JP6532112B2 - コラーゲン生体材料 - Google Patents
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Description
(i)モノマーコラーゲンの溶液、(ii)ポリマーコラーゲンの溶液、(ii)カーゴ粒子及び(iv)非コラーゲン遮断ポリマーを混和させてコラーゲン溶液を得ることと、
コラーゲン溶液を凝固させてコラーゲンヒドロゲルを得ることと、
を含む、方法を提供する。
コラーゲンヒドロゲル中の液体の量を低減させて圧縮コラーゲン生体材料を得ること、
を更に含んでいてもよい。
(i)例えばエチレンジアミン四酢酸(例えば0.5M EDTA)を用いた処理によってコラーゲン組織のサンプルからカルシウムを枯渇させることと、
(ii)カルシウムを枯渇させた組織サンプルを0.5M酢酸等の酸溶液中に分散させて組織懸濁液を得ることと、
(iii)組織懸濁液を例えばNaOHで中和して、懸濁液中のポリマーコラーゲンを凝集させることと、
(iv)凝集ポリマーコラーゲンを中和した組織懸濁液から取り出すことと、
(v)凝集ポリマーコラーゲンを酸性溶液中に分散させてポリマーコラーゲン懸濁液を得ることと、
(vi)ポリマーコラーゲン懸濁液を中和して、懸濁液中のポリマーコラーゲンを凝集させることと、
(vii)中和した懸濁液から凝集ポリマーコラーゲンを取り出すことと、
(viii)任意に工程(v)〜(vii)を1回又は複数回繰り返すことと、
(ix)凝集ポリマーコラーゲンを酸性溶液中に分散させて精製ポリマーコラーゲン懸濁液を得ることと、
を含む方法によって作製することができる。
ポリマーコラーゲン溶液と、
モノマーコラーゲン溶液と、
哺乳動物細胞、固体要素及び治療物質から選択されるカーゴ粒子と、
非コラーゲン遮断ポリマーと、
を含むキットを提供する。
本明細書に記載される組織等価インプラントを上記組織に固定して、該組織を修復、補充及び/又は置換すること、
を含む、方法を提供する。
(i)ポリマーコラーゲンの溶液、(ii)カーゴ粒子及び(iii)異種遮断ポリマーを混和させてコラーゲン溶液を得ることと、
コラーゲン溶液を凝固させてヒドロゲルを得ることと、
を含み得る。
ヒドロゲル中の液体の量を低減させて、カーゴ粒子及び移動性遮断ポリマーを含む圧縮ポリマーコラーゲン生体材料を得ること、
を更に含み得る。
(i)非コラーゲンスキャフォールドポリマーの溶液、(ii)カーゴ粒子及び(iii)異種遮断ポリマーを混和させてゲル溶液を得ることと、
ゲル溶液を凝固させてヒドロゲルを得ることと、
を含み得る。
ヒドロゲル中の液体の量を低減させて、カーゴ粒子及び移動性遮断ポリマーを含む圧縮生体材料を得ること、
を更に含み得る。
1. 材料及び方法
コラーゲンヒドロゲル
無細胞性ヒドロゲルを、10%の10倍最小必須培地(MEM)(Gibco life technologies,UK)を含有する90%のラット尾酸可溶性I型コラーゲン(酢酸中2.05mg/ml、First link,UK)を、5M及び1M水酸化ナトリウム(NaOH)を用いて中和することによって氷上で調製した。細胞性ヒドロゲルについては、酸可溶性溶液の10%を、細胞を含有する10%のダルベッコ変法イーグル培地(10%ウシ胎仔血清及び1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM、Sigma-Aldrich;細胞を含有する)に置き換え、中和してから添加した。
ペプシン処理により、トロポコラーゲン(従来のゲル化コラーゲン)を移動性コラーゲン種の供給源としてのアテロコラーゲンへと変換した。アテロコラーゲンは原線維形成中に隣接コラーゲン分子とあまり容易には会合せず、(圧縮時に)ヒドロゲル内で移動性のままであり、潜在的にFLSを遮断する。ペプシン(Sigma-Aldrich)を0.5M酢酸に溶解し(2.5mg/ml)、(撹拌機において)4℃で酸可溶性I型コラーゲンに99倍で添加した。ペプシン添加後0時間、1.5時間、3時間、6時間、9時間、24時間、48時間、72時間、94時間の時点で、(上に詳述されるように)コラーゲン溶液を中和した。2.5mlの溶液を24ウェルプレートにおいて37℃、5%CO2で30分間インキュベートした。得られたゲルの圧縮速度を測定した(下記を参照されたい)。
原線維形成中に移動性のままである大型ポリマーをコラーゲンヒドロゲルに組み込み、FLSでの遮断を増大した。0.9%生理食塩水中のフィブリノゲン(340kDa、Sigma-Aldrich)、脱イオン水中のデキストラン(500kDa、Fisher Bioreagents)又はポリ(エチレンオキシド)(PEG;400kDa又は1000kDa、Sigma-Aldrich)等の大型ポリマーを0mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml又は20mg/mlの濃度にした。Ficoll(商標) 400(Sigma-Aldrich)を脱イオン水中で10mg/ml又は50mg/mlとした。ポリマー溶液(10%)を90%の中和コラーゲン溶液に(氷上で)混合した後、インキュベーション(30分間、37℃、5%CO2)及びその後の圧縮速度の測定のために2.5mlを24ウェルプレートに移した。
ヒドロゲルをペーパーロールプランジャー(Whatmanのグレード1クロマトグラフィー用ペーパー、95×4cm)を用いて可塑的に圧縮し、ヒドロゲルを保護するように設計された2枚の適切なサイズのペーパーディスク(Whatman、グレード1ペーパー)によってヒドロゲルから分離した。質量増加に応じた圧縮速度を、質量増加がそれ以上検出されなくなるまでプランジャーによって経時的に測定した(圧縮の最初の5分間は30秒毎、続いて毎分測定した)。
10mg/mlのPEG 400kDaは圧縮速度の最適な制御をもたらし、ヒト皮膚線維芽細胞を含有するブレンド(ポリマー)コラーゲンゲルに使用した(1.5mlのゲル、15000細胞/ゲル)。ブレンドゲルを作製し、上記のように圧縮した。ゲルにおける細胞活性をアラマーブルーアッセイによって測定した。アッセイのために、10%のアラマーブルー(AbD, Serotec)を90%のフェノールレッド不含有DMEM(Sigma-Aldrich)に添加し、そのうち0.5mlを各サンプルに添加し、4時間インキュベートした(37℃、5%CO2)。100μlのアラマーブルー溶液を、510nm及び590nmでの吸光度読取りのために96ウェルマイクロプレート分光光度計(二連;MR700マイクロプレートリーダー、Dynatech Laboratories)に移した。
fitc(500nm)とコンジュゲートしたヒアルロナンナノ粒子(HA−NP)を使用して、FLS遮断ポリマーの存在下での圧縮ヒドロゲルにおけるナノ粒子封入の効率を研究した。1mg/mlのHA−NPを脱イオン水に溶解し、30秒間ボルテックスした後に使用した。10%の1mg/ml HA−NPを70%の酸可溶性I型コラーゲン、10%の10倍MEM及び10%のPEG(400kDa)を含有する中和コラーゲン溶液に添加した後、24ウェルプレートにおいてゲル化した(30分間、37℃(ドライインキュベーター))。得られたヒドロゲルを完全に圧縮し(非圧縮ゲルを対照とする)、1mlの0.2%コラゲナーゼI溶液(水中、Gibco,UK)に37℃で最大40分間(振盪機上で)溶解した。得られたHA−NP含有溶液を脱イオン水で2252倍に希釈した後、吸光度を読み取った(LS 50B、発光分光計、Perkin Elmer;励起波長490nm、発光波長525nm)。
圧縮速度に関するデータについての統計的有意性を一元配置ANOVA(LSD post−hoc)によって決定した。他の全ての実験については独立サンプルt検定を用いた。信頼区間はp<0.05に設定した。
コラーゲンのペプシン処理又は大型ポリマーの組込みによる初期速度(最初の30秒間)及び5分間の圧縮時点での速度を表1にまとめる。酸可溶性コラーゲンのペプシン処理は圧縮速度の減少をもたらさなかった。完全な圧縮までの時間は一貫して対照ヒドロゲル(ペプシン処理なし)よりも低く、処理によって生成した任意の移動性種がFLSでの原繊維間の「細孔」の遮断をもたらさないことが示唆された。したがって、これらの移動性種はこれらの細孔よりも小さいか、又はトロポコラーゲン(ゲル形成コラーゲン)の減少がヒドロゲル内で「細孔」の拡大をもたらし、ヒドロゲルを移動性種の捕獲に効果的でなくするはずである。
Claims (13)
- コラーゲン生体材料を作製する方法であって、
(i)モノマーコラーゲンの溶液、(ii)ポリマーコラーゲンの溶液、(iii)生存哺乳動物細胞及び(iv)デキストラン又はポリエチレングリコールである非コラーゲン遮断ポリマーを混和させてコラーゲン溶液を得ることと、
前記コラーゲン溶液を凝固させてコラーゲンヒドロゲルを得ることと、
前記コラーゲンヒドロゲル中の液体の量を低減させて、生存哺乳動物細胞を含む圧縮コラーゲン生体材料を得ることと、
を含む、方法。 - 前記遮断ポリマーが前記ヒドロゲル内で移動性である、請求項1に記載の方法。
- 前記コラーゲン溶液が2mg/ml〜50mg/mlの遮断ポリマーを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記コラーゲン溶液中のコラーゲンの40%〜60%(w/w)がポリマーコラーゲンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマーコラーゲン溶液を、
(i)コラーゲン組織のサンプルからカルシウムを枯渇させることと、
(ii)カルシウムを枯渇させた前記組織サンプルを酸溶液中に分散させて組織懸濁液を得ることと、
(iii)前記組織懸濁液を中和して、該懸濁液中のポリマーコラーゲンを凝集させることと、
(iv)凝集ポリマーコラーゲンを中和した前記組織懸濁液から取り出すことと、
(v)前記凝集ポリマーコラーゲンを酸性溶液中に分散させてポリマーコラーゲン懸濁液を得ることと、
(vi)前記ポリマーコラーゲン懸濁液を中和して、該懸濁液中のポリマーコラーゲンを凝集させることと、
(vii)中和した前記懸濁液から凝集ポリマーコラーゲンを取り出すことと、
(viii)任意に工程(v)〜(vii)を1回又は複数回繰り返すことと、
(ix)前記凝集ポリマーコラーゲンを酸性溶液中に分散させることと、
によって作製する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記モノマーコラーゲン溶液を、酸中に溶解したモノマーコラーゲンの酸可溶性コラーゲン溶液を中和することによって作製する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸可溶性コラーゲン溶液が細胞培養培地を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記圧縮コラーゲン生体材料が、前記コラーゲンヒドロゲルと比べて液体含量が低減し、剛性が増大している、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コラーゲンヒドロゲル中の液体の量を、該ゲルと吸収体とを接触させることによって低減させる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル中の液体の量を0.65ml/分未満の速度で低減させる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル中の液体の量を0.13ml/分未満の平均速度で5分間にわたって低減させる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル中の液体の量を少なくとも50%低減させる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コラーゲン溶液が1ml当たり少なくとも1×104の生存哺乳動物細胞を含む、請求項1に記載の方法。
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