JP6831128B2 - 高血圧症の予防又は治療用医薬 - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、並びにこれを含有する高血圧症の予防又
は治療用医薬、及び血圧降下用医薬に関する。
は治療用医薬、及び血圧降下用医薬に関する。
日本において、高血圧症の患者数は３０００万人ともいわれており、その数は糖尿病（
１０００万人）や脂質異常症（１５００万人）等の患者数が比較的多い他の疾患と比べて
非常に多い。高血圧症治療用医薬としては、現在のところ、カルシウム拮抗薬、アンジオ
テンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、利尿薬等、血圧調整に関
わる種々の経路を標的とする医薬が知られている。例えば、アンジオテンシンＩＩは、遠
位尿細管におけるＮａ＋、Ｃｌ−、及び水の再吸収を促進し、且つ血管を収縮させること
によって血圧上昇を引き起こすところ、アンジオテンシン変換酵素阻害薬はアンジオテン
シンＩＩの生成を抑制することによって血圧降下作用を発揮する。また、アンジオテンシ
ンＩＩ受容体拮抗薬は、アンジオテンシンＩＩの受容体への結合をブロックすることによ
って血圧降下作用を発揮する。
１０００万人）や脂質異常症（１５００万人）等の患者数が比較的多い他の疾患と比べて
非常に多い。高血圧症治療用医薬としては、現在のところ、カルシウム拮抗薬、アンジオ
テンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、利尿薬等、血圧調整に関
わる種々の経路を標的とする医薬が知られている。例えば、アンジオテンシンＩＩは、遠
位尿細管におけるＮａ＋、Ｃｌ−、及び水の再吸収を促進し、且つ血管を収縮させること
によって血圧上昇を引き起こすところ、アンジオテンシン変換酵素阻害薬はアンジオテン
シンＩＩの生成を抑制することによって血圧降下作用を発揮する。また、アンジオテンシ
ンＩＩ受容体拮抗薬は、アンジオテンシンＩＩの受容体への結合をブロックすることによ
って血圧降下作用を発揮する。
しかし、現状では、異なる経路を標的とする複数の治療薬を投与しても、血圧のコント
ロールを十分にできない患者が存在する。このため、新たな経路を標的とする高血圧症治
療用医薬の開発の必要性がある。
ロールを十分にできない患者が存在する。このため、新たな経路を標的とする高血圧症治
療用医薬の開発の必要性がある。
一方、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（Dipeptidyl peptidase III）は、分子量約８
０ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、エキソアミノペプチダーゼの一種で、
３〜１０アミノ酸程度からなるペプチドを、Ｎ末端から２アミノ酸ずつ切断していく酵素
であり、その配列特異性は比較的低い。生体内においては、タンパク質ターンオーバー、
痛覚の調節、酸化ストレス等に関わっているといわれている（非特許文献１）。また、主
に細胞質に存在する酵素であり、このため生体内においては、血清中に存在するアンジオ
テンシンＩＩの制御に関わっている可能性は低いと考えられる。
０ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、エキソアミノペプチダーゼの一種で、
３〜１０アミノ酸程度からなるペプチドを、Ｎ末端から２アミノ酸ずつ切断していく酵素
であり、その配列特異性は比較的低い。生体内においては、タンパク質ターンオーバー、
痛覚の調節、酸化ストレス等に関わっているといわれている（非特許文献１）。また、主
に細胞質に存在する酵素であり、このため生体内においては、血清中に存在するアンジオ
テンシンＩＩの制御に関わっている可能性は低いと考えられる。
Prajapati SC, Chauhan SS. Dipeptidyl peptidase III: a multifaceted oligopeptide N-end cutter. FEBS J. 2011; 278: 3256-3276.
本発明は、従来とは異なる経路を標的とする、高血圧症の予防又は治療用医薬を提供す
ることを課題とする。
ることを課題とする。
本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタ
ンパク質が血圧降下作用を有することを見出した。この血圧降下作用は、アンジオテンシ
ンＩＩの分解に依ると考えられる。このため、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク
質は従来とは異なる経路を標的とするものである。さらに、ジペプチジルペプチダーゼＩ
ＩＩの中でもＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質は、より効率的に
製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内で
の安定性がより高いことを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、
本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
ンパク質が血圧降下作用を有することを見出した。この血圧降下作用は、アンジオテンシ
ンＩＩの分解に依ると考えられる。このため、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク
質は従来とは異なる経路を標的とするものである。さらに、ジペプチジルペプチダーゼＩ
ＩＩの中でもＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質は、より効率的に
製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がより長時間持続し、且つ生体内で
の安定性がより高いことを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、
本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
項１． ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、高血圧症の予防又は
治療用医薬。
治療用医薬。
項２． 前記ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、下記（ａ）に記載するタ
ンパク質及び下記（ｂ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１に記載の予防又は治療用医薬：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有
するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。
ンパク質及び下記（ｂ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１に記載の予防又は治療用医薬：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有
するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。
項３． 前記ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、Ｃ末端欠失型ジペプチジ
ルペプチダーゼＩＩＩタンパク質である、項１又は２に記載の予防又は治療用医薬。
ルペプチダーゼＩＩＩタンパク質である、項１又は２に記載の予防又は治療用医薬。
項４． 前記Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質が、下記（ｃ）
に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少
なくとも１種である、項３に記載の予防又は治療用医薬：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一
性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク
質。
に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少
なくとも１種である、項３に記載の予防又は治療用医薬：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一
性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク
質。
項５． ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、血圧降下用医薬。
項６． 下記（ｃ）又は（ｄ）に記載する、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩ
ＩＩタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一
性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク
質。
ＩＩタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
、及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一
性を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク
質。
本発明によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を有効成分として用いる
ことによって、高血圧症の予防又は治療用医薬を提供することができる。本発明の医薬は
従来とは異なる経路を標的としているので、これを用いれば、従来の治療薬では予防又は
治療効果が不十分であった高血圧症患者を、より有効に予防又は治療できる可能性がある
。また、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を用いれば、より高い
血圧降下作用を発揮することも可能である。
ことによって、高血圧症の予防又は治療用医薬を提供することができる。本発明の医薬は
従来とは異なる経路を標的としているので、これを用いれば、従来の治療薬では予防又は
治療効果が不十分であった高血圧症患者を、より有効に予防又は治療できる可能性がある
。また、Ｃ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を用いれば、より高い
血圧降下作用を発揮することも可能である。
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質（本明細書において、「ＤＰＰ
３」と略記することもある）を含有する、高血圧症の予防又は治療用医薬、或いは血圧降
下用医薬（本明細書において、これらを総称して「本発明の医薬」と示すこともある）、
及びＤＰＰ３の中でもより効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用
がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いＣ末端欠失型ＤＰＰ３に関する。
以下、これらについて説明する。
３」と略記することもある）を含有する、高血圧症の予防又は治療用医薬、或いは血圧降
下用医薬（本明細書において、これらを総称して「本発明の医薬」と示すこともある）、
及びＤＰＰ３の中でもより効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用
がより長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いＣ末端欠失型ＤＰＰ３に関する。
以下、これらについて説明する。
ＤＰＰ３（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＩＩ）としては、例えばヒト
、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のＤＰＰ３を採用す
ることができる。中でも、投与対象の生物種由来のＤＰＰ３が好ましい。
、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のＤＰＰ３を採用す
ることができる。中でも、投与対象の生物種由来のＤＰＰ３が好ましい。
種々の生物種由来ＤＰＰ３のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトＤ
ＰＰ３（アイソフォーム１）としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質（NCBI Reference Sequence：NP_005691.2）が挙げられ、マウスＤＰＰ３としては配
列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_59
8564.2）が挙げられ、ラットＤＰＰ３としては配列番号３に示されるアミノ酸配列からな
るタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_446200.1）が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（ア
イソフォーム２）としては配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI
Reference Sequence：NP_001243599.1）等が挙げられる。
ＰＰ３（アイソフォーム１）としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質（NCBI Reference Sequence：NP_005691.2）が挙げられ、マウスＤＰＰ３としては配
列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_59
8564.2）が挙げられ、ラットＤＰＰ３としては配列番号３に示されるアミノ酸配列からな
るタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_446200.1）が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（ア
イソフォーム２）としては配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI
Reference Sequence：NP_001243599.1）等が挙げられる。
ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、
欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。
欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。
変異の中でも、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用がよ
り長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点からは、Ｃ末端の欠失が好
ましい。この場合の欠失領域としては、Ｃ末端から１番目のアミノ酸から、例えばＣ末端
から５〜６５番目のアミノ酸までの領域、好ましくは５〜５０番目のアミノ酸までの領域
、より好ましくは５〜３０番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは５〜２０番目の
アミノ酸までの領域、よりさらに好ましくは７〜１５番目のアミノ酸までの領域、特に好
ましくは９〜１２番目のアミノ酸までの領域が挙げられる。
り長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点からは、Ｃ末端の欠失が好
ましい。この場合の欠失領域としては、Ｃ末端から１番目のアミノ酸から、例えばＣ末端
から５〜６５番目のアミノ酸までの領域、好ましくは５〜５０番目のアミノ酸までの領域
、より好ましくは５〜３０番目のアミノ酸までの領域、さらに好ましくは５〜２０番目の
アミノ酸までの領域、よりさらに好ましくは７〜１５番目のアミノ酸までの領域、特に好
ましくは９〜１２番目のアミノ酸までの領域が挙げられる。
Ｃ末端欠失型ＤＰＰとして、具体的には、例えばヒトＤＰＰ３（アイソフォーム１）の
Ｃ末端欠失型としては配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ
、マウスＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質が挙げられ、ラットＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（アイソフォーム２）のＣ末端欠
失型としては配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。
Ｃ末端欠失型としては配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ
、マウスＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質が挙げられ、ラットＤＰＰ３のＣ末端欠失型としては配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ヒトＤＰＰ３（アイソフォーム２）のＣ末端欠
失型としては配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。
ＤＰＰ３において、変異は、アンジオテンシンＩＩ分解活性及び血圧降下作用がより損
なわれ難いという観点から、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ
酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン
、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されるこ
とが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性
側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン
、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトフ
ァンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンとい
ったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン
、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な
置換にあたる。
なわれ難いという観点から、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ
酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン
、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されるこ
とが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性
側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン
、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトフ
ァンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンとい
ったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン
、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な
置換にあたる。
ＤＰＰ３の好ましい具体例としては、下記（ａ）に記載するタンパク質及び下記（ｂ）
に記載するタンパク質：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
に記載するタンパク質：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
ＤＰＰ３として、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用が
より長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、より好ましい具体
例としては、下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性
を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
より長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、より好ましい具体
例としては、下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性
を有するアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
ＤＰＰ３として、より効率的に製造可能であり、血圧降下作用がより高く、その作用が
より長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、よりさらに好まし
い具体例としては、下記（ｅ）に記載するタンパク質及び下記（ｆ）に記載するタンパク
質：
（ｅ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｆ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
より長時間持続し、且つ生体内での安定性がより高いという観点から、よりさらに好まし
い具体例としては、下記（ｅ）に記載するタンパク質及び下記（ｆ）に記載するタンパク
質：
（ｅ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｆ）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する
同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど
、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば
、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される
。若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａ
ｒｌｉｎＳ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ
ｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇｓ
ｃｈｅｍｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６
８（１９９０）、ＫａｒｌｉｎＳ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇｓ
ｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３））を用いて決定できる。このようなＢＬ
ＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。
これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど
、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば
、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される
。若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａ
ｒｌｉｎＳ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ
ｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇｓ
ｃｈｅｍｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６
８（１９９０）、ＫａｒｌｉｎＳ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇｓ
ｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３））を用いて決定できる。このようなＢＬ
ＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。
これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
上記（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）において、同一性は、好ましくは９０％以上であり、
より好ましくは９５％以上であり、よりさらに好ましくは９８％以上である。
より好ましくは９５％以上であり、よりさらに好ましくは９８％以上である。
アンジオテンシンＩＩ分解活性の有無は、後述の実施例２に従って、例えばｐＨ８．０
のリン酸緩衝液中で測定対象タンパク質とアンジオテンシンＩＩとを反応させ、反応後の
溶液中のアンジオテンシンＩＩ量を測定することによって判定することができる。測定の
結果、反応後のアンジオテンシンＩＩ量が反応前のアンジオテンシンＩＩ量よりも少ない
場合は、測定対象タンパク質がアンジオテンシンＩＩ分解活性を有すると判定することが
できる。この判定を行うための反応時間は、特に制限されないが、例えば１０分以上、好
ましくは３０分以上である。また、アンジオテンシンＩＩ量の測定は、特に制限されない
が、例えば逆相クロマトグラフにより反応液を分離し、アンジオテンシンＩＩのピークの
高さを測定することによって行うことが可能である。
のリン酸緩衝液中で測定対象タンパク質とアンジオテンシンＩＩとを反応させ、反応後の
溶液中のアンジオテンシンＩＩ量を測定することによって判定することができる。測定の
結果、反応後のアンジオテンシンＩＩ量が反応前のアンジオテンシンＩＩ量よりも少ない
場合は、測定対象タンパク質がアンジオテンシンＩＩ分解活性を有すると判定することが
できる。この判定を行うための反応時間は、特に制限されないが、例えば１０分以上、好
ましくは３０分以上である。また、アンジオテンシンＩＩ量の測定は、特に制限されない
が、例えば逆相クロマトグラフにより反応液を分離し、アンジオテンシンＩＩのピークの
高さを測定することによって行うことが可能である。
上記（ｂ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｂ’）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個の
アミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテン
シンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
（ｂ’）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個の
アミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテン
シンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
上記（ｄ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｄ’）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複
数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジ
オテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
（ｄ’）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複
数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジ
オテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
上記（ｆ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｆ’）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個の
アミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテン
シンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
（ｆ’）配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個の
アミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテン
シンＩＩ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
上記（ｂ’）、（ｄ’）、及び（ｆ’）において、複数個とは、例えば２〜５０個であ
り、好ましくは２〜３０個であり、より好ましくは２〜１５個であり、よりさらに好まし
くは２〜１０個であり、よりさらに好ましくは２〜５個であり、よりさらに好ましくは２
又は３個である。
り、好ましくは２〜３０個であり、より好ましくは２〜１５個であり、よりさらに好まし
くは２〜１０個であり、よりさらに好ましくは２〜５個であり、よりさらに好ましくは２
又は３個である。
上記（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）に記載されるタンパク質において、変異がある場合、
その部位はＤＰＰ３のペプチダーゼ活性を担うドメイン以外であることが好ましい。この
ようなドメインは、例えばＭＥＲＯＰＳデータベース（URL http://merops.sanger.ac.u
k/index.shtml）等のデータベース上で公知となっている。例えば、ラットＤＰＰ３にお
けるペプチダーゼ活性ドメインは、配列番号３のＮ末端から４２５番目のアミノ酸から６
６３番目のアミノ酸である。他の生物種のＤＰＰ３においても、これに相当する部位がペ
プチダーゼ活性ドメインである。
その部位はＤＰＰ３のペプチダーゼ活性を担うドメイン以外であることが好ましい。この
ようなドメインは、例えばＭＥＲＯＰＳデータベース（URL http://merops.sanger.ac.u
k/index.shtml）等のデータベース上で公知となっている。例えば、ラットＤＰＰ３にお
けるペプチダーゼ活性ドメインは、配列番号３のＮ末端から４２５番目のアミノ酸から６
６３番目のアミノ酸である。他の生物種のＤＰＰ３においても、これに相当する部位がペ
プチダーゼ活性ドメインである。
ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、化学修飾されたも
のであってもよい。
のであってもよい。
ＤＰＰ３は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−
）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプ
ロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシ
ルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２
アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−
ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基
；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシ
ルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２
アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−
ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基
；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＤＰＰ３は、Ｃ末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化ま
たはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端
のエステルなどが用いられる。
たはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端
のエステルなどが用いられる。
さらに、ＤＰＰ３には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されて
いるもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化
したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミ
ダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、
アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されてい
るもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されて
いるもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化
したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミ
ダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、
アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されてい
るもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
ＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩ分解活性を有する限りにおいて、公知のタンパク質
タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ
、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等が挙げられる。
タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ
、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等が挙げられる。
ＤＰＰ３は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬
学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用するこ
とができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン
酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、
リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩
； アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩
の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシ
ウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用するこ
とができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン
酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、
リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩
； アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩
の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシ
ウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
ＤＰＰ３は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれ
ば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
ば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
ＤＰＰ３は、公知の方法に従って、例えば化学合成、哺乳動物の細胞又は組織（眼組織
等）からの精製、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精
製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体とし
ては、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドからＤＰＰ３を発現させることができる細
胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞
を利用することができる。
等）からの精製、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精
製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体とし
ては、ＤＰＰ３をコードするポリヌクレオチドからＤＰＰ３を発現させることができる細
胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞
を利用することができる。
昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ細胞、ＭＧ１細胞、High FiveTM細胞、ＢｍＮ細胞な
どが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細
胞などが用いられる。
どが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細
胞などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハ
ムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、
ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
ムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、
ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
本発明の医薬は、ＤＰＰ３を有効成分として含有することにより、血圧降下作用を発揮
することができる。このため、高血圧症やその合併症に対して優れた予防又は治療効果を
発揮することができる。
することができる。このため、高血圧症やその合併症に対して優れた予防又は治療効果を
発揮することができる。
本発明の医薬の適用対象である高血圧症としては、特に限定されず、本態性高血圧症、
二次性高血圧症等、種々の原因による高血圧症を挙げることができる。本発明の医薬の有
効成分であるＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩの分解によって血圧降下作用を発揮する
と考えられるので、本発明の医薬はアンジオテンシンＩＩの上昇が認められる高血圧症に
対して好適に使用することができる。また、高血圧の合併症としては、血圧降下により予
防又は治療が可能な疾患であればとくに制限されず、例えば、脳卒中等の脳血管障害；
虚血性心疾患、心肥大、心不全等の心臓疾患； 腎臓疾患； 動脈瘤、閉塞性動脈硬化症
、高血圧性網膜症等の血管疾患等が挙げられる。
二次性高血圧症等、種々の原因による高血圧症を挙げることができる。本発明の医薬の有
効成分であるＤＰＰ３は、アンジオテンシンＩＩの分解によって血圧降下作用を発揮する
と考えられるので、本発明の医薬はアンジオテンシンＩＩの上昇が認められる高血圧症に
対して好適に使用することができる。また、高血圧の合併症としては、血圧降下により予
防又は治療が可能な疾患であればとくに制限されず、例えば、脳卒中等の脳血管障害；
虚血性心疾患、心肥大、心不全等の心臓疾患； 腎臓疾患； 動脈瘤、閉塞性動脈硬化症
、高血圧性網膜症等の血管疾患等が挙げられる。
本発明の医薬は、ＤＰＰ３そのものであることもできるし、ＤＰＰ３以外の成分（以下
、単に「添加剤」と表記することもある）を含む組成物であってもよい。添加剤としては
、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、
溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保
湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。本発明の医薬が添加剤を含む場合
は、剤形に応じた慣用の方法に従って添加剤を用いることにより、本発明の医薬を製造す
ることができる。
、単に「添加剤」と表記することもある）を含む組成物であってもよい。添加剤としては
、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、
溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保
湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。本発明の医薬が添加剤を含む場合
は、剤形に応じた慣用の方法に従って添加剤を用いることにより、本発明の医薬を製造す
ることができる。
本発明の医薬は、任意の剤形、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤
、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等であることができるが、好ましくは注射剤である。
、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等であることができるが、好ましくは注射剤である。
本発明の医薬の投与対象は、高血圧症の患者、又は高血圧症を発症する可能性がある被
検体である。高血圧症を発症する可能性がある被検体とは、例えば高血圧症の危険因子（
例えば肥満、老化、塩分過摂取等）を保有している被検体である。
検体である。高血圧症を発症する可能性がある被検体とは、例えば高血圧症の危険因子（
例えば肥満、老化、塩分過摂取等）を保有している被検体である。
本発明の医薬の投与経路は、特に限定されない。例えば、経口投与、経管栄養、注腸投
与等の経腸投与； 経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内
投与、腹腔内投与等の非経口投与等を採用することができる。これらの中でも、本発明の
効果をより確実に発揮できるという観点からは、好ましくは非経口投与が挙げられ、より
好ましくは経静脈投与、経動脈投与等が挙げられる。
与等の経腸投与； 経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内
投与、腹腔内投与等の非経口投与等を採用することができる。これらの中でも、本発明の
効果をより確実に発揮できるという観点からは、好ましくは非経口投与が挙げられ、より
好ましくは経静脈投与、経動脈投与等が挙げられる。
本発明の医薬中の、ＤＰＰ３の含有量としては、高血圧症に対する予防又は治療効果を
発揮できる限りにおいて特に限定されない。例えば０．００１〜１００重量％、好ましく
は０．０１〜５０重量％であることができる。
発揮できる限りにおいて特に限定されない。例えば０．００１〜１００重量％、好ましく
は０．０１〜５０重量％であることができる。
本発明の医薬の投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態
、及び医師の判断などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば、体重６０ｋ
ｇの成人に対して、１回当たり、１μｇ〜１０００ｍｇを投与することができる。なお、
投与回数としては、例えば１日当たり１〜３回が挙げられる。
、及び医師の判断などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば、体重６０ｋ
ｇの成人に対して、１回当たり、１μｇ〜１０００ｍｇを投与することができる。なお、
投与回数としては、例えば１日当たり１〜３回が挙げられる。
本発明の医薬は、高血圧症の他の予防又は治療薬と併用してもよい。他の予防又は治療
薬としては、例えば、サイアザイド系利尿薬、サイアザイド類似利尿薬、ループ利尿薬、
カリウム保持性利尿薬等の利尿薬； ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、非ジヒドロ
ピリジン系カルシウム拮抗薬等のカルシウム拮抗薬； アンジオテンシン変換酵素阻害薬
； アンジオテンシン受容体拮抗薬； 直接的レニン阻害薬； α受容体遮断薬、β受容
体遮断薬、α１β遮断薬等の交感神経遮断薬； α２受容体刺激薬等が挙げられる。他の
予防又は治療用医薬は１種又は２種以上を組み併せて用いてもよい。
薬としては、例えば、サイアザイド系利尿薬、サイアザイド類似利尿薬、ループ利尿薬、
カリウム保持性利尿薬等の利尿薬； ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、非ジヒドロ
ピリジン系カルシウム拮抗薬等のカルシウム拮抗薬； アンジオテンシン変換酵素阻害薬
； アンジオテンシン受容体拮抗薬； 直接的レニン阻害薬； α受容体遮断薬、β受容
体遮断薬、α１β遮断薬等の交感神経遮断薬； α２受容体刺激薬等が挙げられる。他の
予防又は治療用医薬は１種又は２種以上を組み併せて用いてもよい。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によっ
て限定されるものではない。
て限定されるものではない。
実施例１：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質の製造
ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（配列番号３）とＣ末端欠失型タン
パク質（配列番号６）を製造した。具体的には次のように行った。
ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（配列番号３）とＣ末端欠失型タン
パク質（配列番号６）を製造した。具体的には次のように行った。
ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タンパク質（配列番号３）又はＣ末端欠失型タ
ンパク質（配列番号６）をコードするcDNAをPCRで増幅し、得られたDNA断片をpGEX-6P1ベ
クター（GEヘルスケア社製）に挿入した。大腸菌に該ベクターを導入し、LB培地（100μg
/mLアンピシリン入り） 5 mLに入れ、37℃で一晩、震盪培養した。培養液全量（5 mL）を
LB培地（100μg/mLアンピシリン入り） 10 mLに加え、37℃で5時間、震盪培養した。0.01
mMになるようにIPTGを培養液に加え、20℃で一晩、震盪培養した。培養液を遠心（5,900
×g、4℃、5分間）して、大腸菌体を回収した。大腸菌体に、細胞破砕用バッファー (50
mM Tris-HCl, pH 7.5, 150ml NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10μg/ml
leupeptin) 1 mLを加え、該菌体を超音波破砕（Branson社製Sonifier450［製品番号: S-4
50A］）（出力1で10秒×2）した。遠心（20,000×g、4℃、15分間）して上清を回収した
。該上清 100μL、細胞破砕用バッファー 400μL、及びGlutathione-Sepharose 4B（GEヘ
ルスケア社製）30μLを混合し、4℃で1時間、転倒混和した。Glutathione-Sepharose 4B
を洗浄用バッファー（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT）300μLで3回
洗浄した後、Glutathione-Sepharose 4Bに洗浄用バッファー 100μLとPreScission prote
ase（GEヘルスケア社製）3μLを加え、4℃で一晩、転倒混和した。遠心（5,900×g、4℃
、1分間）して上清を回収し、PBSで透析し、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タン
パク質（以下、「DPPIII-WT」又は「WT」と示すこともある）及びＣ末端欠失型タンパク
質（以下、「DPPIII-ΔC1」又は「ΔC1」と示すこともある）の精製物を得た。この精製
物、及び粗抽出液（超音波破砕後に遠心して得られた上清）を、定法に従ってSDS-PAGEで
展開してCBB染色した。染色画像を図１に示す。
ンパク質（配列番号６）をコードするcDNAをPCRで増幅し、得られたDNA断片をpGEX-6P1ベ
クター（GEヘルスケア社製）に挿入した。大腸菌に該ベクターを導入し、LB培地（100μg
/mLアンピシリン入り） 5 mLに入れ、37℃で一晩、震盪培養した。培養液全量（5 mL）を
LB培地（100μg/mLアンピシリン入り） 10 mLに加え、37℃で5時間、震盪培養した。0.01
mMになるようにIPTGを培養液に加え、20℃で一晩、震盪培養した。培養液を遠心（5,900
×g、4℃、5分間）して、大腸菌体を回収した。大腸菌体に、細胞破砕用バッファー (50
mM Tris-HCl, pH 7.5, 150ml NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10μg/ml
leupeptin) 1 mLを加え、該菌体を超音波破砕（Branson社製Sonifier450［製品番号: S-4
50A］）（出力1で10秒×2）した。遠心（20,000×g、4℃、15分間）して上清を回収した
。該上清 100μL、細胞破砕用バッファー 400μL、及びGlutathione-Sepharose 4B（GEヘ
ルスケア社製）30μLを混合し、4℃で1時間、転倒混和した。Glutathione-Sepharose 4B
を洗浄用バッファー（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT）300μLで3回
洗浄した後、Glutathione-Sepharose 4Bに洗浄用バッファー 100μLとPreScission prote
ase（GEヘルスケア社製）3μLを加え、4℃で一晩、転倒混和した。遠心（5,900×g、4℃
、1分間）して上清を回収し、PBSで透析し、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの全長タン
パク質（以下、「DPPIII-WT」又は「WT」と示すこともある）及びＣ末端欠失型タンパク
質（以下、「DPPIII-ΔC1」又は「ΔC1」と示すこともある）の精製物を得た。この精製
物、及び粗抽出液（超音波破砕後に遠心して得られた上清）を、定法に従ってSDS-PAGEで
展開してCBB染色した。染色画像を図１に示す。
図１に示されるように、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1共に、CBB染色でシングルバンドと
なる程度まで精製できた。また、精製物のバンドの濃さは、DPPIII-WT：DPPIII-ΔC1＝1
：1.7であった。このことより、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも効率的に製造でき
ることが示唆された。
なる程度まで精製できた。また、精製物のバンドの濃さは、DPPIII-WT：DPPIII-ΔC1＝1
：1.7であった。このことより、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも効率的に製造でき
ることが示唆された。
実施例２：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩのアンジオテンシンＩＩ分解活性の測定
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1のアンジオテンシンＩＩ分解活性を測定
した。具体的には次のように行った。
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1のアンジオテンシンＩＩ分解活性を測定
した。具体的には次のように行った。
反応液（50 mM NaPO4 (pH 8.0), 10 μMアンジオテンシンＩＩ（和光純薬工業社製）,
25 nM DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1）200μLを氷上で調製した。なお、DPPは最後に添加し
た。DPP添加後、0分、5分、10分、又は30分経過後に、30％トリクロロ酢酸 20μLを加え
て反応を停止し、氷上で15分間以上静置した。遠心（20,000×g、4℃、10分間）して上清
を回収した。該上清を、COSMOSIL 5C18-AR-300 column（ナカライテスク社製）を用いた
逆相クロマトグラフ分離により解析した。溶出液としては、バッファーA（0.1%トリフル
オロ酢酸／超純水（MilliQ））及びバッファーB（0.1%トリフルオロ酢酸／アセトニトリ
ル）の混合溶液を用いた。バッファーBの混合割合を徐々に増やして、アセトニトリル濃
度5％から35％で溶出した。各経過時間における溶出液のアセトニトリル濃度を図２に示
す。カラムから溶出されたペプチドはUVモニターで検出した。確認されたピークは定法に
従って別実験でMass解析した結果から、そのピークのペプチド配列を類推した。結果を図
３に示す。
25 nM DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1）200μLを氷上で調製した。なお、DPPは最後に添加し
た。DPP添加後、0分、5分、10分、又は30分経過後に、30％トリクロロ酢酸 20μLを加え
て反応を停止し、氷上で15分間以上静置した。遠心（20,000×g、4℃、10分間）して上清
を回収した。該上清を、COSMOSIL 5C18-AR-300 column（ナカライテスク社製）を用いた
逆相クロマトグラフ分離により解析した。溶出液としては、バッファーA（0.1%トリフル
オロ酢酸／超純水（MilliQ））及びバッファーB（0.1%トリフルオロ酢酸／アセトニトリ
ル）の混合溶液を用いた。バッファーBの混合割合を徐々に増やして、アセトニトリル濃
度5％から35％で溶出した。各経過時間における溶出液のアセトニトリル濃度を図２に示
す。カラムから溶出されたペプチドはUVモニターで検出した。確認されたピークは定法に
従って別実験でMass解析した結果から、そのピークのペプチド配列を類推した。結果を図
３に示す。
図３及び４に示されるように、反応が進むにつれて、アンジオテンシンＩＩ（Ang II）
のピークは低くなり、その分解物（IHPF、及びVY）のピークは高くなっていった。このこ
とから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1は共に、アンジオテンシンＩＩの分解活性を有するこ
とが示された。また、反応時間10分における、アンジオテンシンＩＩ分解物であるIHPFの
ピーク高さを測定したところ、DPPIII-WTの場合は0.15であるのに対して、DPPIII-ΔC1の
場合は0.20であった。このことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりもアンジオテン
シンＩＩ分解活性が高いことが示唆された。
のピークは低くなり、その分解物（IHPF、及びVY）のピークは高くなっていった。このこ
とから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1は共に、アンジオテンシンＩＩの分解活性を有するこ
とが示された。また、反応時間10分における、アンジオテンシンＩＩ分解物であるIHPFの
ピーク高さを測定したところ、DPPIII-WTの場合は0.15であるのに対して、DPPIII-ΔC1の
場合は0.20であった。このことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりもアンジオテン
シンＩＩ分解活性が高いことが示唆された。
実施例３：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩの高血圧症に対する効果
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1の、高血圧症に対する効果を調べた。具
体的には次のように行った。
実施例１で製造したDPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1の、高血圧症に対する効果を調べた。具
体的には次のように行った。
＜3-1．血圧及び心拍数の測定＞
8〜10週齢のC57BL/6J系統マウスの血圧及び心拍数を測定後、該マウスにアンジオテン
シンＩＩ（和光純薬工業社製）を満たした浸透圧ポンプ（Alzet model 1004、Durect社製
）を皮下植込みした。これにより、アンジオテンシンＩＩが、1分間、体重1 kgあたり400
ng（400 ng/kg/min）投与される。マウスを、2週間以上、収縮期血圧が130 mmHg以上に
なるまで飼育した。マウスの血圧及び心拍数を測定し、マウスに、DPPIII-WT又はDPPIII-
ΔC1 200μg、或いはPBSを尾静脈から静注投与した。該投与から1時間、及び3時間経過後
に血圧及び心拍数を測定した。血圧の測定結果を図５〜１０に示し、心拍数の測定結果を
図１１〜１２に示す。また、浸透圧ポンプの埋め込みを行っていない通常血圧のマウスに
対しても、上記と同様にDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1 200μg、或いはPBSを投与し、血圧を
測定した。この結果を図１３〜１４に示す。
8〜10週齢のC57BL/6J系統マウスの血圧及び心拍数を測定後、該マウスにアンジオテン
シンＩＩ（和光純薬工業社製）を満たした浸透圧ポンプ（Alzet model 1004、Durect社製
）を皮下植込みした。これにより、アンジオテンシンＩＩが、1分間、体重1 kgあたり400
ng（400 ng/kg/min）投与される。マウスを、2週間以上、収縮期血圧が130 mmHg以上に
なるまで飼育した。マウスの血圧及び心拍数を測定し、マウスに、DPPIII-WT又はDPPIII-
ΔC1 200μg、或いはPBSを尾静脈から静注投与した。該投与から1時間、及び3時間経過後
に血圧及び心拍数を測定した。血圧の測定結果を図５〜１０に示し、心拍数の測定結果を
図１１〜１２に示す。また、浸透圧ポンプの埋め込みを行っていない通常血圧のマウスに
対しても、上記と同様にDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1 200μg、或いはPBSを投与し、血圧を
測定した。この結果を図１３〜１４に示す。
図５〜１０に示されるように、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1の投与により、収縮期血圧、
拡張期血圧、及び平均血圧が有意に低下した。このことから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1
は共に、抗高血圧作用（血圧降下作用）を有することが示された。また、DPPIII-WTを投
与した場合、投与後3時間経過後の血圧が、投与後1時間経過後の血圧よりもやや上昇して
いるのに対して、DPPIII-ΔC1を投与した場合はこのような上昇は見られなかった。この
ことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも抗高血圧作用（血圧降下作用）がより高
い（より長時間持続する）ことが示された。また、図１１〜１２に示されるように、DPPI
II-WT又はDPPIII-ΔC1共に心拍数への影響はなかった。さらに、図１３〜１４に示される
ように、DPPIII-WTは、アンジオテンシンＩＩを投与していないマウスの血圧への影響は
なかった。このことから、DPPIII-WTの抗高血圧作用（血圧降下作用）はアンジオテンシ
ンＩＩ特異的であることが示唆された。
拡張期血圧、及び平均血圧が有意に低下した。このことから、DPPIII-WT及びDPPIII-ΔC1
は共に、抗高血圧作用（血圧降下作用）を有することが示された。また、DPPIII-WTを投
与した場合、投与後3時間経過後の血圧が、投与後1時間経過後の血圧よりもやや上昇して
いるのに対して、DPPIII-ΔC1を投与した場合はこのような上昇は見られなかった。この
ことから、DPPIII-ΔC1の方が、DPPIII-WTよりも抗高血圧作用（血圧降下作用）がより高
い（より長時間持続する）ことが示された。また、図１１〜１２に示されるように、DPPI
II-WT又はDPPIII-ΔC1共に心拍数への影響はなかった。さらに、図１３〜１４に示される
ように、DPPIII-WTは、アンジオテンシンＩＩを投与していないマウスの血圧への影響は
なかった。このことから、DPPIII-WTの抗高血圧作用（血圧降下作用）はアンジオテンシ
ンＩＩ特異的であることが示唆された。
＜3-2．血清中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量の測定＞
投与から3時間経過後の血清中に存在するDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量を、ウェスタン
ブロッティング法で調べた。具体的には次のように行った。
投与から3時間経過後の血清中に存在するDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1量を、ウェスタン
ブロッティング法で調べた。具体的には次のように行った。
上記実施例3-1において、PBS、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1投与から3時間経過後のマウ
スの尾部から血清を採取し、該血清を4℃で一晩静置した。遠心（5000×g、4℃、5分間）
して、上清を血清サンプルとして回収した。血清サンプル中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1
量を、定法に従ったウェスタンブロッティング法により検出した。一次抗体反応は、抗ラ
ットDPPIIIウサギポリクローナル抗体の希釈溶液（1/500希釈 in 1%スキムミルク/PBS/0
.05%Tween-20）を用いて、4℃で一晩行った。二次抗体反応は、HRP標識抗ウサギIgG抗体
（GEヘルスケア社製、製品番号: NA-934）の希釈液（1/2000希釈 in 1%スキムミルク/PB
S/0.05%Tween-20）を用いて、室温で1時間行った。検出結果を図１５に示す。
スの尾部から血清を採取し、該血清を4℃で一晩静置した。遠心（5000×g、4℃、5分間）
して、上清を血清サンプルとして回収した。血清サンプル中のDPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1
量を、定法に従ったウェスタンブロッティング法により検出した。一次抗体反応は、抗ラ
ットDPPIIIウサギポリクローナル抗体の希釈溶液（1/500希釈 in 1%スキムミルク/PBS/0
.05%Tween-20）を用いて、4℃で一晩行った。二次抗体反応は、HRP標識抗ウサギIgG抗体
（GEヘルスケア社製、製品番号: NA-934）の希釈液（1/2000希釈 in 1%スキムミルク/PB
S/0.05%Tween-20）を用いて、室温で1時間行った。検出結果を図１５に示す。
図１５に示されるように、DPPIII-WT又はDPPIII-ΔC1を投与した場合、投与から3時間
経過後であっても、これらのタンパク質が血清中に残っていた。このことから、投与から
3時間以上経過した後であっても、血圧降下作用が発揮されることが予想された。また、
バンドの濃さの比較より、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも多く残っていることが示さ
れた。このことから、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも、生体内での安定性がより高い
ことが示唆された。
経過後であっても、これらのタンパク質が血清中に残っていた。このことから、投与から
3時間以上経過した後であっても、血圧降下作用が発揮されることが予想された。また、
バンドの濃さの比較より、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも多く残っていることが示さ
れた。このことから、DPPIII-ΔC1の方がDPPIII-WTよりも、生体内での安定性がより高い
ことが示唆された。
Claims (3)
- 下記（ｃ）に記載するタンパク質及び下記（ｄ）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、アンジオテンシンＩＩ分解剤：
（ｃ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
及び
（ｄ）配列番号４〜６及び８のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列Ａからなり、該アミノ酸配列Ａにおいて配列番号１〜３及び７の何れかに示されるアミノ酸配列のＣ末端から１１〜１５番目のアミノ酸までの領域を欠失しており、且つアンジオテンシンＩＩ分解活性を有するタンパク質。 - 前記（ｄ）における同一性が９５％以上である、請求項１に記載のＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、アンジオテンシンＩＩ分解剤。
- 前記（ｄ）における同一性が９８％以上である、請求項１又は２に記載のＣ末端欠失型ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩタンパク質を含有する、アンジオテンシンＩＩ分解剤。
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| JP2019143759A JP6831128B2 (ja) | 2019-08-05 | 2019-08-05 | 高血圧症の予防又は治療用医薬 |
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