JP6556322B2 - 吸着材及び精製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、吸着材およびそれを用いた精製方法に関する。
タンパクのような生体分子を標的物質としたアフィニティ精製は、アフィニティカラムへの標的物質の吸着、非吸着成分の洗浄、溶離液による標的物質のカラムからの脱離、の工程からなる。このとき、溶離液としては、しばしば強酸や強塩基のような過酷なｐＨの溶液を用いる。これは、アフィニティリガンドや標的物質のイオン化状態を変え、電荷反発によりアフィニティリガンドと標的物質の間の相互作用を弱める必要があるためである。しかし、強酸や強塩基のような過酷なｐＨ環境では、しばしば生体分子は不安定であり、精製された標的物質が劣化するリスクがある。また、アフィニティリガンドやカラム材の劣化のリスクもある。
そこで、アフィニティリガンドを改良し、温和なｐＨ条件で生体分子を精製可能としたアフィニティカラムが開発されている（特許文献１）。特許文献１では、遺伝子組換えにより温和な酸で応答するようにプロテインＡを改変している。このように、アフィニティリガンドがタンパクである場合には、遺伝子組換えによって応答するｐＨを調整することが比較的容易である。
しかし、低分子アフィニティリガンドの場合、標的物質と相互作用する部位が小さいため、応答ｐＨの調整のために修飾可能な部位が少なく、応答性の調整の自由度は低い（非特許文献１）。低分子アフィニティリガンドとアミンを共重合させることで低分子アフィニティリガンド近傍の局所ｐＨを摂動させる報告があるが（非特許文献２）、一般的に適用可能な手法ではないという課題がある。
特開２０１０−８１８６６号公報
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２０００，７４０，１−１５． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３，１４６７−１４７１．
低分子リガンドを用いたアフィニティ精製において温和な溶出条件で標的物質を脱離する。
低分子リガンドの近傍に極性補助基を導入することで、低分子リガンド中の官能基のｐＫａに摂動を与え、温和なｐＨ条件にて低分子リガンドをイオン化する。
標的物質の溶出に過酷な溶出条件を用いないため、劣化を抑制可能。標的物質の溶出に過酷なｐＨ条件を用いないため、中和工程を簡略化可能。
ｐＨ変化の前後のアフィニティ吸着材を示す。 吸着材を充填した精製装置を示す。 各試料の抗体に対するアフィニティを、試料をＩｇＧアガロースカラムに通液した際の保持時間から測定した結果を示す表である。 各資料をＩｇＧアガロースカラムからリニアグラジエントにて溶出させた際の挙動を示した図である。 種々の低分子リガンドと極性補助基とスペーサのＩｇＧ溶出の容易性を示す表である。
以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
図１はｐＨ変化の前後のアフィニティ吸着材１を示す。本実施形態で提供する、アフィニティ吸着材１は、標的物質（抗体）２と相互作用する低分子リガンド３と、低分子リガンドのｐＫａに摂動を与える極性補助基４と、担体５を含む。
標的物質は、どのような分子でも構わないが、生体分子や過酷なｐＨ条件で不安定な分子であれば、本発明の特徴を活かすことができる。代表的な例としては、抗体が挙げられる。
低分子リガンド３は、溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基を含む。溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基とは、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである−１．７より２低い−３．７以上の官能基、もしくは、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである−１．７より２低い−３．７以上の共役酸もしくは共役塩基を生じる官能基のことである。
溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基は、例えばカチオン化の場合は、含窒素複素環（ピリジル基、ピリミジル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、トリアゾリル基、など）、アミノ基、アンモニウム基、イミノ基、などであり、アニオン化の場合は、ボロン酸、カルボン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基、活性カルボニル化合物（マロン酸ジエステル、マロニトリル、アセト酢酸エステル、アセチルアセトン、など）、シクロペンタジエン、ニトロアルキル基、などであるが、これらに限定されない。
溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基は、ｐＨ変化前では中性であり、標的物質２と相互作用して吸着可能な状態にある。溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基は、ｐＨ変化後ではイオン化し、吸着していた標的物質２を脱離する。
極性補助基は、低分子リガンドが含む溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基がイオン化状態で有する電荷と逆の電荷を有し得る状態にある官能基である。
低分子リガンドが含む溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基がイオン化状態で有する電荷と逆の電荷を有し得る状態にある官能基とは、例えば正電荷の場合は、テトラアルキルアンモニウム、などであり、負電荷の場合は、フルオロスルホン酸、などであるが、これらに限定されない。
低分子リガンドと極性補助基は、互いに相互作用可能である必要があるため、３０Å以下の距離を隔てて離れていることが好ましい。
非特許文献１では、低分子リガンドと２級アミノ基が約９Åの距離を隔てているが、距離が短すぎることから立体障害により相互作用は認められない。極性補助基が十分に効果を発揮するためには、低分子リガンドと極性補助基の距離は１０Å以上の距離を隔てて離れていることが好ましい。
低分子リガンドは、担体に直接結合していても構わないし、スペーサを介して結合していても構わない。
極性補助基は、担体に直接結合していても構わないし、スペーサを介して結合していても構わない。
低分子リガンドと極性補助基は同じスペーサ上に導入されていても構わないし、異なるスペーサ上に導入されていても構わない。
スペーサは、例えばポリアルキレングリコール、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド）、ε−ポリリジン、ポリアミノ酸、直鎖ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリビニルエーテル、などであるが、これらに限定されない。
担体は、板状、ビーズ上、繊維状、膜状、もしくはモノリス状の固体で、好ましくは多糖類、合成樹脂、もしくは無機化合物もしくはそれらの複合材料を含む材料を備え、より好ましくはアガロース、架橋アガロース、疎水化アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリアルキルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリシロキサン、ポリフッ化エチレン、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化鉄、フェライト、ハイドロキシアパタイト、シリケートのいずれかを含み、さらに好ましくはアガロース、疎水化アガロース、架橋アガロース、セルロース、ポリスチレン、シリカ、酸化鉄、フェライトのいずれかを含むが、それらに限定されるものではない。
担体の表面は、低分子リガンドや極性補助基やスペーサ以外の化合物によって修飾されていてもよい。
本発明で提供するアフィニティ吸着材は、例えば、低分子リガンドと極性補助基を備えるスペーサと、エポキシやＮＨＳエステルのような活性な官能基を備えるカラム担体を反応させることで製造できる。
図２は吸着材１を充填した精製装置６を示す。精製装置６は吸着材を充填する部位７に多数の吸着材１を充填する。精製装置６に標的物質（抗体）２を含む第１の溶液８を接触させることで、標的物質２を吸着材１に吸着させる。その後、抗体を吸着させた吸着材１へ、ｐＨ４．０以上１０以下の第２の溶液９を接触させることで吸着材１から標的物質（抗体）２を脱着させることができる。
ここで、第１の溶液８のｐＨは、好ましくは４以上１０以下、より好ましくは５．０以上９．０以下、さらに好ましくは５．５以上８．５以下である。
また、第２の溶液９の塩濃度は、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは５０ｍＭ以上である。
また、第２の溶液９のｐＨは、好ましくは４以上１０以下、より好ましくは５．０以上９．０以下、さらに好ましくは５．５以上８．５以下である。
標的物質を吸着材から脱着させるときに必要な第２の溶液９は第１の溶液８のｐＨと異なっていれば何でも良い。第２の溶液９のｐＨが第１の溶液８のｐＨと比較して高くても低くても、とにかく異なっていれば良い。同じ場合には、標的物質が吸着材から脱着しない。
吸着材に第２の溶液９が接触して、ｐＨ変化があると低分子リガンドはアニオン化またはカチオン化する。低分子リガンドがアニオン化することで、低分子リガンドから標的物質が離れていく。このとき、極性補助基はカチオン化することで低分子リガンドがアニオン化しやすくなる。
低分子リガンドがカチオン化することで、低分子リガンドから標的物質が離れていく。このとき、極性補助基はアニオン化することで低分子リガンドがアニオン化しやすくなる。
本発明で提供するアフィニティ吸着材を充填したカラムに送液する液体は水を溶媒とした緩衝液が好ましいが、水以外の溶媒を含んでいても構わない。
本発明で提供するアフィニティ吸着材を充填したカラムを用いた精製プロセスは、例えば低いｐＨで分解や凝集体生成が発生する対象に適用することで特徴を活かすことができる。また、溶出された標的物質が中性に近いｐＨ領域の緩衝液に溶解した状態で得られるため、中和工程を必要とせず次の精製プロセスに適用できる。
＜実施例１＞
実施例１では、低分子リガンドと極性補助基を備え、かつそれらが３０Å以下の距離にある化合物を検討した。
ε−ポリリジンに、アミノ基に対して０．１当量の低分子リガンドであるクロロ(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジン（化合物１）を水−ＤＭＦ溶液中８０℃にて３時間作用させた。純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖に(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンが約１０％導入された誘導体を得た（試料１Ａ）。
Figure 0006556322
試料１の水溶液に、アミノ基に対して０．３当量の極性補助基であるピリジルチオ酢酸と０．３当量の縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを加え、室温にて５時間反応させた。１Ｍ塩酸を加えて酸性とした後に、純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖にピリジルチオ酢酸アミドが約２０％、(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンが約１０％導入された誘導体を得た（試料２Ａ）。１ＨＮＭＲおよび分子モデリングを用いた分析の結果、試料２における低分子リガンドと極性補助基の間の平均距離は２０Åであった。
＜比較例１＞
比較例１では、低分子リガンドと極性補助基を備え、かつそれらが３０Å以上の距離にある化合物を検討した。
ε−ポリリジンに、アミノ基に対して０．０２当量の低分子リガンドであるクロロ(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンを水−ＤＭＦ溶液中８０℃にて３時間作用させた。純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖に(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンが約４％導入された誘導体を得た（試料１Ｂ）。
試料１の水溶液に、アミノ基に対して０．１当量の極性補助基であるピリジルチオ酢酸と０．１当量の縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを加え、室温にて５時間反応させた。１Ｍ塩酸を加えて酸性とした後に、純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖にピリジルチオ酢酸アミドが約６％、(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンが約４％導入された誘導体を得た（試料２Ｂ）。１ＨＮＭＲおよび分子モデリングを用いた分析の結果、試料２における低分子リガンドと極性補助基の間の平均距離は４０Åであった。
＜比較例２＞
比較例２では、低分子リガンドのみ備えた化合物を検討した。
試料１の水溶液に、アミノ基に対して０．３当量の極性補助基であるフェニルチオ酢酸と０．３当量の縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを加え、室温にて５時間反応させた。１Ｍ塩酸を加えて酸性とした後に、純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖にフェニルチオ酢酸アミドが約２０％、(アミノ(ヒドロキシフェニル))(アミノ(ヒドロキシナフチル))トリアジンが約１０％導入された誘導体を得た（試料３）。
＜比較例３＞
比較例３では、極性補助基のみ備えた化合物を検討した。
ε−ポリリジンの水溶液に、アミノ基に対して０．３当量の極性補助基であるピリジルチオ酢酸と０．３当量の縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを加え、室温にて５時間反応させた。１Ｍ塩酸を加えて酸性とした後に、純水で透析することで低分子成分を除去し、濾過により不溶性成分を除去することで、ε−ポリリジンの側鎖にピリジルチオ酢酸アミドが約２０％導入された誘導体を得た（試料４）。
＜比較例４＞
比較例４では、スペーサであるε−ポリリジンを検討した（試料５）。
＜アフィニティ測定＞
試料１Ａ、２Ａ、３〜５およびプロテインＡの抗体に対するアフィニティを、試料をＩｇＧアガロースカラムに通液した際の保持時間から測定した（図３）。それぞれ試料１Ａ、２Ａ、３〜５をＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）溶液とし、直径５ｍｍのＩｇＧアガロースカラムに流速０。５ｍＬ／ｍｉｎにて通液し、１０ＣＶ分のＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）によって洗浄した（図３）。
その結果、試料１Ａ、２Ａ、３はＩｇＧアガロースカラムに吸着され、溶出されなかった。このことから、極性補助基は低分子リガンドのＩｇＧに対する親和性を低下させないことが判明した。
また、試料４、５は洗浄によって溶出された。
＜抗体溶出検討＞
試料１〜３、プロテインＡを吸着させたＩｇＧアガロースカラムに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）１００％から、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）２０％と酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、０．１ｍＭ、０．５ｍＭのＮａＣｌ含む）８０％の組成にリニアグラジエントにて溶媒を置換しながらカラムを洗浄し、溶出時間を測定した（図４）。
その結果、ピリジル基を極性補助基として含む試料２Ａが最も溶出が早く、極性補助基を備えない試料１Ａおよび試料３では溶出が遅かった。また、試料１Ｂと試料２Ｂは溶出時間に変化がなかった。このことから、極性補助基は低分子リガンドの近傍にある場合には溶出を容易にする効果があることが判明した。
＜実施例２＞
実施例２では、低分子リガンドと極性補助基を備える試料をビーズに固定化し、抗体精製を実施した。
試料２ＡをｐＨ１０の炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解し、エポキシ基を有するアガロースビーズと４０℃にて１２時間反応させた。得られた試料２Ａで修飾されたアガロースビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）で洗浄し、空カラム管に充填した（カラムＡ）。
カラムＡにＩｇＧを含む溶液を通液し、５ＣＶ分のＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）でカラムを洗浄した後にＰＢＳ（ｐＨ５．８、５０ｍＭ）を通液したところ、回収率８５％でＩｇＧを精製することができた。
＜比較例５＞
比較例５では、低分子リガンドを備え、極性補助基を備えない試料をビーズに固定化し、抗体精製を実施した。
試料３をｐＨ１０の炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解し、エポキシ基を有するアガロースビーズと４０℃にて１２時間反応させた。得られた試料３で修飾されたアガロースビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）で洗浄し、空カラム管に充填した（カラムＢ）。
カラムＢにＩｇＧを含む溶液を通液し、５ＣＶ分のＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）でカラムを洗浄した後にＰＢＳ（ｐＨ５．８、５０ｍＭ）を通液したところ、ＩｇＧの回収率は１５％であり、極性補助基を備える系（カラムＡ）と比較して低い値であった。
＜比較例６＞
比較例６では、低分子リガンドと極性補助基を備えるがそれぞれの間の距離が３０Å以上となるよう試料をビーズに固定化し、抗体精製を実施した。
試料３と試料４の混合物をｐＨ１０の炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解し、エポキシ基を有するアガロースビーズと４０℃にて１２時間反応させた。得られた試料３と試料４で修飾されたアガロースビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）で洗浄し、空カラム管に充填した（カラムＣ）。試料３と試料４の固定化量とビーズの比表面積から、低分子リガンドと極性補助基の間の平均距離は１００Åであった。
カラムＢにＩｇＧを含む溶液を通液し、５ＣＶ分のＰＢＳ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）でカラムを洗浄した後にＰＢＳ（ｐＨ５．８、５０ｍＭ）を通液したが、ＩｇＧの回収率は１５％であり、カラムＢと同等であったため、極性補助基が溶出を容易にするためには、極性補助基が低分子リガンドの近傍に存在する必要があることが示唆された。
＜実施例３＞
実施例３では、種々の低分子リガンドと極性補助基とスペーサの組み合わせに関して、実施例２と同様のカラムを用いた実験にてＩｇＧ溶出の容易性を検討した（図５）。
１：吸着材、２：標的物質、３：低分子リガンド、４：極性補助基、５：担体
６：精製装置、７：吸着材を充填する部位、８：第１の溶液、９：第２の溶液

Claims (13)

  1. 低分子リガンドと極性補助基と担体を備え、
    前記低分子リガンドは溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基を備え、
    前記極性補助基は、前記低分子リガンドがイオン化状態で有する電荷と逆の電荷を有し得る状態にあり、
    前記低分子リガンドと前記極性補助基の平均距離が１０Å以上３０Å以下であることを特徴とする吸着材。
  2. 請求項１に記載の吸着材において、
    前記低分子リガンドがｐＨ変化に基づきアニオン化する官能基を備え、
    前記極性補助基がカチオン性極性補助基を備えることを特徴とする吸着材。
  3. 請求項２に記載の吸着材において、
    前記ｐＨ変化に基づきアニオン化する官能基がフェノール性水酸基、ボロン酸、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸のいずれかを含み、
    前記カチオン性極性補助基が含窒素複素環、アミノ基、アンモニウム基のいずれかを含むことを特徴とする吸着材。
  4. 請求項１に記載の吸着材において、
    前記低分子リガンドがｐＨ変化に基づきカチオン化する官能基を備え、
    前記極性補助基がアニオン性極性補助基を備えることを特徴とする吸着材。
  5. 請求項４に記載の吸着材において、
    前記ｐＨ変化に基づきカチオン化する官能基が含窒素複素環、アミノ基、アンモニウム基のいずれかを含み、
    前記アニオン性極性補助基がフェノール性水酸基、ボロン酸、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸のいずれかを含むことを特徴とする吸着材。
  6. 請求項１に記載の吸着材において、
    前記低分子リガンドと前記極性補助基がスペーサを介して結合していることを特徴とする吸着材。
  7. 請求項６に記載の吸着材において、
    前記スペーサがポリアルキレングリコール、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド）、ε−ポリリジン、ポリアミノ酸、直鎖ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリビニルエーテル、のいずれかを含むことを特徴とする吸着材。
  8. 請求項１に記載の吸着材において、
    前記担体がアガロース、架橋アガロース、疎水化アガロース、セルロース、ポリスチレン、シリカ、酸化鉄、フェライト、のいずれかを含むことを特徴とする吸着材。
  9. 請求項１に記載の吸着材において、
    前記低分子リガンドが抗体を吸着可能であることを特徴とする吸着材。
  10. 請求項１に記載の吸着材を充填したことを特徴とする精製装置。
  11. 標的物質を精製する精製方法であって、
    吸着材に標的物質を含む第１の溶液を接触させることにより前記標的物質を前記吸着材に吸着させる工程と、
    前記標的物質が吸着した前記吸着材に第２の溶液を接触させることにより前記標的物質を前記吸着材から脱着させる工程を含み、
    前記吸着材は低分子リガンドと極性補助基と担体を備え、
    前記低分子リガンドは溶液のｐＨ変化に基づきイオン化する官能基を備え、
    前記極性補助基は、前記低分子リガンドがイオン化状態で有する電荷と逆の電荷を有し得る状態にあり、
    前記低分子リガンドと前記極性補助基の平均距離が１０Å以上３０Å以下であり、
    前記第１の溶液のｐＨ値と前記第２の溶液のｐＨ値は異なることを特徴とする精製方法。
  12. 請求項１１に記載の精製方法であって、
    前記第１の溶液のｐＨ及び前記第２の溶液のｐＨは、４以上１０以下であることを特徴とする精製方法。
  13. 請求項１１または１２に記載の精製方法であって、
    前記標的物質が抗体であることを特徴とする精製方法。
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