JP6615504B2

JP6615504B2 - 高血圧症の予防又は治療用医薬

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Publication number: JP6615504B2
Application number: JP2015121371A
Authority: JP
Inventors: 久和扇田; 宗一栗田; 暁玲逢
Original assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Current assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Priority date: 2015-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2019-12-04
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: JP2017007949A

Description

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、並びにこれを含有する高血圧症の予防又は治療用医薬、及び血圧降下用医薬に関する。

日本において、高血圧症の患者数は３０００万人ともいわれており、その数は糖尿病（１０００万人）や脂質異常症（１５００万人）等の患者数が比較的多い他の疾患と比べて非常に多い。高血圧症治療用医薬としては、現在のところ、カルシウム拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、利尿薬等、血圧調整に関わる種々の経路を標的とする医薬が知られている。例えば、アンジオテンシンＩＩは、遠位尿細管におけるＮａ^＋、Ｃｌ⁻、及び水の再吸収を促進し、且つ血管を収縮させることによって血圧上昇を引き起こすところ、アンジオテンシン変換酵素阻害薬はアンジオテンシンＩＩの生成を抑制することによって血圧降下作用を発揮する。また、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬は、アンジオテンシンＩＩの受容体への結合をブロックすることによって血圧降下作用を発揮する。

しかし、現状では、異なる経路を標的とする複数の治療薬を投与しても、血圧のコントロールを十分にできない患者が存在する。このため、新たな経路を標的とする高血圧症治療用医薬の開発の必要性がある。

一方、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（Dipeptidyl peptidase III）は、分子量約８０ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、エキソアミノペプチダーゼの一種で、３〜１０アミノ酸程度からなるペプチドを、Ｎ末端から２アミノ酸ずつ切断していく酵素であり、その配列特異性は比較的低い。生体内においては、タンパク質ターンオーバー、痛覚の調節、酸化ストレス等に関わっているといわれている（非特許文献１）。また、主に細胞質に存在する酵素であり、このため生体内においては、血清中に存在するアンジオテンシンＩＩの制御に関わっている可能性は低いと考えられる。

Prajapati SC, Chauhan SS. Dipeptidyl peptidase III: a multifaceted oligopeptide N-end cutter. FEBS J. 2011; 278: 3256-3276.

本発明は、従来とは異なる経路を標的とする、高血圧症の予防又は治療用医薬を提供することを課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が血圧降下作用を有することを見出した。この血圧降下作用は、アンジオテンシンＩＩの分解に依ると考えられる。このため、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質は従来とは異なる経路を標的とするものである。さらに、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの中でもＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質は、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いことを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。

項１．ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、高血圧症の予防又は治療用医薬。

項２．前記ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、下記（ａ）に記載するタンパク質及び下記（ｂ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の予防又は治療用医薬：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。

項３．前記ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質である、項１又は２に記載の予防又は治療用医薬。

項４．前記Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である、項３に記載の予防又は治療用医薬：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。

項５．ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、血圧降下用医薬。

項６．下記（ｃ）又は（ｄ）に記載する、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。

本発明によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を有効成分として用いることによって、高血圧症の予防又は治療用医薬を提供することができる。本発明の医薬は従来とは異なる経路を標的としているので、これを用いれば、従来の治療薬では予防又は治療効果が不十分であった高血圧症患者を、より有効に予防又は治療できる可能性がある。また、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を用いれば、より高い血圧降下作用を発揮することも可能である。

ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（WT）又はＣ末端欠失型タンパク質（ΔC1）を発現させた大腸菌の粗抽出液（左側の2レーン）及びこれらのタンパク質の精製物（右側2レーン）をSDS-PAGEした結果を示す（実施例１）。矢印が目的のタンパク質のバンド位置を示す。 DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1とアンジオテンシンＩＩの反応液の逆相クロマトグラフ分離（実施例２）における、溶出液のアセトニトリル濃度の変化を示す。縦軸は溶出液中のアセトニトリル濃度を示し、横軸は逆相クロマトグラフの経過時間を示す。 DPPIII-WTとアンジオテンシンＩＩの反応液の逆相クロマトグラフ分離（実施例２）結果を示す。各グラフ線左下の0、5、10、30 minは反応時間、縦軸は吸光度、横軸は逆相クロマトグラフの経過時間を示す（図４においても同様）。各ピークの横に、別実験でMass解析した結果から類推されたアミノ酸配列を示す。 DPPIII-ΔC1とアンジオテンシンＩＩの反応液の逆相クロマトグラフ分離（実施例２）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、収縮期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。横軸中、PreはアンジオテンシンＩＩ投与前を示し、それ以外はDPPIII-WT又はPBS投与後の経過時間を示す（図６〜１４においても同様）。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-ΔC1を投与したマウスの、収縮期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、拡張期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-ΔC1を投与したマウスの、拡張期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、平均血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-ΔC1を投与したマウスの、平均血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、心拍数の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与後にDPPIII-ΔC1を投与したマウスの、心拍数の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与せずに、DPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、収縮期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。アンジオテンシンＩＩ投与せずに、DPPIII-WT又はPBSを投与したマウスの、拡張期血圧の測定（実施例3-1）結果を示す。 PBS、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1投与から3時間経過後のマウス血清中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1を、ウェスタンブロッティングで検出した結果を示す（実施例3-2）。

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質（本明細書において、「ＤＰＰ３」と略記することもある）を含有する、高血圧症の予防又は治療用医薬、或いは血圧降下用医薬（本明細書において、これらを総称して「本発明の医薬」と示すこともある）、及びＤＰＰ３の中でもより効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いＣ末端欠失型ＤＰＰ３に関する。以下、これらについて説明する。

ＤＰＰ３（ＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＩＩ）としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のＤＰＰ３を採用することができる。中でも、投与対象の生物種由来のＤＰＰ３が好ましい。

種々の生物種由来ＤＰＰ３のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトＤＰＰ３（アイソフォーム１）としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_005691.2）が挙げられ、マウスＤＰＰ３としては配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_598564.2）が挙げられ、ラットＤＰＰ３としては配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_446200.1）が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（アイソフォーム２）としては配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001243599.1）等が挙げられる。

ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。

変異の中でも、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点からは、Ｃ末端の欠失が好ましい。この場合の欠失領域としては、Ｃ末端から１番目のアミノ酸から、例えばＣ末端から５〜６５番目のアミノ酸までの領域、好ましくは５〜５０番目のアミノ酸までの領域、より好ましくは５〜３０番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは５〜２０番目のアミノ酸までの領域、よりさらに好ましくは７〜１５番目のアミノ酸までの領域、特に好ましくは９〜１２番目のアミノ酸までの領域が挙げられる。

Ｃ末端欠失型ＤＰＰとして、具体的には、例えばヒトＤＰＰ３（アイソフォーム１）のＣ末端欠失型としては配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、マウスＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ラットＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（アイソフォーム２）のＣ末端欠失型としては配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。

ＤＰＰ３において、変異は、アンジオテンシンＩＩ分解活性及び血圧降下作用がより損なわれ難いという観点から、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。

ＤＰＰ３の好ましい具体例としては、下記（ａ）に記載するタンパク質及び下記（ｂ）に記載するタンパク質：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。

ＤＰＰ３として、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、より好ましい具体例としては、下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。

ＤＰＰ３として、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、よりさらに好ましい具体例としては、下記（ｅ）に記載するタンパク質及び下記（ｆ）に記載するタンパク質：
（ｅ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｆ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。

アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ＫａｒｌｉｎＳ，ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ．“Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｑｕｅｎｃｅｆｅａｔｕｒｅｓｂｙｕｓｉｎｇｇｅｎｅｒａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅｓ”Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８７：２２６４−２２６８（１９９０）、ＫａｒｌｉｎＳ，ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ．”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３））を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。

上記（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）において、同一性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、よりさらに好ましくは９８％以上である。

アンジオテンシンＩＩ分解活性の有無は、後述の実施例２に従って、例えばｐＨ８．０のリン酸緩衝液中で測定対象タンパク質とアンジオテンシンＩＩとを反応させ、反応後の溶液中のアンジオテンシンＩＩ量を測定することによって判定することができる。測定の結果、反応後のアンジオテンシンＩＩ量が反応前のアンジオテンシンＩＩ量よりも少ない場合は、測定対象タンパク質がアンジオテンシンＩＩ分解活性を有すると判定することができる。この判定を行うための反応時間は、特に制限されないが、例えば１０分以上、好ましくは３０分以上である。また、アンジオテンシンＩＩ量の測定は、特に制限されないが、例えば逆相クロマトグラフにより反応液を分離し、アンジオテンシンＩＩのピークの高さを測定することによって行うことが可能である。

上記（ｂ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｂ’）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。

上記（ｄ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｄ’）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。

上記（ｆ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｆ’）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。

上記（ｂ’）、（ｄ’）、及び（ｆ’）において、複数個とは、例えば２〜５０個であり、好ましくは２〜３０個であり、より好ましくは２〜１５個であり、よりさらに好ましくは２〜１０個であり、よりさらに好ましくは２〜５個であり、よりさらに好ましくは２又は３個である。

上記（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）に記載されるタンパク質において、変異がある場合、その部位はＤＰＰ３のペプチダーゼ活性を担うドメイン以外であることが好ましい。このようなドメインは、例えばＭＥＲＯＰＳデータベース（URL http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml）等のデータベース上で公知となっている。例えば、ラットＤＰＰ３におけるペプチダーゼ活性ドメインは、配列番号３のＮ末端から４２５番目のアミノ酸から６６３番目のアミノ酸である。他の生物種のＤＰＰ３においても、これに相当する部位がペプチダーゼ活性ドメインである。

ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。

ＤＰＰ３は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。

ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。

ＤＰＰ３は、Ｃ末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。

さらに、ＤＰＰ３には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。

ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等が挙げられる。

ＤＰＰ３は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。

ＤＰＰ３は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。

ＤＰＰ３は、公知の方法に従って、例えば化学合成、哺乳動物の細胞又は組織（眼組織等）からの精製、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体としては、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドからＤＰＰ３を発現させることができる細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞を利用することができる。

昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ細胞、ＭＧ１細胞、High Five^TM細胞、ＢｍＮ細胞などが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。

動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。

本発明の医薬は、ＤＰＰ３を有効成分として含有することにより、血圧降下作用を発揮することができる。このため、高血圧症やその合併症に対して優れた予防又は治療効果を発揮することができる。

本発明の医薬の適用対象である高血圧症としては、特に限定されず、本態性高血圧症、二次性高血圧症等、種々の原因による高血圧症を挙げることができる。本発明の医薬の有効成分であるＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩの分解によって血圧降下作用を発揮すると考えられるので、本発明の医薬はアンジオテンシンＩＩの上昇が認められる高血圧症に対して好適に使用することができる。また、高血圧の合併症としては、血圧降下により予防又は治療が可能な疾患であればとくに制限されず、例えば、脳卒中等の脳血管障害；虚血性心疾患、心肥大、心不全等の心臓疾患；腎臓疾患；動脈瘤、閉塞性動脈硬化症、高血圧性網膜症等の血管疾患等が挙げられる。

本発明の医薬は、ＤＰＰ３そのものであることもできるし、ＤＰＰ３以外の成分（以下、単に「添加剤」と表記することもある）を含む組成物であってもよい。添加剤としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。本発明の医薬が添加剤を含む場合は、剤形に応じた慣用の方法に従って添加剤を用いることにより、本発明の医薬を製造することができる。

本発明の医薬は、任意の剤形、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等であることができるが、好ましくは注射剤である。

本発明の医薬の投与対象は、高血圧症の患者、又は高血圧症を発症する可能性がある被検体である。高血圧症を発症する可能性がある被検体とは、例えば高血圧症の危険因子（例えば肥満、老化、塩分過摂取等）を保有している被検体である。

本発明の医薬の投与経路は、特に限定されない。例えば、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等を採用することができる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点からは、好ましくは非経口投与が挙げられ、より好ましくは経静脈投与、経動脈投与等が挙げられる。

本発明の医薬中の、ＤＰＰ３の含有量としては、高血圧症に対する予防又は治療効果を発揮できる限りにおいて特に限定されない。例えば０．００１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％であることができる。

本発明の医薬の投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば、体重６０ｋｇの成人に対して、１回当たり、１μｇ〜１０００ｍｇを投与することができる。なお、投与回数としては、例えば１日当たり１〜３回が挙げられる。

本発明の医薬は、高血圧症の他の予防又は治療薬と併用してもよい。他の予防又は治療薬としては、例えば、サイアザイド系利尿薬、サイアザイド類似利尿薬、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬等の利尿薬；ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、非ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬等のカルシウム拮抗薬；アンジオテンシン変換酵素阻害薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；直接的レニン阻害薬； α受容体遮断薬、β受容体遮断薬、α_１β遮断薬等の交感神経遮断薬； α_２受容体刺激薬等が挙げられる。他の予防又は治療用医薬は１種又は２種以上を組み併せて用いてもよい。

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質の製造
ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（配列番号３）とＣ末端欠失型タンパク質（配列番号６）を製造した。具体的には次のように行った。

ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（配列番号３）又はＣ末端欠失型タンパク質（配列番号６）をコードするcDNAをPCRで増幅し、得られたDNA断片をpGEX-6P1ベクター（GEヘルスケア社製）に挿入した。大腸菌に該ベクターを導入し、LB培地（100μg/mLアンピシリン入り） 5 mLに入れ、37℃で一晩、震盪培養した。培養液全量（5 mL）をLB培地（100μg/mLアンピシリン入り） 10 mLに加え、37℃で5時間、震盪培養した。0.01 mMになるようにIPTGを培養液に加え、20℃で一晩、震盪培養した。培養液を遠心（5,900×g、4℃、5分間）して、大腸菌体を回収した。大腸菌体に、細胞破砕用バッファー (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150ml NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10μg/ml leupeptin) 1 mLを加え、該菌体を超音波破砕（Branson社製Sonifier450［製品番号: S-450A］）（出力1で10秒×2）した。遠心（20,000×g、4℃、15分間）して上清を回収した。該上清 100μL、細胞破砕用バッファー 400μL、及びGlutathione-Sepharose 4B（GEヘルスケア社製）30μLを混合し、4℃で1時間、転倒混和した。Glutathione-Sepharose 4Bを洗浄用バッファー（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT）300μLで3回洗浄した後、Glutathione-Sepharose 4Bに洗浄用バッファー 100μLとPreScission protease（GEヘルスケア社製）3μLを加え、4℃で一晩、転倒混和した。遠心（5,900×g、4℃、1分間）して上清を回収し、PBSで透析し、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（以下、「DPPIII-WT」又は「WT」と示すこともある）及びＣ末端欠失型タンパク質（以下、「DPPIII-ΔC1」又は「ΔC1」と示すこともある）の精製物を得た。この精製物、及び粗抽出液（超音波破砕後に遠心して得られた上清）を、定法に従ってSDS-PAGEで展開してCBB染色した。染色画像を図１に示す。

図１に示されるように、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1共に、CBB染色でシングルバンドとなる程度まで精製できた。また、精製物のバンドの濃さは、DPPIII-WT：DPPIII-ΔC1＝1：1.7であった。このことより、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも効率的に製造できることが示唆された。

実施例２：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩのアンジオテンシンＩＩ分解活性の測定
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1のアンジオテンシンＩＩ分解活性を測定した。具体的には次のように行った。

反応液（50 mM NaPO₄ (pH 8.0), 10 μMアンジオテンシンＩＩ（和光純薬工業社製）, 25 nM DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1）200μLを氷上で調製した。なお、DPPは最後に添加した。DPP添加後、0分、5分、10分、又は30分経過後に、30％トリクロロ酢酸 20μLを加えて反応を停止し、氷上で15分間以上静置した。遠心（20,000×g、4℃、10分間）して上清を回収した。該上清を、COSMOSIL 5C₁₈-AR-300 column（ナカライテスク社製）を用いた逆相クロマトグラフ分離により解析した。溶出液としては、バッファーA（0.1%トリフルオロ酢酸／超純水（MilliQ））及びバッファーB（0.1%トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）の混合溶液を用いた。バッファーBの混合割合を徐々に増やして、アセトニトリル濃度5％から35％で溶出した。各経過時間における溶出液のアセトニトリル濃度を図２に示す。カラムから溶出されたペプチドはUVモニターで検出した。確認されたピークは定法に従って別実験でMass解析した結果から、そのピークのペプチド配列を類推した。結果を図３に示す。

図３及び４に示されるように、反応が進むにつれて、アンジオテンシンＩＩ（Ang II）のピークは低くなり、その分解物（IHPF、及びVY）のピークは高くなっていった。このことから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1は共に、アンジオテンシンＩＩの分解活性を有することが示された。また、反応時間10分における、アンジオテンシンＩＩ分解物であるIHPFのピーク高さを測定したところ、DPPIII-WTの場合は0.15であるのに対して、DPPIII-ΔC1の場合は0.20であった。このことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりもアンジオテンシンＩＩ分解活性が高いことが示唆された。

実施例３：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの高血圧症に対する効果
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1の、高血圧症に対する効果を調べた。具体的には次のように行った。

＜3-1．血圧及び心拍数の測定＞
8〜10週齢のC57BL/6J系統マウスの血圧及び心拍数を測定後、該マウスにアンジオテンシンＩＩ（和光純薬工業社製）を満たした浸透圧ポンプ（Alzet model 1004、Durect社製）を皮下植込みした。これにより、アンジオテンシンＩＩが、1分間、体重1 kgあたり400 ng（400 ng/kg/min）投与される。マウスを、2週間以上、収縮期血圧が130 mmHg以上になるまで飼育した。マウスの血圧及び心拍数を測定し、マウスに、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1 200μg、或いはPBSを尾静脈から静注投与した。該投与から1時間、及び3時間経過後に血圧及び心拍数を測定した。血圧の測定結果を図５〜１０に示し、心拍数の測定結果を図１１〜１２に示す。また、浸透圧ポンプの埋め込みを行っていない通常血圧のマウスに対しても、上記と同様にDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1 200μg、或いはPBSを投与し、血圧を測定した。この結果を図１３〜１４に示す。

図５〜１０に示されるように、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1の投与により、収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧が有意に低下した。このことから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1は共に、抗高血圧作用（血圧降下作用）を有することが示された。また、DPPIII-WTを投与した場合、投与後3時間経過後の血圧が、投与後1時間経過後の血圧よりもやや上昇しているのに対して、DPPIII-ΔC1を投与した場合はこのような上昇は見られなかった。このことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも抗高血圧作用（血圧降下作用）がより高い（より長時間持続する）ことが示された。また、図１１〜１２に示されるように、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1共に心拍数への影響はなかった。さらに、図１３〜１４に示されるように、DPPIII-WTは、アンジオテンシンＩＩを投与していないマウスの血圧への影響はなかった。このことから、DPPIII-WTの抗高血圧作用（血圧降下作用）はアンジオテンシンＩＩ特異的であることが示唆された。

＜3-2．血清中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量の測定＞
投与から3時間経過後の血清中に存在するDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量を、ウェスタンブロッティング法で調べた。具体的には次のように行った。

上記実施例3-1において、PBS、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1投与から3時間経過後のマウスの尾部から血清を採取し、該血清を4℃で一晩静置した。遠心（5000×g、4℃、5分間）して、上清を血清サンプルとして回収した。血清サンプル中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量を、定法に従ったウェスタンブロッティング法により検出した。一次抗体反応は、抗ラットDPPIIIウサギポリクローナル抗体の希釈溶液（1/500希釈 in 1%スキムミルク/PBS/0.05%Tween-20）を用いて、4℃で一晩行った。二次抗体反応は、HRP標識抗ウサギIgG抗体（GEヘルスケア社製、製品番号: NA-934）の希釈液（1/2000希釈 in 1%スキムミルク/PBS/0.05%Tween-20）を用いて、室温で1時間行った。検出結果を図１５に示す。

図１５に示されるように、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1を投与した場合、投与から3時間経過後であっても、これらのタンパク質が血清中に残っていた。このことから、投与から3時間以上経過した後であっても、血圧降下作用が発揮されることが予想された。また、バンドの濃さの比較より、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも多く残っていることが示された。このことから、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも、生体内での安定性がより高いことが示唆された。

Claims

下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、高血圧症の予防又は治療用医薬：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。
下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、血圧降下用医薬：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。