JP6548063B2 - タンパク質、融合タンパク質の製造法及び精製法 - Google Patents

Description

本発明は、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット又はγのサブユニットに由来するペプチドを付加することにより、溶解性が改変された可溶性タンパク質の製造及び精製方法に関する。

従来、生物関連製品の主要部分であるタンパク質や酵素の製造は、それをコードする遺伝子が単離されている場合にはこれを大腸菌などの微生物に導入し、目的のタンパク質や酵素を発現／蓄積させるといった生物学的手法が利用されている。

しかしながら、異種タンパク質を微生物細胞内で発現／蓄積させた際に不成功に終わるケースも多い。その原因は生成効率を挙げようとした場合に特に顕著である。すなわち、生合成された異種タンパク質が微生物細胞内で不溶性封入体を形成し、不活性なタンパク質として蓄積する場合があり、活性を保持する目的のタンパク質や酵素を得ることができないという問題があった。

当該問題を解決すべく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが生産するＣｒｙタンパク質のＣ末端ペプチドを目的のタンパク質に付加し、この融合タンパク質を大腸菌などの微生物に生産させることによって、当該融合タンパク質は活性を保持したまま微生物細胞内で封入体として蓄積でき、また当該融合タンパク質をアルカリ性の水溶液（緩衝液）に可溶化させ、活性を保持したまま回収できることが報告されている（特許文献１）。

しかしながら、当該手法は融合タンパク質の可溶化のためにアルカリ性の水溶液を用いていることから、この処理の過程で不活化されるタンパク質が少なくない。

また別の方法として、親和性タグ（例えばヒスチジンタグ等）を目的のタンパク質に付加し、この融合タンパク質を大腸菌などの微生物に生産させ、そして当該融合タンパク質をアフィニティーカラムを用いて精製し、活性を保持したまま目的のタンパク質を回収する方法が報告されている（特許文献２）。

しかしながら、アフィニティーカラムは非常に高価であり、また該融合タンパク質のアフィニティーカラムへの吸着及びアフィニティーカラムからの溶出は長時間を要することから、当該手法は効率的な手法とはいえなかった。

したがって、当該分野においては依然として、目的のタンパク質や酵素を不活性化することなく、簡便かつ効率的に製造する方法が切望されている。

一方、腸内細菌がもつ、ジオールデヒドラターゼの遺伝子（非特許文献１）を大腸菌に大量発現させると、当該酵素は低溶解性でほとんどの酵素が活性を保持したまま沈殿画分中に存在・回収することが可能であるが、溶液に１％Ｂｒｉｊ３５を加えることにより当該酵素を可溶化できることが示されている（非特許文献２）。

このジオールデヒドラターゼの低溶解性という性質には、当該酵素を構成するα、β及びγのサブユニットのうち、βサブユニットのＮ末端２０アミノ酸残基とγサブユニットのＮ末端１６アミノ酸残基が必須であることが確認されている（非特許文献３）。

また、本発明者らはこれまでに、ジオールデヒドラターゼの等機能酵素で、ジオールデヒドラターゼと高いアミノ酸配列の相同性をもつ、高溶解性の酵素であるグリセロールデヒドラターゼについて、当該酵素を構成するα、β及びγのサブユニットのうち、βサブユニットのＮ末端とγサブユニットのＮ末端を、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基とγサブユニットのＮ末端３３アミノ酸残基でそれぞれ改変することによって、当該グリセロールデヒドラターゼを低溶解性化できることを確認し、報告している（特許文献３、非特許文献４）。

ＷＯ２０１０／０１３７８９ ＥＰ０２８２０４２ 特開２００６−２９６４２０号公報

Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７１４２−７１４８（１９９５） Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４７，１３２−１４０（１９９７） Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９，４５５−４６２（２００５） Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９１，１９９−２０６（２００９）

本発明は、組換えタンパク質を不活性化することなく、簡便かつ効率的に製造することが可能な手法を提供することを目的とする。

いくつかの可溶性タンパク質は塩析などによる沈殿化と可溶化を繰り返すことで容易に精製できることが知られているが、この手法は限られたタンパク質に対してのみ用いることができる手法である。この塩析などによる可溶性タンパク質の沈殿化は可溶性タンパク質の集合による巨大分子化によるものであることから、タンパク質が安定に存在できる中性域から弱アルカリ性の条件下で可溶性タンパク質の解離会合を制御する手段を開発すれば、可溶性タンパク質の集合を制御することで沈殿化と洗浄、可溶化という単純な操作で可溶性タンパク質を簡便かつ効率的に回収する手法を開発できると考え開発に取り組んだ。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する２０アミノ酸残基を少なくとも含むペプチドとジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の連続する１６アミノ酸残基を少なくとも含むペプチドからなる群から選択されるペプチド同士が会合する能力をもち、その会合の強さが塩濃度及び／又は中性域から弱アルカリ性のｐＨ値によって大きく変化することを見出した。さらに、それらを付加した可溶性タンパク質の解離会合も塩濃度及び／又は中性域から弱アルカリ性のｐＨ値によって制御できることを見出した。これらの発想と発見とを集約することにより、つまり、調節可能な会合力を有するこれらのペプチドを可溶性タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に付加することによって、当該タンパク質の水溶液に対する溶解性を、塩濃度及び／又は中性域から弱アルカリ性のｐＨ値によって調節することができ、これによって当該タンパク質を不活性化することなく、簡便かつ効率的に回収できる、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
[１] 組換えタンパク質の製造方法であって、
（ａ）調節可能な会合力を有するペプチドを可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
（ｂ）形質転換体を回収し、ペプチド領域同士が強い会合力を発揮する条件の水溶液中にて細胞を破砕し、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
（ｃ）該沈殿画分を、ペプチド領域同士が会合能を失うか又は会合力が弱くなる水溶液中に懸濁し、該融合タンパク質を抽出し、可溶性画分中にある該融合タンパク質を回収する工程、
を含む、上記方法。
［２］ 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、[１]の方法：
（ａ）ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも２０アミノ酸残基を含むペプチドとジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも１６アミノ酸残基を含むペプチドからなる群から選択されるペプチドが、可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
（ｂ）形質転換体を回収し、弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液中にて細胞を破砕し、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
（ｃ）該沈殿画分を中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液中に懸濁し、該融合タンパク質を抽出し、可溶性画分中にある該融合タンパク質を回収する工程。
[３] 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端又はＣ末端いずれか一方に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも２０アミノ酸残基を含むペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも１６アミノ酸残基を含むペプチドが付加されてなる、[１]又は[２]の方法。
[４] 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも２０アミノ酸残基を含むペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも１６アミノ酸残基を含むペプチドが付加され、ならびに該可溶性タンパク質のＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも２０アミノ酸残基を含むペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも１６アミノ酸残基を含むペプチドが付加されてなる、[１]又は[２]の方法。
[５] 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基を含むペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基を含むペプチドが付加され、ならびに該可溶性タンパク質のＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基を含むペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基を含むペプチドが付加されてなる、[４]の方法。
[６] 工程（ｂ）において、回収された形質転換体を、ｐＨ５〜ｐＨ８を有する塩の水溶液中にて細胞を破砕する、[２]〜[５]のいずれかの方法。
[７] 工程（ｂ）における塩の水溶液が５０〜３０００ｍＭの塩を含む、[２]〜[６]のいずれかの方法。
[８] 工程（ｃ）において、回収された沈殿画分体を、ｐＨ６〜ｐＨ１０を有する水溶液中に懸濁する、[２]〜[７]のいずれかの方法。
[９] 工程（ｃ）における水溶液が、０．１〜３００ｍＭの濃度にて塩を含む、[２]〜[８]のいずれかの方法。
[１０] 工程（ｃ）における水溶液が界面活性剤を含む、[２]〜[９]のいずれかの方法。

本発明によれば、組換えタンパク質を不活性化することなく、簡便かつ効率的に製造することが可能な手法を提供することができる。

図１は、（Ａ）Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したＩＣＤＨの発現ベクター［ｐＥＴ２１ｂ（Ｎｂ６０−ＩＣＤＨ−Ｎｂ６０）］、並びに（Ｂ）Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したＧＳＴの発現ベクター［ｐＮＥＸ（Ｎｂ６０−ＧＳＴ−Ｎｂ６０）］の模式図である。 図２は、大腸菌で大量発現させた大腸菌野生型イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）の、５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）中における可溶性及び不溶性の解析結果を示す写真図である。各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）。ＩＣＤＨのバンド位置を矢印で示す。 図３は、大腸菌で大量発現させた、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドが付加された大腸菌キメラＩＣＤＨの５０ｍＭリン酸カリ緩衝液中における可溶性及び不溶性の解析結果を示す写真図である。各レーンは、Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）である。（１）：リン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）中で細胞を破砕したもの、（２）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）中で細胞を破砕したもの、（３）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞を破砕したもの。大腸菌キメラＩＣＤＨのバンド位置を矢印で示す。 図４は、大腸菌で大量発現させた、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドが付加された大腸菌キメラＩＣＤＨの沈殿画分（不溶性画分）からの精製結果を示す写真図である。（Ａ）の各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）、ｗ１：洗浄画分１、ｗ２：洗浄画分２、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分。（Ｂ）の各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：５０ｍＭ炭酸カリ緩衝液（ｐＨ９．０）による抽出画分１、ｅｘ２：５０ｍＭ炭酸カリ緩衝液（ｐＨ９．０）による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分。（Ｃ）の各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）による抽出画分１、ｅｘ２：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分、矢印：大腸菌キメラＩＣＤＨのバンド位置をそれぞれ示す。 図５は、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドが付加された大腸菌キメラＩＣＤＨを大量発現させた大腸菌から調製した、洗浄後の沈殿画分（不溶性画分）から、１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）でキメラＩＣＤＨを抽出する時に使用する溶液の量の効果の解析結果を示す写真図である。各レーンは、Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）、ｗ１：洗浄画分１、ｗ２：洗浄画分２、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）による抽出画分１、ｅｘ２：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分である。（１）沈殿の３倍体積の緩衝液を用いて抽出、（２）沈殿の１４倍体積の緩衝液を用いて抽出、矢印：大腸菌キメラＩＣＤＨのバンドの位置を示す。 図６は、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドが付加された大腸菌キメラＩＣＤＨを大量発現させた大腸菌から調製した、洗浄後の沈殿画分（不溶性画分）からの抽出において、１％Ｂｒｉｊ３５による抽出促進効果の解析結果を示す写真図である。（Ａ）の各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）、ｗ１：洗浄画分１、ｗ２：洗浄画分２、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）／１％Ｂｒｉｊ３５による抽出画分１、ｅｘ２：１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）／１％Ｂｒｉｊ３５による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分。（Ｂ）の各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）による抽出画分１、ｅｘ２：１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分。 図７は、大腸菌で大量発現させた野生型グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）の５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）中における可溶性及び不溶性の解析結果を示す写真図である。各レーンは左より順に以下のとおりである。Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）。タンパク質分子量マーカーのサイズと位置をゲルの左に示す。ＧＳＴのバンド位置を矢印で示す。 図８は、大腸菌で大量発現させた、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドを有するキメラＧＳＴ酵素の各５０ｍＭ緩衝液中における可溶性及び不溶性の解析結果を示す写真図である。（１）：リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）中で細胞を破砕したもの、（２）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）中で細胞を破砕したもの、（３）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞を破砕したもの。各レーンは、Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）である。矢印はキメラＧＳＴ酵素のバンド位置を示す。 図９は、大腸菌で大量発現させた、Ｎ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドを有し、かつＣ末端にジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドを有するキメラＧＳＴ酵素の各５０ｍＭ緩衝液中における可溶性及び不溶性の解析結果を示す写真図である。（１）：リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）中で細胞を破砕したもの、（２）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）中で細胞を破砕したもの、（３）リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞を破砕したもの。各レーンは、Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）である。矢印はキメラＧＳＴ酵素のバンド位置を示す。 図１０は、大腸菌で大量発現させた、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドを有するキメラＧＳＴの沈殿画分（不溶性画分）からの精製結果を示す写真図である。各レーンは以下のとおりである。Ｍ：タンパク質分子量マーカー（サイズをゲルの左に記す）、Ｈ：細胞破砕液、Ｓ：上清画分（可溶性画分）、Ｐ：沈殿画分（不溶性画分）、ｗ１：洗浄画分１、ｗ２：洗浄画分２、Ｗ−Ｐ：洗浄後の沈殿画分、ｅｘ１：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液による抽出画分１、ｅｘ２：１０ｍＭリン酸カリ緩衝液による抽出画分２、Ｅｘ−Ｐ：抽出後に残った沈殿画分。（１）ｐＨ８．０の緩衝液で抽出したもの、（２）ｐＨ７．０の緩衝液で抽出したもの。矢印はキメラＧＳＴ酵素のバンド位置を示す。

本発明は、組換えタンパク質である可溶性タンパク質の効率的な製造方法に関するものであって、調節可能な自己会合力を有するペプチドが可溶性タンパク質に付加されてなる融合タンパク質を、ペプチドの自己会合力を調節して、沈殿化及び可溶化して回収することを含む。

本発明は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）調節可能な会合力を有するペプチドを可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
（ｂ）形質転換体を回収し、ペプチド領域同士が強い会合力を発揮する条件の水溶液中にて細胞を破砕し、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
（ｃ）該沈殿画分を、ペプチド領域同士が会合能を失うか又は会合力が弱くなる水溶液中に懸濁し、該融合タンパク質を抽出し、可溶性画分中にある該融合タンパク質を回収する工程。

一実施形態において、本発明は以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも２０アミノ酸残基を含むペプチドとジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の連続する少なくとも１６アミノ酸残基を含むペプチドからなる群から選択されるペプチドが、可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
（ｂ）形質転換体を回収し、弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液中にて細胞を破砕し、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
（ｃ）該沈殿画分を中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液中に懸濁し、該融合タンパク質を抽出し、可溶性画分中にある該融合タンパク質を回収する工程。

本発明において「可溶性タンパク質」とは、水溶性又は親水性のタンパク質であればよく、特に限定はされず、いずれの可溶性タンパク質であってもよい。また、可溶性タンパク質には、水溶性又は親水性のタンパク質である限り、一以上のタンパク質及び／又はペプチドをさらに含むキメラタンパク質も含まれる。本発明における「可溶性タンパク質」としては、好ましくは２量体以上のタンパク質、より好ましくは少なくともホモ２量体以上のタンパク質を構成する単量体を利用することができる。単量体が多量体化することによって、付加されたジオールデヒドラターゼのβサブユニット又はγサブユニットに由来するペプチドの効果が高まり、当該タンパク質の回収がより容易となる。本発明において利用可能な「可溶性タンパク質」としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、ラクターゼ、Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素（芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素や分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を含む）、Ｄ−アミノ酸アミノ基転移酵素、カテコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、β−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、デアミダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、リパーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、α−グルコシダーゼ、α‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、フィターゼ、パーオキシダーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、アスパルターゼ、グルタミン（アスパラギン）合成酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、トリプトファナーゼ、シスラインデスルフヒドラーゼ、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、トリプトファン合成酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、αガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、グルタミナーゼ等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明において、「調節可能な自己会合力を有するペプチド」としては、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットに由来するペプチドが挙げられる。

本発明において、「ジオールデヒドラターゼ」とは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、１，２−ジオールを脱水して対応するアルデヒド及び水へ変換する反応を、アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）依存的に触媒する活性を有する酵素である。ジオールデヒドラターゼは、６０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び１９ｋＤａの３つのサブユニット（それぞれαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニット）を含む。ジオールデヒドラターゼにおいては、α、β、γサブユニットと補酵素が会合することにより、酵素活性が発揮される。

ジオールデヒドラターゼは、上記酵素活性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属及びＬｉｓｔｅｒｉａ属等に属する細菌に由来するものが挙げられる。

本発明においては、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットに由来するペプチドを、上記可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加することによって、可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させることができる。

ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットのアミノ酸配列及び各サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｄ４５０７１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。例えば、本発明において、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、また、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものを利用することができる。

ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドは、ジオールデヒドラターゼの低溶解性に関与することが公知である（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９，４５５−４６２（２００５））、そのＮ末より連続する少なくとも２０個のアミノ酸残基を含んでいればよく、当該ペプチドの大きさはアミノ酸残基の数にして２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、５５個以上、６０個以上、６５個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、又はそれ以上の範囲より適宜選択することができる。

好ましくは本発明において、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１〜２５番目、１〜３０番目、１〜４０番目、１〜５０番目、１〜６０番目、１〜７０番目、１〜８０番目、１〜９０番目、又は１〜１００番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、特に好ましくは１〜６０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号３）からなる。また、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドには、これらの特定のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドや、前述の特定のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドも含まれる。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

ジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドは、ジオールデヒドラターゼの低溶解性に関与することが公知である（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ Ｔら、前出）、そのＮ末より連続する少なくとも１６個のアミノ酸残基を含んでいればよく、当該ペプチドの大きさはアミノ酸残基の数にして２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、５５個以上、６０個以上、６５個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、又はそれ以上の範囲より適宜選択することができる。

好ましくは本発明において、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜２０番目、１〜２５番目、１〜３０番目、１〜４０番目、１〜５０番目、１〜６０番目、１〜７０番目、１〜８０番目、１〜９０番目、又は１〜１００番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、特に好ましくは１〜６０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号４）からなる。また、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドには、これらの特定のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドや、前述の特定のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドも含まれる。

本発明における融合タンパク質は、可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に、上記ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチド及びγサブユニットに由来するペプチドより選択されるペプチドが付加されてなる。Ｎ末端及びＣ末端に付加されるペプチドの種類（由来、長さ、配列等）はそれぞれ独立して選択することができ、例えば、Ｎ末端及びＣ末端が共にβサブユニット（又はγサブユニット）に由来するペプチドであってもよいし、Ｎ末端はβサブユニットに由来するペプチドであり、かつＣ末端はγサブユニットに由来するペプチドであってもよいし、Ｎ末端はγサブユニットに由来するペプチドであり、かつＣ末端はβサブユニットに由来するペプチドであってもよく、また、Ｎ末端及びＣ末端に付加されるペプチドの長さや配列はそれぞれ独立して選択することができ、同一であってもよいし、異なっていてもよい。好ましくは、本発明における融合タンパク質は、Ｎ末端にβサブユニットに由来するペプチド又はγサブユニットに由来するペプチドを、かつＣ末端にβサブユニットに由来するペプチド又はγサブユニットに由来するペプチドをそれぞれ有し、より好ましくは、Ｎ末端にβサブユニットに由来するペプチドを、かつＣ末端にβサブユニットに由来するペプチドをそれぞれ有する。

本発明における融合タンパク質は、一般的な遺伝子組み換え手法を用いて製造することができる。すなわち、可溶性タンパク質をコードする遺伝子のＮ末側及びＣ末側のそれぞれ又はいずれか一方に、ジオールデヒドラターゼの上記サブユニット由来のペプチドをコードする遺伝子を連結してなる、融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを作製し、これを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して当該融合タンパク質を発現させることによって行うことができる。

融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。例えば、可溶性タンパク質及び、ジオールデヒドラターゼを発現することが公知である細胞や細菌より、例えばＭａｒｍｕｒ法（Ｍａｒｍｕｒ Ｊ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２０８−２１８（１９６１））により全ＤＮＡを抽出する。公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセスすることによって入手可能である可溶性タンパク質、ジオールデヒドラターゼのサブユニットの公知塩基配列を基にプライマーを設計し、上記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、可溶性タンパク質をコードする遺伝子、ジオールデヒドラターゼの上記サブユニット由来のペプチドをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることができる。

例えば、本発明において、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列からなり、また、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号６で表される塩基酸配列からなるものを利用することができる。

好ましくは本発明において、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドをコードする遺伝子は、当該ペプチドのＮ末から１〜２５番目、１〜３０番目、１〜４０番目、１〜５０番目、１〜６０番目、１〜７０番目、１〜８０番目、１〜９０番目、又は１〜１００番目のアミノ酸残基からなるペプチドをコードする塩基配列を含み、特に好ましくは１〜６０番目のアミノ酸残基からなるペプチドをコードする塩基配列（配列番号７）からなる。また、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドをコードする遺伝子には、可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドをコードする限り、前述の特定の塩基配列において１〜２０個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有するものや、前述の特定の塩基配列の全部もしくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するものや、前述の特定の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性する塩基配列を有するものも含まれる。

また、好ましくは本発明において、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドをコードする遺伝子は、当該ペプチドのＮ末から１〜２０番目、１〜２５番目、１〜３０番目、１〜４０番目、１〜５０番目、１〜６０番目、１〜７０番目、１〜８０番目、１〜９０番目、又は１〜１００番目のアミノ酸残基からなるペプチドをコードする塩基配列を含み、特に好ましくは１〜６０番目のアミノ酸残基からなるペプチドをコードする塩基配列（配列番号８）からなる。さらに、また、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットに由来するペプチドをコードする遺伝子には、可溶性タンパク質の弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液に対する溶解性を低減させる機能を有するポリペプチドをコードする限り、前述の特定の塩基配列において１〜２０個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有するものや、前述の特定の塩基配列の全部もしくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するものや、前述の特定の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性する塩基配列を有するものも含まれる。

なお、ここで塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも７５塩基、より好ましくは少なくとも１００塩基の配列である。また、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各塩基配列に対し高い配列同一性（８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて、具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。また、塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、上記ＢＬＡＳＴ等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

可溶性タンパク質をコードする遺伝子と、ジオールデヒドラターゼの上記サブユニット由来のペプチドをコードする遺伝子を所定の順序で連結することによって、融合タンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。各遺伝子は隣接する遺伝子と直接連結してもよいし、リンカーをコードする遺伝子を介して、間接的に連結してもよい。リンカーは、トロンビンやファクターＸａ等のプロテアーゼによって認識・切断され得る配列を有するものが好ましい。このようなリンカーを含めることによって、得られた融合タンパク質より、必要に応じて、ジオールデヒドラターゼのサブユニットに由来するペプチドを除去することができる。

融合タンパク質をコードする遺伝子は、宿主に適合性を有する適当な発現ベクターに、プロモーター及び／又はその他の制御配列と機能し得るかたちで連結して挿入する。ここで「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該発現ベクターが導入された細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御の下、融合タンパク質が発現されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。

発現ベクターは、宿主に適合性を有するものであればよく特に限定はされないが、例えば大腸菌での発現を目的とした場合は、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３，１９８８）、又はＴ７プロモーター等を有するベクターを例示することができ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン）、ｐＥＧＦＰ、及びｐＥＴ等が挙げられる。また、発現ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。

他のベクターとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（ライフテクノロジーズ）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８（１７）：５３２２，１９９０）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（ライフテクノロジーズ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられる。

ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８，１９７９）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１プロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２，１９９０）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。また、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）等も利用することができる。

また、発現ベクターには複製開始点として、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のために、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

発現ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、例えば大腸菌や種々の真核細胞等を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９１：３５８−３４０，１９８１）、あるいは昆虫細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が挙げられる。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０：１２７５，１９６８）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。植物細胞としては、例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。原核細胞を使用する場合、細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１等が挙げられ、その他、枯草菌等が挙げられる。

宿主への発現ベクターの導入（形質転換）は公知の一般的な手法により行うことができ、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：１３１１−１３２６，１９８７）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２，１９８７）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：５７０７−５７１７，１９８４、Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１６４２−１６４３，１９８５）、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム）を用いた方法、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７：１０２５−１０３７，１９９４、Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ５：２２−３０，１９９３、Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：２３０−２３４，１９９３）、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法等により等の方法を用いることができる。

得られた形質転換体は、宿主の培養に適した培地（例えば、ｐＨは５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５）中にて、例えば、温度は約１０〜約８０℃、好ましくは約１５〜約５０℃、さらに好ましくは約３０℃〜約４０℃にて、５分〜９６時間、好ましくは１０分〜７２時間、培養することができる。必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えてもよい。

培養終了後、形質転換体を弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する適当な塩の水溶液に懸濁させて充分破砕した後、懸濁液を遠心分離し、融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する。

「塩」としては、例えば、陽イオンがアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）、アンモニウム等であり、陰イオンが硫酸イオン、リン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、炭酸イオン、塩化イオン、硝酸イオン、等である塩が挙げられ、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する「塩の水溶液」としては、上記塩を含む水溶液であればよく特に限定されないが、例えば、緩衝液として用いられる、リン酸塩緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液）、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フタル酸緩衝液、フマル酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリセロールリン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏ−ｔｒｉｓ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、等も利用することができる。塩の水溶液のｐＨ値は、弱酸性〜中性域であればよく、好ましくは中性域より選択することができ、例えば、ｐＨ３．０〜８．０、好ましくは５．０〜８．０、さらに好ましくは６．５〜８．０の範囲より選択することができる（４℃における測定値）。塩の水溶液のｐＨ値をこれらの範囲とすることによって、融合タンパク質の水溶液中への溶解を低減することができる。塩の水溶液のｐＨ値は、融合タンパク質の大部分（例えば、懸濁液中の融合タンパク質の総量の５割を超える量、６割以上、７割以上、８割以上、９割以上、又はそれ以上の量）が沈殿画分中に得られる値を選択することができる。

また、水溶液の塩の濃度は、例えば、５０ｍＭ〜５０００ｍＭ、好ましくは、５０〜３０００ｍＭ、さらに好ましくは５０ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲より選択することができる。弱酸性〜中性域の塩の水溶液の塩濃度を高めることによって、融合タンパク質が沈殿画分中に得られる量を増すことができる。水溶液の塩濃度は、融合タンパク質の大部分（例えば、懸濁液中の融合タンパク質の総量の５割を超える量、６割以上、７割以上、８割以上、９割以上、又はそれ以上の量）が沈殿画分中に得られる値を選択することができる。

形質転換体の破砕は、一般的な細胞破砕方法を用いることができ、例えば、超音波、フレンチプレス、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ等を用いた処理方法を利用することができる。

弱酸性〜中性域のｐＨ値を有する塩の水溶液中にて破砕した形質転換体を含む懸濁液を遠心分離することによって、水溶液中への溶解性が低い融合タンパク質を沈殿画分中に回収することができると共に、この操作により可溶性成分（夾雑物）は除去することができる。必要に応じて、得られた沈殿画分を、再び同じ水溶液中に懸濁して遠心分離し、沈殿画分を回収する操作（洗浄操作）を一又は複数回行ってもよい。

次いで、得られた沈殿画分を、中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液に懸濁し、融合タンパク質を可溶化・抽出した後、懸濁液を遠心分離し、融合タンパク質を含む可溶性画分（上清画分）を回収する。

ここで中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する「水溶液」としては、タンパク質精製に一般にもちいられる水系の緩衝液であればよく特に限定はされない。また、適当な濃度の塩を含んでいても良い。中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液としては、例えば、炭酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、グリセロールリン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、等を利用することができる。

水溶液のｐＨ値は、中性域〜弱アルカリ性であればよく、例えば、６．０〜１０．０、さらに好ましくは７．０〜９．０の範囲より選択することができる。水溶液のｐＨ値を大きくすることによって、融合タンパク質の水溶液中への溶解性を高めることができる。水溶液のｐＨ値は、融合タンパク質の大部分（例えば、懸濁液中の融合タンパク質の総量の５割を超える量、６割以上、７割以上、８割以上、９割以上、又はそれ以上の量）が可溶性画分（上清画分）中に得られる値を選択することができる。

また、中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液の塩濃度は、低塩濃度が好ましく、例えば、０．１〜３００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲より選択される濃度とすることができる。水溶液の塩濃度を低く設定することによって、融合タンパク質が可溶性画分（上清画分）中に得られる量を増すことができる。

中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液の用量は、融合タンパク質を十分に溶解できる量であればよく、特に限定はされないが、得られた沈殿画分の体積の１倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、１０倍以上、１２倍以上、１４倍以上、１６倍以上、１８倍以上、又はそれ以上とすることができる。

また中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液にはさらに界面活性剤を加えることができる。界面活性剤を加えるによって、融合タンパク質が可溶性画分（上清画分）中に得られる量を増すことができる。界面活性剤としては、例えば、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウム等のステロイド骨格を有する界面活性剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）等の両性界面活性剤を利用することができる。界面活性剤は水溶液に対して、例えば、０．２重量％〜３重量％、好ましくは０．５重量％〜１重量％の範囲より選択する量にて添加することができる。

中性域〜弱アルカリ性のｐＨ値を有する水溶液中に融合タンパク質を懸濁し、遠心分離して可溶性画分（上清画分）を回収することによって、当該水溶液中への溶解性を有する融合タンパク質を可溶性画分（上清画分）中に回収することができると共に、この操作により非可溶性成分（夾雑物）は除去することができる。

得られた可溶性画分（上清画分）より融合タンパク質を、タンパク質の精製で一般的に使用されている手法を用いて、さらに精製することができる。精製方法としては、特に限定されることなく、例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて用いることができる。クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を利用することができる。

また、得られた融合タンパク質は、必要に応じて、可溶性タンパク質以外の領域、すなわち、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットに由来するペプチドを、除去してもよい。

一実施形態において、本願発明は以下の工程を含むことができる：
（ａ）可溶性タンパク質のＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の６０アミノ酸残基を含むペプチドもしくはジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の６０アミノ酸残基を含むペプチドが付加され、かつ該可溶性タンパク質のＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の６０アミノ酸残基を含むペプチドもしくはジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の６０アミノ酸残基を含むペプチドがそれぞれ付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
（ｂ）形質転換体を回収し、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜８．０を有する塩の水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液）中にて細胞を破砕し得られた懸濁液を遠心分離して、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
（ｃ）該沈殿画分をｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０を有する低塩濃度の水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液）中に懸濁し、該融合タンパク質を水溶液中に可溶化・抽出し、遠心分離して、該融合タンパク質を含む可溶性画分を回収する工程、
を含む、上記方法。ここで、工程（ｂ）において、塩の水溶液は、塩濃度を５０ｍＭ〜３０００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１５００ｍＭとすることができる。また、工程（ｃ）において、水溶液は、塩濃度を０．１ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭとすることができ、及び／又は、界面活性剤を含めることができる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

大腸菌イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）とグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）は可溶性酵素である。特に、ＧＳＴは溶解性の低いタンパク質に結合させることによって、当該タンパク質を可溶性画分に存在させることを可能とする高溶解性タグタンパク質の一つである。以下の実験においては、ＩＣＤＨ及びＧＳＴを可溶性タンパク質のモデルとして使用し、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットやγサブユニットのＮ末端の６０アミノ酸残基からなるペプチドを付加することによる、タンパク質／酵素の低溶解性化の効果を評価した。

実施例１：大腸菌ＩＣＤＨの低溶解性化
大腸菌Ｋ１２株ＭＣ１６５５株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲによりＩＣＤＨ遺伝子のタンパク質コーディング領域を増幅した。得られた遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩサイトをＢｇｌＩＩに変換し、このベクター（ｐＥＴ２１ＢｄＢ）のＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩサイトに導入し、発現ベクターｐＥＴ２１ＢｄＢ（ＩＣＤＨ）を構築した。

次に、このｐＥＴ２１ＢｄＢ（ＩＣＤＨ）ＩＣＤＨを鋳型として、ＰＣＲにより終止コドンをもたないＩＣＤＨ遺伝子のタンパク質コーディング領域を増幅した。得られた遺伝子をｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入した後、更にＩＣＤＨのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイト間とＮｄｅＩサイトとにジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドをコードするＤＮＡ断片をそれぞれ挿入することで、Ｎ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合し、更にＩＣＤＨのＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＩＣＤＨをコードするＤＮＡを含み、当該キメラＩＣＤＨを発現する発現ベクターｐＥＴ２１ｂ（Ｎｂ６０−ＩＣＤＨ−Ｎｂ６０）を構築した（図１（Ａ））。

得られた発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＬＢ培地にて３０℃で振盪培養し、対数増殖期後期に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して６時間振盪培養して、キメラＩＣＤＨの発現を誘導した。

次いで、得られた培養液を遠心分離して菌体を分離し、２倍体積の５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ＫＰＢ）を加えた後に超音波処理で細胞を破砕した。その細胞破砕液を遠心分離して、得られた上清画分（可溶性画分）と沈殿画分（不溶性画分）とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、ＩＣＤＨのバンドの濃さより、上清画分及び沈殿画分におけるＩＣＤＨの分布を確認した。対照には、Ｎ末端及びＣ末端のいずれにも、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットが融合されていない野生型大腸菌ＩＣＤＨをコードするＤＮＡを含み、当該野生型ＩＣＤＨを発現する発現ベクターであるｐＥＴ２１ＢｄＢ（ＩＣＤＨ）を用いた。

野生型大腸菌ＩＣＤＨを大量発現させた組換え体大腸菌の培養液を上記のとおり、５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して細胞破砕して遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離しＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動したところ、発現させたほとんどの野生型ＩＣＤＨが上清画分（可溶性画分）に存在することが確認された（図２、レーンＳ）。

これに対して、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＩＣＤＨを大量発現させた大腸菌の培養液を、以下の（１）〜（３）のいずれかの緩衝液に懸濁して細胞破砕し、遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離して１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した：（１）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）、（２）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）、（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ。

結果、いずれの緩衝液を用いた場合においても、ほとんどのキメラＩＣＤＨが沈殿画分に存在していた（図３）。それらの中でも特に、（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞破砕した場合に最も多くのキメラＩＣＤＨ酵素が沈殿画分に確認された（図３、（３）のレーン沈殿画分Ｐ）。これらの結果は、可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドを付加することによって、当該タンパク質を低溶解性化できること、また低溶解性化の程度は用いる緩衝液のｐＨ値や塩濃度によって調整できることを示す。

実施例２：大腸菌ＩＣＤＨの簡便な精製
次に、上記のとおり、培養液を５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ＫＰＢ）／３００ｍＭ ＫＣｌに懸濁して細胞破砕し、遠心分離して得られた沈殿画分からのキメラＩＣＤＨの可溶化・抽出と精製を試みた。

まず、上記のとおり、培養液について細胞破砕し、遠心分離して得られたキメラＩＣＤＨを含む沈殿画分を５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液を用いて２回洗浄した。この洗浄画分には少量のキメラＩＣＤＨが検出されたが（図４（Ａ）、レーンｗ１（洗浄画分１），ｗ２（洗浄画分２））、ほとんどは沈殿画分に存在した（図４（Ａ）、レーンＷ−Ｐ（洗浄後沈殿画分））。

この沈殿画分を、以下の（１）、（２）のいずれかの緩衝液（沈殿の３倍体積）に懸濁し、遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離して１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した：
（１）５０ｍＭ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、（２）１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）。

結果、（１）、（２）のいずれの緩衝液を用いた場合においても、上清画分中にほとんどのキメラＩＣＤＨ酵素を可溶化・抽出することができ（図４（Ｂ），（Ｃ）のレーンｅｘ１（抽出画分１）及びｅｘ２（抽出画分２））、沈殿画分中に含まれるキメラＩＣＤＨ酵素は大きく減少した（図４（Ｂ），（Ｃ）のレーンＥｘ−Ｐ（抽出後の沈殿画分））。

次に、沈殿画分に存在するキメラＩＣＤＨが生物活性を保持するか否かを確認した。ＩＣＤＨ活性の測定は公知の手法（Ｓｔｏｋｋｅら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ １１，４８１−４９３，２００７）に従って、ＮＡＤＰ^＋とＤ−イソクエン酸とを用いて行った。細胞破砕及び洗浄を５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌにて行った場合、沈殿画分にて検出されるＩＣＤＨ活性は全体（上清画分＋沈殿画分）の７０％であった。この沈殿画分から２回の１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）にて抽出・回収された酵素は全体の５６％であった。また、抽出後の沈殿画分には全体の１％以下のＩＣＤＨ活性しか認められなかった。

次に、同様に調製した洗浄後の沈殿画分（図５、レーンＷ−Ｐ）を以下の（１）、（２）のいずれかの量の１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離して１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した：
（１）沈殿の３倍体積、（２）沈殿の１４倍体積。

結果、（１）、（２）のいずれの緩衝液を用いた場合においても、上清画分中にほとんどのキメラＩＣＤＨ酵素が可溶化・抽出することができ（図５（１），（２）のレーンｅｘ１（抽出画分１）及びｅｘ２（抽出画分２））、沈殿画分中に含まれるキメラＩＣＤＨ酵素は大きく減少した（図５（１），（２）のレーンＥｘ−Ｐ（抽出後の沈殿画分））。特に、抽出に用いる溶液量を増やすと回収率が向上することが示された。

次に、１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）にて抽出された酵素活性を測定することで酵素の回収率を求めた。沈殿の３倍体積の１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合の回収率は６３％、沈殿の１４倍体積の１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合の回収率は７１％であった。

これらの結果より、Ｎ末端及びＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドを付加することによって、低溶解性化された可溶性タンパク質は、中性域〜弱アルカリ性条件（ｐＨ７〜９程度）下にて、及びさらに低塩濃度下にて、可溶化・抽出することが可能であることが示された。

実施例３：大腸菌ＩＣＤＨの可溶化に対するＢｒｉｊ３５の効果
次に、同様に調製した洗浄後の沈殿画分（図６、レーンＷ−Ｐ）からのキメラＩＣＤＨの可溶化をＢｒｉｊ３５が促進するかを見た。

まず、上記のとおり、培養液について細胞破砕し、遠心分離して得られたキメラＩＣＤＨを含む沈殿画分を５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液を用いて２回洗浄した。得られた沈殿画分を、以下の（１）、（２）のいずれかの緩衝液（４倍体積）に懸濁し、遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離して１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した：
（１）１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８）／１％ Ｂｒｉｊ３５、（２）１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８）。

結果、沈殿画分から可溶性画分に抽出できたタンパク質（図６レーンｅｘ１（抽出画分１）及びｅｘ２（抽出画分２））の量を比較すると、（１）の１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８）／１％ Ｂｒｉｊ３５を用いた場合の方が（２）の１００ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８）のみの場合に比べてより多くのキメラＩＣＤＨが可溶性画分に得られた。この結果より、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチドをＮ末端及びＣ末端に付加することによって低溶解性化された可溶性タンパク質は、Ｂｒｉｊ３５の添加により溶解性が増加することが示された。

実施例４：グルタチオン−Ｓ−転移酵素の低溶解性化
グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）の公知の発現ベクターであるｐＮＥＸ（特開２００６−２９６４２０号公報）を用いて、グルタチオン−Ｓ−転移酵素のＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合し、更にグルタチオン−Ｓ−転移酵素のＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチド又はジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＧＳＴをコードするＤＮＡを含み、当該キメラＧＳＴを発現する発現プラスミドｐＮＥＸ（Ｎｂ６０−ＧＳＴ−Ｎｂ６０）（図１（Ｂ））及びｐＮＥＸ（Ｎｂ６０−ＧＳＴ−Ｎｇ６０）を構築した。

得られた発現ベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ培地にて３０℃で振盪培養し、対数増殖期後期に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して６時間振盪培養して、キメラＧＳＴの発現を誘導した。

次いで、得られた培養液を遠心分離することで菌体を分離し、２倍体積の５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ＫＰＢ）を加えた後に超音波処理で細胞を破砕した。その細胞破砕液を遠心分離して、得られた上清画分（可溶性画分）と沈殿画分（不溶性画分）とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、キメラＧＳＴのバンドの濃さより、上清画分及び沈殿画分における当該キメラＧＳＴの分布を確認した。対照には、Ｎ末端及びＣ末端のいずれにも、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットが融合されていない野生型ＧＳＴをコードするＤＮＡを含み、当該野生型ＧＳＴを発現する発現ベクターであるｐＮＥＸを用いた。

野生型ＧＳＴを大量発現させた組換え体大腸菌の培養液を上記のとおり、５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して細胞破砕して遠心分離を行い上清画分と沈殿画分に分離し１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動したところ、発現させたほとんどの野生型ＧＳＴが可溶性画分に存在していた（図７、レーンＳ）。

また、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＧＳＴについても、当該キメラＧＳＴを大量発現させた組換え体大腸菌を細胞破砕する際に加えた緩衝液（５０ｍＭリン酸カリ緩衝液）のｐＨが８．０であると、キメラＧＳＴの多くが可溶性画分に存在することが確認された。

そこで、細胞破砕する際に加える緩衝液緩衝液のｐＨをより酸性側にしたもの、すなわち（１）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）、（２）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）、あるいは、緩衝液の塩濃度を更にあげたもの、すなわち（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌに代えて同様の操作を行った。

結果、いずれの条件でも多くのキメラＧＳＴが沈殿画分において検出された（図８、レーンＳ）。それらの中でも特に、（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞破砕した場合に最も多くのキメラＧＳＴ酵素が沈殿画分に確認された（図８、（３）のレーンＰ）。

次に、沈殿画分に存在するキメラＧＳＴが生物活性を保持するか否かを確認した。ＧＳＴ活性の測定は公知の手法（Ｈａｂｉｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２：３９８−４０５,１９８１）に従って、還元型グルタチオンと１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（１−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ；ＣＤＮＢ）とを用いて行った。

結果、上清画分だけでなく沈殿画分においてもＧＳＴ活性が検出され、当該活性は電気泳動で見られたバンドの濃さに相関することが確認された。細胞破砕する際に加える緩衝液を（１）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）、（２）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）、又は（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌにした場合、沈殿画分にて検出されるＧＳＴ活性は全体（上清画分＋沈殿画分）の、６９％、７１％、及び９３％となり、（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞破砕した場合に最も多くのＧＳＴ活性が沈殿画分に確認された。

一方、Ｎ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合し、Ｃ末端側にジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＧＳＴについては、当該キメラＧＳＴを大量発現させた組換え体大腸菌を細胞破砕する際に加えた緩衝液（５０ｍＭリン酸カリ緩衝液）のｐＨが８．０であると、キメラＧＳＴの多くが可溶性画分に存在することが確認された。

そこで、細胞破砕する際に加える緩衝液のｐＨをより酸性側にしたもの、すなわち（１）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）、（２）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）、あるいは、緩衝液の塩濃度を更にあげたもの、すなわち（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌに代えて同様の操作を行った。

結果、いずれの条件でも多くのキメラＧＳＴが沈殿画分において検出された（図９、レーンＰ）。それらの中でも特に、（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞破砕した場合に最も多くのキメラＧＳＴ酵素が沈殿画分に確認された（図９、（３）のレーンＰ）。

次いで、上記と同様に上清画分と沈殿画分に存在するＧＳＴ活性を測定したところ、細胞破砕に用いる緩衝液を（１）５０ｍＭ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）、（２）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．５）、又は（３）５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌにした場合、沈殿画分にて検出されるＧＳＴ活性は全体（上清画分＋沈殿画分）の、６１％、６０％、及び７０％となり、（３）５０ｍＭ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で細胞破砕した場合に最も多くのＧＳＴ活性が沈殿画分に確認された。

これらの結果は、高可溶性タンパク質であるＧＳＴであってもそのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニット由来のペプチド、及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβ又はγサブユニット由来のペプチドを付加することによって、当該タンパク質を低溶解性化できること、またその低溶解性化の程度は用いる緩衝液のｐＨ値や塩濃度によって調整できることを示す。また、低溶解性化されたタンパク質であっても、生物活性を保持していることが示された。

実施例５：グルタチオン−Ｓ−転移酵素の簡便な精製
上記のとおり、Ｎ末端及びＣ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端６０アミノ酸残基からなるペプチドを融合したキメラＧＳＴ酵素を大量発現させた大腸菌を、５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液中にて細胞破砕し、遠心分離して得られた沈殿画分より、キメラＧＳＴ酵素の精製と可溶化を試みた。

まず、得られた沈殿画分を５０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ ＫＣｌ溶液を用いて２回洗浄し、可溶性の不純物を取り除いた。この洗浄画分には少量のキメラＧＳＴ酵素が検出されたものの（図１０のレーンｗ１及びｗ２）、ほとんどのキメラＧＳＴ酵素は沈殿画分中にて回収できた。

次にこの沈殿画分をｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に懸濁・抽出したところと、ほとんどのキメラＧＳＴ酵素が可溶化して、単一バンドとして抽出・精製することができた（図１０（１）のレーンｅｘ１及びｅｘ２）。

更に、上記沈殿画分を１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁・抽出した場合、遠心沈殿画分（不溶性画分）に存在していたキメラＧＳＴ酵素のほとんどが高純度に可溶化して抽出されることが確認できた（（図１０（２）のｅｘ１とｅｘ２）。

次に、抽出された酵素活性を測定することで酵素の回収率を求めた。１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた場合の回収率は５３％、１０ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合の回収率は５５％であった。

これらの結果より、Ｎ末端及びＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのサブユニット由来のペプチドを付加することによって、低溶解性化された可溶性タンパク質は、中性域〜弱アルカリ性条件下にて、及びさらに低塩濃度下にて、可溶化・抽出することが可能であることが示された。

Claims (6)

1. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、組換えタンパク質の製造方法：
   （ａ）ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する２０アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチドとジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の連続する１６アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチドからなる群から選択されるペプチドが、可溶性タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれか一方に付加されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む形質転換体を培養する工程、
   （ｂ）形質転換体を回収し、ｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ値を有する塩の水溶液中にて細胞を破砕し、該融合タンパク質を含む沈殿画分を回収する工程、ならびに、
   （ｃ）該沈殿画分をｐＨ７〜ｐＨ９のｐＨ値を有する０．１〜３００ｍＭの範囲より選択される塩濃度の水溶液中に懸濁し、該融合タンパク質を抽出し、可溶性画分中にある該融合タンパク質を回収する工程。
2. 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端又はＣ末端いずれか一方に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する２０アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する１６アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチドが付加されてなる、請求項１に記載の方法。
3. 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する２０アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する１６アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチドが付加され、ならびに該可溶性タンパク質のＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する２０アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する１６アミノ酸残基以上全長以下からなるペプチドが付加されてなる、請求項１に記載の方法。
4. 融合タンパク質が、可溶性タンパク質のＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基からなるペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基からなるペプチドが付加され、ならびに該可溶性タンパク質のＣ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基からなるペプチド又はγサブユニットのＮ末端の連続する６０アミノ酸残基からなるペプチドが付加されてなる、請求項３に記載の方法。
5. 工程（ｂ）における塩の水溶液が５０〜３０００ｍＭの塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程（ｃ）における水溶液が界面活性剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

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