JP6557935B2

JP6557935B2 - 多孔性粒子の製造方法

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Publication number: JP6557935B2
Application number: JP2016560204A
Authority: JP
Inventors: 紹玲張; 亘作川上; 克彦有賀
Original assignee: National Institute for Materials Science
Current assignee: National Institute for Materials Science
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2019-08-14
Anticipated expiration: 2035-11-16
Also published as: EP3222273B1; EP3222273A1; EP3222273A4; WO2016080336A1; US20170319483A1; US9987228B2; JPWO2016080336A1

Description

本発明は、多孔性粒子の製造方法に関し、詳細には両親媒性物質を含む溶液を相分離させること及び凍結乾燥することを含む方法に関する。
本願は、２０１４年１１月１８日に、日本に出願された特願２０１４−２３３６７１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

様々な多孔性粒子が開発され、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の薬物担持キャリアとしての可能性が検討されている（特許文献１、２、３）。特許文献１においては、非ステロイド系抗炎症化合物の放出性に優れる多孔性材料が提供されている。特許文献２においては、薬物および薬物含有ナノ粒子の担体として機能する多孔性材料が示されており、溶解性の上昇によって薬物の経口吸収性の向上が達成されている。これらの、低分子薬物の担体として多孔性材料を用いる場合には、溶解補助がその目的となる。特許文献３では、遺伝子治療の際の薬物担体として、多孔性粒子が利用されている。遺伝子薬物の安定化と、効果的な細胞内デリバリーが達成されている。
無機材料及び／又は炭素材料を主体とする多孔性粒子は、硬いものであり、生体中で速やかに分解せず、長期間存在すると生体に悪影響を与えるおそれがあった。高分子材料を用いた多孔性粒子も開発されたが（特許文献４、５）、該多孔性粒子も分解には時間を要し、また単量体等の不純物が残存することによって、生体安全性の問題を生じる恐れがある。特許文献４は、生体適合性物質の水不溶化多孔性粒子及びその製造法に関する。特許文献５は、荷電分子が固定化した多孔性高分子粒子およびその製造方法に関する。

非特許文献１は、多孔性シリカ粒子の医療応用に関する総説である。シリカ関連素材の多孔性材料としての利用について解説されている。

非特許文献２は、高分子化合物を用いた多孔性材料の作成に関する総説である。高分子化合物の利用に特化している。

非特許文献３は、インドメタシンを多孔性シリカに内封し、薬物の溶解性の上昇と、動物における経口吸収性の向上を確認した文献である。多孔性粒子は溶解性向上のための材料として使用されている。

非特許文献４は、噴霧乾燥を用いた有機材料粒子の形状制御に関する総説である。有機化合物による多孔性材料について開示されている。テンプレートを含んだ噴霧乾燥粒子を、加温や溶解によって取り除くことによって多孔性粒子化する手法が開示されている。孔径はサブミクロンが主体であり、非常に大きいものが開示されている。

非特許文献５は、医薬品経肺投与のための微粒子作成法に関する総説である。有機材料による多孔性粒子作製法について開示されている。噴霧乾燥中に気化する材料を添加することで多孔性粒子が得られることが開示されている。孔径はサブミクロンが主体であり、非常に大きいものが開示されている。

非特許文献６は、凍結乾燥によって、再生医療への利用を指向した多孔性材料が作製できることが開示されている。

特表２００５−５３３７５１号公報特表２００８−５１００００号公報特表２０１１−５２０８１３号公報特開２００５−１０３３１９号公報特表２０１０−５３５８８５号公報

Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１，２５９０−２６０５（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１２，３９５９−４０１５（２０１２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６９，２２３−２３０（２００８）Ａｄｖ．ＰｏｗｄｅｒＴｅｃｈｎｏｌ．２２，１−１９（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４，４１１−４３７（２００７）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．２，６７−７７（２００２）

本発明は、生体安全性が高く、ゲスト分子、特に薬物分子を包含可能な多孔性粒子の製造方法、及び該方法で得られる多孔性粒子及びゲスト分子包含多孔性粒子を提供することを課題とする。

上記目的を達成するために種々検討したところ、驚くことに、両親媒性物質を含む混合溶媒系を冷却して凍結乾燥すると、粒径がほぼ揃った固形粒子が得られること、該粒子はナノオーダー以上の大きさの孔を有し、該粒子には種々の物質を担持できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は以下のものである。
［１］（１）両親媒性物質を、凍結乾燥可能な混合溶媒に溶解させて、両親媒性物質の溶液を調製する工程と、
（２）工程（１）で得られた溶液を該溶液の相分離温度以下の温度に冷却してから、該温度で保持して、該両親媒性物質を含む沈殿物を生成する工程と、
（３）工程（２）で得られた沈殿物を含む溶液を凍結乾燥して、多孔性粒子を製造する工程、
を有することを特徴とする多孔性粒子の製造方法。

［２］該多孔性粒子がラメラ様の構造を有することを特徴とする上記方法。

［３］該両親媒性物質がリン脂質であることを特徴とする上記方法。

［４］前記リン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、セラミドの群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする上記方法。

［５］前記リン脂質が天然由来のリン脂質であることを特徴とする上記方法。
［６］前記天然由来リン脂質が、水添大豆レシチン又は水添卵黄レシチンであることを特徴とする上記方法。

［７］前記両親媒性物質がジセチルホスフェート、ジヘキサデシルホスフェート、ジオクタデシルジメチルアンモニウム塩、ステアリルアミンの群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする上記方法。

［８］前記混合溶媒が、水、ｔ−ブタノール、シクロヘキサン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジエチルアミン、酢酸、及びt-アミルアルコールからなる群より選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることを特徴とする上記方法。

［９］前記混合溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロバノール、ブタノール、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカン、エーテル類、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、イソペンタン、メチルアミン、エチルアミン、イソブタン、エチレンオキシドの群から選択される少なくとも一種の溶媒を更に含むことを特徴とする上記方法。

［１０］工程（１）において、さらに生体適合性物質を溶解させることを特徴とする上記方法。

［１１］（４）多孔性粒子を生体適合性物質と混合する工程をさらに含むことを特徴とする上記方法。

［１２］前記生体適合性物質が、薬剤であることを特徴とする上記方法。
［１３］前記薬剤が、低分子医薬、ペプチド医薬、抗体医薬、及び核酸医薬からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする上記方法。
［１４］前記生体適合性物質が、安定化剤、保湿剤、増粘剤、賦形剤の群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする上記方法。

［１５］多孔性粒子の体積平均粒子径が１００ｎｍ以上５０μｍ以下であることを特徴とする、上記方法。

上記本発明の製造方法によれば、例えばリン脂質を用いた場合、１００ｎｍ以上５０μｍ以下のほぼ揃った粒径を有した、多孔性粒子を得ることができる。該製造方法の各工程は工業化が容易であり、特殊な物質も必要としない。得られる多孔性粒子の孔径は、ナノオーダーからサブミクロンまで分布しており、本体内および細孔内に種々のゲスト分子を取り込むことができると共に、放出速度を変えることができ、徐放性担体等として大変に有用である。

本発明の実施形態である多孔性粒子の一例を示す模式図であって、全体図（ａ）及び（ａ）のＡ部拡大図（ｂ）である。図１（ｃ）は、多孔性粒子の一例の、断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。図１（ｂ）のＢ部拡大図（ａ）、（ａ）のＣ部拡大図（ｂ）である。両親媒性分子４１の一例であるリン脂質の拡大図である。本発明の実施形態であるゲスト分子包含多孔性粒子の一例を示す模式図である。本発明の実施形態であるゲスト分子包含多孔性粒子の一例を示す模式図である。本発明の実施形態であるゲスト分子包含多孔性粒子の一例を示す模式図である。実施例１−１の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−２の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−３の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−５の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−６の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−７の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−８の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例１−９の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。３．０ｗｔ％（実施例１−１）、９．６ｗｔ％（実施例１−３）、６．０ｗｔ％（実施例１−４）についての細孔分布の解析結果であって、ｒｐ（多孔性粒子の孔径）の体積分布を示すグラフである（Ｖｐ：粒子全体の細孔体積）。実施例２−２の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例２−３の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例２−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例２−５の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。実施例３のＦＩＴＣデキストラン包含多孔性粒子からのＦＩＴＣデキストランの放出パーセンテージと経時時間との関係を示すグラフであって、実施例３−１（ｂ）、３−２（ａ）である。多孔性粒子のＳＥＭ写真であって、実施例４−１（ａ）、実施例４−２（ｂ）、実施例４−３（ｃ）、実施例４−４（ｄ）である。実施例４−１〜４−４のテオフィリン包含多孔性粒子からのテオフィリンの放出パーセンテージと経時時間との関係を示すグラフである。比較例１のバルク体のＳＥＭ写真である。比較例２の板状構造体のＳＥＭ写真である。多孔性粒子（実施例５）のＳＥＭ写真である。（ａ）は、フェノフィブラートを含む多孔性粒子（実施例６）のＳＥＭ写真である。（ｂ）は、フェノフィート代謝物の血中濃度を示すグラフである。

［多孔性粒子］
まず、本発明の方法により得られる多孔性粒子について説明する。
図１は、該多孔性粒子の一例を示す模式図であって、全体図（ａ）及び（ａ）のＡ部拡大図（ｂ）、断面ＳＥＭ写真（ｃ）である。
図１（ａ）に示す多孔性粒子１１は、略球形状である。しかし、これに限られるものではなく、楕円球等、種々の形態になり得る。
経口製剤への利用を想定した場合、表面積確保のために、体積平均粒子径は５０μｍ以下であることが好ましい。また経肺投与を想定した場合には、空気力学径を数μｍとすることによって効果的な吸入治療が期待されるため、体積平均粒子径は２０μｍ以下であることが望ましい。粒径の下限は特に限定されないが、ハンドリングを容易にするためには１００ｎｍ以上であることが望ましい。また、本発明の方法によれば、狭い粒径分布を実現できる。

図１（ｂ）に示すように、多孔性粒子１１は、両親媒性物質、例えばリン脂質からなる部分２１と、孔２１ｃを有する。孔２１ｃは、断面写真（図１（ｃ））に示すように表面から内部へ延びている。

図２（ａ）は、図１（ｂ）のＢ部拡大図であり、図２（ｂ）は図２（ａ）のＣ部拡大図である。
図２（ａ）に示すように、２つの孔２１ｃ、２１ｃ’の間で、脂質二分子膜２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃが積層されてラメラ様の構造が構成されている。もっとも実際の層の数は任意であり、３層に限定されるわけではない。

図２（ｂ）に示すように、脂質二分子膜２３Ａは、脂質層２５Ａが別の脂質層２５Ｂと、疎水性基３１Ａ同士が集合した状態で構成されている。該脂質二分子膜が複数集まってラメラ構造を形成している。

図３は、リン脂質の拡大図であり、親水性基３８と、前記親水性基３８に結合された２つの疎水性基３９Ａ、３９Ｂを有する。

疎水性基３９Ａ、３９Ｂは、Ｃ１２以上Ｃ１８以下の飽和炭化水素鎖であることが好ましく、不飽和炭化水素鎖は好ましくない。不飽和炭化水素鎖を有するリン脂質は凍結相ガラス転移温度が低いため、粒子構造を維持できる凍結乾燥条件の設定が困難なためである。
２つの疎水性基３９Ａ、３９Ｂは、同一であっても、異なっていてもよい。
前記Ｃ１２以上Ｃ１８以下の飽和アルキル基を有する脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリル酸等を挙げることができる。

親水性基３８は、疎水性基３９Ａ、３９Ｂにエーテル結合で結合する連結基３３を有する。
連結基３３は、グリセリン残基である。例えば、グリセリンのＣ１、Ｃ２位に脂肪酸がエステル結合され、Ｃ３位にリン酸がエステル結合されると、ホスファチジン酸となる。

［多孔性粒子の製造方法］
次に、本発明の多孔性粒子の製造方法について説明する。
本発明の実施形態である多孔性粒子の製造方法は、（１）両親媒性物質の溶液を調製する工程と、（２）沈殿物生成工程と、（３）凍結乾燥工程と、を有する。

（１）両親媒性物質溶液調製工程
この工程では、両親媒性物質を、凍結乾燥可能な混合溶媒に溶解させる。本発明において、両親媒性物質は分子中に疎水性基と親水基を備える物質であり、好ましくは生体適合性である。斯かる両親媒性物質としては、例えば上述のリン脂質、セラミド脂質等の天然両親媒性物質、ジセチルホスフェート、ジヘキサデシルホスフェート、ジオクタデシルジメチルアンモニウム塩、ステアリルアミン等の合成両親媒性物質、及びこれらのものの親水基を、ポリエチレングリコールや膜透過性ペプチドなど、ゲスト薬物との相互作用や体内標的部位への薬物送達能を向上させるための分子で修飾したものが例示される。

リン脂質としては、その疎水鎖部分が飽和炭化水素鎖のみを有することが望ましい。該リン脂質の例としては、ホスファチジルコリン（レシチン）（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルグリセロール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）等を挙げることができる。

リン脂質として天然由来の混合物を用いてもよく、例えば水添大豆レシチン、及び水添卵黄レシチンを挙げることができる。水添大豆レシチンは、例えばジステアリルホスファチジルコリン８７ｗｔ％と、ジパルミトイルホスファチジルコリン１３ｗｔ％とから主に構成される。リン脂質に、多孔性構造が崩壊しない範囲で、前記ホスファチジル誘導体、不飽和炭化水素鎖を有する脂質を混合してもよい。また、多孔性構造が崩壊しない範囲で、コレステロールを添加してもよい。

セラミド脂質としては、動物性セラミド、植物性セラミド、バイオセラミド、及び合成セラミドが挙げられる。セラミド脂質に、多孔性構造が崩壊しない範囲で、前記ホスファチジル誘導体、不飽和炭化水素鎖を有する脂質を混合してもよい。また、多孔性構造が崩壊しない範囲で、コレステロールを添加してもよい。

凍結乾燥可能な混合溶媒としては、水、ｔ−ブタノール、ｔ−アミルアルコール、シクロヘキサン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジエチルアミン、及び酢酸から選択される２以上の溶媒を混合した溶媒が例示される。これらのうち、水、ｔ−ブタノール、シクロヘキサン、ジオキサンの群から選択される２以上の溶媒を混合した溶媒であることが好ましい。この混合溶媒は、使用する両親媒性物質の存在下において、冷却により相分離を起こすような組合わせ、及び量比で使用される。

前記混合溶媒に、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロバノール、ｎ−ブタノール、イソブタン、イソペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカン、エーテル類、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、エチルアミン、プロピルアミン、Ｎ−メチルピロリドンの群から選択される少なくとも一種の溶媒を更に混合してもよい。

溶解の方法は、特に限定されず、最初に混合溶媒を調製し、そこへ両親媒性物質を加えて、定法に従い攪拌機等を用いて行う。或いは、一の溶媒に両親媒性物質を溶解し、得られた溶液に他の溶媒を加えて混合してもよい。溶解する際に、加熱してもよい。リン脂質をｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２の混合溶媒に溶解する場合、５０℃程度に加熱するのが好ましい。これにより、加熱による分解を起こすことなく、１ｗｔ％以上の高濃度のリン脂質を溶解させることができる。

（２）沈殿物生成工程
工程（１）で得られた溶液を、該溶液の相分離温度以下に冷却してから、該温度で保持して、該両親媒性物質を含む沈殿物を生成する。相分離が起こる温度は、少なくとも２種の溶媒と両親媒性物質との、少なくとも３成分系に依存して決まる。冷却手段は特に限定されず、凍結乾燥機の中で行ってもよい。冷却速度は特に限定されないが、比較的急速に冷却することが好ましく、０．１℃／分以上で行う。冷却の際、撹拌してもよい。相分離温度で保持しても沈殿物を生成することは可能であるが、好ましくは相分離温度より１℃以下、より好ましくは５℃以下まで冷却する。次いで、該温度で保持して、両親媒性物質を含む沈殿物を生成させる。例えば、リン脂質を用いた場合、該リン脂質を含む球状の沈殿が生成する。
例えば、６ｗｔ％の水添大豆レシチンを含有する場合、ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２溶液の相分離温度は約１８℃である。これより低く、かつ、凍結しない温度、例えば４℃で、ラメラ構造のレシチンを含む、球形の沈殿を発生させることができる。
保持時間は、両親媒性物質及び溶媒系に依存して、調整することが好ましい。例えば、リン脂質と、ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２の系の場合、５時間以上４日以下とすることが好ましい。数時間程度では、沈殿物が均一に形成できない場合がある。逆に４日超とすると、凝集体ができてしまう。

（３）凍結乾燥工程
次いで、工程（２）で得られた沈殿物を含む溶液を凍結乾燥する。凍結温度は、例えば−２０℃以下、好ましくは−４０℃以下である。冷却は液体窒素で行ってもよく、真空凍結乾燥器内で行っても良い。
凍結する前に、上澄み液をデカンテーション等により除去してもよい。
凍結乾燥時間は、特に限定されないが、半日以上とすることが好ましい。凍結乾燥温度は、例えば―４０℃から４０℃の間で、好ましくは―２０℃から２５℃の間で行う。なお凍結乾燥の最終工程で、加温して残留溶媒を留去してもよい。温度は５０℃以下、時間は５時間以下が望ましいが、これに限定されない。
なお、凍結乾燥法として、噴霧凍結乾燥法を用いてもよい。以上により、多孔性粒子が得られる。

［ゲスト分子包含多孔性粒子］
該多孔性粒子は、担体として任意の物質（以下「ゲスト分子」という）を担持することができる。
図４〜６は、該ゲスト分子包含多孔性粒子の一例を示す模式図である。該ゲスト分子包含多孔性粒子は、多孔性粒子１１（図１）と、ゲスト分子５０と、を有して概略構成されている。

ゲスト分子５０は、多孔性粒子１１の表面、孔内、ラメラ様構造内のいずれの部位に担持されてもよい。
図４では、ゲスト分子５０が、多孔性粒子１１の孔２１ｃ内に取り込まれている。
図５では、ゲスト分子５０が、多孔性粒子１１の疎水性層３１Ａ、３１Ａ’内に取り込まれている。つまり、脂質二分子膜２３Ａ内に取り込まれている。
図６では、ゲスト分子５０が、多孔性粒子１１の親水性層３１Ｂ、３１Ｂ’間に取り込まれている。つまり、脂質二分子膜２３Ａ、２３Ｂ間に取り込まれている。

好ましいゲスト分子５０は、薬物、もしくはその他の生体適合性物質である。前記薬物として、図５のように脂質二分子膜内に取り込まれる薬物としては、ステロイド類又は脂溶性ビタミン類を含有する疎水性低分子薬物を挙げることができる。図６のように脂質二分子膜間に取り込まれる薬物としては、抗生物質などに代表される水溶性低分子医薬、ペプチド医薬、抗体医薬、核酸医薬などの親水性薬物を挙げることができる。前記水溶性低分子医薬としては、抗生剤を挙げることができる。いずれの場合も、単独でも二種類以上の薬物が含有されていても良く、親水性薬物と疎水性薬物を同時に取り込ませても良い。

前記その他の生体適合性物質としては、慣用の医薬品・化粧品・食品添加剤、例えば安定化剤、保湿剤、増粘剤、賦形剤を挙げることができる。
前記安定化剤としてはビタミンＣなどの抗酸化剤又はパラベンなどの防腐剤、前記保湿剤としてはグリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ソルビットなどの多価アルコール類、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ケラチンなどの水溶性高分子類やその加水分解物、又はアミノ酸類や尿素などの低分子化合物、前記増粘剤としてはセルロース類を含む多糖類、ポリビニル誘導体又は増粘剤用合成高分子、前記賦形剤としては糖類もしくは水溶性高分子を挙げることができる。

薬物およびその他の生体適合性物質は、工程（１）において、両親媒性物質と共に、混合溶媒中に溶解するか、工程（３）で得られた多孔性粒子と、機械的に混合する工程（４）で行ってもよい。
ゲスト分子５０の含有量は、該ゲスト分子の種類に応じて調整されることが好ましいが、多孔性粒子の重量に対して５０ｗｔ％以下とすることが好ましく、３０ｗｔ％以下とすることがより好ましい。

ゲスト分子包含多孔性粒子が、ゲスト分子濃度が薄い媒体、例えば消化管液、に接触すると、濃度勾配により、ゲスト分子包含多孔性粒子からゲスト分子を徐放出させることができる。
ゲスト分子を孔内及びラメラ様構造間の両方に包含させることにより、放出速度を制御することができる。また、疎水性層内に疎水性ゲスト分子を包含し、親水性層間に親水性ゲスト分子を包含することにより、それぞれ放出開始時間を変えて放出させることができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（多孔性粒子の製造）
（実施例１−１）
リン脂質（日油（株）製、水添大豆レシチン）を混合溶媒（ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶媒）に溶解させて、リン脂質溶液（９．６ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液）を調製した。

次に、前記リン脂質溶液を氷冷によって０℃に冷却して相分離させた後、０℃で２４時間保持して、沈殿物を生成させた。

次に、前記沈殿物を液体窒素で凍結して、凍結物を生成した。

次に、前記凍結物を、凍結乾燥機内に保持して、減圧下で、−２０℃で半日保持してから温度を室温に上げ、１日凍結乾燥することによって、実施例１−１の多孔性粒子を製造した。

図７は、実施例１−１の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。窒素吸着法（日本ベル製BEL-sorp mini）を用いて測定した該粒子の比表面積は２３．９ｍ^２／ｇであり、その体積基準平均粒子径は１５．８μｍであった。同図から分かるように、得られた粒子は粒径がほぼ揃った狭い粒径分布を示しており、分布の標準偏差は２．７μｍであった。

（実施例１−２）
前記リン脂質溶液を−２０℃に冷却してから、その温度で２４時間保持して、沈殿物を生成した他は実施例１−１と同様にして、実施例１−２の多孔性粒子を製造した。

図８は、実施例１−２の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は６．７３ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は８．２μｍ（標準偏差１．２μｍ）であった。

（実施例１−３）
３．０ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を用いて、リン脂質溶液を調製した他は実施例１−１と同様にして、実施例１−３の多孔性粒子を製造した。

図９は、実施例１−３の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は１９．８ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は１１．５μｍ（標準偏差１．６μｍ）であった。

（実施例１−４）
６．０ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を用いて、リン脂質溶液を調製した他は実施例１−１と同様にして、実施例１−４の多孔性粒子を製造した。

図１０、１１は、実施例１−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は４３．１ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は１２．４μｍ（標準偏差１．８μｍ）であった。

（実施例１−５）
６．０ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を用いて、リン脂質溶液を調製し、混合溶媒として、ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝２：１混合溶媒を用いた他は実施例１−１と同様にして、実施例１−５の多孔性粒子を製造した。

図１２は、実施例１−５の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は４９．３ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は１３．０μｍ（標準偏差１．８μｍ）であった。

（実施例１−６）
６．０ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を用いて、リン脂質溶液を調製し、混合溶媒として、ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：１混合溶媒を用いた他は実施例１−１と同様にして、実施例１−６の多孔性粒子を製造した。

図１３は、実施例１−６の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は５０．４ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は１５．６μｍ（標準偏差１．７μｍ）であった。

（実施例１−７）
６．０ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を用いて、リン脂質溶液を調製し、混合溶媒として、ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：４混合溶媒を用いた他は実施例１−１と同様にして、実施例１−７の多孔性粒子を製造した。

図１４は、実施例１−７の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。比表面積は４１．７ｍ^２／ｇであり、平均粒子径は９．９μｍ（標準偏差２．４μｍ）であった。

（実施例１−８）
前記リン脂質溶液を４℃に冷却してから、その温度で保持して、沈殿物を生成した他は実施例１−１と同様にして、実施例１−８の多孔性粒子を製造した。

図１５は、実施例１−８の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

（実施例１−９）
ジステアロイルホスファチジルコリンとジパルミトイルホスファチジルコリンをモル比１：１で混合し、合計濃度３．９ｗｔ％としてｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶媒に均一に溶解させ、４℃に冷却してから、その温度で保持して、沈殿物を生成した他は実施例１−１と同様にして、実施例１−９の多孔性粒子を製造した。

図１６は、実施例１−９の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

＜細孔分布の解析結果＞
図１７は、レシチン濃度９．６ｗｔ％（実施例１−１）、３．０ｗｔ％（実施例１−３）、６．０ｗｔ％（実施例１−４）について、窒素吸着法（日本ベル製BEL-sorp mini）にて求めた細孔分布の解析結果であって、ｒｐ（多孔性粒子の孔径）に対するＶｐ（多孔性粒子全体のポアボリューム）の関係を示すグラフである。縦軸は、ｄＶｐ／ｄｒｐとしている。本図はつまり、細孔径の分布を表している。
３．０ｗｔ％（実施例１−３）では、鮮明なピークは観察されず、１００ｎｍ以下の細孔は少ないと考えられた。
９．６ｗｔ％（実施例１−１）では、１０ｎｍ近傍にピークが見られた。
６．０ｗｔ％（実施例１−４）では、２０ｎｍ近傍にピークが見られた。
表１は、多孔性粒子の製造条件及び得られた多孔性粒子の比表面積及び平均粒子径を示す。

（実施例２−１）
溶媒にｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶液を用いて、９．２ｗｔ％の水添大豆レシチンを含有する溶液を調製した。
次に、この溶液を４℃で一日保持し、沈殿物を得た。
次に、その沈殿物を液体窒素で凍結させたのち、凍結乾燥を行った。
以上により、実施例２−１の多孔性粒子を得た。
小角Ｘ線散乱より求めたラメラ様の層の間隔（以下「ラメラ間隔」とする）は６．１７ｎｍであった。

（実施例２−２）
溶媒にｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶液を用い、９．２ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を調製した。別に２０ｗｔ％のグルコース水溶液を調製し、これをレシチン溶液に対して４．６ｗｔ％となるように添加して、グルコースを含むレシチン溶液を調製した。沈澱操作以降は実施例２−１と同様にして、実施例２−２の多孔性粒子を得た。
図１８は、実施例２−２の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。
小角Ｘ線散乱より求めたラメラ間隔は６．３５ｎｍであった。

（実施例２−３）
グルコース水溶液濃度が４０ｗｔ％である以外は実施例２−２と同様にして、実施例２−３の多孔性粒子を得た。
図１９は、実施例２−３の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。
小角Ｘ線散乱より求めたラメラ間隔は６．５９ｎｍであった。

（実施例２−４）
グルコース水溶液濃度が６０ｗｔ％である以外は実施例２−２と同様にして、実施例２−４の多孔性粒子を得た。
図２０は、実施例２−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。
小角Ｘ線散乱より求めたラメラ間隔は６．７４ｎｍであった。

（実施例２−５）
グルコース水溶液濃度が８０ｗｔ％である以外は実施例２−２と同様にして、実施例２−５の多孔性粒子を得た。
図２１は、実施例２−５の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。
小角Ｘ線散乱より求めたラメラ間隔は６．８４ｎｍであった。
表２は、製造条件及びラメラ間隔の結果をまとめたものである。

添加したグルコース水溶液濃度の上昇に伴いラメラ間隔が広がった。これは、（１）グルコースが主に脂質二分子膜間に存在しており、（２）グルコース濃度の上昇に伴い、脂質二分子膜間に存在するグルコース量が増え、脂質二分子膜間距離が広がったことによるものと思われる。

（実施例３）
（デキストラン包含多孔性粒子の製造）
ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶液を用いて９．６ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を調製した。続いて０．１ｗｔ％の、フルオレセインイソシアネートで修飾されたデキストラン（以下「ＦＩＴＣデキストラン」とする）を、デキストラン／レシチン＝０．５μｇ／２００ｍｇ又は０．５μｇ／１００ｍｇになるように添加した。
次に、この水添大豆レシチン溶液を４℃で一日保持して、沈殿物を生成した。
次に、この沈殿物を液体窒素で凍結させたのち、凍結乾燥を行って、実施例３のＦＩＴＣデキストラン包含多孔性粒子を製造した。

（ＦＩＴＣデキストラン放出実験）
（実施例３−１）
実施例３のＦＩＴＣデキストラン包含多孔性粒子（デキストラン／レシチン＝0.5μｇ／200ｍｇ）を２００ｍｇ／１００ｍＬでｐＨ７のリン酸緩衝液に分散させた。
次に、溶液を経時的に採取、フィルタによる濾過、ろ液の蛍光分析を行い、ＦＩＴＣデキストラン濃度を測定した。

（実施例３−２）
実施例３のＦＩＴＣデキストラン包含多孔性粒子（デキストラン／レシチン＝0.5μｇ／100ｍｇ）を１００ｍｇ／１００ｍＬで分散させた他は実施例３−１と同様にして、溶液中のＦＩＴＣデキストラン濃度を測定した。

図２２は、実施例３のＦＩＴＣデキストラン包含多孔性粒子からのＦＩＴＣデキストランの放出パーセンテージと経時時間との関係を示すグラフであって、実施例３−１（ｂ）、３−２（ａ）である。
いずれも、二相性を有する放出挙動が観察された。これは、ラメラ間に捕獲されたＦＩＴＣデキストランが、孔内に捕獲されたＦＩＴＣデキストランより放出されにくいことによると考えられる。
以上により、本発明の方法で得られる多孔性粒子は、放出速度を制御可能な担体として作用することが示された。
表３は、製造条件及び放出特性の結果をまとめたものである。

（テオフィリン包含多孔性粒子の製造）
（実施例４−１）
ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶液を用いて、９．２ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を調製した。続いて０．２５ｗｔ％のテオフィリン水溶液を調製し、上記レシチン溶液に対して４．６ｗｔ％のテオフィリン水溶液を添加した。
次に、この水添大豆レシチン溶液を４℃で一日保持し、沈殿物を生成した。
次に、その沈殿物を液体窒素で凍結させたのち、凍結乾燥を行って、実施例４−１のテオフィリン包含多孔性粒子を得た。
図２３の（ａ）は、実施例４−１の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

（実施例４−２）
加えた４．６ｗｔ％のテオフィリン水溶液の濃度を２倍とした他は実施例４−１と同様にして、実施例４−２のテオフィリン包含多孔性粒子を得た。
図２３の（ｂ）は、実施例４−２の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

（実施例４−３）
加えた４．６ｗｔ％のテオフィリン水溶液の濃度を３倍とした他は実施例４−１と同様にして、実施例４−３のテオフィリン包含多孔性粒子を得た。
図２３の（ｃ）は、実施例４−３の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

（実施例４−４）
加えた４．６ｗｔ％のテオフィリン水溶液の濃度を４倍とした他は実施例４−１と同様にして、実施例４−４のテオフィリン包含多孔性粒子を得た。
図２３の（ｄ）は、実施例４−４の多孔性粒子のＳＥＭ写真である。

（テオフィリン放出実験）
まず、実施例４−１〜４−４のテオフィリン包含多孔性粒子を２００ｍｇ／１００ｍＬでｐＨ７のリン酸緩衝液に分散させた。
次に、溶液を経時的に採取し、フィルタで濾過した後、高速液体クロマトグラフィー分析して、溶液中のテオフィリン濃度を測定した。

図２４は、実施例４−１〜４−４のテオフィリン包含多孔性粒子からのテオフィリンの放出パーセンテージと経時時間との関係を示すグラフである。
実施例４−１〜４−４のテオフィリン包含多孔性粒子からテオフィリンが時間とともに少しずつ放出された。
テオフィリン単独では一瞬で全量が溶解したことと比較すると、実施例４−１〜４−４のテオフィリン包含多孔性粒子にテオフィリンが包含されていること、包含されたテオフィリンが少しずつ放出されることを確認した。
表４は、製造条件及び放出特性の結果をまとめたものである。

（参考例１）
水添大豆レシチンをｔ−ブタノールに９．６ｗｔ％で溶解した後、凍結乾燥した。
図２５のＳＥＭ写真に示すようなバルク体が得られ、球形粒子は得られなかった。

（参考例２）
ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２混合溶液を用い、９．６ｗｔ％の水添大豆レシチン溶液を調製した。
次に、この水添大豆レシチン溶液を２５℃で一日保持し、沈殿物を生成した。
次に、その沈殿物を液体窒素で凍結させたのち、凍結乾燥を行った。
板状構造体が得られた。球形粒子は得られなかった。
図２６は、比較例２の板状構造体のＳＥＭ写真である。
実験条件及び結果を表５にまとめた。

（実施例５）
３．９ｗｔ％の水添大豆レシチンと０．２ｗｔ％のプレドニゾロンを含むｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２溶液を４℃で一日保持した後、その沈殿物を液体窒素で凍結させ、凍結乾燥を行うことによって、多孔性粒子を得た。
図２７は、該多孔性粒子の電子顕微鏡写真である。
プレドニゾロンの多孔性粒子への含有率は８０％であった。

（実施例６）
ｔ−ブタノール：シクロヘキサン＝１：２の混合溶液を用いて、９ｗｔ％の水添大豆レシチンと１ｗｔ％のフェノフィブラートを含有する溶液を調製した。この溶液を4℃で1日保持したのち、液体窒素で凍結させ、さらに凍結乾燥を行って、フェノフィブラートを含む多孔性粒子を得た。図２８（ａ）にそのＳＥＭ写真を示す。得られた粒子を薬物量換算７．５ｍｇ／ｋｇでラットに経口投与して、フェノフィブラート代謝物の血中濃度を測定した。比較として、多孔性粒子の原料に用いた水添大豆レシチンとフェノフィブラートを９対１の割合で物理的に混合し、同じ量を投与した。図２８（ｂ）に示すように、多孔性粒子を投与した場合、原料の水添大豆レシチンとフェノフィブラートとの物理混合物の投与と比べて顕著に経口吸収性が向上した。これは、多孔性粒子と腸管粘膜が親和性を有し、経粘膜吸収性が促進されたためと考えられる。

本発明の方法により得られる多孔性粒子及びゲスト分子包含多孔性粒子は、多孔性構造を備え、ゲスト分子、特に薬物分子の担体として、徐放性や低密度性を活かした経口剤、吸入剤、注射剤、外用剤（化粧品を含む）、点眼剤など、薬物担体として大変有用である。

１１…多孔性粒子、２１…両親媒性分子のみからなる部分、２１ｃ、２１ｃ’…孔、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ…脂質二分子膜、２５Ａ、２５Ｂ…脂質層、３１Ａ、３１Ａ’…疎水性層、３１Ｂ、３１Ｂ’…親水性層、３３…連結部、３８…親水性基、３９Ａ、３９Ｂ…疎水性基、４１…両親媒性分子（リン脂質）、５０…ゲスト分子。

Claims

（１）両親媒性物質を、ｔ−ブタノールとシクロヘキサンとの混合溶媒に溶解させて、両親媒性物質の溶液を調製する工程と、
（２）工程（１）で得られた溶液を該溶液の相分離温度以下であるが凍結しない温度に冷却してから、該温度で保持して、相分離により該両親媒性物質を含む球状の沈殿物を生成する工程と、
（３）工程（２）で得られた沈殿物を含む溶液を凍結乾燥して多孔性粒子を製造する工程、
を有し、
前記混合溶媒は前記両親媒性物質の存在下で冷却により相分離を引き起こすものであり、
前記両親媒性物質はリン脂質を含むことを特徴とする多孔性粒子の製造方法。
該多孔性粒子が、ラメラ様の構造を有することを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
前記リン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンの群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
前記リン脂質が天然由来のリン脂質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
前記天然由来リン脂質が、水添大豆レシチン又は水添卵黄レシチンであることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
前記混合溶媒が、水、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジエチルアミン、酢酸、及びt-アミルアルコールからなる群より選択される少なくとも一の溶媒を更に含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
前記混合溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロバノール、ブタノール、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカン、エーテル類、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、イソペンタン、メチルアミン、エチルアミン、イソブタン、エチレンオキシドの群から選択される少なくとも一の溶媒を更に含むことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
工程（１）において、さらに生体適合性物質を溶解させることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
（４）多孔性粒子を生体適合性物質と混合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
前記生体適合性物質が、薬剤であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の製造方法。
前記薬剤が、低分子医薬、ペプチド医薬、抗体医薬、及び核酸医薬からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
前記生体適合性物質が、安定化剤、保湿剤、増粘剤、賦形剤の群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の製造方法。
前記多孔性粒子の体積平均粒子径が１００ｎｍ以上５０μｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。