JP6606353B2 - Ｐｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、Ｐｍｅｌ１７遺伝子発現を抑制し、美白に有効であり、さらには日焼け防止や黒色腫瘍に有効な製剤に関する。

皮膚の色素沈着の原因は、基底層ケラチノサイト内に過剰に蓄積するメラニン色素である。皮膚の色素沈着の原因となるこのメラニンは、表皮基底層にある色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームと呼ばれる小器官において生成される。
メラノソームは構造タンパク質Ｐｍｅｌ１７が骨格となって構造を形成し、そこにメラニン色素が沈着している。（非特許文献１）
生成したメラニンはケラチノサイトに受け渡される。そして取り込まれたメラニンはターンオーバーにより自然に排出されていく。しかし、メラニンが過剰に作られるとメラニンの排出が間に合わず、シミ等が発生する。
また、インビボでＰｍｅｌ１７はＵＶＢの暴露により遺伝子の発現が増加することが確認され、Ｐｍｅｌ１７ノックアウトマウスでは淡色化が起こることが確認されている。（非特許文献２）

白朮（ビャクジュツ）は、漢方生薬の１種であり、キク科の植物であるオケラ（Atractylodes japonica）、オオバナオケラ（Atractylodes ovata）等のオケラ属の周皮を除いた根茎部分（ワビャクジュツ）、オオバナオケラ（Atractylodes ovata）の根茎部をいう。美白、シワ改善等の目的で外用剤に用いられている。（特許文献１〜２）。
桑は学名をモルス ボムビシス（Morus Bombycis）、モルス アルバ（Morus alba）等と称する桑の木の乾燥した葉を言う。モルス ボムビシスは日本各地、および南千島、朝鮮、中国、ベトナムからインド、カシミールの温帯から亜熱帯に分布する。山地にはえ、畑に栽植される落葉高木であり、クワまたはヤマグワと呼ばれる。モルス アルバは中国，朝鮮半島の原産で日本には古くより渡来し、庭園樹、街路樹、養蚕用に各地で栽植される落葉高木で、カラグワ、トウグワと呼ばれている。これは、従来解熱、鎮咳、涼血、明目薬として、感冒、咳嗽、頭痛、目疾、脚気、水腫、腹痛、下痢、撲損お血などに応用し、医薬品としてすでに用いられている。ニキビ治療薬として利用されている。（特許文献３）

マコモ（真菰）は、日本をはじめ、東アジアや東南アジアに分布し、沼地の水辺、川の岸辺、湖などに生育するイネ科マコモ属の多年草で学名Zizania latifoliaという。 マコモの花芽に黒穂菌が寄生し、根元が筍状に肥大したものを「マコモダケ」といい、緑色の葉鞘を何枚か剥ぎとり、食用として利用されている。また黒穂菌がついてできた芽は絵の具や眉墨に利用されている。 この部位は食用以外にも抗炎症作用を有する皮膚外用剤や幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤として利用されている。（特許文献４〜５） これ以外の部位は、肥料やムシロ（葉）に一部利用されているにすぎず、有効で且つ高度な利用方法が求められていた。

特開平０９−０７７６３５号公報 特開平１０−１９４９４６号公報 特開平１０−００７５４４号公報 特開２０１１−９３８８０号公報 特開２０１１−２１１９５７号公報

Jan Borovansky, Patrick A. Riley 「Melanins and Melanosomes: Biosynthesis, Biogenesis, Physiological, and Pathological Functions」, Wiley-Blackwell June 2011 258-264 Wonseon Choi et.al J Invest Dermatol 2010 130(6)1685-1696

本発明の目的はＰｍｅｌ１７遺伝子の発現を抑制することによって、メラニンの排出を促し美白に有効であり、さらには日焼け防止や黒色腫瘍に有効な製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、白朮、桑枝、マコモの抽出物にＰｍｅｌ１７遺伝子の発現を抑制する作用があることがわかった。
白朮、桑枝、マコモを、抽出効率を考え、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物（海藻）に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。

これらの抽出物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。

ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。

ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。

レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。

赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。

馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。

パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。

これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
白朮、桑枝、マコモの抽出物の製剤への配合量は、固形分として好ましくは０．００００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１．０重量％である。

実施例１
中国産白朮（乾燥品）を１０ｇに精製水３００ｍｌを加えて３時間加熱する。これを放冷した後濾過後凍結乾燥した。

実施例２
桑の枝（乾燥品）１０ｇに５０％エタノール３００ｍｌを加えて、時々撹拌しつつ５日間放置した。これを濾過後、エバポレートした後、凍結乾燥した。

実施例３〜５
マコモを水で洗ったのち、マコモダケ（可食部）と、葉と、茎と、根に分け細断したのち、５０℃で２４時間乾燥させた。
葉と、茎と、根をそれぞれ別々に５０ｇ取り、精製水８００ｍｌを加えて３時間加熱する。これを放冷した後濾過後凍結乾燥した。
。
葉の熱水抽出物を実施例３と、茎の熱水抽出物を実施例４と、根の熱水抽出物を実施例５とした。

確認試験１
実施例１と２について以下の実験を行った。
２継代目の正常ヒト表皮メラニン細胞（クラボウ）を１．５×１０³個となるよう播種し、４日間培養した。その後、増殖添加剤を含まないＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍ（クラボウ）へ、ホルスコリンを終濃度１００μＭとなるように加えた。そして、その培地へ検体（実施例）を添加し試験培地とした。

ＲＮＡの抽出
細胞からのＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用い、添付マニュアルに従い調整した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。

ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ
抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて実施した。
詳細には、前述のＲＴ産物と、Ｐｍｅｌ１７または内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのＴａｑＭａｎ（登録商標） プライマー（ライフテクノロジーズ・ジャパン）、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、ΔΔＣＴ法により遺伝子発現量の比較を行った。

確認試験２
実施例３〜５について以下の実験を行った。
確認試験１と同様な操作を行ったが、ホルスコリンの添加は行わず、検体（実施例）の添加の有無でＰｍｅｌ１７の遺伝子発現抑制効果を見た。

結果を図１〜３に示す。
図１及び２は、実施例１と２の確認試験１で行った結果を示す。
図は左より、
１．検体（実施例）未添加、ホルスコリン未添加
２．検体（実施例）未添加、ホルスコリン終濃度１００μＭ添加
３．検体（実施例）実施例１は終濃度６．３mg／ml、実施例２は終濃度０．５mg／ml添加、ホルスコリン終濃度１００μＭ添加
の結果を示す。
ホルスコリンによって発現が増加したＰｍｅｌ１７遺伝子発現を実施例１は終濃度６．３mg／mlで約３０％抑制し、実施例２は終濃度０．５mg／mlで約２０％抑制した。
図３は実施例３〜５の確認試験２で行った結果を示す。
終濃度０．１mg／mlで実施例３は約３５％抑制し、実施例４は約３０％抑制し、実施例５は約２０％抑制した。

また、実施例１〜５を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、美白は勿論、日焼け防にも有効な製剤が得られた。

実施例１（白朮熱水抽出物）の確認試験１（Ｐｍｅｌ１７の遺伝子発現量）の結果を示す図である。 実施例２（桑枝５０％エタノール抽出物）の確認試験１（Ｐｍｅｌ１７の遺伝子発現量）の結果を示す図である。 実施例３〜５（マコモ熱水抽出物）の確認試験２（Ｐｍｅｌ１７の遺伝子発現量）の結果を示す図である。

Claims (6)

1. 白朮及び桑枝の抽出物から選択される１種以上を有効成分として含有するＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途を除く）
2. マコモの抽出物を有効成分として含有するＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途、日焼け防止用途及び抗炎症用途を除く）
3. マコモの抽出物の起原が葉、茎、根のいずれか１種以上である請求項２に記載のＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途、日焼け防止用途及び抗炎症用途を除く）
4. 白朮の抽出物が熱水抽出物である請求項１のＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途を除く）
5. 桑枝の抽出物が５０％エタノール抽出物である請求項１のＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途を除く）
6. マコモの抽出物が熱水抽出物である請求項２又は３に記載のＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途、日焼け防止用途及び抗炎症用途を除く）