って、ＰＤＨＫ阻害によるＰＤＨの活性化は、アルツハイマー病に対する治療に有用であると考えられる（例えば、非特許文献２３、２４）。
　ＰＤＨ活性化作用を有する薬剤であるジクロロ酢酸は、糖尿病、心筋虚血、心筋梗塞、狭心症、心不全、高乳酸血症、脳虚血症、脳卒中、末梢動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、癌性疾患、肺高血圧症の治療に有望な効果を有することが示されている（例えば、非特許文献１０、１８、２０、２２、２５、２６、２７）。
　これらの知見から、ＰＤＨＫ阻害剤は、グルコース利用障害に関連した疾患、例えば、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）の治療または予防に有益であると考えられる。また、ＰＤＨＫ阻害剤は、組織へのエネルギー基質供給が制限される疾患、例えば、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症および脳卒中の治療または予防に有益であると考えられる。さらに、ＰＤＨＫ阻害剤はミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症等の治療または予防に有益であると考えられる。
　したがって、ＰＤＨＫ阻害剤は、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症、またはアルツハイマー病の治療または予防に有益であると考えられる。
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　本発明は、以下の通りである。
［１］式（Ｊ)： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で表される化合物、
［２］上記［１］記載の化合物の結晶、
［３］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、６．９±０．２、１０．２±０．２、１５．５±０．２、１５．８±０．２および１６．６±０．２を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［４］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、約６．９、約１０．２、約１５．５、約１５．８および約１６．６を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［５］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、６．９、１０．２、１５．５、１５．８および１６．６を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［６］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、１０．２±０．２のピークを含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［７］粉末Ｘ線回析スペクトルにおいて、下記のピーク：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
を有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［８］示差走査熱量測定での補外開始温度が８８．７±５．０℃を示す、上記［２］乃至［７］のいずれかに記載の結晶、
［９］結晶の純度が７０％以上である上記［３］乃至［８］のいずれかに記載の結晶である、上記［１］記載の化合物、
［１０］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物、
［１１］顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤または錠剤である、上記［１０］記載の医薬組成物、
［１２］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有するＰＤＨＫ阻害剤、
［１３］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有するＰＤＨＫ１阻害剤、
［１４］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有するＰＤＨＫ２阻害剤、
［１５］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［１５’］上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［１６］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ阻害方法、
［１７］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物における糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療方法、
［１８］ＰＤＨＫ阻害剤を製造するための、上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［１９］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［２０］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせての、上記［１８］または［１９］に記載の使用、
［２１］（ａ）上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［２１’］（ａ）上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［２２］（ａ）上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［２２’］（ａ）上記［１］乃至［９］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［２３］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、６．９±０．２、１０．２±０．２、１３．６±０．２、１５．８±０．２および１６．６±０．２を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［２４］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、約６．９、約１０．２、約１３．６、約１５．８および約１６．６を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［２５］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、６．９、１０．２、１３．６、１５．８および１６．６を含む回折ピークを有する、上記［１］記載の化合物の結晶、
［２６］結晶の純度が７０％以上である上記［２３］乃至［２５］のいずれかに記載の結晶である、上記［１］記載の化合物、
［２７］上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物、
［２８］顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤または錠剤である、上記［２７］記載の医薬組成物、
［２９］上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有するＰＤＨＫ阻害剤、
［３０］上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［３０’］上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［３１］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ阻害方法、
［３２］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物における糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療方法、
［３３］ＰＤＨＫ阻害剤を製造するための、上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［３４］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［３５］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせての、上記［３３］または［３４］に記載の使用、
［３６］（ａ）上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［３６’］（ａ）上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［３７］（ａ）上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［３７’］（ａ）上記［２３］乃至［２６］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［３８］上記［３］乃至［８］のいずれかに記載の結晶、および上記［２３］乃至［２５］のいずれかに記載の結晶を含有する混合結晶、
［３９］上記［３］乃至［８］のいずれかに記載の結晶を７０％以上含有する上記［３８］記載の混合結晶、
［４０］上記［２３］乃至［２５］のいずれかに記載の結晶を７０％以上含有する上記［３８］記載の混合結晶、
［４１］上記［３８］乃至［４０］のいずれかに記載の混合結晶を含有する医薬組成物、
［４２］顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤または錠剤である、上記［４１］記載の医薬組成物、
［４３］２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－２－メチル－プロパン－１，３－ジオールの０．５水和物の結晶の製造方法であって、
（ａ）２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－２－メチル－プロパン－１，３－ジオールを水または含水溶媒と混合する工程、
（ｂ）２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－２－メチル－プロパン－１，３－ジオールの０．５水和物が形成するまで、撹拌および／または静置する工程、および
（ｃ）上記［３］乃至［８］または［２３］乃至［２５］のいずれかに記載の結晶が析出するまで撹拌および／または静置する工程
を含む、製造方法、
［４４］式（Ｑ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表される化合物、
［４５］上記［４４］記載の化合物の結晶、
［４６］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、１１．８±０．２、１３．２±０．２、１４．３±０．２、１６．６±０．２および１９．８±０．２を含む回折ピークを有する、上記［４４］記載の化合物の結晶、
［４７］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、約１１．８、約１３．２、約１４．３、約１６．６および約１９．８を含む回折ピークを有する、上記［４４］記載の化合物の結晶、
［４８］粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、１１．８、１３．２、１４．３、１６．６および１９．８を含む回折ピークを有する、上記［４４］記載の化合物の結晶、
［４９］示差走査熱量測定での補外開始温度が６２．３±５．０℃を示す、上記［４５］乃至［４８］のいずれかに記載の結晶、
［５０］粉末Ｘ線回析スペクトルにおいて、下記のピーク：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
を有する、上記［４４］記載の化合物の結晶、
［５１］結晶の純度が７０％以上である上記［４６］乃至［５０］のいずれかに記載の結晶である、上記［４４］記載の化合物、
［５２］上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物、
［５３］顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤または錠剤である、上記［５２］記載の医薬組成物、
［５４］上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有するＰＤＨＫ阻害剤、
［５５］上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［５５’］上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤、
［５６］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物におけるＰＤＨＫ阻害方法、
［５７］哺乳動物に対し、医薬上有効量の上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶を投与することを含む、当該哺乳動物における糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療方法、
［５８］ＰＤＨＫ阻害剤を製造するための、上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［５９］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶の使用、
［６０］糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせての、上記［５８］または［５９］に記載の使用、
［６１］（ａ）上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［６１’］（ａ）上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を含む、医薬組成物、
［６２］（ａ）上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［６２’］（ａ）上記［４４］乃至［５１］のいずれかに記載の化合物または結晶、ならびに
（ｂ）糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の予防および／または治療に有効な少なくとも１つの他の薬剤を、同時に、別々にまたは連続的に投与する、組み合わせ医薬、
［６３］２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオールの２水和物の結晶の製造方法であって、
（ａ）２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオールを水または含水溶媒と混合する工程、
（ｂ）２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオールの２水和物が形成するまで、撹拌および／または静置する工程、および
（ｃ）上記［４５］乃至［５０］のいずれかに記載の結晶が析出するまで撹拌および／または静置する工程
を含む、製造方法等に関する。
図１は、実施例１－１の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図２は、実施例１－２の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図３は、実施例１－３の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図４は、実施例１－４の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図５は、実施例１－５の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図６は、実施例１－６の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図７は、実施例１－７の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図８は、実施例１－８の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図９は、実施例１－９の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１０は、実施例１－１０の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１１は、実施例２－１の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１２は、実施例２－２の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１３は、実施例２－３の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１４は、実施例２－４の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１５は、実施例２－５の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１６は、実施例２－６の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１７は、実施例２－７の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１８は、実施例２－８の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図１９は、実施例２－９の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図２０は、実施例２－１０の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。 図２１は、実施例１－１の結晶のＤＳＣ熱分析データである。 図２２は、実施例１－３の結晶のＤＳＣ熱分析データである。 図２３は、実施例２－１の結晶のＤＳＣ熱分析データである。 図２４は、実施例１－１の結晶の示差熱熱重量同時測定データである。 図２５は、実施例１－２の結晶の示差熱熱重量同時測定データである。 図２６は、実施例２－１の結晶の示差熱熱重量同時測定データである。 図２７は、実施例１－１の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥なし）。 図２８は、実施例１－１の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥あり）。 図２９は、実施例１－２の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥なし）。 図３０は、実施例１－２の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥あり。 図３１は、実施例２－１の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥なし）。 図３２は、実施例２－１の結晶の水分吸脱着等温線データである（予備乾燥あり）。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－２－メチル－プロパン－１，３－ジオール（国際公開第２０１０／０４１７４８号）は、以下、「化合物Ａ」と称することもある。
　２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオール（国際公開第２０１０／０４１７４８号）は、以下、「化合物Ｂ」と称することもある。
　本発明の一つは、化合物Ａの０．５水和物（以下、化合物（Ａｈ）と称することもある。）である。１つの態様として以下の化学式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　１つの態様として以下の化学式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　別の態様として以下の化学式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　また、本発明の一つは、化合物Ｂの２水和物（以下、化合物（Ｂｈ）と称することもある。）である。１つの態様として以下の化学式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明の結晶の一つは、例えば、非晶形の化合物Ａ（溶媒和物（水和物等）を含む）、または化合物Ａの他の結晶（溶媒和物（水和物等）を含む）を結晶転移させることにより製造できる。また、本発明の結晶の一つは、例えば、非晶形の化合物Ｂ（溶媒和物（水和物等）を含む）、または化合物Ｂの他の結晶（溶媒和物（水和物等）を含む）を結晶転移させることにより製造できる。
　本発明の化合物（Ａｈ）の結晶を得るには、上記した中でも、溶媒として水または非プロトン性溶媒を用いるスラリー法が好ましい。
　得られた結晶の解析方法としては、Ｘ線回折による結晶解析の方法が一般的である。さらに、結晶形を決定する方法としては、機械的な方法または光学的な方法（例えば、ＦＴ－ラマンスペクトル、固体ＮＭＲスペクトル）等も挙げられる。また、結晶の熱分析（示差走査熱量測定、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（ＤＳＣ））、赤外吸収スペクトル分析等も通常の方法に従って測定することができる。
　本発明において、化合物（Ａｈ）の「Ｉ形晶」とは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが１０．２°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ｉ）の結晶を意味する。
　また、化合物（Ａｈ）の「Ｉ形晶」の一つの態様として粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における回折ピークが
（１）６．９、１０．２、１３．６、１３．８、１４．０、１５．５、１５．８、１６．６、１７．１、１８．２、１８．６、１８．８、２０．７、２２．１および２２．６°、
（２）６．９、１０．２、１３．６、１５．５、１５．８、１６．６、１８．６、１８．８、２０．７および２２．１°、
（３）６．９、１０．２、１５．５、１５．８、１６．６および１８．６°、または、
（４）６．９、１０．２、１３．６、１３．８および１４．０°
に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ａｈ）の結晶を意味する。
　本発明における化合物（Ａｈ）の「Ｉ形晶」は、好ましくは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが６．９、１０．２、１５．５、１５．８および１６．６°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ａｈ）の結晶である。
　本発明における化合物（Ａｈ）の「Ｉ形晶」は、より好ましくは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが６．９、１０．２、１３．６、１５．５、１５．８、１６．６、１８．６、１８．８、２０．７および２２．１°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ａｈ）の結晶である。
　本発明において、化合物（Ａｈ）の「Ｖ形晶」とは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが６．９、１０．２、１３．６、１５．８および１６．６°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ａｈ）の結晶を意味する。
　本発明における化合物（Ａｈ）の「Ｖ形晶」は、より好ましくは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが６．９、１０．２、１３．６、１５．５、１５．８、１６．６、１８．５、２０．６、２２．１および２２．７°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ａｈ）の結晶である。
　本発明において、化合物（Ｂｈ）の「ＩＶｂ形晶」とは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが１１．８、１３．２、１４．３、１６．６および１９．８°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ｂｈ）の結晶を意味する。
　また、化合物（Ｂｈ）の「ＩＶｂ形晶」の一つの態様として粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における回折ピークが、
（１）６．６、１１．８、１３．２、１３．９、１４．３、１５．４、１６．６、１７．１、１９．２、１９．８、２１．７、２１．９、２２．２、２４．０および２４．１°、
（２）１１．８、１３．２、１３．９、１４．３、１６．６、１９．８、２１．７、２１．９、２２．２および２４．１°、
（３）１１．８、１３．２、１３．９、１４．３、１６．６および１９．８°、
（４）１１．８、１３．２、１４．３、１６．６および１９．８°、または、
（５）６．６、１１．８、１３．２、１３．９および１４．３°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ｂｈ）の結晶を意味する。
　本発明における化合物（Ｂｈ）の「ＩＶｂ形晶」は、より好ましくは、粉末Ｘ線回折で測定した回折角２θ（°）における特徴的回折ピークが１１．８、１３．２、１３．９、１４．３、１６．６、１９．８、２１．７、２１．９、２２．２および２４．１°に現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物（Ｂｈ）の結晶である。
　なお、上記回折角２θ（°）における回折ピーク値は、測定機器により、もしくは測定条件等により多少の測定誤差を生じることがある。具体的には、測定誤差は、±０．２、好ましくは±０．１、より好ましくは±０．０６の範囲内であってもよい。また、該測定誤差を含む回折ピーク値を、「約」を付して表すこともある。
　本発明における化合物（Ａｈ）もしくは化合物（Ｂｈ）、あるいはそれらの結晶（以下、これらを総称して「本発明の化合物」と略記することもある。）は熱分析によっても特徴付けられる。例えば、化合物（Ａｈ）のＩ形晶をＤＳＣ測定に供した場合、吸熱ピークのエンタルピーが約７９．２Ｊ／ｇであり、補外開始温度が８８．７±５．０℃である。また、例えば、本発明の化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶をＤＳＣ測定に供した場合、吸熱ピークのエンタルピーが約１２４．３Ｊ／ｇであり、補外開始温度が６２．３±５．０℃である。
　ここで、「補外開始温度」とは、ＪＩＳ Ｋ ７１２１（プラスチックの転移温度測定方法）で定義されるように、ＤＳＣ曲線において、高温側に向かう低温側の補外ベースラインと、融解ピークのリーディングエッジ上の低温側の曲線勾配が最大になる点で引いた接線の交点の温度を意味する。吸熱ピークのエンタルピーおよび補外開始温度が上記範囲内であれば、本発明の化合物は高い安定性を有する。
　本発明の化合物（Ａｈ）の結晶は、Ｉ形晶またはＶ形晶のいずれかであるか、あるいはＩ形晶および／またはＶ形晶を含む混合形結晶であり得る。化合物Ａの医薬品等への使用に際しては、安定形結晶であるという点では化合物Ａの０．５水和物である化合物（Ａｈ）のＩ形晶もしくはＶ形晶が好ましく、最安定形結晶であるという点では化合物（Ａｈ）のＩ形晶がより好ましい。
　また、本発明の化合物（Ｂｈ）の結晶は、ＩＶｂ形晶であるか、あるいはＩＶｂ形晶を含む混合形結晶であり得る。化合物Ｂの医薬品等への使用に際しては、安定形結晶であるという点では化合物Ｂの２水和物である化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶が好ましく、最安定形結晶であるという点では化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶がより好ましい。
　本発明において、「結晶の純度」とは、化合物（Ａｈ）の結晶の全体量に対する特定の結晶形の化合物（Ａｈ）の割合（純度）を意味する。
　また、本発明において、「結晶の純度」とは、化合物（Ｂｈ）の結晶の全体量に対する特定の結晶形の化合物（Ｂｈ）の割合（純度）を意味する。
　本発明の結晶の純度は、例えば、粉末Ｘ線回折測定法、熱分析等の公知の方法で求めることができる。本発明の結晶または混合形結晶の純度は、必ずしも１００％の純度である必要はなく、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。純度がこの範囲内にあることは、医薬品としての品質を保証する上で好ましい。
　本発明の化合物は、１つ以上の同位元素（例えば、３Ｈ、２Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等）で標識されていてもよい。
　例えば、化合物（Ａｈ）のいずれか１つまたは２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も本発明の化合物に包含される。また、例えば、化合物（Ｂｈ）のいずれか１つまたは２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も本発明の化合物に包含される。
　「医薬組成物」としては、１つ以上の医薬有効成分と１種以上の製薬上許容される担体との混合物、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、あるいは外用剤、坐剤、注射剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤等の非経口剤が挙げられる。好ましくは経口剤である。
　本発明の医薬組成物は、医薬製剤の技術分野において自体公知の方法に従って、本発明の化合物または結晶を、少なくとも１種以上の製薬上許容される担体等と、適宜、適量混合等することによって、製造される。該医薬組成物中の本発明の化合物または結晶の含有率は、剤形、投与量等により異なるが、例えば、組成物全体の０．１から１００重量％である。好ましくは０．１乃至７０重量％である。
　該「製薬上許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機または無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤等、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。さらに必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物が用いられる。
　「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム等が挙げられる。
　「崩壊剤」としては、例えば、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース等が挙げられる。
　「結合剤」としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、結晶セルロース、白糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、アラビアゴム等が挙げられる。
　「流動化剤」としては、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
　「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。
　「溶剤」としては、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
　「溶解補助剤」としては、例えば、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　「懸濁化剤」としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。
　「等張化剤」としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。
　「緩衝剤」としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
　「保存剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
　「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等が挙げられる。
　「着色剤」としては、例えば、食用色素（例：食用赤色２号もしくは３号、食用黄色４号もしくは５号等）、β－カロテン等が挙げられる。
　「甘味剤」としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、ヒトはもちろんのこと、ヒト以外の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）に対しても、経口的または非経口的（例：局所、筋肉内、皮下、直腸、静脈投与等）に投与することができる。投与量は、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート等により異なるが、例えば、成人の患者（体重：約６０ｋｇ）に経口投与する場合の投与量は、有効成分である本発明の化合物として、１日あたり、通常約１ｍｇ乃至１ｇの範囲である。これらの量を１回乃至数回に分けて投与することができる。
　本発明の化合物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫ、すなわち、ＰＤＨＫ１および／またはＰＤＨＫ２）を阻害する活性を有し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）を効果的に活性化することができる。したがって、本発明の化合物は、糖尿病、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症、心不全、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症またはアルツハイマー病の治療剤または予防剤の有効成分として用いることができる。
　糖尿病とは、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病である。
　糖尿病合併症とは、例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障である。
　心不全とは、例えば、急性心不全、慢性心不全である。
　「ＰＤＨＫを阻害する」とは、ＰＤＨＫの機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味する。「ＰＤＨＫを阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫを阻害する」である。「ＰＤＨＫ阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ阻害剤」である。
　「ＰＤＨＫ１を阻害する」とは、ＰＤＨＫ１の機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味し、例えば、後述する試験例１の条件に基づいて、ＰＤＨＫ１の機能を阻害することを意味する。「ＰＤＨＫ１を阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ１を阻害する」である。「ＰＤＨＫ１阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ１阻害剤」である。さらに好ましくは、「ヒト標的臓器におけるＰＤＨＫ１阻害剤」である。
　「ＰＤＨＫ２を阻害する」とは、ＰＤＨＫ２の機能を阻害してその活性を消失もしくは減弱することを意味し、例えば、後述する試験例１の条件に基づいて、ＰＤＨＫ２の機能を阻害することを意味する。「ＰＤＨＫ２を阻害する」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ２を阻害する」である。「ＰＤＨＫ２阻害剤」として、好ましくは、「ヒトＰＤＨＫ２阻害剤」である。さらに好ましくは、「ヒト標的臓器におけるＰＤＨＫ２阻害剤」である。
　「ＰＤＨを活性化する」とは、標的臓器（例、肝臓、骨格筋、脂肪組織、心臓、脳）等または癌等のＰＤＨを活性化することを意味する。
　「血糖値を低下させる」とは、血中（血清中または血漿中を含む）のグルコース濃度を低下させることを意味し、好ましくは高い血糖値を低下させることを意味する。さらに好ましくは、血糖値を、治療学的に有効なヒトの正常値に低下させることを意味する。
　「乳酸値を低下させる」とは、血中（血清中または血漿中を含む）の乳酸濃度を低下させることを意味し、好ましくは高い乳酸値を低下させることを意味する。さらに好ましくは、乳酸値を、治療学的に有効なヒトの正常値に低下させることを意味する。
　本発明の化合物を、医薬分野で行われている一般的な方法で、１または複数の他の薬剤（以下、併用薬剤ともいう。）と組み合わせて使用（以下、併用ともいう。）することができる。
　本発明の化合物、および併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、配合剤として投与してもよいし、両製剤を同時にまたは一定の間隔をおいて投与してもよい。また、本発明の医薬組成物および併用薬剤とからなるキットであることを特徴とする医薬として用いてもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート、投与時間、組み合わせ等により適宜選択することができる。併用薬剤の投与形態は、特に限定されず、本発明の化合物と併用薬剤とが組み合わされていればよい。
　併用薬剤としては、例えば、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症またはアルツハイマー病の治療剤および／または予防剤等が挙げられ、これら１剤から複数剤と本発明の化合物とを組み合わせて用いることができる。
　「糖尿病の治療剤および／または予防剤」としては、例えば、インスリン製剤、スルホニルウレア系血糖降下剤、メトフォルミン、ＤＰＰ－４阻害剤、チアゾリジン誘導体、ＧＬＰ－１受容体作動薬等が挙げられる。
　以下に、本発明の化合物および結晶の製造方法の一例を説明するが、これらの実施例、ならびに製剤例および試験例は単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
　本製法に記載はなくとも、必要に応じて官能基に保護基を導入し、後工程で脱保護を行う；官能基を前駆体として各工程に処し、しかるべき段階で所望の官能基に変換する；各製法および工程の順序を入れ替える等の工夫により効率のよい製造を実施してもよい。
　また、各工程において、反応後の処理は、通常行われる方法で行えばよく、単離精製は、必要に応じて、結晶化、再結晶、蒸留、分液、シリカゲルクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ等の慣用される方法を適宜選択し、また組み合わせて行えばよい。
　全ての試薬および溶媒は、市販用の品質を備えており、さらに精製することなく使用した。
　粉末Ｘ線回折分析は、粉末Ｘ線回折装置（Ｘ’Ｐｅｒｔ Ｐｒｏ、スペクトリス社製）を用いて測定した。
　示差走査熱量分析は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）装置（ＤＳＣ－６０Ａ、島津製作所社製）、または粉末Ｘ線回折・示差走査熱量同時測定（ＸＲＤ－ＤＳＣ）装置（ＸＲＤ：ＲＩＮＴ－２１００；ＤＳＣ：ＤＳＣ８２３０、リガク社製）を用いて測定した。
　水分吸脱着試験は、水分平衡測定装置（ＳＧＡ－１００、ＶＴＩ社製）を用いて測定した。
　示差熱熱重量同時測定（ＴＧ－ＤＴＡ）は、ＴＧ－ＤＴＡ測定装置（ＴＧＡ／ＳＤＴＡ８５１ｅ／ＳＦ、メトラー・トレド社製）を用いて測定した。
　元素分析は、元素分析装置（ＶａｒｉｏＥＬＩＩＩ、エレメンタール社製）を用いて測定した。
　融点測定は、融点測定機器（Ｙａｎａｃｏ ＭＰ－５００Ｄ、柳本製作所製）を用いて測定した。
　百分率％は、クロマトグラフィーで用いられる溶媒については体積％を、その他については重量％を示す。その他の本文中で用いられている略号は下記の意味を示す。
　　ｓ：シングレット
　　ｄ：ダブレット
　　ｔ：トリプレット
　　ｑ：カルテット
　　ｍ：マルチプレット
　　ｂｒ：ブロード
　　Ｊ：カップリング定数
　　ＣＤＣｌ３：重クロロホルム
　　ＤＭＳＯ－Ｄ６：重ジメチルスルホキシド
　　１Ｈ　ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴
　　ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
　１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ－Ｄ６中、テトラメチルシランを内部標準として測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
（光学純度決定のための誘導方法Ａ）
　分析する固体（０．００２ｇから０．００３ｇ）を酢酸エチル（０．１ｍｌ）と１Ｎ塩酸（０．１ｍｌ）と共に振とうし、その後、この混合物を静置して分層した。上層（０．０１０ｍｌ）を下記調製液（０．１ｍｌ）に加え、この混合物を５０℃で３０分間振とうした。得られた混合物を５０ｖ／ｖ％アセトニトリル水で１ｍｌに希釈して、ＨＰＬＣにて分析した。
（調製液）
　１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（０．１９１ｇ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．１５３ｇ）にジメチルホルムアミドを全体で１０ｍｌになるように加えた。この混合物に（１Ｓ）－１－フェニルエチルアミン（０．２５８ｍｌ）を加えることで、標題調製液を得た。
（１０ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０））
　リン酸二水素カリウム（４．０８ｇ）を水（３０００ｍｌ）に溶解し、リン酸を用いてｐＨを２．０にすることで、標題緩衝液を得た。
ＨＰＬＣ分析条件
分析条件１
測定機器：ＨＰＬＣシステム　島津製作所　高速液体クロマトグラフ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ
カラム：ダイセル　ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ　ＯＤ－ＲＨ　４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：（Ａ液）１０ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．０）、（Ｂ液）アセトニトリル
Ａ液：Ｂ液＝５０：５０から２０：８０まで２０分間かけて直線的に組成を変化させながら送液。その後、Ａ液：Ｂ液＝２０：８０一定で５分間送液。
送液速度：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２２０ｎｍ）
実施例１
２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（化合物Ａ）の合成
工程１
　２’－クロロ－４’－フルオロビフェニル－２－カルボン酸エチルエステル　 　　　　　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　反応容器に１－ブロモ－２－クロロ－４－フルオロベンゼン（２５ｇ）、２－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）安息香酸エチル（４６ｇ）、トルエン（１２５ｍｌ）、水（１２５ｍｌ）およびリン酸三カリウム（５０．５ｇ）を加え、アルゴン置換した。この混合物にジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）（１．６７ｇ）を加えて油浴温度１１０℃で３時間撹拌した。反応容器を油浴からはずし、この反応混合物に水（１２５ｍｌ）を加えた。この混合物をそのまま室温で１時間撹拌したのち、セライトろ過した。ろ液を分液ロートに移して分層した。水層をトルエンで抽出し、有機層と合わせた。この有機層を水（１２５ｍｌ）で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を４１．８ｇ得た。得られた固体はこれ以上の精製を行わず、次の反応に用いた。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.06-8.02 (1H, m), 7.60-7.54 (1H, m), 7.52-7.45 (1H, m), 7.27-7.16 (3H, m), 7.06-7.00 (1H, m), 4.18-4.09 (2H, m), 1.11-1.06 (3H, m).
工程２
２’－クロロ－４’－フルオロビフェニル－２－カルボン酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　エタノール（１７９ｍｌ）と混合した２’－クロロ－４’－フルオロビフェニル－２－カルボン酸エチルエステル（４１．８ｇ）に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１７９ｍｌ）を加え、油浴温度８０℃で２時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、活性炭（２．５g）を加えて２．５時間撹拌した。活性炭をセライトろ過し、５０ｖ／ｖ％エタノール水（１００ｍｌ）で洗浄した。このろ液に２Ｎ塩酸（１９６ｍｌ）を加えて酸性にした。つぎにこの混合物に水（３３ｍｌ）を加えて室温で２時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を２時間風乾したのち、６０℃で減圧乾燥して、標題化合物を２８．６ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.12-8.08 (1H, m), 7.64-7.59 (1H, m), 7.52-7.47 (1H, m), 7.27-7.24 (1H, m), 7.22-7.16 (2H, m), 7.05-7.00 (1H, m).
工程３
４－クロロ－２－フルオロ－９Ｈ－フルオレン－９－オン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　酸化リン（Ｖ）（１３３ｇ）とメタンスルホン酸（１３００ｍｌ）の混合物に２’－クロロ－４’－フルオロビフェニル－２－カルボン酸（１３２．９ｇ）を加え、８０℃で２．５時間撹拌した。この反応混合物を氷冷後、水（１３００ｍｌ）をゆっくり滴下し、さらに室温で１時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を水（３００ｍｌ）で洗浄した。この固体を５０ｖ／ｖ％エタノール水（１３００ｍｌ）と混合し、室温で１．５時間スラリー洗浄（懸濁攪拌）し、ろ過した。得られた固体を５０ｖ／ｖ％エタノール水（２００ｍｌ）で洗浄し、３時間風乾し、６０℃で減圧乾燥して、標題化合物を１２１．６ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.13-8.10 (1H, m), 7.72-7.69 (1H, m), 7.57-7.53 (1H, m), 7.36-7.30 (2H, m), 7.20-7.17 (1H, m).
工程４
［４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸エチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ジメチルホルムアミド（１０００ｍｌ）と混合した４－クロロ－２－フルオロ－９Ｈ－フルオレン－９－オン（２０４ｇ）に炭酸カリウム（３６．４ｇ）を加え、水浴中で撹拌した。この混合物にトリメチル（トリフルオロメチル）シラン（１５６ｍｌ）を３０分で滴下し、室温でさらに３０分撹拌した。この反応液にフッ化セシウム（１７３ｇ）を加え、次にブロモ酢酸エチル（７５ｍｌ）を２０分で滴下し、さらに室温で撹拌した。この反応混合物に水（１０００ｍｌ）を加え、分液ロートに移し、酢酸エチル（１０００ｍｌ）で抽出した。この有機層を食塩水（水：飽和食塩水＝４：１，１０００ｍｌ）で２回、飽和食塩水（５００ｍｌ）で１回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を３６０ｇ得た。得られた残さはこれ以上の精製を行わず、直接次の反応に用いた。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.30-8.27 (1H, m), 7.73-7.69 (1H, m), 7.57-7.52 (1H, m), 7.43-7.37 (2H, m), 7.25-7.21 (1H, m), 4.11 (2H, q, J= 7.1 Hz), 3.60 (1H, d, J = 15.5 Hz), 3.53 (1H, d, J = 15.3 Hz), 1.19 (3H, t, J = 7.2 Hz).
工程５
［４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　エタノール（４４０ｍｌ）と混合した［４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸エチル（３６０ｇ）に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（８７７ｍｌ）を加え、８０℃で３．５時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、不溶物をセライトろ過し、水（５００ｍｌ）とエタノール（６０ｍｌ）で洗浄した。このろ液に水（１２０ｍｌ）を加えて氷冷し、ぎ酸（１９９ｍｌ）を滴下した。この懸濁液を室温で一晩撹拌したのち、ろ過した。得られた固体を２５ｖ／ｖ％エタノール水（４００ｍｌ）で洗浄し、一晩風乾したのち、６０℃で減圧乾燥して、標題化合物を２８５ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.32-8.29 (1H, m), 7.71-7.67 (1H, m), 7.59-7.54 (1H, m), 7.45-7.40 (1H, m), 7.38-7.34 (1H, m), 7.27-7.23 (1H, m), 3.65 (1H, d, J = 16.0 Hz), 3.60 (1H, d, J = 16.0 Hz).
工程６
［（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸と（１Ｒ）－１－（１－ナフチル）エチルアミンの塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　メチルエチルケトン（２５０ｍｌ）と混合した［４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸（５０ｇ）に（１Ｒ）－１－（１－ナフチル）エチルアミン（１１．１ｍｌ）を加え、５０℃で３日間撹拌した。この懸濁液を室温まで冷却し、さらに４日間撹拌し、ろ過した。得られた固体を減圧乾燥して、標題化合物を２５．５ｇ得た。この固体は、光学純度決定のための誘導方法Ａを実施した後、ＨＰＬＣ分析条件１で分析した。（Ｒ）－体カルボン酸の誘導体が多く、光学純度は９２．５％ｅ．ｅ．であった。
（Ｓ）－体カルボン酸の誘導体（保持時間２２．５８分）
（Ｒ）－体カルボン酸の誘導体（保持時間２２．７３分）
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.27 (1H, d, J = 7.7 Hz), 8.26 (3H, br s), 8.14 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.00-7.94 (1H, m), 7.89 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.73 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.70-7.47 (8H, m), 5.12 (1H, q, J = 6.6 Hz), 3.19 (1H, d, J = 14.3 Hz), 3.14 (1H, d, J = 14.3 Hz), 1.52 (3H, d, J = 6.6 Hz).
工程７
［（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　酢酸エチル（１７８ｍｌ）と混合した［（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸と（１Ｒ）－１－（１－ナフチル）エチルアミンの塩（２５．４５ｇ）に２Ｎ塩酸（５１ｍｌ）と水（１２７ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。この混合物を分液ロートに移し、分層した。この有機層を水（１００ｍｌ）で２回、飽和食塩水（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、得られた残さにヘキサン（１２７ｍｌ）を加えて室温で１時間スラリー洗浄（懸濁攪拌）した。この懸濁液をろ過し、得られた固体をヘキサンで洗浄し、減圧乾燥して、標題化合物を１６．３３ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.78 (1H, br s), 8.31-8.28 (1H, m), 7.73-7.65 (3H, m), 7.56-7.49 (2H, m), 3.57 (1H, d, J = 15.8 Hz), 3.51 (1H, d, J = 15.5 Hz).
工程８
（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ジメチルホルムアミド（１８４ｍｌ）と混合した［（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸（３６．７４ｇ）にＮ－エチルジイソプロピルアミン（２０．９ｍｌ）を加え、０℃で撹拌した。これにジフェニルホスホリルアジド（２３．７ｍｌ）を３０分かけて滴下し、さらに０℃で２時間撹拌した。この反応混合物に酢酸（２．８６ｍｌ）を加えて室温まで昇温し、ｔ－ブチルアルコール（９６ｍｌ）を加え、続いて１００℃で１時間撹拌した。この反応混合物を氷冷し、２Ｎ塩酸（３６７ｍｌ）を加えた後、室温に戻し終夜攪拌した。反応溶液を分液ロートに移してトルエン（１８０ｍｌ）で３回抽出した。合わせた有機層を水（１８０ｍｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１８０ｍｌ）、水（１８０ｍｌ）、飽和食塩水（１８０ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して得られた残さとエタノール（３７ｍｌ）、テトラヒドロフラン（３７ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３７ｍｌ）を混合し、６０℃で３時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、水（１８０ｍｌ）を加え、分液ロートに移し、トルエン（１８０ｍｌ）で２回抽出した。この有機層を水（１８０ｍｌ）で２回、飽和食塩水（１８０ｍｌ）で１回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まずヘキサン：酢酸エチルの混合比９：１にて混合液を溶出し、さらに混合比８：２で溶出した。) で精製することにより、標題化合物２１．６９ｇを得た。
比旋光度［α］Ｄ＝＋３０．６０°（２０℃、ｃ＝１．００、メタノール）．
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.29-8.26 (1H, m), 7.73-7.69 (1H, m), 7.55-7.50 (1H, m), 7.43-7.35 (2H, m), 7.21-7.18 (1H, m), 2.82 (1H, s).
（絶対立体配置について）
　実施例２の工程３で得られる４－クロロ－２－メチル－９Ｈ－フルオレン－９－オンに対してトリフルオロメチル化を行い、［４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸を得た。この化合物を（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミンを用いて光学分割し、得られた（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミンの塩（化合物１００ＡＡ）を単結晶Ｘ線構造解析により、絶対立体配置を（Ｒ）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　化合物１００ＡＡから誘導したフッ素化合物（４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール）と、前記工程８で得られた化合物（４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール）を、光学活性カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって絶対立体配置を決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
工程９
２－［４－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］プロピオン酸エチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　４－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール（２１．３ｇ）および炭酸カリウム（２０．７ｇ）のジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）懸濁液に、２－ブロモプロピオン酸エチル（１３ｍｌ）を加え、８０℃で１４時間撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却し、トルエン（１００ｍｌ）および水（１５０ｍｌ）を順次滴下した。この混合物を分層し、水層をトルエン（５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、１０％炭酸カリウム水溶液（５０ｍｌ）で１回、水（５０ｍｌ）で２回、および飽和食塩水（５０ｍｌ）にて１回順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を２１．６ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7.85 (1H, s), 7.81 (1H, s), 5.10 (1H, q, J = 7.3 Hz), 4.19 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.78 (3H, d, J = 7.4 Hz), 1.32 (12H, s), 1.25 (3H, t, J = 7.2 Hz).
工程１０
２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝プロピオン酸エチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　２－［４－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］プロピオン酸エチル（２９．２ｇ）、（９Ｒ）－４－クロロ－２－フルオロ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール（２０．４ｇ）、および炭酸水素ナトリウム（１１．１ｇ）のトルエン／水（２００ｍｌ／６６ｍｌ）懸濁液に、酢酸パラジウム（７４３ｍｇ）および２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジメトキシビフェニル（２．７２ｇ）を室温で加え、１１５℃で８時間撹拌した。この反応混合物を室温に戻し、活性炭（１０ｇ）およびセライト（１０ｇ）を加え、１時間撹拌した。この混合物をセライトろ過し、固体をトルエン（１００ｍｌ）で洗浄した。ろ液を分層し、水層をトルエン（６０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、水（１００ｍｌ）で３回、および飽和食塩水（１００ｍｌ）で１回順次洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過した。ろ液を減圧濃縮した。得られた残さのトルエン／酢酸エチル（３／１、１３０ｍｌ）溶液に、シリカゲル（４０ｇ）を加え、室温で１時間撹拌した。この混合物をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてヘキサンと酢酸エチルの混合液を用いた。まずヘキサン：酢酸エチルの混合比５：１にて混合液を溶出し、さらに混合比２：１で溶出した。）で精製して、標題化合物を２７．９ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.20-8.18 (1H, m), 7.72-7.71 (1H, m), 7.67-7.63 (1H, m), 7.44-7.40 (2H, m), 7.37-7.23 (4H, m), 5.40-5.34 (1H, m), 4.22-4.15 (2H, m), 1.78-1.75 (3H, m), 1.23-1.18 (3H, m).
工程１１
２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］プロピオン酸エチル（２７．９ｇ）およびパラホルムアルデヒド（１７．０ｇ）のジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）溶液に、室温でフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍテトラヒドロフラン溶液（１７０ｍｌ）を加え、１００℃で６時間撹拌した。この反応混合物をセライトろ過し、得られた固体を酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄した。ろ液に１Ｎ塩酸（４００ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。分離した水層を、酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を、１Ｎ塩酸（１００ｍｌ）で１回、食塩水（水／飽和食塩水＝１００ｍｌ／１０ｍｌ）で２回、および飽和食塩水で１回順次洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過した。ろ液を減圧濃縮した。得られた残さをトルエンで２回共沸して、標題化合物を２６．６ｇ得た。
1H-NMR (400MHZ, DMSO-D6) δ: 8.19-8.17 (1H, m), 7.71-7.70 (1H, m), 7.66-7.61 (1H, m), 7.46-7.19 (6H, m), 5.31 (1H, brs), 4.21-4.12 (1H, m), 3.96-3.88 (1H, m), 1.80 (3H, s).
工程１２
２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－２－メチル－プロパン－１，３－ジオール（化合物Ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　２－｛４－［（９Ｒ）－２－フルオロ－９－ヒドロキシ－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（２６．６ｇ）のテトラヒドロフラン（４０ｍｌ）溶液に、室温でボラン－テトラヒドロフラン錯体の１．０９Ｍテトラヒドロフラン溶液（２００ｍｌ）を滴下し、３時間撹拌した。この反応混合物に、エタノール（２５ｍｌ）を室温で滴下し、８０℃で１時間撹拌した。この混合物に、水（２００ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を、水（１００ｍｌ）で２回、および飽和食塩水（１００ｍｌ）で１回順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過した。ろ液を減圧濃縮した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてクロロホルムとメタノールの混合液を用いた。まずクロロホルム：メタノールの混合比２０：１にて混合液を溶出し、さらに混合比１０：１で溶出した。）で精製して、標題化合物を１７．４ｇ得た。
比旋光度［α］Ｄ＝＋７２．４°（２５℃、ｃ＝１．００４、メタノール）．
1H-NMR (400MHZ, DMSO-D6) δ: 8.05 (1H, d, J= 0.7 Hz), 7.68 (1H, d, J = 0.7 Hz), 7.65-7.62 (1H, m), 7.44-7.42 (1H, m), 7.40-7.36 (2H, m), 7.35-7.26 (2H, m), 7.21-7.17 (1H, m), 4.98-4.93 (2H, m), 3.84-3.79 (2H, m), 3.76-3.70 (2H, m), 1.52 (3H, s).
実施例１－１
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を水（０．２０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａの０．５水和物（化合物（Ａｈ））のＩ形晶（３４ｍｇ）を得た。
融点９１～９９℃。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（粉末Ｘ線回折測定）
　化合物（Ａｈ）のＩ形晶について、以下の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
条件：
Ｘ線源：Ｃｕ―Ｋα線
管電圧：４５ｋＶ
管電流：４０ｍＡ
測角範囲：２θ＝３°から２５°
　粉末Ｘ線回折パターンを図１に示し、２θで表される回折角度１０．２°のピーク強度を１００とした時の相対強度を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
（示差走査熱量測定／ＤＳＣ）
　次にＩ形晶２～３ｍｇについて、示差走査熱量測定装置ＤＳＣ－６０Ａ（島津製作所社製）を用いて、昇温速度５℃／分（アルミニウム製密閉パン）で測定した。測定により得られたＤＳＣ曲線を図２１に示した。ＤＳＣ曲線上の吸熱ピークのエンタルピーは、約７９．２Ｊ／ｇであり、および補外開始温度は、８８．７±５℃であった。
（示差熱-熱重量同時測定）
　また、Ｉ形晶約５ｍｇをアルミニウム製開放パンにとり、ＴＧ－ＤＴＡ測定装置（ＴＧＡ／ＳＤＴＡ８５１ｅ／ＳＦ、メトラー・トレド社製）を用いて、乾燥窒素雰囲気下、昇温速度５℃／分にて測定した。測定結果を図２４に示した。
　図２４によれば、加熱時に２．０２％の重量減少を示し、その減少率は、化合物（Ａｈ）の理論水分含量の２．０９％と良く一致した。
（元素分析測定）
　さらに、Ｉ形晶約２ｍｇをスズ箔に包み込んで、元素分析装置（ＶａｒｉｏＥＬＩＩＩ、エレメンタール社製）を用いて測定した。その結果、Ｉ形晶の元素分析結果は、以下のとおり化合物（Ａｈ）の理論値と良く一致した。
計算値：Ｃ，５８．４７；Ｈ，４．４４；Ｎ，６．４９（０．５水和物としての計算値）；実測値：Ｃ，５８．４１；Ｈ，４．５０；Ｎ，６．５４．
（水分吸脱着測定）
　また、以下の方法により水分吸脱着試験を実施した。
方法１（予備乾燥なし）：
　Ｉ形晶約１０ｍｇを石英製セルに秤取り、水分平衡測定装置（ＳＧＡ－１００、ＶＴＩ社製）を用い、温度２５℃下、各相対湿度下で平衡に達したときの重量変化率を測定した。
試験条件：
試験温度：２５℃
平衡化条件：５分間で重量変化率が０．０３％以下
最大平衡化時間：１８０分間
相対湿度の変化：５％から９５％まで５％間隔で上昇させた後、９５％から５％まで５％間隔で下降させた。
方法２（予備乾燥あり）：
　Ｉ形晶約１０ｍｇを石英製セルに秤取り、水分平衡測定装置（ＳＧＡ－１００、ＶＴＩ社製）を用い、乾燥窒素気流下、６０℃で乾燥させた後、温度２５℃下、各相対湿度下で平衡に達したときの重量変化率を測定した。
試験条件
試験温度：２５℃
平衡化条件：５分間で重量変化率が０．０３％以下
最大平衡化時間：１８０分間
相対湿度の変化：５％から９５％まで５％間隔で上昇させた後、９５％から５％まで５％間隔で下降させた。
　水分吸脱着試験は、「予備乾燥（試験前乾燥）あり」と、「予備乾燥（試験前乾燥）なし」の２条件で測定を行い、それぞれ加湿、乾燥の繰返しを１回で実施した。その結果、Ｉ形晶に対し予備乾燥（乾燥窒素気流下、６０℃）を行うと２．１５％重量が減少し、その減少率は、化合物（Ａｈ）の理論水分含量の２．０９％と良く一致した。従って、予備乾燥により結晶水が全て留去されたと推測した。
　一方、乾燥後に相対湿度１０％まで加湿していくと、２．４４％の重量増加が観察されたことから０．５当量分の水が加湿により、再吸湿したと考えられる。
　また、予備乾燥を行わなかった場合には、相対湿度９５％下でも顕著な吸湿は認められず、相対湿度７５％下での吸湿度が０．２７５から０．２８２％であり、３％未満であったこと。この結果から、化合物（Ａｈ）のＩ形晶は吸湿性なしと判断した。
実施例１－２
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％メタノール水（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で１時間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａの０．５水和物（化合物（Ａｈ））のＶ形晶（４０ｍｇ）を得た。融点９０～１００℃。
（粉末Ｘ線回折分析）
　化合物（Ａｈ）のＶ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図２に示し、２θで表される回折角度６．９°のピーク強度を１００とした時の相対強度を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
（示差熱-熱重量同時測定）
　また、Ｖ形晶約５ｍｇをアルミニウム製開放パンにとり、ＴＧ－ＤＴＡ測定装置（ＴＧＡ／ＳＤＴＡ８５１ｅ／ＳＦ、メトラー・トレド社製）を用いて、乾燥窒素雰囲気下、昇温速度２℃／分にて測定した。測定結果を図２５に示した。
　図２５によれば、加熱時に２．４８％の重量減少を示し、その減少率は、化合物（Ａｈ）の理論水分含量の２．０９％と良く一致した。
（元素分析測定）
　さらに、Ｖ形晶について、実施例１－１と同様の条件で元素分析を行った。その結果、Ｖ形晶の元素分析結果は、以下のとおり化合物（Ａｈ）の理論値と良く一致した。
計算値：Ｃ，５８．４７；Ｈ，４．４４；Ｎ，６．４９（０．５水和物としての計算値）；実測値：Ｃ，５８．３０；Ｈ，４．４９；Ｎ，６．５４．
（水分吸脱着測定）
　また、Ｖ形晶について、実施例１－１と同様の条件で水分吸脱着試験を実施した。
　その結果、予備乾燥（乾燥窒素気流下、６０℃）を行うと２．３６％重量が減少し、その減少率は、化合物（Ａｈ）の理論水分含量の２．０９％と良く一致した。従って、予備乾燥により結晶水が全て留去されたと推測した。
　一方、乾燥後に相対湿度１０％まで加湿していくと、２．４６％の重量増加が観察されたことから０．５当量分の水が加湿により、再吸湿したと考えられる。
　また、予備乾燥を行わなかった場合には、相対湿度９５％下でも顕著な吸湿は認められず、相対湿度７５％下での吸湿度が０．２１０％から０．２３７％であり、３％未満であった。この結果から、化合物（Ａｈ）のＶ形晶は吸湿性なしと判断した。
実施例１－３
　実施例１で得られた化合物Ａ（９５７ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％エタノール水（２．０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、５０℃で減圧乾燥することにより、化合物Ａの０．３～０．４水和物のＩＸ形晶（８３１ｍｇ）を得た。融点８９～９７℃。
　ＩＸ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析および熱分析を実施した。ＩＸ形晶の粉末Ｘ線回折パターンおよびＤＳＣ曲線を、それぞれ図３および図２２に示した。
実施例１－４
　実施例１で得られた化合物Ａ（２０ｍｇ）を３３ｖ／ｖ％メタノール水（０．１５ｍｌ）に懸濁させ、室温で５日静置した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａの０．５水和物のＩＩ形晶（１９ｍｇ）を得た。ＩＩ形晶はＩ形晶の晶癖であった。融点８９～１２１℃。
　ＩＩ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図４に示した。
実施例１－５
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％エタノール水（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で１時間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａのエタノール溶媒和物のＩＩＩ形晶（３６ｍｇ）を得た。融点６６～８３℃。
　ＩＩＩ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図５に示した。
実施例１－６
　実施例１で得られた化合物Ａ（１．００ｇ）を２９ｖ／ｖ％メタノール水（７．０ｍｌ）に懸濁させ、５０℃で４５分攪拌した後、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、化合物Ａのメタノール溶媒和物のＩＶ形晶（１．０５ｇ）を得た。融点８９～９５℃。
　ＩＶ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図６に示した。
実施例１－７
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％イソプロパノール水（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａのイソプロパノール溶媒和物のＶＩ形晶（４４ｍｇ）を得た。融点６９～１０２℃。
　ＶＩ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図７に示した。
実施例１－８
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％アセトン水（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で４日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａのアセトン溶媒和物のＶＩＩ形晶（３８ｍｇ）を得た。融点７９～９８℃。
　ＶＩＩ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図８に示した。
実施例１－９
　実施例１で得られた化合物Ａ（５０ｍｇ）を３０ｖ／ｖ％酢酸水（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で１時間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａの酢酸溶媒和物のＶＩＩＩ形晶（４０ｍｇ）を得た。融点５９～７５℃。
　ＶＩＩＩ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図９に示した。
実施例１－１０
　実施例１－３で得られた化合物ＡのＩＸ形晶（５０ｍｇ）をトルエン（０．２０ｍｌ）に懸濁させ、室温で６日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ａの水和物のＩ＋Ｘ形晶（３４ｍｇ）を得た。融点９３～９９℃。
　Ｉ＋Ｘ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１０に示した。
　化合物Ａ（溶媒和物を含む）の結晶を得るにあたり、上記実施例１－１から実施例１－１０を含む約２３０の結晶化条件を検討した結果、上記３種類の水和物を含む９種類の結晶多形を確認することができた。また、これらの結晶形は、水や非プロトン性溶媒中でのスラリー法により全てＩ形晶に変換されること、および再現性良く取得することができた。
実施例２
２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオール（化合物Ｂ）の合成
工程１
２’－クロロ－４’－メチルビフェニル－２－カルボン酸エチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　アルゴン雰囲気下、反応容器に４－ブロモ－３－クロロトルエン（２００ｇ）、２－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）安息香酸エチル（３７６ｇ）、トルエン（１０００ｍｌ）、水（１０００ｍｌ）、リン酸三カリウム（４１２ｇ）およびジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）（１４ｇ）を加えて１１０℃で２時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却した。不溶物をろ去し、水（５００ｍｌ）とトルエン（５００ｍｌ）で洗浄した。ろ液を分液ロートに移して分層した。有機層を水（１０００ｍｌ）で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を３３７ｇ得た。得られた残さはこれ以上の精製を行わず、次の反応に用いた。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.02-7.99 (1H, m), 7.58-7.53 (1H, m), 7.48-7.43 (1H, m), 7.28-7.23 (2H, m), 7.13-7.11 (2H, m), 4.17-4.08 (2H, m), 2.38 (3H, s), 1.06 (3H, t, J = 7.1 Hz).
工程２
２’－クロロ－４’－メチルビフェニル－２－カルボン酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　エタノール（７２８ｍｌ）と混合した２’－クロロ－４’－メチルビフェニル－2－カルボン酸エチル（３３７ｇ）に４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（７２８ｍｌ）を加え、８０℃で２時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、活性炭（１７g）を加えて終夜撹拌した。活性炭をろ去し、５０ｖ／ｖ％エタノール水（２００ｍｌ）で洗浄した。ろ液に酢酸（５００ｍｌ）を室温で滴下して酸性にした。この混合物に水（４１４ｍｌ）を室温で滴下し、２時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を４０ｖ／ｖ％エタノール水（２５０ｍｌ）で洗浄し、８０℃で減圧乾燥して、標題化合物を２０３ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.60 (1H, br s), 7.93-7.89 (1H, m), 7.64-7.58 (1H, m), 7.53-7.47 (1H, m), 7.32-7.29 (1H, m), 7.25-7.21 (1H, m), 7.20-7.13 (2H, m), 2.34 (3H, s).
工程３
４－クロロ－２－メチル－９Ｈ－フルオレン－９－オン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　酸化リン（Ｖ）（１５０ｇ）とメタンスルホン酸（１５００ｍｌ）の混合物に２’－クロロ－４’－メチルビフェニル－２－カルボン酸（１５３ｇ）を加え、８０℃で２時間撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却した。反応混合物の温度を９０℃以下に保ちながら水（１５００ｍｌ）を滴下し、さらに室温で２時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を水（１０００ｍｌ）で洗浄した。この固体を５０ｖ／ｖ％エタノール水（１５００ｍｌ）に懸濁させ、室温で２時間スラリー洗浄（懸濁攪拌）し、ろ過した。得られた固体を１時間風乾し、８０℃で減圧乾燥して、標題化合物を１４０．１２ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.69-7.64 (2H, m), 7.49-7.41 (3H, m), 2.36 (3H, s).
工程４
［４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　アルゴン気流下、ジメチルホルムアミド（５００ｍｌ）と混合した４－クロロ－２－メチル－９Ｈ－フルオレン－９－オン（１００ｇ）に炭酸カリウム（１８ｇ）を加えた。この混合物にトリメチル（トリフルオロメチル）シラン（７８ｍｌ）を８０分かけて滴下し、室温でさらに１時間撹拌した。この反応液にフッ化セシウム（８７ｇ）を室温で加え、次にブロモ酢酸エチル（６３ｍｌ）を１５分で滴下し、さらに室温で４時間撹拌した。この反応混合物に水（５００ｍｌ）を加え、水層をトルエン（５００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を水（５００ｍｌ）、飽和食塩水（５００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮した。得られた残さにエタノール（２２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（４４０ｍｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、活性炭（１５ｇ）を加え、室温で終夜撹拌した。活性炭をろ去し、３３ｖ／ｖ％エタノール水（１２０ｍｌ）で洗浄した。このろ液に酢酸（１５１ｍｌ）を滴下して酸性にし、室温で終夜撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を３３ｖ／ｖ％エタノール水（１５０ｍｌ）で洗浄し、８０℃で減圧乾燥して、標題化合物を１３６．４０ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.76 (1H, br s), 8.26 (1H, d, J= 7.7 Hz), 7.69-7.62 (2H, m), 7.53-7.45 (3H, m), 3.50 (1H, d, J = 15.5 Hz), 3.43 (1H, d, J = 15.5 Hz), 2.41 (3H, s).
工程５
［（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸と（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミンの塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
工程５－１　
種晶の調製
　イソプロピルエーテル（１６ｍｌ）と混合した［４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸（０．４００ｇ）に（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミン（０．０５８ｍｌ）を加えた。この混合物を室温で１時間４０分撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られたろ過物を減圧乾燥して固体を０．２４０ｇ得た。この固体（０．２１０ｇ）を酢酸エチル（４．２ｍｌ）に懸濁し、この混合物を室温で１時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られたろ過物を減圧乾燥して固体を０．１７８ｇ得た。この固体（０．１７０ｇ）を酢酸エチル（３．４ｍｌ）に再度懸濁し、この混合物を５０℃で１時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体を減圧乾燥して、標題化合物を０．１３７ｇ得た。この固体は、光学純度決定のための誘導方法Ａを実施した後、ＨＰＬＣ分析条件１で分析した。（Ｒ）－体カルボン酸の誘導体が多く、光学純度は９６．７％ｅ．ｅ．であった。
（Ｓ）－体カルボン酸の誘導体（保持時間２０．１９分）
（Ｒ）－体カルボン酸の誘導体（保持時間２１．４１分）
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 8.24 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.70 (3H, br s), 7.67-7.57 (2H, m), 7.51-7.40 (5H, m), 7.39-7.32 (2H, m), 7.32-7.26 (1H, m), 4.22 (1H, q, J = 6.8 Hz), 3.12 (1H, d, J = 14.0 Hz), 3.08 (1H, d, J = 14.0 Hz), 2.40 (3H, s), 1.39 (3H, d, J = 6.8 Hz).
工程５－２
　メチルイソブチルケトン（５７５ｍｌ）と混合した［４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸（１９１．６０ｇ）に（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミン（３４．８１ｍｌ）を加えた。この混合物に種晶を加え、５０℃で３日間撹拌した。この懸濁液をろ過し、得られた固体をメチルイソブチルケトン（１９２ｍｌ）で洗浄し、減圧乾燥して、標題化合物を７１．１０ｇ得た。この固体は、工程５－１と同様に光学純度決定のための誘導方法Ａを実施した後、ＨＰＬＣ分析条件１で分析した。（Ｒ）－体カルボン酸の誘導体が多く、光学純度は９５．０％ｅ．ｅ．であった。
（絶対立体配置について）
　［４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸の絶対立体配置は、単結晶Ｘ線構造解析により（Ｒ）と決定した。
工程６
［（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　酢酸エチル（７９６ｍｌ）と混合した［（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸と（１Ｒ）－１－フェニルエチルアミンの塩（１５９．１６ｇ）に２Ｎ塩酸（３１８ｍｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。この混合物を分液ロートに移し、分層した。この有機層を水（６００ｍｌ）で２回、飽和食塩水（３００ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、得られた残さにヘキサンを加えて室温で１時間スラリー洗浄（懸濁攪拌）した。この懸濁液をろ過し、ヘキサンで洗浄した。得られた固体を減圧乾燥して、標題化合物を１１２．３３ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 12.75 (1H, br s), 8.26 (1H, d, J= 7.7 Hz), 7.71-7.62 (2H, m), 7.54-7.45 (3H, m), 3.50 (1H, d, J = 15.5 Hz), 3.43 (1H, d, J = 15.5 Hz), 2.41 (3H, s).
工程７
（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　ジメチルホルムアミド（９０ｍｌ）と混合した［（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－イルオキシ］酢酸（３０ｇ）にトリエチルアミン（１４．１ｍｌ）を加え、０℃で撹拌した。これにジフェニルホスホリルアジド（２０．０ｍｌ）のジメチルホルムアミド（６０ｍｌ）溶液を２０分で滴下し、さらに０℃で２時間撹拌した。この反応混合物にｔ－ブチルアルコール（７５ｍｌ）を加え、続いて１００℃で１時間撹拌した。この反応混合物を氷冷し、２Ｎ塩酸（３００ｍｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。この混合物に水（１００ｍｌ）を加えて分液ロートに移し、水層をトルエン（３００ｍｌ、２００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を水（２００ｍｌ）で２回、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１５０ｍｌ）で２回、飽和食塩水（１５０ｍｌ）で１回と順次洗浄した。得られた有機層に無水硫酸ナトリウムとシリカゲル(６ｇ)を加えて、室温で撹拌した。不溶物をろ去し、トルエン（５００ｍｌ）で洗浄した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を２８．５８ｇ得た。
比旋光度［α］Ｄ＝＋２２．５０°（２０℃、ｃ＝１．００、メタノール）．
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.27 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.70-7.69 (1H, m), 7.52-7.47 (1H, m), 7.44-7.42 (1H, m), 7.40-7.35 (1H, m), 7.25 (1H, s), 2.82 (1H, br s), 2.41 (3H, s).
工程８
［４－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］酢酸ｔ－ブチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　４，４，５，５－テトラメチル－２－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）［１，３，２］ジオキサボロラン（１０ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１００ｍｌ）、炭酸カリウム（１７．８ｇ）およびブロモ酢酸ｔ－ブチル（９．９ｍｌ）を混合し、室温で４時間撹拌した。反応混合物をセライトろ過した。このろ液に水とジエチルエーテルを加え、分液ロートに移して分層した。水層をジエチルエーテルで再抽出し、有機層と合わせた。得られた有機層を水で３回、飽和食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。不溶物をろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残さにヘキサン（５０ｍｌ）を加えてスラリー洗浄（懸濁攪拌）した。この懸濁液をろ過し、得られた固体をヘキサンで洗浄し、減圧乾燥して、標題化合物を１２．２３ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 7.92 (1H, d, J = 0.7 Hz), 7.59 (1H, d, J = 0.5 Hz), 4.95 (2H, s), 1.42 (9H, s), 1.25 (12H, s).
工程９
｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝酢酸ｔ－ブチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　［４－（４，４，５，５－テトラメチル［１，３，２］ジオキサボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］酢酸ｔ－ブチル（２４．８ｇ）、（９Ｒ）－４－クロロ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－９－オール（２０．０ｇ）、および炭酸水素ナトリウム（１１．３ｇ）のトルエン／水（２００ｍｌ／６０ｍｌ）懸濁液に、酢酸パラジウム（７５０ｍｇ）および２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジメトキシビフェニル（２．７５ｇ）を室温で加え、１１０℃で２時間撹拌した。この反応混合物を室温に戻し、水（８０ｍｌ）および活性炭（２．０ｇ）を加え、１時間撹拌した。この混合物をセライトろ過し、固体をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）で洗浄した。ろ液を分層し、水層を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、水（１００ｍｌ）で２回、および飽和食塩水（１００ｍｌ）で１回順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムおよびシリカゲル（４０ｇ）を加え、終夜撹拌した。この混合物をろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残さを、ヘキサンと酢酸エチルの混合液（ヘキサン：酢酸エチルの混合比２：１、１２０ｍｌ）溶液に懸濁させ、固体をろ過して、標題化合物を１７．８ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7.68-7.64 (1H, m), 7.65 (1H, d, J = 0.7 Hz), 7.60 (1H, d, J= 0.7 Hz), 7.51-7.49 (1H, m), 7.40-7.37 (1H, m), 7.28-7.23 (2H, m), 7.14-7.13 (1H, m), 4.93 (1H, d, J = 17.4 Hz), 4.88 (1H, d, J = 17.4 Hz), 4.80 (1H, s), 2.42 (3H, s), 1.52 (9H, s).
工程１０
３－ヒドロキシ－２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝プロピオン酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝酢酸ｔ－ブチル（１７．８ｇ）およびパラホルムアルデヒド（１２．０ｇ）のジメチルホルムアミド（６０ｍｌ）溶液に、室温でフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍテトラヒドロフラン溶液（１２０ｍｌ）を加え、９５℃で３時間撹拌した。この反応混合物に１Ｎ塩酸（１８０ｍｌ）および水（９０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１８０ｍｌ）で抽出した。分離した水層を、酢酸エチル（９０ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を、１Ｎ塩酸（９０ｍｌ）で１回、水（９０ｍｌ）で２回、および飽和食塩水（９０ｍｌ）で１回順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。ろ液を減圧濃縮して、標題化合物を１５．５ｇ得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 13.10 (1H, br s), 8.03 (1H, s), 7.65 (1H, s), 7.63-7.59 (1H, m), 7.44-7.40 (2H, m), 7.31-7.27 (1H, m), 7.25-7.20 (1H, m), 7.15 (2H, s), 5.14 (2H, br s), 4.21-4.09 (4H, m), 2.39 (3H, s).
工程１１
２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－プロパン－１，３－ジオール（化合物Ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　３－ヒドロキシ－２－ヒドロキシメチル－２－｛４－［（９Ｒ）－９－ヒドロキシ－２－メチル－９－（トリフルオロメチル）－９Ｈ－フルオレン－４－イル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝プロピオン酸（１５．５ｇ）のテトラヒドロフラン（３１ｍｌ）溶液に、室温でボラン－テトラヒドロフラン錯体の１．０９Ｍテトラヒドロフラン溶液（１２７ｍｌ）を滴下し、５時間撹拌した。この反応混合物に、エタノール（１５ｍｌ）を室温で滴下し、７５℃で１時間撹拌した。この混合物に、水（９０ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１５０ｍｌ、７５ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ｍｌ）で１回、水（７５ｍｌ）で２回、および飽和食塩水（７５ｍｌ）で１回順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残さのエタノール（４５ｍｌ）溶液に、室温で水素化ホウ素ナトリウム（１．３ｇ）を加え、１時間撹拌した。この反応混合物に１Ｎ塩酸（１５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１５０ｍｌ）で抽出した。分離した水層を、酢酸エチル（７５ｍｌ）で再度抽出した。合わせた有機層を、水（７５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ｍｌ）、水（７５ｍｌ）、および飽和食塩水（７５ｍｌ）で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、ろ過した。ろ液を減圧濃縮した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒としてクロロホルムとメタノールの混合液を用いた。まずクロロホルム：メタノールの混合比２０：１にて混合液を溶出し、さらに混合比１０：１で溶出した。）で精製して、標題化合物を１２．６ｇ得た。
比旋光度［α］Ｄ＝＋６５．６°（２５℃、ｃ＝１．００８、メタノール）．
1H-NMR (400MHz, DMSO-D6) δ: 7.96 (1H, d, J = 0.7 Hz), 7.63-7.59 (1H, m), 7.62 (1H, d, J = 0.7 Hz), 7.46-7.40 (2H, m), 7.31-7.21 (2H, m), 7.14 (2H, s), 4.82 (3H, t, J = 5.6 Hz), 3.91 (6H, d, J= 5.6 Hz), 2.39 (3H, s).
実施例２－１
　実施例２で得られた化合物Ｂ（３０．２ｇ）を３０ｖ／ｖ％メタノール水（２００ｍｌ）に懸濁させ、５０℃で４時間攪拌した後、室温で４日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物Ｂの２水和物（化合物（Ｂｈ））のＩＶｂ形晶（２８．７ｇ）を得た。融点９６～１０４℃。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
（粉末Ｘ線回折分析）
　化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１１に示し、２θで表される回折角度１６．６°のピーク強度を１００とした時の相対強度を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
（粉末Ｘ線回析分析と示差走査熱量測定）
　次にＩＶｂ形晶２～３ｍｇについて、粉末X線回折・示差走査熱量同時測定（ＸＲＤ－ＤＳＣ）装置（ＸＲＤ：ＲＩＮＴ－２１００、ＤＳＣ：ＤＳＣ８２３０、リガク社製）を用いて、乾燥窒素雰囲気下、昇温速度２℃／分（アルミニウム製密閉パン）で測定した。得られたＤＳＣ曲線を図２１に示した。ＤＳＣ曲線上の吸熱ピークによれば、エンタルピーは、約１２４．３Ｊ／ｇであり、および補外開始温度は、６２．３±５℃であった。
（示差熱-熱重量同時測定）
　また、ＩＶｂ形晶約５ｍｇをアルミニウム製開放パンにとり、ＴＧ－ＤＴＡ測定装置（ＴＧＡ／ＳＤＴＡ８５１ｅ／ＳＦ、メトラー・トレド社製）を用いて、乾燥窒素雰囲気下、昇温速度５℃／分にて測定した。測定結果を図２６に示した。
　図２６によれば、加熱時に７．６８％の重量減少を示し、その減少率は、化合物（Ｂｈ）の理論水分含量の７．６６％と良く一致した。
（元素分析測定）
　さらに、ＩＶｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で元素分析を行った。その結果、ＩＶｂ形晶の元素分析結果は、以下のとおり化合物（Ｂｈ）の理論値と良く一致した。
計算値：Ｃ，５６．１７；Ｈ，５．３６；Ｎ，５．９５（２水和物としての計算値）；
実測値：Ｃ，５６．１９；Ｈ，５．３７；Ｎ，５．９７． 
　また、ＩＶｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で水分吸脱着試験を実施した。
　その結果、予備乾燥（乾燥窒素気流下、６０℃）を行うと７．７５％重量が減少し、その減少率は、化合物（Ｂｈ）の理論水分含量の７．６６％と良く一致した。従って、予備乾燥により結晶水が全て留去されたと推測できた。
　一方、乾燥後に相対湿度５０％まで加湿していくと、７．９３％の重量増加が観察されたことから２当量分の水が加湿により、再吸湿したと考えられる。
　また、予備乾燥を行わなかった場合には、相対湿度９５％下でも顕著な吸湿は認められず、相対湿度７５％下での吸湿度が０．３０５％から０．３５４％であり、３％未満であったことから、化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶は吸湿性なしと判断することができた。
実施例２－２
　実施例２で得られた化合物Ｂ（２００ｍｇ）をクロロホルム（４．０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＩｂ形晶（２２７ｍｇ）を得た。
融点８８～１１１℃。
　Ｉｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１２に示した。
実施例２－３
　実施例２で得られた化合物Ｂ（２０ｍｇ）をジエチルエーテル（０．２０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＩＩｂ形晶（１３ｍｇ）を得た。
　ＩＩｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１３に示した。
実施例２－４
　実施例２で得られた化合物Ｂ（２０ｍｇ）を１，２－ジクロロエタン（０．１０ｍｌ）に懸濁させ、室温で終夜攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＩＩＩｂ形晶（２３ｍｇ）を得た。
　ＩＩＩｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１４に示した。
実施例２－５
　実施例２－１で得られた化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶（５０ｍｇ）をプロピオニトリル（０．０５０ｍｌ）に懸濁させ、室温で４日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＶｂ＋ＩＶｂ形晶（９ｍｇ）を得た。
　Ｖｂ＋ＩＶｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１５に示した。
実施例２－６
　実施例３で得られた化合物Ｂ（２００ｍｇ）をプロピオニトリル（０．２０ｍｌ）に溶解させ、実施例２－５で得られた化合物ＢのＶｂ＋ＩＶｂ形晶を接種した後、室温で３０分静置した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＶＩｂ形晶（２０１ｍｇ）を得た。
　ＶＩｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１６に示した。
実施例２－７
　実施例２で得られた化合物Ｂ（２００ｍｇ）をトリメチルアセトニトリル（０．２０ｍｌ）に溶解し、実施例２－５で得られた化合物ＢのＶｂ＋ＩＶｂ形晶を接種した後、室温で３０分静置した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＶＩＩｂ形晶（２１５ｍｇ）を得た。
　ＶＩＩｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１７に示した。
実施例２－８
　実施例２で得られた化合物Ｂ（５０ｍｇ）を２－ブタノール（０．０５０ｍｌ）に溶解させ、実施例２－２で得られた化合物ＢのＩｂ形晶を接種した後、室温で７日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＶＩＩＩｂ形晶（１６ｍｇ）を得た。
　ＶＩＩＩｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１８に示した。
実施例２－９
　実施例２で得られた化合物Ｂ（５０ｍｇ）を３－メチル－１－ブタノール（０．０５０ｍｌ）に溶解させ、実施例２－２で得られた化合物ＢのＩｂ形晶を接種した後、室温で７日間攪拌した。析出した固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＩＸｂ形晶（１７ｍｇ）を得た。
　ＩＸｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図１９に示した。
実施例２－１０
　実施例２－２で得られた化合物ＢのＩｂ形晶（５０ｍｇ）をヘプタン（０．２０ｍｌ）に懸濁させ、室温で７日間攪拌した。固体をろ取し、室温で減圧乾燥することにより、化合物ＢのＸｂ形晶（２４ｍｇ）を得た。
　Ｘｂ形晶について、実施例１－１と同様の条件で粉末Ｘ線回折分析を実施した。
　粉末Ｘ線回折パターンを図２０に示した。
　化合物Ｂ（溶媒和物を含む）の結晶を得るにあたり、上記実施例２－１から実施例２－１０を含む約３００の結晶化条件を検討した結果、有機溶媒を含まない結晶形として、ＩＶｂ形晶（２水和物）のみを確認することができた。
　本発明の製剤例としては、例えば下記の製剤が挙げられる。しかしながら、本発明はこれら製剤例によって限定されるものではない。
製剤例１（カプセルの製造）
１）実施例１－１（化合物（Ａｈ））の結晶　　　　 　 ３０ｍｇ
２）微結晶セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
３）乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９ｍｇ
４）ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
　１）、２）、３）および４）を混合して、ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例２（錠剤の製造）
１）実施例１－１（化合物（Ａｈ））の結晶　　　　　　  １０ｇ
２）乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｇ
３）トウモロコシデンプン　　　　　　　　　　　　　　　１５ｇ
４）カルメロースカルシウム　　　　　　　　　　　　　　４４ｇ
５）ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
　１）、２）、３）の全量および３０ｇの４）を水で練合し、真空乾燥後、整粒を行う。この整粒末に１４ｇの４）および１ｇの５）を混合し、打錠機により打錠する。このようにして、１錠あたり実施例１－１（化合物（Ａｈ））の結晶１０ｍｇを含有する錠剤１０００錠を得る。
製剤例３（カプセルの製造）
１）実施例２－１（化合物（Ｂｈ））の結晶　　　　　  ３０ｍｇ
２）微結晶セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
３）乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９ｍｇ
４）ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
　１）、２）、３）および４）を混合して、ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例４（錠剤の製造）
１）実施例２－１（化合物（Ｂｈ））の結晶　　　　 　　 １０ｇ
２）乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｇ
３）トウモロコシデンプン　　　　　　　　　　　　　　　１５ｇ
４）カルメロースカルシウム　　　　　　　　　　　　　　４４ｇ
５）ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
　１）、２）、３）の全量および３０ｇの４）を水で練合し、真空乾燥後、整粒を行う。この整粒末に１４ｇの４）および１ｇの５）を混合し、打錠機により打錠する。このようにして、１錠あたり実施例２－１（化合物（Ｂｈ））の結晶１０ｍｇを含有する錠剤１０００錠を得る。
試験例１：インビトロにおけるＰＤＨＫ活性阻害作用
　ＰＤＨＫ活性阻害作用は被験化合物存在下においてキナーゼ反応を行い、その後、残存したＰＤＨ活性を測定することにより、間接的に評価した。
（ＰＤＨＫ１活性阻害作用）
　ヒトＰＤＨＫ１（ｈＰＤＨＫ１、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号Ｌ４２４５０．１）の場合、このタンパク質をコードする１．３ｋｂｐフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒト肝ｃＤＮＡから単離した。ＰＣＲでＮ末端にＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列を付加した改変ｈＰＤＨＫ１　ｃＤＮＡを作製し、ベクター（ｐＥＴ１７ｂ－Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。組換え構築体を大腸菌（ＤＨ５α－ＴＯＹＯＢＯ社）内へ形質転換した。組換えクローンを同定し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列分析した。予想核酸配列を持つ１クローンを発現作業用に選択した。
　ｈＰＤＨＫ１活性発現のために、改変ｈＰＤＨＫ１　ｃＤＮＡを含むｐＥＴ１７ｂベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質転換した。大腸菌を光学濃度０．６（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）に達するまで３０℃で増殖させた。５００μｍｏｌ／Ｌイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導した。大腸菌を３０℃で５時間培養した後、遠心分離により採集した。大腸菌ペースト再懸濁液をマイクロフロイダイザーにより破砕した。ＦＬＡＧ－Ｔａｇ付加タンパク質を、ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ社）により分離した。
　２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸－水酸化ナトリウム（ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、１％　エチレングリコール、０．１％　ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＦ－６８）（ｐＨ８．０）でゲルを洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１００μｇ／ｍＬ　ＦＬＡＧペプチド、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、１％　エチレングリコール、０．１％　プルロニックＦ－６８（ｐＨ８．０）で結合タンパク質を溶離した。
　ＦＬＡＧ－Ｔａｇ付加タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％　エチレングリコール、０．１％　プルロニックＦ－６８（ｐＨ８．０）に対し透析し、－８０℃に保存した。アッセイに際し、ｈＰＤＨＫ１の酵素濃度は９０％を上回るＰＤＨ活性抑制を示す最小濃度に設定した。
　緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　３－モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＨ７．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、６０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化マグネシウム、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、０．２％　プルロニックＦ－６８、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ジチオスレイトール）中において、０．０５Ｕ／ｍＬ　ＰＤＨ（ブタ心臓ＰＤＨ複合体、Ｓｉｇｍａ社　Ｐ７０３２）および1．０μｇ／ｍＬ　ｈＰＤＨＫ１を混合し、４℃で一晩インキュベーションしてＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ１複合体を調製した。
　被験化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。９６穴ハーフエリアＵＶ透過マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社　３６７９）にＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ１複合体２０μＬ、被験化合物１．５μＬおよび３．５３μｍｏｌ／Ｌ　ＡＴＰ（緩衝液にて希釈）８．５μＬを添加し、室温で４５分間ＰＤＨＫ反応を行った。対照ウェルには被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加した。また、ＰＤＨ反応の最大速度を測定するためのブランクウェルには、被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加し、ｈＰＤＨＫ１を除いた。
　続いて、基質（５ｍｍｏｌ／Ｌ　ピルビン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ　コエンザイムＡ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　チアミンピロリン酸、緩衝液にて希釈）を１０μＬ添加し、室温で９０分間インキュベーションすることにより、残存ＰＤＨ活性を測定した。
　ＰＤＨ反応前後における３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定することにより、ＰＤＨ反応により産生されるＮＡＤＨを検出した。被験化合物のｈＰＤＨＫ１阻害率（％）は式［｛（被験化合物のＰＤＨ活性－対照のＰＤＨ活性）／ブランクのＰＤＨ活性－対照のＰＤＨ活性）｝×１００］から算出した。ＩＣ５０値はｈＰＤＨＫ１阻害率５０％を挟む２点の被験化合物濃度より算出した。
　被験化合物として化合物（Ａｈ）のＩ形晶を用いた場合に得られた結果を以下の表６に示す。
（ＰＤＨＫ２活性阻害作用）
　ヒトＰＤＨＫ２（ｈＰＤＨＫ２、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号ＮＭ＿００２６１１）の場合、ｈＰＤＨＫ２　ｃＤＮＡクローン（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ－Ｍ０１／ＰＤＫ２－ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を基に、ＰＣＲでＮ末端にＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列を付加した改変ｈＰＤＨＫ２　ｃＤＮＡを作製し、ベクター（ｐＥＴ１７ｂ－Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。組換え構築体を大腸菌（ＤＨ５α－ＴＯＹＯＢＯ社）内へ形質転換した。組換えクローンを同定し、プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列分析した。予想核酸配列を持つ１クローンを発現作業用に選択した。
　ｈＰＤＨＫ２活性発現のために、改変ｈＰＤＨＫ２　ｃＤＮＡを含むｐＥＴ１７ｂベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質転換した。大腸菌を光学濃度０．６（６００ｎｍｏｌ／Ｌ）に達するまで３０℃で増殖させた。５００μｍｏｌ／Ｌイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導した。大腸菌を３０℃で５時間培養した後、遠心分離により採集した。大腸菌ペースト再懸濁液をマイクロフルイダイザーにより破砕した。ＦＬＡＧ－Ｔａｇ付加タンパク質を、ＦＬＡＧアフィニティーゲルにより分離した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸－水酸化ナトリウム（ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、１％　エチレングリコール、０．１％　プルロニックＦ－６８（ｐＨ８．０）でゲルを洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１００μｇ／ｍＬ　ＦＬＡＧペプチド、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、１％　エチレングリコール、０．１％　プルロニックＦ－６８（ｐＨ８．０）で結合タンパク質を溶離した。ＦＬＡＧ－Ｔａｇ付加タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％　エチレングリコール、０．１％　プルロニックＦ－６８（ｐＨ８．０）に対し透析し、－８０℃に保存した。アッセイに際し、ｈＰＤＨＫ２の酵素濃度はＰＤＨを最も阻害する最小濃度に設定した。
　緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　３－モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＨ７．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、６０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化マグネシウム、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、０．２％　プルロニックＦ－６８、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ジチオスレイトール）中において、０．０５Ｕ／ｍＬ　ＰＤＨおよび１．６μｇ／ｍＬ　ｈＰＤＨＫ２を混合し、４℃で一晩インキュベーションしてＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ２複合体を調製した。被験化合物はＤＭＳＯで希釈した。９６穴ハーフエリアＵＶ透過マイクロプレートにＰＤＨ／ｈＰＤＨＫ２複合体２０μＬ、被験化合物１．５μＬおよび３．５３μｍｏｌ／Ｌ　ＡＴＰ（緩衝液にて希釈）８．５μＬを添加し、室温で４５分間ＰＤＨＫ反応を行った。対照ウェルには被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加した。また、ＰＤＨ反応の最大速度を測定するためのブランクウェルには、被験化合物の代わりにＤＭＳＯを１．５μＬ添加し、ｈＰＤＨＫ２を除いた。続いて、基質（５ｍｍｏｌ／Ｌ　ピルビン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ　コエンザイムＡ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　チアミンピロリン酸、緩衝液にて希釈）を１０μＬ添加し、室温で９０分間インキュベーションすることにより、残存ＰＤＨ活性を測定した。ＰＤＨ反応前後における３４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定することにより、ＰＤＨ反応により産生されるＮＡＤＨを検出した。被験化合物のｈＰＤＨＫ２阻害率（％）は式［｛（被験化合物のＰＤＨ活性－対照のＰＤＨ活性）／ブランクのＰＤＨ活性－対照のＰＤＨ活性）｝×１００］から算出した。ＩＣ５０値はｈＰＤＨＫ２阻害率５０％を挟む２点の被験化合物濃度より算出した。
　被験化合物として化合物（Ａｈ）のＩ形晶および化合物（Ｂｈ）のＩＶｂ形晶を用いた場合に得られた結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　本発明の化合物（Ａｈ）またはその結晶、あるいは化合物（Ｂｈ）またはその結晶は、ＰＤＨＫ阻害作用を示し、かつ安定性に優れるため、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症（糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、白内障等）、心不全（急性心不全、慢性心不全）、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌、肺高血圧症およびアルツハイマー病の予防または治療のための医薬として有用である。

Claims (10)

  1. 　式（Ｊ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    で表される化合物。
  2. 　請求項１記載の化合物の結晶。
  3. 　粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、６．９±０．２、１０．２±０．２、１５．５±０．２、１５．８±０．２および１６．６±０．２を含む回折ピークを有する、請求項１記載の化合物の結晶。
  4. 　請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
  5. 　請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症、心不全、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤。
  6. 　式（Ｑ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    で表される化合物。
  7. 　請求項６記載の化合物の結晶。
  8. 　粉末Ｘ線回析における回折角２θ（°）が、１１．８±０．２、１３．２±０．２、１４．３±０．２、１６．６±０．２および１９．８±０．２を含む回折ピークを有する、請求項６記載の化合物の結晶。
  9. 　請求項６乃至８のいずれか１項に記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
  10. 　請求項６乃至８のいずれか１項に記載の化合物または結晶、および製薬上許容される担体を含有してなる、糖尿病、インスリン抵抗性症候群、メタボリックシンドローム、高血糖症、高乳酸血症、糖尿病合併症、心不全、心筋症、心筋虚血症、心筋梗塞、狭心症、脂質異常症、アテローム性硬化症、末梢動脈疾患、間欠性跛行、慢性閉塞性肺疾患、脳虚血症、脳卒中、ミトコンドリア病、ミトコンドリア脳筋症、癌および肺高血圧症からなる群より選択される疾患の予防および／または治療剤。
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