JP6511878B2 - 腸内細菌叢改善剤 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分とする腸内細菌叢改善剤に関する。
従来、乳酸菌を中心とした善玉菌の餌となる食物繊維、オリゴ糖等を摂取するプレバイオティクスを謳った商品や、腸内細菌叢のバランスを改善する効果のある細菌自体を摂取するプロバイオティクスを謳った商品などが知られており、そのような商品への消費者の関心は高い。そして、特に高齢者では、加齢にともない腸内細菌叢の多様性が低下したり善玉菌が相対的に低下したりすることが報告されており、健康に長寿を全うするためにはそのような現象を防いだり進行を遅らせたりすることが重要であると考えられている（下記非特許文献１参照）。
一方、例えば、下記特許文献１には、Ｎ−アセチルグルコサミンを、炎症性腸疾患、憩室炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、食品アレルギー等の胃腸粘膜組織障害疾患の治療剤に用いることが記載されている。また、下記特許文献２には、Ｎ−アセチルグルコサミンを、炎症性腸疾患患者における炎症性腸疾患治療のための組成物に用いることが記載されている。また、下記特許文献３には、グルコサミン塩を、炎症性腸疾患の予防又は治療剤に用いることが記載されている。
E.J. Woodmansey「Intestinal Bacteria and Ageing」Journal of Applied Microbiology 102 (2007): 1178-1186.
しかしながら、上記特許文献１〜３には、Ｎ−アセチルグルコサミンやグルコサミンに、腸内細菌叢を多様化させたり善玉菌を相対的に増加させたりする作用効果のあることは示されていなかった。
本発明の目的は、長期間摂取しても副作用などを伴うことがなく、安全に使用でき、特に高齢者の生活の質（ＱＯＬ）を向上させるのに有用な腸内細菌叢改善剤を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、Ｎ−アセチルグルコサミンやグルコサミンに、腸内細菌叢を多様化させたり善玉菌を相対的に増加させたりする作用効果のあることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する腸内細菌叢改善剤を提供する。
［１］ Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
［２］ 腸内細菌叢を多様化させる作用を有するものである前記［１］記載の腸内細菌叢改善剤。
［３］ 腸内の善玉菌を相対的に増加させる作用を有するものである前記［１］又は［２］記載の腸内細菌叢改善剤。
［４］ 前記善玉菌がビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）の細菌である前記［３］記載の腸内細菌叢改善剤。
［１］ Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
［２］ 腸内細菌叢を多様化させる作用を有するものである前記［１］記載の腸内細菌叢改善剤。
［３］ 腸内の善玉菌を相対的に増加させる作用を有するものである前記［１］又は［２］記載の腸内細菌叢改善剤。
［４］ 前記善玉菌がビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）の細菌である前記［３］記載の腸内細菌叢改善剤。
本発明の腸内細菌叢改善剤によれば、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分とするので、長期間摂取しても副作用などを伴うことがなく、安全に使用できる。特に、腸内細菌叢を多様化させたり、腸内の善玉菌を相対的に増加させたりするのに有用である。
本発明においては、腸内細菌叢の改善のための有効成分としてＮ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を用いる。
本発明に使用されるＮ−アセチルグルコサミンは、その由来、製法等について特に制限はなく、化学合成法、発酵法、キチンの酵素的加水分解などによって調製されたものを適宜選択して用いればよいが、好ましい態様においては、キチン等の天然物から調製されたものを用いることが好ましい。これによれば、食品等に準じてより安全に摂取することができる。
天然物から調製する方法としては、例えば、グルコース等の糖類を原料とした発酵法（特開２００３−０３４５６８号公報等）なども挙げられるが、生産効率の観点からは、酸や酵素を用いた加水分解法（特公平５−３３０３７号公報、特開２０００−２８１６９６号公報等）などによることが好ましい。具体的には、例えば、カニ、エビ等の甲殻類の甲皮から調製されたキチン質原料を塩酸等の酸で部分的に加水分解し、得られたＮ−アセチルキトオリゴ糖を含有する分解液を中和後、イオン交換膜電気透析法等によって脱塩処理した後、共存するグルコサミン塩酸塩をイオン交換樹脂等によって吸着除去し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有する酵素（例えば、リゾチーム、キチナーゼ、キトビアーゼ等）を作用させて、Ｎ−アセチルグルコサミンを調製することができる。Ｎ−アセチルグルコサミンは、必要に応じて更に活性炭、イオン交換樹脂、アルコール、結晶化等で精製することにより、その純度を高めることができる。また、上記のようにして調製された天然型のＮ−アセチルグルコサミンは市販されており、例えば、商品名「マリンスウィート」（焼津水産化学工業株式会社製）等を用いてもよい。
本発明において使用されるグルコサミンは、その由来、製法等について特に制限はなく、例えば、エビ、カニ、オキアミ等の甲殻類やイカの軟骨等から調製されたキチン質原料を塩酸等の無機酸を用いて完全に加水分解し、生成したグルコサミン（Ｄ−グルコサミン）を必要に応じて更に活性炭、アルコール等で脱色したうえ、結晶化すること等により調製することができる。その塩類としては、塩酸塩、硫酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩などの有機酸塩等が挙げられる。このようにして天然物から調製されたグルコサミンは、食品等に準じてより安全に摂取することができる。なお、上記のようにして調製された天然型のグルコサミンは市販されており、例えば、商品名「ナチュラルグルコサミン」（焼津水産化学工業株式会社製）等を用いてもよい。
本発明の腸内細菌叢改善剤は、既に健康食品やサプリメント等として使用実績が豊富なＮ−アセチルグルコサミンやグルコサミンを有効成分としているため、長期間摂取しても副作用などを伴うことがなく、安全に使用できる。
本発明の腸内細菌叢改善剤は、有効成分であるＮ−アセチルグルコサミン、グルコサミン及びその塩から選ばれた少なくとも１種を腸管や腸内細菌に作用させるため、経口的に摂取するように用いられることが好ましい。そのため必要に応じて、経口摂取用として許容される基材や担体を用いて、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゼリー状剤等の経口摂取用組成物の形態とすることができる。その場合、剤形形態によっても異なるが、有効成分を全体中に固形分換算で０．１〜９９質量％含有していることが好ましく、０．１〜８０質量％含有していることがより好ましく、０．１〜６０質量％含有していることが最も好ましい。また、その有効成分の摂取量は、成人１日当たり０．１〜１５ｇ程度であることが好ましく、０．３〜５ｇ程度であることがより好ましい。摂取量が０．１ｇ未満では改善の効果が期待できず、１５ｇを超えると体質により軟便、下痢などの症状が出る可能性があるため好ましくない。
本発明の腸内細菌叢改善剤は、特に、例えば２０歳以上、より典型的には４５歳以上のヒトの腸内細菌叢の改善のために、好ましく用いることができる。また、ペット動物等に適用してもよく、特に、上記ヒトの年齢に相当する高齢のペット動物等の腸内細菌叢の改善のために、好ましく用いることができる。例えば、イヌの場合、１．５年齢以上、より典型的には７年齢以上のイヌの腸内細菌叢の改善のために、好ましく用いることができる。また、例えば、ネコの場合、１．５年齢以上、より典型的には７年齢以上のネコの腸内細菌叢の改善のために、好ましく用いることができる。
本発明の腸内細菌叢改善剤を摂取する使用形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用健康食品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメントなど各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。また、各種の飲食品と組み合わせて使用してもよい。特に、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、食物繊維、糖アルコール、乳酸菌、ビフィズス菌、酵母、麹菌、又はこれらを含有もしくは配合した飲食品などと組み合わせて使用されることが可能である。これによれば、本発明の作用効果をより有効に発揮させることができる。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
＜試験例１＞
・被検物質
（１）グルコサミン塩酸塩（焼津水産化学工業株式会社、エビ由来、純度９８％以上）
（２）Ｎ−アセチルグルコサミン（焼津水産化学工業株式会社、エビ・カニ由来、純度９５％以上）
・被検物質
（１）グルコサミン塩酸塩（焼津水産化学工業株式会社、エビ由来、純度９８％以上）
（２）Ｎ−アセチルグルコサミン（焼津水産化学工業株式会社、エビ・カニ由来、純度９５％以上）
・供試動物
（１）老化促進モデルマウス（SAMP/1マウス）：日本エスエルシー株式会社から１５週齢のマウスを購入して使用
（２）自然加齢マウス（ICRマウス）：宮城大学食産業学部ファームビジネス学科動物遺伝育種学研究室から分譲されたものを使用
（１）老化促進モデルマウス（SAMP/1マウス）：日本エスエルシー株式会社から１５週齢のマウスを購入して使用
（２）自然加齢マウス（ICRマウス）：宮城大学食産業学部ファームビジネス学科動物遺伝育種学研究室から分譲されたものを使用
・飼育環境
供試動物のSAMP/1マウスは３ヵ月間、ICRマウスは６ヵ月間馴致したのち、試験に使用した。水は自由飲水で、飼料は市販飼料である「ラボMRストック」（商品名、日本農産工業株式会社）を給餌した。明暗は１２時間で切り替え、床替えは週１回行い、１ケージに１頭という個別飼育を行った。SAMP/1マウスの区分けは１区：水投与、２区：グルコサミン塩酸塩投与、３区：Ｎ−アセチルグルコサミン投与とし、各区５頭（ｎ＝５）で行ったが、実験中に２区と３区で１頭ずつ死亡したため、１区はｎ＝５、２区はｎ＝４、３区はｎ＝４で行った。ICRマウスの区分けも同様に、１区：水投与、２区：グルコサミン塩酸塩投与、３区：Ｎ−アセチルグルコサミン投与とし、１区、２区、３区共にｎ＝５で行った。
供試動物のSAMP/1マウスは３ヵ月間、ICRマウスは６ヵ月間馴致したのち、試験に使用した。水は自由飲水で、飼料は市販飼料である「ラボMRストック」（商品名、日本農産工業株式会社）を給餌した。明暗は１２時間で切り替え、床替えは週１回行い、１ケージに１頭という個別飼育を行った。SAMP/1マウスの区分けは１区：水投与、２区：グルコサミン塩酸塩投与、３区：Ｎ−アセチルグルコサミン投与とし、各区５頭（ｎ＝５）で行ったが、実験中に２区と３区で１頭ずつ死亡したため、１区はｎ＝５、２区はｎ＝４、３区はｎ＝４で行った。ICRマウスの区分けも同様に、１区：水投与、２区：グルコサミン塩酸塩投与、３区：Ｎ−アセチルグルコサミン投与とし、１区、２区、３区共にｎ＝５で行った。
・投与試料の調製及び投与方法
被検物質の投与量としては、年齢６５−７０歳、平均体重６２ｋｇの一般人男性が、１日当たりに摂取する量、すなわち、グルコサミン塩酸塩は１日当たり１５００ｍｇ、Ｎ−アセチルグルコサミンは１日当たり１０００ｍｇを想定し、マウスの体重で換算した量を投与するように蒸留水に溶かして投与試料とした。調製した投与試料を、１ｍＬシリンジで１００μＬ計量し、胃ゾンデ針を装着して、マウスに経口で強制投与した。投与は毎日正午に１回（２４時間に１回）行い、８週間継続して連続投与を行った。
被検物質の投与量としては、年齢６５−７０歳、平均体重６２ｋｇの一般人男性が、１日当たりに摂取する量、すなわち、グルコサミン塩酸塩は１日当たり１５００ｍｇ、Ｎ−アセチルグルコサミンは１日当たり１０００ｍｇを想定し、マウスの体重で換算した量を投与するように蒸留水に溶かして投与試料とした。調製した投与試料を、１ｍＬシリンジで１００μＬ計量し、胃ゾンデ針を装着して、マウスに経口で強制投与した。投与は毎日正午に１回（２４時間に１回）行い、８週間継続して連続投与を行った。
・糞便の採取及び細菌叢解析
投与開始より８週間後、マウスを麻酔下に屠殺し、開腹して大腸管を採取した。糞便は、大腸管から直接１．５ｍＬチューブに採取し、−３０℃で凍結した。この凍結サンプルを室温にて解凍し、常法に従いＤＮＡを抽出、精製して、T-RFLP（Terminal restriction fragment length polymorphism）解析に供した。なお、T-RFLP解析は、下記Nagashimaらの方法（以下参照）に基づく解析を、株式会社テクノスルガ・ラボに委託した。
投与開始より８週間後、マウスを麻酔下に屠殺し、開腹して大腸管を採取した。糞便は、大腸管から直接１．５ｍＬチューブに採取し、−３０℃で凍結した。この凍結サンプルを室温にて解凍し、常法に従いＤＮＡを抽出、精製して、T-RFLP（Terminal restriction fragment length polymorphism）解析に供した。なお、T-RFLP解析は、下記Nagashimaらの方法（以下参照）に基づく解析を、株式会社テクノスルガ・ラボに委託した。
K. Nagashima et al., Application of New Primer-Enzyme Combinations to Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling of Bacterial Populations in Human Feces, Applied and Environmental Microbiology, 2003, p.1251-1262.
K. Nagashima et al., Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Sequences from Human Fecal Microbiota and Improved Utility of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling, Bioscience and Microflora, Vol. 25, 2006, No. 3, pp.99-107.
K. Nagashima et al., Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Sequences from Human Fecal Microbiota and Improved Utility of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling, Bioscience and Microflora, Vol. 25, 2006, No. 3, pp.99-107.
T-RFLP解析は、鋳型ＤＮＡを末端蛍光標識したプライマーセットでＰＣＲ増幅し、制限酵素による消化後、フラグメント解析を行い、細菌叢を構成する細菌種毎のＤＮＡ塩基配列の違いから制限酵素切断部位が異なることを利用して、検出ピークの強度、位置（フラグメント長さ）、数（フラグメント数）により評価・比較する、断片多型性解析である（株式会社テクノスルガ・ラボ、ホームページ参照）。
本試験例の解析に使用したプライマーセットは、5’HEX-labeled 516f(5’-TGCCAGCAGCCGCGGTA-3’;E. coli positions 516から532)及び1510r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’;E. coli positions 1510から1492）であり、このプライマーセットを使用したＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を制限酵素BslIによりフラグメント化した。フラグメント解析には、ABI PRISM3130xl DNA Sequencer （Applied Biosystems, CA, USA）及びGeneMapper（Applied Biosystems, CA, USA）を使用した。各フラグメントの長さをもとにクラスター解析を行い、マウス腸内フローラデータベースとの対照を行って、そのクラスターグループ（operational taxonomic unit：OTU）として割り当てた。クラスター解析には解析ソフトGene Maths（Applied Maths, Belgium）を使用し、クラスタリングの方法は、ピアソン相関係数(pearson correlation)ならびに非加重結合法(UPGMA)を選択した。
下記表１〜４に示すように、各OTUは同じ属又は分類群の細菌に由来すると推測できる。よって、各OTUに含まれるフラグメントの検出ピークからは、細菌叢全体中の各OTUの割合、つまり菌種組成比を求めることができる。
具体的には、データ解析は、各検体のOTUのピーク面積比を試験区ごとに分け、各OTUのピーク面積比の平均値を算出し、平均値をグラフ化した後、各試験区と比較した。その結果を、SAMP/1マウスについて下記表５に、ICRマウスについて下記表６に、それぞれ示す。
・SAMP/1マウスの腸内細菌叢解析
下記表５に示されるように、水投与区と比較し、グルコサミン塩酸塩投与区及びＮ−アセチルグルコサミン投与区でClostridiales目及びLactobacillales目の相対的な割合が顕著に低下した。また、グルコサミン塩酸塩投与区においてBifidobacteriales目の相対的な割合が顕著に増加した。
下記表５に示されるように、水投与区と比較し、グルコサミン塩酸塩投与区及びＮ−アセチルグルコサミン投与区でClostridiales目及びLactobacillales目の相対的な割合が顕著に低下した。また、グルコサミン塩酸塩投与区においてBifidobacteriales目の相対的な割合が顕著に増加した。
・ICRマウスの腸内細菌叢解析
下記表６に示されるように、水投与区と比較し、グルコサミン塩酸塩投与区およびＮ−アセチルグルコサミン投与区でClostridiales目及びLactobacillales目の相対的な割合が顕著に低下した。また、Ｎ−アセチルグルコサミン投与区においてビフィドバクテリウム目（Bifidobacteriales）の相対的な割合が顕著に増加した。
下記表６に示されるように、水投与区と比較し、グルコサミン塩酸塩投与区およびＮ−アセチルグルコサミン投与区でClostridiales目及びLactobacillales目の相対的な割合が顕著に低下した。また、Ｎ−アセチルグルコサミン投与区においてビフィドバクテリウム目（Bifidobacteriales）の相対的な割合が顕著に増加した。
以上の結果から、加齢マウスにＮ−アセチルグルコサミンやグルコサミンを投与することによって、通常加齢マウスの腸内細菌叢の大勢を占めているClostridiales目及びLactobacillales目の相対的な割合を顕著に低下させることができ、腸内細菌叢を多様化させることができることが明らかとなった。また、用いられた実験動物により効果に差異はみられたものの、善玉菌が多く属するビフィドバクテリウム目（Bifidobacteriales）の相対的な割合を増加させる作用効果も見出された。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の種特異的領域のＰＣＲ増幅のための蛍光標識フォワードプライマー；5’HEX-labeled 516f（5’-TGCCAGCAGCCGCGGTA-3’;E. coli positions 516-532）
配列番号２：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の種特異的領域のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー；1510r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’;E. coli positions 1510-1492）
配列番号１：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の種特異的領域のＰＣＲ増幅のための蛍光標識フォワードプライマー；5’HEX-labeled 516f（5’-TGCCAGCAGCCGCGGTA-3’;E. coli positions 516-532）
配列番号２：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の種特異的領域のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー；1510r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’;E. coli positions 1510-1492）
Claims (5)
- Ｎ−アセチルグルコサミンを有効成分とし、ヒトの場合には２０歳以上、動物の場合には、前記ヒトの場合の２０歳以上に相当する年齢の動物に投与するものであることを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
- 上記動物がイヌである場合には、１．５年齢以上の動物に投与し、上記動物がネコである場合には、１．５年齢以上の動物に投与する、請求項１記載の腸内細菌叢改善剤。
- 腸内細菌叢を多様化させる作用を有するものである請求項１又は２記載の腸内細菌叢改善剤。
- 腸内の善玉菌を相対的に増加させる作用を有するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の腸内細菌叢改善剤。
- 前記善玉菌がビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）の細菌である請求項４記載の腸内細菌叢改善剤。
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