JP6580895B2 - アスタキサンチン含有デスモグレイン減少剤 - Google Patents

Description

本発明は、アスタキサンチンを含有する、角層細胞におけるデスモグレイン減少剤に関する。

くすみは、肌の印象年齢に大きく影響を及ぼすことから、幅広い年代で女性の肌悩みとして挙げられることが多い。くすみの要因としては肌の色調と肌表面状態の形態変化に分類されるが、特に肌表面状態の形態変化に関しては、皮膚表面凹凸などによる影、透明感の減少やつやの低下が挙げられ、いずれも加齢と共に悪化することが知られている。例えば、ターンオーバーが適切に行われずに角層の肥厚や重層化が見られる、不全角化が生じる、角層の水分量が減少する、内分泌や疾病などの全身的かつ皮膚の内面からの影響を受ける、などが肌や口唇のくすみの発生要因として挙げられる。

ここで、「角層」とは、平板状になった角層細胞が、顔面で約１０層程度、他の部位で約１５層程度積み重なって密接に接着した重層化構造を有し、皮膚の一番上にある層をいう。「表皮角化細胞」とは、表皮の大部分を占め、角化という特殊な分化を示す細胞で、ケラチノサイト、角化細胞ともいう。「角層細胞」とは、表皮角化細胞が分化し、角化したものをいう。また、「不全角化」とは、角化過程が不完全であり、本来、角層に至る過程において消失するはずの核が残存し、角層において有核細胞が出現した状態をいう。

肌や口唇のくすみの対策としては、主に、古くなった角層を取り除くことで、肌表面の凹凸をなめらかにし、明度や透明感を上げることが挙げられる。しかしながら、肌や口唇のくすみに関与する皮膚内成分についての検討はほとんどなされておらず、肌や口唇のくすみ発生機序については、多くの不明な点が残されていた（非特許文献１）。

武田克之ら監修、化粧品の有用性−評価技術の進歩と将来展望−、株式会社薬事日報社、２００１年３月３１日、ｐ．１８５−１９１

本発明は、皮膚内成分に作用し、ターンオーバーを正常化へと導き、肌や口唇のくすみを改善する剤を提供することを主目的とする。

本発明者らは、皮膚内成分であるデスモグレインに着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、角層細胞中のデスモグレインの量がアスタキサンチンによってコントロールされ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

ここで、「デスモグレイン」とは、デスモソームにある細胞接着分子タンパク質であって、カルシウム依存性の細胞−細胞接着を担う膜貫通タンパク質をいう。「デスモソーム」とは、角層細胞や表皮角化細胞の細胞接着において、細胞が他の細胞と接着結合する細胞構造の１種をいい、細胞同士は、デスモソームを介して相互に接着される。

なお、「デスモグレイン」には、アイソフォームのデスモグレイン−１、デスモグレイン−２、デスモグレイン−３、デスモグレイン−４がある。これらのアイソフォームは、繰返し単位ドメインの数が異なり、デスモグレイン−１は５個、デスモグレイン−２は６個、デスモグレイン−３は２個、デスモグレイン−４は３個の繰返し単位ドメインを持っている。

本発明では、アスタキサンチンを有効成分として含有する、角層細胞におけるデスモグレインの減少剤を提案する。本技術により減少され得る角層細胞中のデスモグレインは、特に限定されないが、例えば、デスモグレイン−１が挙げられる。

ここで、くすみが見られる肌や口唇の状態と、角層細胞のデスモグレインの減少との関係について説明する。
通常、角層細胞は、細胞膜がコーニファイドエンベロープとして残り、細胞小器官は消失し、ケラチン繊維と繊維間物質（ケラトヒアリン顆粒、天然保湿因子）を内包する形態を有する。表皮角化細胞が角層細胞となり、角層の最外層では、その接着機構が弱まって角層細胞が皮膚からはがれ落ちる。角層が最終的に表面から離脱するまで、肌で約４０〜６０日、口唇で約３〜４日を要するとされる。

健康な皮膚では、皮溝と皮丘がはっきりと整っていて、核のある角層細胞がほとんどない。角層重層化が進んでいないため、角層が上から一枚ずつ剥がれていき、良好にターンオーバーが進む。

一方、くすみが見られる肌や口唇の状態は、肌・口唇の表面形態が乱れている状態である。この場合、角化過程が不完全であり、本来、角層に至る過程において消失するはずの核が残存した「不全角化」と、角層が上から１枚ずつ剥がれない、「角層重層剥離」の片方、あるいは両方が生じることが多い。ここで、「角層重層剥離」とは、角層の最外層において角層細胞が皮膚からはがれ落ちるときに、角層が複数枚重なった形で皮膚表面からはがれ落ちることをいう。このような角層の離脱には、角層細胞における、角層細胞同士のデスモソームによる接着の変化や角層細胞間脂質の変化が関係していると考えられている。

本発明の角層細胞におけるデスモグレインの減少剤は、角層重層化を亢進させる角層細胞中のデスモグレインを減少させ、ターンオーバーの乱れ、肌や口唇のくすみを改善することができる。

実験開始前に口唇から採取された角層細胞におけるデスモグレイン−１の発現を、蛍光染色にて示す図である。 リップクリームＡ塗布前後での口唇から採取された角層細胞におけるデスモグレイン−１の発現を、蛍光染色にて示す図である。 リップクリームＮ又はＡの１週間塗布後の口唇から採取された角層細胞におけるデスモグレイン−１の発現を、蛍光染色にて示す図である。 口唇の角層重層剥離の変化を示すグラフである。 口唇の角層細胞面積の変化を示すグラフである。 口唇の角層細胞における有核細胞の変化を示すグラフである。 口唇の角層細胞における自家蛍光の変化を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

＜角層細胞におけるデスモグレインの減少剤＞
本技術のデスモグレインの減少剤は、アスタキサンチンを有効成分として含む。アスタキサンチンは、酸化防止効果、抗炎症効果、皮膚老化防止効果、美白効果を有するものと従来から認識されていた。本技術は、アスタキサンチンが角層細胞におけるデスモグレインを減少させる効果を有することを、初めて明らかにし、それを応用したものである。

（１）アスタキサンチン
本明細書において「アスタキサンチン」は、特に断らない限り、アスタキサンチンエステルなどの誘導体を含めるものとする。

アスタキサンチンは、４７６ｎｍ（エタノール）、４６８ｎｍ（ヘキサン）に吸収極大を持つ赤色の色素でキサントフィル類に分類され、化学構造は３，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−β，β−ｃａｒｏｔｅｎｅ−４，４’−ｄｉｏｎｅ（Ｃ_４０Ｈ_５２Ｏ_４、分子量５９６．８２）である。アスタキサンチンは、分子の両端に存在する環構造の３（３’）−位の水酸基の立体配置により異性体が存在する３Ｓ，３Ｓ’−体、３Ｓ，３Ｒ’−体（ｍｅｓｏ−体）、３Ｒ，３Ｒ’−体の三種で、さらに分子中央の共役二重結合のｃｉｓ−、ｔｒａｎｓ−の異性体も存在する。例えば、全ｃｉｓ−、９−ｃｉｓ体と１３−ｃｉｓ体などの如くである。３，３’−位の水酸基は脂肪酸とエステルを形成することができる。オキアミから得られるアスタキサンチンは、脂肪酸二個結合したジエステル体、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓから得られるものは３Ｓ，３Ｓ’−体である。脂肪酸一個結合したモノエステル体が多く含まれている、赤色酵母のＰｈａｆｆｉａ Ｒｈｏｄｏｚｙｍａより得られるアスタキサンチンは、３Ｒ，３Ｒ’−体で、通常天然に見出される３Ｓ，３Ｓ’−体と反対の構造を持っている。

本技術に用いられるアスタキサンチンは、例えば、オキアミ、サケ、マス、福寿草、赤色酵母、ヘマトコッカス藻などの天然物から抽出したものや、分離して得られるアスタキサンチン含有オイルでもよいし、それを適宜精製したもの、合成品でもよい。特に、ヘマトコッカス藻から抽出されたものが、品質、生産性の点から好ましい。

天然物からアスタキサンチンを得る場合の抽出溶媒については、水系溶媒でも有機溶媒であってもよい。有機溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、酢酸エチル、エーテル、ヘキサンなどを用いることができる。また、超臨界状態の二酸化炭素などを用いることもできる。これらの溶媒は単独で用いてもよいし２種類以上を混合して用いてもよい。

ヘマトコッカス藻からの抽出物としては、例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバゲンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などからの抽出物が挙げられるが、特に限定されない。

本技術では、市販されているアスタキサンチンを用いてもよく、例えば、マリン大王（株）製のＡＳＴＡＸ（登録商標）−Ｓ、武田紙器（株）製のアスタッツ（登録商標）−ＳＳ、アスタッツ−Ｓ、アスタッツ−１０Ｏ、アスタッツ−ＥＣＳ、アスタッツ−２．０ＰＷ、アスタッツ−１．０ＰＷ、アスタッツ−１．５ＭＢなど、富士化学工業（株）製のアスタリールオイル（登録商標）５０Ｆ、アスタリールオイル５Ｆ、アスタリールパウダー２０Ｆ、水溶性アスタリール液、アスタリールＷＳ液など、東洋酵素化学（株）製のＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標）、オリザ油化社製のアスタキサンチン−５Ｃなどとして入手できる。

本技術のデスモグレインの減少剤へのアスタキサンチンの含有量は、特に限定されないが、減少剤に対して、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上の濃度を採用することができる。また、含有量の上限は特に限定されないが、好ましくは１％以下、より好ましくは０．１％以下の濃度を採用することができる。

（２）デスモグレインの減少剤の剤形
本技術の角層細胞におけるデスモグレインの減少剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品などの皮膚に適用できる剤形のものであれば特に限定されない。具体的な剤形としては、例えばクリーム状、ゲル状、液状、懸濁状、粉末状、フォーム状、シート状、固形のものなどが挙げられる。

（３）デスモグレインの減少剤の化粧料（薬用化粧料）
本技術のデスモグレインの減少剤を化粧料・薬用化粧料に適用する場合、特に限定されないが、例えば、皮膚化粧料、口唇化粧料に配合されることが好ましい。具体的には、ハンドクリーム、化粧水、乳液、美容液、フェイスクリーム、クレンジングクリーム、洗顔石鹸、パック、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼け止めクリーム、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、口紅、リップグロス、リップクリーム、アイクリーム、アイシャドウ、シャンプー、リンス、コンディショナー、ボディシャンプー、ボディローションなどの製品にすることができる。

本技術のデスモグレインの減少剤には、デスモグレイン減少のための有効成分であるアスタキサンチンの他に、化粧料に用いられる各種成分、例えば、基剤、保湿剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、血行促進剤、細胞賦活剤、紫外線吸収剤などを適宜配合することができる。

更に、本技術のデスモグレインの減少剤には、賦形剤、崩壊剤、結合剤、可塑剤、乳化剤、滑沢剤、増粘剤、糖類、ｐＨ調整剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、色素、ｐＨ調整剤、香料、清涼剤、収斂剤、増泡剤などを含めてもよい。

（４）デスモグレインの減少剤の皮膚外用剤（医薬品・医薬部外品）
本技術のデスモグレインの減少剤を皮膚外用剤に適用する場合、例えば、外用液剤、外用ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、点鼻液剤、リニメント剤、ローション剤、ハップ剤、硬膏剤、噴霧剤、エアゾール剤などの形にすることができる。

本技術の皮膚外用剤の適用方法は、肌や口唇に適量を塗布、噴霧、散布、浸潤、湿布などで適用することが好ましいが、特に限定されない。本技術のデスモグレインの減少剤に係る化粧料、薬用化粧料、医薬部外品のいずれにおいても皮膚外用剤と同様に適用できる。

本技術のデスモグレインの減少剤には、デスモグレイン減少のための有効成分であるアスタキサンチンの他に、上述した化粧品に用いられる各種成分や、医薬品に用いられる各種成分を適宜配合することができる。例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、可塑剤、乳化剤、滑沢剤、増粘剤、糖類、ｐＨ調整剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、色素、ｐＨ調整剤、角質溶解剤、創傷治療剤、抗菌剤、抗アレルギー剤などを含めてもよい。薬理学的に許容される添加剤及び医薬製剤の分野で通常使用し得る添加剤を、１種以上又は２種以上組み合わせて適宜含有させることができる。

医薬品、医薬部外品などを製造する際は医薬品などの製造技術分野において慣用の方法、例えば医薬品であれば、日本薬局方に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。

（５）デスモグレインの減少剤の応用
表皮角化細胞や角層細胞中のデスモグレインの存在量が適切な状態にない場合、角層深層から異常に角層が剥離され、各種の病態を示す。デスモグレインなどの接着分子の異常分解によるデスモグレインの減少で生じる疾患としては、Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、酒さ、魚鱗癬や毛髪異常などの皮膚疾患が挙げられる。そこで、本技術のデスモグレインの減少剤は、それらの皮膚病の研究に用いることができる。具体的にいえば、これらの病態モデルの作成や、研究に際してのコントロール薬剤としての利用、治療薬のスクリーニング方法、スクリーニングに当たってのポジティブコントロールなどとして利用が可能である。

さらに、粘膜細胞が異常角化亢進した病気に白板症がある。この病気の原因は不明だが、表層の細胞があたかも皮膚の上皮＝表皮のように、高密度のケラチンが細胞内に蓄積し、粘膜の重層扁平上皮の性質を保ったままの、細胞核を失わない不完全な角化状態にもかかわらず、量的には角化亢進している状態になる。ターンオーバーが正常化することによりこのような病気の治療に役立つ可能性も想定できる。

＜デスモグレインの減少剤によるターンオーバーの改善＞
本技術のデスモグレインの減少剤を皮膚に適用すると、ターンオーバーが改善することによって、肌や口唇のくすみを改善できる。角層は、角層細胞が層状に重なったものであり、デスモグレインが関与する角層細胞の細胞接着性が亢進すると（角化亢進）、ターンオーバーが遅れ、更に角層重層化が進み、肌や口唇の表面形態が乱れ、角層重層剥離が生じる。

角層重層剥離を調べる方法には、目視や触診がある。その他の角層重層剥離を調べる方法には、例えば、皮膚にスライドガラスや粘着テープを接触させて角層細胞を剥離、採取し、この角層細胞に２５０〜３３０ｎｍの紫外線を照射して、３１０〜４００ｎｍの自家発光物質を指標として、蛍光顕微鏡で健康な角層細胞と比較観察する方法がある。この方法において、明度が高く、細胞形状もはっきり観察されると、皮膚が乱れていると評価される（特開２００８−２８１４９６号公報参照）。

＜デスモグレインの減少剤による角層細胞面積の減少＞
角層細胞は、加齢によりターンオーバーが遅れ、徐々に細胞面積が大きくなる。逆に角層細胞の細胞面積が減少すると、皮膚が抗老化（若返り）に向かっていると考えられる。本技術のデスモグレインの減少剤を皮膚に適用すると、ターンオーバーが改善し、角層細胞の面積を減少させることがわかった。これは、肌や口唇のくすみを改善し、健康な皮膚に導くことができることを示している。

角層細胞の面積を調べる方法として、例えば、皮膚の表面にテープを一定圧で押し当てて剥がし（テープストリッピング）、その角層試料を染色して顕微鏡にて画像を取得し、市販の画像解析ソフトで角層細胞の面積を算出する方法がある。

＜その他の肌や口唇状態の評価方法＞
（１）角層細胞における有核細胞の減少
肌や口唇状態の評価方法には、上記の他に、例えば、角層を採取し、その細胞中に核があるかどうか（有核細胞か否か）をみる方法が挙げられる。肌表面形態が乱れているときには、角層細胞に核が残る不全角化が認められることから、単に角層のみの変化にとどまらず、表皮角化細胞の増殖や角化の過程の異常を伴っていると考えられる。そこで、本技術のデスモグレインの減少剤を皮膚に適用し、角層細胞のうち、有核細胞の数が少なくなれば、表皮角化細胞の増殖や角化の過程の異常が改善され、肌や口唇のくすみが改善されたと考えられる。

（２）角層細胞における自家発光の蛍光分光測定
また、別の方法として、スライドガラスなどに採取した角層と、標準物質試料として、スライドガラスなどに載せたトリプトファン試薬とを、蛍光分光測定装置を用いて蛍光分光測定を行う方法もある。この方法では、蛍光スペクトルから、トリプトファンの極大蛍光波長よりも短波長側に極大値が観察されると健常な皮膚と評価され、長波長側に極大値が観察されると肌表面形態が乱れていると評価される（特開平２００８−２８１４９６号公報参照）。

（３）標識抗体によるデスモグレインの検出
更に、肌や口唇状態の別の評価方法として、採取した角層に標識抗デスモグレイン抗体を適用する方法も挙げられる。検出された標識が少なければ（弱ければ）、デスモグレインも少ないことを示す。本技術のデスモグレインの減少剤を皮膚に適用した結果、角層中のデスモグレインが少なくなれば、ターンオーバーの遅れ、肌や口唇のくすみが改善されたと考えられる。

以下に、具体的な実施例などを説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜アスタキサンチン含有リップクリームの製造＞
下記成分を含有するリップクリームを製造した。
成分１ ポリエチレンワックス ６．０質量％
成分２ マイクロクリスタリンワックス １０．０質量％
成分３ ２−エチルヘキサン酸セチル １０．０質量％
成分４ トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ２０．０質量％
成分５ ワセリン ２０．０質量％
成分６ ポリブテン １０．０質量％
成分７ トリイソステアリン酸ジグリセリル 残量
成分８ フェノキシエタノール ０．３質量％
成分９ アスタキサンチン５％含有油（オリザ油化社製 アスタキサンチン−５Ｃ） ０．１質量％
成分１０ ビタミンＥ ０．３質量％

上記成分１〜６を混合、加熱し、均一に溶解した。一方、上記成分７〜１０を均一に混合した。成分１〜６の溶解物に、成分７〜１０の混合物を加え、成型してアスタキサンチン含有リップクリーム（以下、「リップクリームＡ」ということがある。）を製造した。

上記成分９の代わりに上記成分７をその分増量し、上記と同様にして、アスタキサンチンを含有しないリップクリーム（以下、「リップクリームＮ」ということがある。）を製造した。

＜アスタキサンチン含有リップクリームを口唇に適用したときの角層細胞におけるデスモグレイン−１の発現＞
（１）試料の採取
２０代から４０代の男女被験者１０名より、下口唇の角層のテープストリッピングを行った。その後、４０代の男性被験者を選定し、リップクリームＡもしくはリップクリームＮを１週間、１日２回以上使用させた。リップクリーム使用前、使用１週間後にそれぞれ下口唇の角層のテープストリッピングを行った。テープストリッピングは、透明両面テープ（ニチバン社製）をスライドガラスに貼り付け、粘着面を下口唇の中央部に一定圧で押し当て、下口唇から剥がして行った。

（２）一次抗体反応
上記で得られたスライドガラス試料のテープ表面に、抗デスモグレイン−１マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＰＲＯＧＥＮ社製）液を適量かけ、室温にて1時間反応させた。その後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に浸し、未反応の抗体を洗い流した。

（３）二次抗体反応
上記一次抗体反応させたスライドガラス試料のテープ表面に、蛍光標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の２００倍ＰＢＳ希釈溶液を適量かけ、室温にて１時間反応させた。その後、ＰＢＳに浸し、未反応の抗体を洗い流した。

（４）封入
上記二次抗体反応させたスライドガラス試料の表面に、マウント・クイック・アクオス（Ｍｏｕｎｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｑｕｅｏｕｓ；ＳＰＩ ＳＵＰＰＬＩＥＳ）を滴下し、カバーガラスで覆い観察用試料とした。

（５）観察
上記包埋したスライドガラス試料をオリンパス社製の倒立型蛍光顕微鏡を用いて観察した。この観察画面を図１〜３に示した。

（６）結果
口唇状態が良好な被験者と口唇状態が悪化している被験者からそれぞれ採取した試料の蛍光顕微鏡写真を図１に示した。左の図１Ａは、良好な口唇状態、右の図１Ｂは、悪化している口唇状態である。図１Ｂは、図１Ａと比べて、角層細胞の１つ１つにおいて全体的に蛍光を発し、明度が高く、細胞形状も部分的にはっきりしたものが見られた。従って、口唇状態が悪化している被験者の角層細胞では、蛍光が強いことから、デスモグレイン−１が多く存在することがわかった。また、図１Ｂの方が、角層細胞の面積が大きく、角層重層剥離の割合も高いことが観察された。

リップクリームＡ使用前と１週間使用後に被験者から採取した試料の蛍光顕微鏡写真を図２に示した。左の図２Ａは、リップクリームＡ使用前のもの、右の図２Ｂは、リップクリームＡを１週間使用後のものである。図２Ａの角層細胞は、全体的に蛍光を発しているのに対し、図２Ｂの角層細胞は、細胞の辺縁は蛍光を発しているものの、細胞の内側は蛍光を発していないか又は蛍光が弱い細胞が多く見られた。これは、アスタキサンチンを含有するリップクリームＡを口唇に適用することにより、角層細胞におけるデスモグレイン−１が減少したこと、また、特に角層細胞の辺縁よりも内側でデスモグレイン−１が減少したことが考えられた。

リップクリームＡ又はＮを１週間使用後に採取した試料の蛍光顕微鏡写真を図３に示した。左の図３Ａは、リップクリームＮを１週間使用したもの、右の図３Ｂは、リップクリームＡを１週間使用したものである。図３Ａの角層細胞は、全体的に蛍光を発しているのに対し、図３Ｂの角層細胞は、細胞の辺縁は蛍光を発しているものの、細胞の内側は蛍光を発していないか又は蛍光が弱い細胞が多く見られた。これは、アスタキサンチンを含有しないリップクリームＮを適用しても、ほとんど角層細胞のデスモグレイン−１が減少しなかったのに対し、アスタキサンチンを含有するリップクリームＡを適用すると、デスモグレイン−１が明らかに減少することが考えられた。

＜アスタキサンチン含有リップクリームを口唇に適用したときの角層重層剥離の低減効果＞
（１）試料の採取
２０〜４０代の男性被験者２０名を１０名ずつ２群に分け、１群にリップクリームＡを、もう１群にリップクリームＮを、１週間１日２回以上使用させた。リップクリーム使用前、使用１週間後にそれぞれ下口唇の角層のテープストリッピングを行った。テープストリッピングは、テープ（ニチバン社製）の粘着面を下口唇の中央部に一定圧で押し当て、
下口唇から剥がし、スライドガラスに貼り付けた。

（２）試料の染色
スライドガラスに貼り付けた角層をキシレンで洗浄し、水洗し、ケルンエヒトロート（武藤化学株式会社製）にて核染した。その後水洗した後に、アルコール脱水とキシレンで処理をし、標本用封入剤ＭＸ（松浪硝子工業株式会社製）で封入した。

（３）観察
上記包埋したスライドガラス試料をオリンパス社製の倒立型光学顕微鏡を用いて観察した。
まず、リップクリーム使用前の角層重層剥離の程度を初期値「０」とした。次に、リップクリームＮ又はリップクリームＡをそれぞれ１週間適用した被験者の重層角層剥離の程度が、それぞれリップクリーム使用前の角層重層剥離の程度と比較して、角層重層の数が同数程度のもの（変化なし）は、スコア「０」とした。角層重層が減少したと観察されたもの（口唇状態が改善）は、スコア「１」とした。角層重層が増加したと観察されたもの（口唇状態が悪化）は、スコア「−１」とした。図４に、リップクリームＡ又はＮを１週間使用した後の被験者から採取した角層重層剥離の程度をスコアの平均をとってグラフにしたものを示す。

（４）結果
リップクリームＡを１週間使用した群では、角層重層剥離の程度のスコアの平均が約０．３２であった。スコアが「０」よりも大きいほど角層重層剥離が低減されたことを示す。一方、リップクリームＮを１週間使用した群では、角層重層剥離の程度のスコアの平均が約０．１３であった。従って、アスタキサンチンを含有するリップクリームＡは、アスタキサンチンを含有しないリップクリームＮに比べて、有意に角層重層剥離の低減効果が見られた。これは、角層の重層化が抑制され、健康な角層で見られる１枚ごとの剥離が多くなり、口唇状態が改善されたと考えられた。

＜アスタキサンチン含有リップクリームによる角層細胞面積の減少効果＞
（１）実験方法
上記＜アスタキサンチン含有リップクリームを口唇に適用したときの角層重層剥離の低減効果＞の「（１）試料の採取」から「（３）観察」に記載した操作と同様の操作にて得られた画像を画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事株式会社）にて解析し、角層細胞の面積を測定した。

まず、リップクリームＮを使用する前の被験者の角層細胞面積とリップクリームＮを１週間適用した被験者の角層細胞面積の変化量（減少量）の平均をとった。一方、リップクリームＡを使用する前の被験者の角層細胞面積とリップクリームＡを１週間使用した被験者の角層細胞面積の変化量(減少量)の平均をとった。そのグラフを図５に示す。

（２）結果
アスタキサンチンを含有するリップクリームＡを１週間使用すると、角層細胞の面積が平均で約１５０μｍ^２減少した。一方、アスタキサンチンを含有しないリップクリームＮを１週間使用すると、角層細胞の面積が平均で約２５μｍ^２しか減少しなかった。したがって、アスタキサンチン含有リップクリームは、角層細胞面積を減少させることが確認された。これは、皮膚老化やターンオーバーの遅れなどによる角層細胞面積の増大を抑制し、健康な口唇に近づいたと考えられた。

＜アスタキサンチン含有リップクリームによる有核細胞の減少効果＞
（１）実験方法
上記＜アスタキサンチン含有リップクリームを口唇に適用したときの角層重層剥離の低減効果＞の「（１）試料の採取」から「（３）観察」に記載した操作と同様の操作にて得られた画像を画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦにて有核細胞の割合を測定した。

まず、リップクリーム使用前の有核細胞の割合を初期値「０」とした。次に、リップクリームＮ又はリップクリームＡをそれぞれ１週間適用した被験者の有核細胞の割合の程度が、それぞれリップクリーム使用前の有核細胞の割合の程度と比較して、有核細胞の割合が同数程度のもの（変化なし）は、スコア「０」とした。有核細胞の割合が減少したと観察されたもの（口唇状態が改善）は、スコア「１」とした。有核細胞の割合が増加したと観察されたもの（口唇状態が悪化）は、スコア「−１」とした。図６に、リップクリームＡ又はＮを１週間使用した後の被験者から採取した角層細胞中の有核細胞の増減をスコアから数値化してグラフにしたものを示す。

（２）結果
リップクリームＡを１週間使用した群では、有核細胞の減少のスコアの平均が約０．０７であった。スコアが「０」よりも大きいほど有核細胞の割合が減少したことを示す。一方、リップクリームＮを１週間使用した群では、有核細胞の減少のスコアの平均が約−０．２５であった。従って、アスタキサンチンを含有するリップクリームＡは、アスタキサンチンを含有しないリップクリームＮに比べて、有核細胞の減少効果が見られた。これは、角化の際、細胞の核が正常に消失して、ターンオーバーのバランスがとれ、口唇状態が改善されたと考えられた。

＜アスタキサンチン含有リップクリームによる自家蛍光の低減効果＞
（１）実験方法
上記＜アスタキサンチン含有リップクリームを口唇に適用したときの角層重層剥離の低減効果＞の「（１）試料の採取」から「（３）観察」に記載した操作と同様の操作にて得られた試料を、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にセットし、３４０ｎｍの紫外部領域の波長の光により生じる自家蛍光を観察した。

まず、リップクリーム使用前の自家蛍光の蛍光強度を初期値「０」とした。次に、リップクリームＮ又はリップクリームＡをそれぞれ１週間適用した被験者の自家蛍光の蛍光強度が、それぞれリップクリーム使用前の自家蛍光の蛍光強度の程度と比較して、蛍光強度が同程度のもの（変化なし）は、スコア「０」とした。蛍光強度が低減したと観察されたもの（口唇状態が改善）は、スコア「１」とした。蛍光強度が増加したと観察されたもの（口唇状態が悪化）は、スコア「−１」とした。図７に、リップクリームＡ又はＮを１週間使用した後の被験者から採取した角層細胞の自家蛍光の蛍光強度の増減をスコアから数値化してグラフにしたものを示す。

（２）結果
リップクリームＡを１週間使用した群では、自家蛍光の蛍光強度のスコアの平均が約０．５であった。スコアが「０」よりも大きいほど自家蛍光が低減したことを示す。一方、リップクリームＮを１週間使用した群では、自家蛍光の蛍光強度のスコアの平均が約−０．１３であった。従って、アスタキサンチンを含有するリップクリームＡは、アスタキサンチンを含有しないリップクリームＮに比べて、有意に自家蛍光の低減効果が見られた。これは、アスタキサンチン含有リップクリームが、口唇状態の改善に、明らかに有効であることを示すと考えられた。

＜アスタキサンチン含有リップクリーム使用における使用後アンケート＞
（１）実験方法
下記表１に示す成分を含有するアスタキサンチン含有リップクリーム（以下、「リップクリームＡ’」ということがある。）を製造した。
また、表１の成分６の代わりに、成分４のトリイソステアリン酸ポリグリセリル−２をその分増量したアスタキサンチンを含有しないリップクリーム（以下、「リップクリームＮ’」ということがある。）を製造した。

２０〜５０代の男女被験者２０名を２群に分け、Ｉ群にリップクリームＡ’又はＩＩ群にリップクリームＮ’をそれぞれ３週間使用してもらい、アンケートを実施した。
次に３週間使用を中止した後に、Ｉ群にはリップクリームＮ’を、ＩＩ群にはリップクリームＡ’をそれぞれ３週間使用してもらい、同様にアンケートを実施した。

評価項目は、口唇のふっくら感、シワ、うるおい感、くすみの４項目とし、使用前に比べて悪化、やや悪化、変化なし、やや改善、改善の５段階で評価した。結果はやや改善以上で評価した被験者の数の割合を算出した。

（２）結果
使用前に比べてやや改善もしくは改善を実感した被験者の数の割合（％）を表２に示した。

リップクリームＮ’に比べてリップクリームＡ’使用により、ふっくら感、シワ、うるおい感、くすみの評価項目において改善が確認された。
以上のことから、本技術のデスモグレインの減少剤を含有する口唇用化粧料の使用により、ふっくら感、シワ、うるおい感、くすみが改善することが明らかとなった。

本発明によればターンオーバーを改善し、角層細胞面積を減少させ、くすみを改善させる、皮膚外用剤、化粧料などを製造することができる。

Claims (5)

1. アスタキサンチンを有効成分として含有し、表皮ターンオーバーを改善させる、角層細胞におけるデスモグレインの減少剤。
2. アスタキサンチンを有効成分として含有し、角層細胞面積を減少させる、角層細胞におけるデスモグレインの減少剤。
3. デスモグレインがデスモグレイン−１である、請求項１又は２に記載の減少剤。
4. 皮膚化粧料に配合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の減少剤。
5. 口唇化粧料に配合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の減少剤。