JP6509833B2 - 免疫応答性を増強するための哺乳動物乳オステオポンチン - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト被験者における感染症に対する免疫応答性の向上、並びにヒトなどの哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置のためのワクチン接種の効力の増強に関する。哺乳動物乳オステオポンチン（ＯＰＮ）、又はその活性切断部分の経口投与が、哺乳動物の免疫応答性を増強すると共に、哺乳動物においてワクチン接種により誘導される免疫応答を増強し、これによって、ワクチン接種の予防又は治療効果を増強することが判明している。

免疫系は、生存生物において疾患に対する一次防御機構を賦与し、これによって、病原体及び外来生物が免疫系の成分により検出され、排除される。自然免疫応答は、感染に対する第１防御ラインとして機能し、これは、顆粒球（好塩基球、好酸球及び好中球）、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫＣ）並びにマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、並びに補体タンパク質などの液性因子を含む。第２防御ラインとしての適応免疫応答は、発生が遅く、病原体排除のための細胞性及び体液性応答の選択を含む。細胞性免疫は、主としてＴｈ１誘導性であり、易感染性宿主細胞（例えば、ウイルス若しくは病原体感染細胞）を破壊する役割を果たす細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫＣ）及び活性化マクロファージの分化を引き起こす。体液性免疫は、抗原特異性及び抗原記憶の増大として発現し、それによって、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン生成が、抗体産生Ｂ細胞及び記憶細胞の生成をもたらし、これらは、病原体由来抗原の認識及び病原体排除を促進する。

新生哺乳動物の自然免疫は、未発達であるため、新生児における疾患耐性は、母乳、特に初乳から受ける移行抗体の受動獲得に大きく依存する。同時に、乳児の免疫系の発達は、母乳中に存在する免疫刺激成分により誘導される。母乳ではなく、調合乳を与えた新生哺乳動物における免疫系の発達は、そうでなければ母乳中に供給されたであろう主要な免疫誘導及び免疫賦与成分の不足のために遅れる。

免疫系の維持は、一生涯の健康に不可欠であり続けることから、あらゆる年齢の免疫無防備状態の個体、並びに免疫が徐々に低下する高齢の個体は、疾患関連死のリスクが高い患者群の典型である。

感染症に対する免疫耐性を高めるためのワクチン接種は、公衆衛生を改善する最も有効な方法である。ワクチンが入手可能である疾患の種類は、絶えず増加しており、成人集団、特に、増大する高齢者集団を防御するための上記ワクチンの使用が増加している。ワクチン接種は、予防又は治療目的の何れも、身体の免疫系を刺激して、所与の病原体に類似した抗原因子を認識し、それを破壊し、それを「記憶」することによって、免疫系が、再曝露時に病原体を容易に認識して、それを破壊することができるようにする。典型的には、このような因子は、病原性微生物の弱毒化若しくは死滅形態、その毒素又はその表面タンパク質の１つから作製される。

ワクチン接種の効力は、ワクチン接種を受けた被験者が、有効な免疫応答を高める能力に依存することから、ワクチン接種の有益性は、新生児又は乳幼児のように、免疫系が十分に発達していない個体、又は、一部の成人及び高齢者のように、免疫系が抑制、無防備状態、若しくは低下している個体では低減する。従って、これらの患者群における免疫応答性、特にワクチン接種に対する免疫応答を増強することができる薬剤が求められる。これらの大きな患者集団にワクチン接種するための公衆衛生計画は、極めて安全でなければならず、従って、ワクチン接種に対する免疫応答を増強するのに用いる薬剤と、その投与に用いられる手段との両方が、これらの安全要件を満たしていなければならない。

オステオポンチン（ＯＰＮ）は、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞を含むいくつかの細胞型により発現される細胞外基質タンパク質である。これは、骨、腎臓、胎盤、平滑筋及び分泌上皮などの数種の組織に存在する。ＯＰＮは、細胞接着及び移動を媒介することができ、骨再吸収、血管新生、創傷治癒及び組織外傷などの正常な組織再生過程に関連する。ＯＰＮはまた、特定の病態、例えば、再狭窄、アテローム性動脈硬化、腎疾患及び腫瘍形成にも発現される。ＯＰＮをコード化する遺伝子の修飾された転写が認められており、ここで、選択的スプライシング転写物によって、特定の病態における様々なＯＰＮの発現が起こる（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１２）。ＯＰＮは、インテグリン（細胞−細胞及び細胞−基質相互作用の両方を媒介するヘテロ二量体膜貫通受容体の大きなファミリーを含む）と相互作用することにより、その生物学的作用の多くを発揮し、炎症性疾患において役割を果たし得る。

国際公開第９８／５６４０５Ａ１号パンフレットは、オステオポンチン活性を改変（増大若しくは低減）することにより、個体の免疫応答を調節（増大若しくは低減）する方法に関するが、ＯＰＮ（例えば、組換えＯＰＮ）を投与する治療効果を支持するエビデンスが不足している。

国際公開第００／６３２４１Ａ２号パンフレットは、免疫応答の調節物質としてのＥｔａ−１／オステオポンチンに関するが、ＯＰＮの投与によって、感染症に対する免疫耐性を増強することを証明することができていない。

Ｋｈａｊｏｅｅ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２００６ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，１４３（２）：２６０−２６８は、ヒト単球由来のマクロファージ細胞培養物を用いて実施した研究に基づく、細菌感染症の防御におけるオステオポンチンの役割に関する。

図１は、動物試験集団及び試験設計を示す。仔豚を、母乳代用調合乳（ＦＦ；ｎ＝１０）若しくは１４０ｍｇ／Ｌのオステオポンチンを補給した調合乳（ＯＰＮ；ｎ＝１２）の何れかを受けるか、又は雌豚授乳（ＳＲ；ｎ＝７）の３つの食餌群に分けた。 図２は、母乳代用調合乳（ＦＦ；ｎ＝１０）若しくは１４０ｍｇ／Ｌのオステオポンチンを補給した調合乳（ＯＰＮ；ｎ＝１２）を受ける食餌群に属する仔豚の出産後の毎日の平均体重を示し、雌豚授乳の仔豚（ＳＲ；ｎ＝７）を差し込みグラフに示す。 図３は、ＥＬＩＳＡにより測定した７、１４及び２１日齢の仔豚由来の血清中のＦｌｕｚｏｎｅ（商標）特異的ＩｇＧ力価を示す。非ワクチン接種仔豚におけるＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧレベルを差し込みグラフに示す。データは、平均値±ＳＤとして表す。様々な添え字は、ｐ＜０．０５の統計的有意性を指す。非ワクチン接種群の添え字は、統計的に有意な時間の差を指し；ワクチン接種グラフの添え字は、２１日目の食餌処置群同士の差を示す。 図４は、ＥＬＩＳＡにより測定したワクチン接種及び非ワクチン接種仔豚の血清中の全ＩｇＧ濃度を示す。血清は、７、１４及び２１日齢で採取した仔豚の血液サンプルから取得した。２１日目に採取したサンプル中で測定した全ＩｇＧレベルは、差し込みグラフに示す。データは、平均値±ＳＤとして表す。添え字は、時間経過による統計的に有意な差を指す。 図５は、ＥＬＩＳＡにより測定した７、１４及び２１日齢の仔豚由来の血清中の全ＩｇＭ濃度を示す。データは、平均値±ＳＤとして表す。添え字は、時間経過による統計的に有意な差を指す。 図６は、ＣＤ４（クローン７４−１２−４）及びＣＤ８（クローン７６−２−１１）について染色したＰＢＭＣ Ｔ−リンパ球集団のフローサイトメトリー散布図を示す。４つの象限は、ＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋プロフィールを有する細胞傷害性Ｔ細胞）；ＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−プロフィールを有するヘルパーＴ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋プロフィールを有するメモリーＴ細胞）をプロットする。 図７は、２１日目のＰＢＭＣ中のＴ−ヘルパーＣＤ４＋細胞（パネルＡ）、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＢ）及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋比（パネルＣ）の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全ＣＤ３＋Ｔ細胞の％として表示する。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示す。＊は、ｐ＜０．１の統計的傾向を示す。 図８は、２１日目のＭＬＮ中の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＡ）及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞比（パネルＢ）の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全ＣＤ３＋Ｔ細胞の％として表示する。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、ｐ＜０．０５の統計的に有意な差を示す。＊は、ｐ＜０．１の統計的傾向を示す。 図９は、２１日目の脾臓中のメモリー（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）Ｔ細胞の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全ＣＤ３＋Ｔ細胞の％として表示する。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、ワクチン接種群内の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１０は、ＰＢＭＣ細胞によるＩＬ−１２分泌を示す。ＰＢＭＣ細胞を７２時間ｅｘ ｖｉｖｏで培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１１Ａは、ＰＢＭＣのＩＬ−１２分泌に対するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激の効果を示す。図１１Ｂは、ＰＢＭＣのＩＬ−１０分泌に対するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激の効果を示す。ＰＢＭＣ細胞をＰＨＡの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．１の統計的傾向を示す。 図１２Ａは、ＰＢＭＣのＩＬ−１２分泌に対するリポ多糖（ＬＰＳ）刺激の効果を示す。図１２Ｂは、ＰＢＭＣのＩＬ−６分泌に対するリポ多糖（ＬＰＳ）刺激の効果を示す。図１２Ｃは、ＰＢＭＣのＩＬ−１０分泌に対するリポ多糖（ＬＰＳ）刺激の効果を示す。ＰＢＭＣ細胞をＬＰＳの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１３Ａは、ＰＢＭＣのＩＬ−１２分泌に対するＦｌｕｚｏｎｅ刺激の効果を示す。図１３Ｂは、ＰＢＭＣのＩＬ−１０分泌に対するＦｌｕｚｏｎｅ刺激の効果を示す。ＰＢＭＣ細胞をＦｌｕｚｏｎｅの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士でｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１４Ａは、脾細胞によるＩＬ−１２分泌を示す。図１４Ｂは、脾細胞によるＩＬ−１０分泌を示す。脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＝０．０７の傾向を示す。 図１５Ａは、脾細胞のＩＬ−１２分泌に対するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激の効果を示す。図１５Ｂは、脾細胞のＩＬ−１０分泌に対するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激の効果を示す。脾細胞をＰＨＡの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し；様々な添え字は、処置群同士で、ｐ＝０．０７の統計的傾向を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１６Ａは、脾細胞のＩＬ−１２分泌に対するリポ多糖（ＬＰＳ）刺激の効果を示す。図１６Ｂは、脾細胞のＩＬ−１０分泌に対するリポ多糖（ＬＰＳ）刺激の効果を示す。脾細胞をＬＰＳの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１７Ａは、脾細胞のＩＬ−１２分泌に対するＦｌｕｚｏｎｅ刺激の効果を示す。図１７Ｂは、脾細胞のＩＬ−１０分泌に対するＦｌｕｚｏｎｅ刺激の効果を示す。脾細胞をＦｌｕｚｏｎｅの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで７２時間培養し、ならし培地を回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分析した。データは、平均値±ＳＤとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示し；＊は、ワクチン接種効果について、ｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 図１８は、１）母乳；２）ＯＰＮを添加しない標準調合乳（ＲＦ）（Ｆ０）；３）約６５ｍｇのＯＰＮ／ＬでウシＯＰＮを添加したＲＦ（Ｆ６５）及び４）約１３０ｍｇのＯＰＮ／ＬでウシＯＰＮを添加したＲＦ（Ｆ１３０）の何れかを与えた場合の、１〜６月齢の乳児における発熱の発生率を示す。発生率は、各治療群に属する乳児が、１暦月の期間中に熱を有するとして記録された時間のパーセンテージとして表示する（暦月当たりの記録時間は、臨床試験の期間にわたって記録された値の平均値である）。

経口投与すると、哺乳動物乳オステオポンチン（ＯＰＮ）及び／又は活性切断型は、意外なことに、哺乳動物被験者における特異的免疫応答性を増強し、これによって、ワクチン接種に対するその特異的免疫応答を改善することが判明している。本発明は、ＯＰＮの経口投与を用いて、ワクチン接種によって哺乳動物被験者に誘導される特異的免疫応答性を増強することができることを立証する最初の研究に基づくものである。

本発明は、例えば、疾患に対するワクチン接種によって誘導される免疫耐性を増強することにより、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する薬剤として使用するための哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型を提供し、ここで、ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、経口投与用である。一実施形態によれば、活性切断ＯＰＮは、タンパク質分解切断による哺乳動物乳ＯＰＮから取得可能な少なくとも１種の活性ＯＰＮペプチドを含む。ＯＰＮ又は活性切断型は、哺乳動物のワクチン接種の前；哺乳動物のワクチン接種と同時；若しくは哺乳動物のワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いることができる。

哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。

哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの組み合わせの何れか１つに由来するものであってよい。

一実施形態によれば、哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するのに用いることを目的とし、ここで、哺乳動物はヒトである。一実施形態によれば、ヒトは、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４、及び８４歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。

一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ；ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、Ｂ型肝炎、Ｃ型髄膜炎；ヒトパピローマウイルス；ロタウイルス；Ａ型インフルエンザ；Ｂ型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。

本発明はさらに、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するための、ワクチンと哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型とを含むワクチン系を提供し、哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、ワクチン接種の前；ワクチン接種と同時；若しくはワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いる。哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型の経口投与は、ワクチン接種により誘導される、感染症に対する免疫耐性を増強する。哺乳動物乳オステオポンチン及び／又はその活性切断型は、ワクチン接種哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。

一実施形態によれば、ワクチン系は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ又はこれらの任意の組み合わせに由来するＯＰＮ及び／又はその活性切断型を含む。

ワクチン系の一実施形態によれば、哺乳動物は、ヒトである。

ワクチン系の一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、Ｂ型肝炎、Ｃ型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。

ワクチン系の一実施形態によれば、ワクチンは、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、若しくは組み合わせワクチン（例えば、ＴａＰ／ＩＰＶワクチン）；麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹混合ワクチン（例えば、ＭＭＲワクチン）；結核ワクチン（例えば、ＢＣＧワクチン）；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型髄膜炎ワクチン）；ロタウイルス（ロタウイルスワクチン）；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン；Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ（例えば、インフルエンザワクチン）；肺炎球菌ワクチン；及び帯状疱疹ワクチンの中から選択される。

ワクチン系の一実施形態によれば、ヒトは、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４歳、及び８４歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。

本発明はさらに、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する方法も提供し、これは、ワクチンと哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型とを哺乳動物に投与するステップを含み、ここで、ＯＰＮ及び／又は１つ若しくは複数のその活性切断型は、経口投与される。哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型は、ワクチン接種哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。

哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する方法の一実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。

方法の一実施形態によれば、ＯＰＮ又はその活性切断型は、ワクチン接種の前；ワクチン接種と同時；若しくはワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いる。

方法の一実施形態によれば、ＯＰＮ又はその活性切断型は、治療対象の被験者の体重ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約５ｇ／ｋｇの範囲の毎日用量で投与する。

ヒトにおける感染症に対する免疫耐性を増強する方法の一実施形態によれば、ヒトは、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４歳、及び８４歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。

方法の一実施形態によれば、ＯＰＮ又はその活性切断型は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの任意の組み合わせから選択される哺乳動物を起源とする。

方法の一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、Ｂ型肝炎、Ｃ型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス；Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。

方法の一実施形態によれば、ワクチンは、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、若しくは混合ワクチン（例えば、ＴａＰ／ＩＰＶワクチン）；麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹混合ワクチン（例えば、ＭＭＲワクチン）；結核ワクチン（例えば、ＢＣＧワクチン）；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型髄膜炎ワクチン）；ロタウイルス（ロタウイルスワクチン）；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン；Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ（例えば、インフルエンザワクチン）；肺炎球菌ワクチン；及び帯状疱疹ワクチンの中から選択される。

本発明は、哺乳動物被験者、特に、調合乳が与えられる乳幼児；免疫能が低い成人（例えば、免疫無防備状態の被験者）；及び高齢者における免疫応答を増強する必要性に対処する。本発明者らは、哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型が、被験者に経口投与されると、哺乳動物において免疫応答性を増強し、それによって哺乳動物のワクチン接種の効果を向上させることをみいだした。

Ｉ．哺乳動物乳オステオポンチン（ＯＰＮ）及び／又はその活性切断型
Ｉ．ｉ．哺乳動物乳ＯＰＮの構造
第１の実施形態によれば、本発明は、感染に対する免疫応答性、特に、哺乳動物における感染症に対してワクチンにより誘導される免疫耐性を増強するのに用いるための哺乳動物乳ＯＰＮ及び／又はその活性切断型を提供する。

哺乳動物乳ＯＰＮは、乳腺からの分泌により生成される可溶性乳タンパク質である。哺乳動物乳ＯＰＮは、分子量が約６０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される）のポリペプチドとして分泌されるが、ＯＰＮの切断型と一緒に乳汁中に共存することが一般にみいだされている。他の組織に発現される選択的（転写）スプライシングＯＰＮアイソフォームとは対照的に、乳腺からの乳ＯＰＮは、ただ１つのスプライシングアイソフォームとして存在し；乳ＯＰＮの切断型は、この分泌ポリペプチドアイソフォームのタンパク質分解切断の結果である。乳ＯＰＮは、全長ポリペプチド及びその切断型の何れも、高度にリン酸化及びグリコシル化したポリペプチドである。ＯＰＮのリン酸化及びグリコシル化の翻訳後パターンは、組織特異的であり、その生理学的特性を調節することがわかっている。乳ＯＰＮポリペプチドアイソフォームのリン酸化及びグリコシル化の高いレベル及びそのパターンは、その機能的特性に重要な際立った特徴である（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１２）。

本発明の乳ＯＰＮは、哺乳動物を起源とし、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ又はラマ乳汁に由来するものであってよい。乳ＯＰＮポリペプチドは、αインテグリン結合特性を特徴とする、いくつかの高度に保存された配列モチーフ、特にＲＧＤモチーフを含む。哺乳動物乳ＯＰＮポリペプチドの間で保存されたこれらのモチーフの位置は、ウシＯＰＮに関して特定されており、その一次翻訳産物アミノ酸配列を表１に記載する。

哺乳動物乳ＯＰＮが、牛乳由来の場合、ＯＰＮは、成熟型完全長ＯＰＮポリペプチド以外に少なくとも１つの活性切断型ＯＰＮポリペプチドを含む。典型的に、１つ又は複数の活性切断型ＯＰＮポリペプチドは、分子量約４０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する）を有する。典型的に、１つ又は複数の切断型ＯＰＮポリペプチドは、ＲＧＤモチーフに対してＣ末端側の位置でのｉｎ ｖｉｖｏペプチド結合切断により完全長ＯＰＮポリペプチドから得られる。典型的に、少なくとも１つ又は複数の活性切断型牛乳ＯＰＮは、完全長成熟型ＯＰＮポリペプチドから得られ、成熟型ＯＰＮは、配列番号１の残基１７〜２７８に対して決定された配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。牛乳ＯＰＮは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸残基１〜１６に対応する）を有する分泌ポリペプチドであり、そのシグナルペプチドは、同時翻訳により除去されて、成熟型完全長ポリペプチドをもたらす。牛乳ＯＰＮが、完全長ＯＰＮポリペプチドを含む場合、これは、典型的に、配列番号１の残基１７〜２７８のアミノ酸配列を有する。１つの活性切断型牛乳ＯＰＮは、トロンビン切断部位又はその近傍でのペプチド切断部位（表１）により、ウシＯＰＮポリペプチド（配列番号１）から得られ、ＲＧＤモチーフを保持する、分子量が約４０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定）のＣ末端切断型ＯＰＮポリペプチドをもたらすと推定される。

一実施形態によれば、配列番号１に対して少なくとも６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する成熟型完全長ＯＰＮポリペプチド；及び／又は配列番号１のアミノ酸残基１７〜１６１；１７〜１６２；１７〜１６３；１７〜１６４及び１７〜１６５の何れか１つの中から選択される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する１つ又は複数の活性切断型ＯＰＮポリペプチド含む。

本発明に関して、「配列同一性」という用語は、好ましくは同じ長さの２つのアミノ酸配列同士又は２つの核酸配列同士の同一性の度合いの定量的測度である。比較しようとする２つの配列が等しい長さでなければ、これらは、可能な限り適合するようにアラインメントしなければならない。配列同一性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算することができ、ここで、Ｎｄｉｆは、アラインメントしたとき、２つの配列中の非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、標準配列の残基の数である。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）。ギャップは、特定の残基の非同一性として計数する。すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）。配列同一性は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），ＵＳＡにより提供されるＢＬＡＳＴｐアルゴリズムなどの適切なＢＬＡＳＴプログラムを用いて計算することができる。

哺乳動物乳ＯＰＮは、活性切断型ＯＰＮポリペプチド（ｔＯＰＮ）又は完全長ＯＰＮポリペプチド（ｆｌＯＰＮ）を含んでもよく、又は２つの形態が、様々な比で存在してもよい。例えば、ｔＯＰＮ／ｆｌＯＰＮの比は、０：１００〜１００：０の範囲であってよく；より好ましくは、上記の比は、５：９５；１０：９０；１５：８５；２０：８０；２５：７５；３０：７０；３５：６５；４０：６０；４５：５５；５０：５０；５５：４５；６０：４０；６５：３５；７０：３０；７５：３５；８０：２０；８５：１５；９０：１０；及び９５：５の何れか１つである。典型的に、牛乳中の比は、７５％ｔＯＰＮ：２５％ｆｌＯＰＮであり、ここで、ｔＯＰＮは、約４０ｋＤａの分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定）を有する。

さらなる実施形態によれば、哺乳動物乳ＯＰＮは、切断型ＯＰＮであり、切断型ＯＰＮは、タンパク質分解切断により哺乳動物乳ＯＰＮ（例えば、配列番号１を有する牛乳ＯＰＮ）から誘導可能な少なくとも１つの活性ＯＰＮペプチドを含む。哺乳動物被験者の消化管を通過中に、哺乳動物ＯＰＮは、タンパク質分解酵素、とりわけエンドプロテアーゼペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンに曝露される。本発明の活性ＯＰＮペプチドは、哺乳動物の消化管中に典型的に存在するプロテアーゼへの曝露後も活性を保持するペプチドである。活性ＯＰＮペプチドは、典型的には５〜１６アミノ酸残基の長さを有するインテグリン結合モチーフの一部又は全部を含むペプチドを一般に含み得る。

Ｉ．ｉｉ 哺乳動物乳ＯＰＮは、ワクチン接種により哺乳動物に誘導される特異的免疫応答性を増強する
本発明の哺乳動物乳ＯＰＮは、哺乳動物の免疫応答性を増強することができ、従って、感染症に対する曝露により（及び任意選択でそれに感染した哺乳動物において）又はワクチン接種により、哺乳動物に誘導される特異的免疫応答増大することができる完全長ＯＰＮポリペプチド（ｆｌＯＰＮ）及び／又は少なくとも１つの活性切断型ＯＰＮポリペプチドを含む。感染症に暴露された（感染した）哺乳動物又はワクチン接種哺乳動物における特異的免疫応答は、感染症の因子（感染症及びその因子の例は、ＩＩｉに詳しく記載する）又はワクチンに存在する抗原と選択的に反応する抗体分子の集団の産生を含む。本発明の切断型ＯＰＮポリペプチド又はペプチドに関して、「活性」という用語は、感染症又はワクチン接種に対する哺乳動物の特異的免疫応答を増強する能力として定義される。

ワクチン接種により誘導される特異的抗体の力価は、ワクチン接種時に統合的免疫応答のｉｎ ｖｉｖｏ指標として一般に用いられ；また、所与のワクチンに対して特異的な、賦与され得る臨床的防御の指標でもある（Ａｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１３）。

ワクチン接種により哺乳動物に誘導される特異的免疫応答に対する牛乳ＯＰＮ投与の効果は、実施例１に例示する。この実施例では、牛乳ＯＰＮを補充した調合餌を給餌した仔豚は、２１日間にわたってＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧを産生することにより、Ｆｌｕｚｏｎｅワクチンに応答したが、仔豚の血清サンプル中のその力価は、対照調合餌供給仔豚からの血清より有意に高く、ネイティブブタＯＰＮを含有するブタ乳汁を授乳された仔豚に認められたＩｇＧレベルと一致した。

ワクチン接種哺乳動物における特異的免疫応答は、ワクチン抗原と複合体を形成することができる、哺乳動物由来の体液のサンプル中に存在する抗体を直接又は間接的に検出して、定量することにより、決定することができる。ワクチンが、微粒子、例えば、全細胞不活性化ワクチンである場合、定量的凝集（細胞集塊）試験を用いて、全細胞ワクチンの細胞集塊を誘導するのに十分な特異的抗体を含有する体液サンプル中の連続希釈を決定することができる。ワクチンが可溶性である、例えば、タンパク質サブユニット又はペプチドワクチンである場合、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、特異的抗体検出に好適な方法である。

抗体検出のためのＥＬＩＳＡの使用は、実施例１．３に例示し、この実施例では、ブタ専用のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｆｌｕｚｏｎｅワクチン特異的ＩｇＧ抗体を検出する。

Ｉ．ｉｉｉ 哺乳動物乳ＯＰＮは、哺乳動物の体液性免疫応答性を増強する
驚くことに、例えば、食餌へのＯＰＮ補給という形態でのＯＰＮの経口投与は、ワクチン接種哺乳動物における抗原特異的ＩｇＧのレベル増大、並びに一般により高レベルのＩｇＧをもたらすなどの体液性免疫の強力な刺激を誘導する。これは、実施例１に例示しており、この実施例では、ＯＰＮ補給調合餌を受けた仔豚を、調合餌を受けた仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較する。この応答の原因は、ＯＰＮ調合餌を受けた仔豚に認められる免疫系のいくつかの修飾にあると考えられる。第１に、ＯＰＮ補給餌を受けた仔豚は、対照調合餌を受けた仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較して、高レベルのＩＬ−１０を有し、Ｔｈ２応答の誘導に寄与すると共に、より高いＩｇＧレベルをもたらす抗体分泌細胞へのＢ細胞の分化を刺激する。ＯＰＮ誘導によるＩＬ−１０の産生は、マクロファージ活性化又は炎症誘発応答のなどの下流Ｔｈ１応答を阻害する上で重要な役割も果たす。

第２に、ＯＰＮ調合餌供給仔豚の血清中に認められる高レベルのＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の分化を刺激し、これが今度は、分化したＢ細胞の活性化を引き起こし、これらを誘導して抗体（ＩｇＧ）を分泌させる。ＯＰＮ補給餌を受けた仔豚におけるこの体液性応答の誘導は、調合餌供給仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較して、有意に高いレベルのＣＤ４分泌Ｔヘルパー細胞、及び比較的低いレベルのＣＤ８分泌細胞傷害性Ｔ細胞に表される。Ｔｈ１及びＴｈ２系を介したＴヘルパー細胞集団は、ワクチン接種後に、観測される体液性応答、並びに重要なことには、増大したレベルの抗原特異的ＩｇＧに寄与する。調合餌で飼育した仔豚の場合、餌にＯＰＮを添加すると、ブタが育てた仔豚に認められるレベルに対して、ワクチン接種応答が向上する。これらの研究は、食餌にＯＰＮを添加すると、ワクチン接種に対する免疫応答を増強及び促進することができ、これによって、投与したワクチンにおける抗原に対する免疫を向上させることができるというエビデンスを提供する。この結論は、ワクチン接種により誘導される抗体の力価は、ワクチン接種により賦与される疾患に対する防御と少なくとも相対的に相関するという事実により支持される（Ｐｌｏｔｋｉｎ，ＳＡ．，２００８）。

Ｉ ｉｖ 哺乳動物乳ＯＰＮは、哺乳動物の感染症に対する免疫耐性を増強する
哺乳動物、特にヒト乳幼児への本発明の哺乳動物乳ＯＰＮの経口投与は、感染症に対するその免疫耐性を増強する。これは、実施例２に記載する臨床試験において明らかに立証され、この実施例では、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、真菌又は真核生物病原体、例えば、原生動物感染など）を原因とする、乳幼児が罹患する感染症の診断症状として、幼児の体温を測定し、高い体温を検出することにより、感染イベントの頻度をモニターした。

Ｉ．ｖ．投与に適した哺乳動物乳ＯＰＮの調製
泌乳哺乳動物の乳汁に存在する哺乳動物乳ＯＰＮを精製して、富化ＯＰＮ供給源を提供してもよく、これは、少なくとも約５０％〜約６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、又は少なくとも約７０％〜約８０％の純度であってよい。一部の実施形態では、少なくとも約８０〜約９０％の純度であり、他の実施形態では、乳ＯＰＮの供給源は、少なくとも約９０％〜約９５％、又はそれを超える純度である。いくつかの実施形態では、精製した乳ＯＰＮ供給源は、少なくとも約９５％の純度、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％、又はそれを超える純度である。

特定の実施形態では、ＯＰＮの供給源は、精製した牛乳ＯＰＮ調製物、例えば、Ｌａｃｐｒｏｄａｎ ＯＰＮ−１０（登録商標）（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｖｉｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）である（また、米国特許第７，２５９，２４３号明細書も参照）。Ｌａｃｐｒｏｄａｎ ＯＰＮ−１０（登録商標）は、約２２％（ｗ／ｗ）の完全長牛乳ＯＰＮと、約６５％（ｗ／ｗ）の牛乳ＯＰＮアイソフォーム（切断型ＯＰＮ）を含む。

Ｉ ｖｉ 哺乳動物乳ＯＰＮの製剤化及び用量決定
本発明の哺乳動物乳ＯＰＮ、例えば、牛乳ＯＰＮは、治療対象の被験者の体重ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約５ｇの範囲の毎日用量で投与してよい。例えば、毎日のＯＰＮ用量は、典型的に、体重が３〜１０ｋｇの乳幼児の場合、約５〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは２５〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。典型的に、成人の場合、例えば、１００〜２５０ｍｌの１日投与量中、１日当たり０．５〜５ｇのＯＰＮを投与することが推奨される。投与形態は、投与形態当たり０．１ｍｇ〜１０ｇの範囲で哺乳動物乳ＯＰＮを含有してよい。例えば、経口投与形態は、投与形態当たり１ｍｇ〜１ｇの範囲の量のＯＰＮを含有してよい。あるいは、経口投与形態は、投与形態当たり１０ｍｇ〜８００ｍｇの範囲の量のＯＰＮを含有してよい。経口投与形態は、例えば、投与形態当たり２５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の量のＯＰＮを含有してよい。

哺乳動物乳ＯＰＮは、栄養補助食品の形態で投与してもよく、その場合、補助食品は、０．０１〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含む。例えば、栄養補助食品は、０．１〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、１〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。

本発明の一部の実施形態では、栄養補助食品は、５〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含む。例えば、栄養補助食品は、１０〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。

本発明の他の実施形態では、栄養補助食品は、０．００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含む。例えば、栄養補助食品は、０．００５〜２％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、０．０１〜１％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。栄養補助食品は、例えば、０．０５〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含んでよい。典型的に、すぐ飲める栄養飲料は、０．００５％〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の乳ＯＰＮを含む。

乳ＯＰＮを含む栄養補助食品は、液体又は粉末形態で予め包装することができる（例えば、缶詰め若しくは瓶詰め液体飲料）。一部の実施形態では、粉末形態を食品又は飲料に添加して、別の栄養食品を提供する。いくつかの実施形態では、栄養飲料は、例えば、果物、野菜、ヨーグルト、乳汁、及び／又はアイスクリームと一緒に調合する。一部の実施形態では、栄養補助食品は、スムージーの粘度まで混合する。特定の実施形態では、栄養飲料は、例えば、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、プロバイオティクス、及び／又はプレバイオティクスで強化する。いくつかの実施形態では、栄養飲料は、ラクトースフリー及び／又はグルテンフリーである。一部の実施形態では、栄養補助食品は、有機質である。小児用栄養飲料の例として、ＰＥＤＩＡＳＵＲＥ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＳＭＡＲＴ（登録商標）、及びＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）Ｊｕｓｔ Ｆｏｒ Ｋｉｄｓが挙げられる。成人用栄養飲料の例としては、ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）、ＢＯＯＳＴ（登録商標）、ＮＥＳＴＬＥ（登録商標）、ＣＡＲＮＡＴＩＯＮ（登録商標）ＩＮＳＴＡＮＴ ＢＲＥＡＫＦＡＳＴ（登録商標）、ＧＬＵＣＥＲＮＡ（登録商標）、ＧＬＹＴＲＯＬ（登録商標）、ＮＵＴＲＥＮ（登録商標）、及びＰＥＰＴＡＭＥＮ（登録商標）が挙げられる。栄養補助食品には、乳汁、豆乳及び牛乳の両方（例えば、全乳、セミスキム若しくは低脂肪、スキム若しくは脱脂乳（例えば、Ｃｒａｖｅｎｄａｌｅ）、ラクトースフリー（例えば、ＬＡＣＴＯＦＲＥＥ（登録商標））も含まれる。

Ｉ ｖｉｉ．哺乳動物乳ＯＰＮの投与
Ｉ ｖに記載したように、哺乳動物に対する経口投与のために調合した哺乳動物乳ＯＰＮ（哺乳動物乳ＯＰＮを含有する栄養補助食品若しくは飲料を含む）は、ワクチン接種の前、ワクチン接種と同時、ワクチン接種後、又はその組み合わせで、哺乳動物に投与してよい。好ましくは、乳ＯＰＮの経口投与は、ワクチン接種の前に開始し、少なくともワクチン接種が投与されるまで、投与を継続する。乳ＯＰＮの投与をワクチン接種の前に開始する場合、投与は、ワクチン接種の少なくとも１〜２１日前、典型的には、ワクチン接種の少なくとも１〜７日前に開始し、少なくともワクチン接種が投与されるまで投与を継続するのが好ましい。有利には、乳ＯＰＮの投与期間は、ワクチン接種後に、さらに少なくとも１〜４週間延長してもよい。哺乳動物のワクチン接種が追加ワクチン接種を含む場合には、乳ＯＰＮ（又はその製剤）の投与の期間は、少なくとも追加ワクチンの送達まで延長するのが好ましい。

ＩＩ ワクチン
ＩＩ．ｉ 哺乳動物の予防又は治療的処置のためのワクチン
ワクチンは、予防及び治療機能の両方を果たすことができ、これによって、予防又は治療的処置を用いて、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強し、それにより感染症のリスクを低減するか、又は既存の感染症を治療することができる。

一実施形態によれば、ワクチンを用いて、感染症に対する免疫耐性を増大させ、ここで、ワクチンは、哺乳動物被験者における免疫原性応答を誘導することができる免疫原を含む。免疫原は、感染症を引き起こす生（好ましくは、弱毒化）又は死滅感染因子（例えば、細菌若しくはウイルス、寄生体、又は他の病原体などの微生物）の懸濁液を含んでもよい。あるいは、免疫原は、免疫原性ポリペプチド、例えば、抗原であってよく、従って、動物における免疫応答を活性化する感染因子に由来するポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、免疫原は、核酸、例えば、抗原をコード化する組換えベクター（ＤＮＡベクター又はプラスミド、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含む）であってもよく、例えば、ＤＮＡワクチンの一部として投与することができる。

一実施形態では、免疫原は、哺乳動物（例えば、ヒト）のウイルス、細菌、真菌、又は原生動物病原体から選択される病原体に由来する。本発明のワクチンで治療しようとする感染症としては、ジフテリア、破傷風、百日咳及びポリオ（典型的に、混合ワクチン、例えば、ＴａＰ／ＩＰＶワクチンにより治療される；ＭＭＲ：麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹（例えば、ＭＭＲワクチン）；結核（例えば、ＢＣＧワクチン）；Ｂ型肝炎（Ｂ型肝炎ワクチン）；Ｃ型髄膜炎（例えば、Ｃ型髄膜炎ワクチン）；頸癌／肛門癌及び性器疣贅の病原体としてのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えば、ＨＰＶワクチン）；Ａ型及びＢ型インフルエンザ（例えば、インフルエンザワクチン）；肺炎球菌感染症肺炎球菌ワクチン）；ロタウイルス（ロタウイルスワクチン）及び帯状疱疹（帯状疱疹ワクチン）が挙げられる。ワクチン接種は、主に乳幼児期の間に投与されるが、帯状疱疹に対するワクチン接種は主として高齢者に限定され、他の全ての列記される疾患に対するワクチン接種はあらゆる年齢群に関連する。

ＩＩ ｉｉ．予防又は治療的処置のためのワクチンの製剤化
ワクチンは、一般に、治療に有効な用量の免疫原（例えば、感染因子の抗原、腫瘍抗原、固定した腫瘍細胞）と、好ましくは、アジュバント及び／又は薬学的に許容される担体とを含む。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物又は混合物を指す。アジュバントは、例えば、抗原を徐放する組織デポとして、並びにまた、免疫応答１０を増強するリンパ系活性化物質としても役立つことができる（例えば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ｐ．３８４を参照）。アジュバントの例として、限定はしないが、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、サポニン、ミネラルジェル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、界面活性物質（例えば、リソレシチン）、プルロニックポリオール（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、ポリアニオン、ポリペプチド（例えば、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン）、油若しくは炭化水素エマルジョン（例えば、マンニドモノオレエート（Ａｒａｃｅｌ Ａ））、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。

ＩＩ ｉｉｉ．免疫プロトコル及び用量
ワクチンは、投与製剤と適合可能な方法で、しかも予防又は治療に有効かつ免疫原性となるような頻度及び量で投与する。ワクチンは、典型的に、感染前ワクチンとして投与されるが、感染後ワクチンとして投与することもできる。一実施形態によれば、標準的免疫プロトコルは、一次ワクチン接種を含み、これに続いて、その１、２、３、４、５、６、７、８週間後若しくはそれより後に投与される１回又は複数回の追加ワクチン接種を実施してもよい。投与しようとする量は、治療対象の被験者の年齢及び体重、例えば、被験者の免疫系が免疫応答を開始する能力、及び要望される防御度などに応じて変動する。好適な用量は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム程度の単一又は複数回サブユニットワクチンのポリペプチドであり、好ましい範囲は、０．１μｇ〜１０００μｇの範囲、例えば、１μｇ〜３００μｇの範囲で、特に約４μｇ〜１００μｇの範囲である。

ＩＩ ｉｖ．ワクチンの投与
ワクチンの投与のための従来の方法の何れも適用可能であり、そのようなものとして、活性成分を含む固体形態（丸薬、座薬若しくはカプセルなど）、又は生理学的に許容可能な分散体、例えば、スプレー、粉末若しくは液体の何れかによる経口、鼻内若しくは粘膜投与、又は注射、例えば、皮下、内皮若しくは筋内若しくは経皮適用による非経口投与が挙げられる。

座薬としての投与に適したワクチン製剤は、従来の結合剤と担体（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリアルカレングリコール若しくはトリグリセリド）を含み；このような座薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をしており、有利には、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。

ＩＩＩ 哺乳動物乳ＯＰＮの経口投与に対して応答性の集団群
本発明は、感染症に対する曝露により（及び任意選択で感染した）又はワクチン接種により、哺乳動物において誘導される特異的免疫応答を増強するために哺乳動物乳ＯＰＮの経口投与に関連する。哺乳動物は、ブタ、反芻動物、ウマ、ネコ、イヌ、及び霊長類から選択され得る。好ましくは、哺乳動物は、ヒト被験者である。哺乳動物乳ＯＰＮの経口投与が特に有益な集団群は、特に、小児期疾患（Ｉｉｉを参照）のワクチン接種期間中の新生児若しくは乳幼児；並びに一部の成人及び高齢者の場合のように、免疫系が抑制、無防備状態であるか、又は低下している何れかの個体である。これらの集団群に属するヒト被験者は、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４、及び８４歳超の年齢群に属する個体から選択され得る。

実施例１
１．プロトコル
１．１ 動物試験集団及び試験設計
過去にワクチン接種を受けたことがない妊娠した雌豚（妊娠期間約８４日；ｎ＝３）をＭｉｄｗｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｗｉｎｅ（Ｇｉｂｓｏｎ，ＭＮ）から入取した。血液サンプルを雌豚から採取して、ＥＬＩＳＡアッセイによりＦＺ特異的ＩｇＧについて試験した（ＦＺは、ヒトインフルエンザワクチンＦｌｕｚｏｎｅ（商標）である）。最も低いＦＺ特異的ＩｇＧ力価を有する雌豚を上記試験のために選択した。受け取り後、選択した雌豚をＬｉｔｔｅｒＧｕａｒｄ ＬＴ−Ｃ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｔｙｐｅ Ｃ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂａｃｔｅｒｉｎ−Ｔｏｘｏｉｄ；Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ１ Ｏｎｅ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｂａｃｔｅｒｉｎ；Ｐｆｉｚｅｒ）、及びＲｈｉｎｏｇｅｎ ＢＰＥ（Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ，Ｐａｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｂａｃｔｅｒｉｎ−ｔｏｘｏｉｄ；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）でワクチン接種した後、分娩の２週間前に追加ワクチン接種を行った。雌豚は、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）に対するワクチン接種は受けなかった。雌豚を分娩枠に収容し、抗生物質（ＢＭＤ）に富んだ妊娠期食餌を与えた。雌豚を自然に分娩させ、出産後４時間にわたり仔豚に初乳を与え、この時間内に、仔豚は雌豚の初乳に存在する抗生物質を取り込み、雌豚がワクチン接種された一般的感染症に対する受動免疫を獲得する。

１．２ 動物食餌群及びワクチン接種プログラム
次に、仔豚をランダムに３つの食餌群に分けられ、これらは、雌豚母乳代用調合乳（ＦＦ；ｎ＝１０）又は１４０ｍｇ／Ｌの牛乳ＯＰＮを補給した調合乳（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ ＯＰＮ−１０；Ａｒｌａ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｇｒｏｕｐ Ｉ／Ｓ，Ｓｏｎｄｅｒｈｏｊ １０−１２，８２６０ Ｖｉｂｙ Ｊ，Ｄｅｎｍａｒｋにより供給）（ＯＰＮ；ｎ＝１２）（雌豚母乳代用調合乳は、ＬｉｑｕｉＷｅａｎであり、Ｍｉｌｋ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｄｕｎｄｅｅ，ＩＬから入手した）の何れかを受け、第３の仔豚群（ｎ＝７）は、雌豚に授乳され（ＳＲ）、対照群として使用した（図１）。ＦＦ及びＯＰＮ仔豚は、環境が制御された室内（２５℃）のカスタマイズしたケージ中に個別に収容した。雌豚代用調合乳（牛乳タンパク質に基づく）を毎日調製して、３６０ｍＬ／ｋｇ／日の割合で２２回供給した。

７日目に、各食餌群（ＳＲ、ＦＦ、ＯＰＮ）の仔豚の半分に、ヒトインフルエンザワクチン（Ｆｌｕｚｏｎｅ（商標），Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ，ＰＡ）の０．２５ｍＬの筋肉内注射でワクチン接種した（ＳＲＶ、ＦＦＶ、ＯＰＮＶ）。ワクチン接種した仔豚は、１４日目に追加ワクチン接種（第１ワクチン接種と同じ用量）を受けた。

１．３ 血液サンプルから得られる血清の血清抗体濃度の分析
７日目（ベースライン、ワクチン接種前）及び１４日目に頸静脈穿刺により；さらに、２１日目に心臓内穿刺によって（安楽死させる直前）、血液サンプルを収集した。

採取した全ての血液サンプルから得た血清中のＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧを、本発明者らの研究室で開発したＥＬＩＳＡを用いて評価した。手短には、平底プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を、コーティングバッファー［０．５Ｍ Ｃａｒｂ／Ｂｉｃａｒｂバッファー、ｐＨ９．６］中１：８０希釈倍率の透析Ｆｌｕｚｏｎｅ（商標）ワクチンでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）により１時間室温（ＲＴ）でウェルをブロックした。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳで希釈した血清５０μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで再度洗浄した後、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ中１：４００の希釈倍率で、ペルオキシダーゼに結合したヤギ−ブタＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を３７℃で１時間添加した。ＴＭＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及び室温で２０分間インキュベートした後、５０μＬの２Ｎ硫酸を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により、各ウェルについて４５０ｎｍで吸光度を測定した。既知量のＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧを含む陽性ストック血清のサンプルを各プレートに１：２，０００〜１：８０，０００の希釈倍率で添加し、これを用いて、Ｆｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧ濃度の標準曲線を作製した。Ｆｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧは、標準曲線の直線部分から計算した任意単位で表した。

採取された血液サンプル由来の血清の全ＩｇＧ及びＩｇＭ濃度を、市販されているＥＬＩＳＡキットを用いて測定した（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）。

１．４ 血清抗体濃度の統計分析
ＳＡＳ内の時間に関する多項式対比（Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．２，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）と共に、反復測定分析を用いて、免疫グロブリンの循環レベル（ＦＺ特異的ＩｇＧ、全ＩｇＧ及び全ＩｇＭ）を試験した。この分析は、完全データセットを用いて、ワクチン接種及び非ワクチン接種群内で個別に実施した。２１日目に採取した血液サンプルについて実施した測定結果を、確率変数として、本来の同腹仔でのＰｒｏｃ Ｍｉｘｅｄ分析を用いて試験した。分析した主要効果は、食餌、ワクチン接種、並びに食餌及びワクチン接種の相互作用であった。相互作用は、それが有意でない場合、モデルから除去した。データは、平均値±ＳＤとして記録した。ｐ＜０．０５の比較結果は有意とみなし、ｐ＜０．１のものを傾向（ｔｒｅｎｄ）とみなした。

１．５ 動物試験群からの組織サンプル収集
出産から２１日後に安楽死させる前に、仔豚に鎮静剤Ｔｅｌａｚｏｌ（７ｍｇ／ｋｇ（体重）、ＩＭ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）を投与してから、心臓内穿刺により、末梢血をヘパリン添加真空チューブ中に収集した。続いて、ナトリウムペントバルビタール（７２ｍｇ／ｋｇ（体重）、Ｆａｔａｌ Ｐｌｕｓ，Ｖｏｒｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅａｒｂｏｒｎ，ＭＩ）の注射により仔豚を安楽死させた。幽門括約筋及び回盲弁から小腸を切除し、小腸の全長を測定した後、近位末端から１０％及び８５％の地点で小腸を切断し、十二指腸、空腸及び回腸にそれぞれ対応する３つのセグメントを得た。単核細胞の単離のために、膵臓及び回腸腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）サンプルも切除した。

１．６ 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
末梢血をまずＲＰＭＩ−１６４０（２：１；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に塗布した後、２０℃、４００×ｇで４０分スピンした。勾配界面からＰＢＭＣを収集し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、並びに１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン（１００００Ｕ／ｍｌのストック、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬのストック、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した洗浄バッファー（ハンクス緩衝塩類溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｃａ＋＋なし、Ｍｇ＋＋なし、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３回洗浄した。ペレット中に残った赤血球を溶解バッファー（０．１５ＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、及び０．１ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ）で溶解させた。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２０ｍＭ １０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させた。生存細胞の数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。次に、フローサイトメトリー又はｅｘ ｖｉｖｏ細胞刺激による表現型細胞同定のために、細胞を用いた。

１．６ 膵臓及びＭＬＮからの全免疫細胞の単離
収集バッファー（ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、０．０１Ｍ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）に、膵臓及びＭＬＮサンプルを導入し、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋抗体（５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）で３回洗浄した。次に、組織をＨＢＳＳ中で均質化した後、Ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて細断した。１００μｍ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、続いて４０μｍセルストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を通して、組織ホモジネートを濾した。単離した細胞を、赤血球細胞の溶解後に洗浄バッファーで３回洗浄してから、完全培地（ＰＲＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２０ｍＭ １０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）に懸濁させた。前述したように、生存細胞の数を評価した。

１．７ ＰＢＭＣ、並びにＭＬＮ及び膵臓から単離した全免疫細胞の表現型同定
末梢血、ＭＬＮ及び膵臓からの単核亜集団の表現型を、１群のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）標識ｍＡｂを用いたフローサイトメトリー（ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩ、Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ）によりモニターした。Ｔ−リンパ球を、マウス抗ブタＣＤ４（ＦＩＴＣ、クローン７４−１２−４）及びマウス抗ブタＣＤ８（ＰＥ、クローン７６−２−１１）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により同定した。１０μｌの各抗体を各サンプルからの１×１０^６細胞に添加した。氷上で染色手順を実施し、可能なときにサンプルを遮光した。手短には、各ウェルを５％マウス血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃ）及び２００μｇ／ｍＬの精製マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で各々５分間ブロックした。遠心分離後、ＣＤ３をウェルに添加し、２０分間インキュベートした（５０μＬ：ＣＤ３：ＰＥ−Ｃｙ５）後、再度遠心分離した。ＣＤ４：ＦＩＴＣ及びＣＤ８：ＰＥを添加し（各々１０μＬ）、さらに１５分インキュベートしてから、遠心分離した。細胞をＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウムで洗浄した後、２％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメトリー（ＢＤ（商標）、Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ）を用いて、細胞を評価した。

ＦｌｏｗＪｏ ７．９ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、Ｔ細胞亜集団のパーセンテージを決定した。ＣＤ３＋イベントをＴ細胞とみなす。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−イベントはＴヘルパー細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋は、細胞傷害性Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞とそれぞれみなした。ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８＋イベントは、標識したナチュラルキラー細胞であった。

１．７ 末梢血単核細胞及び膵細胞のｅｘ ｖｉｖｏ刺激：
免疫系の機能的能力の指標として、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激アッセイを実施した。合計２×１０^６／ｍＬの血液由来単核細胞及び膵臓由来細胞を、９６ウェルプレートにおいて、最終容量２００μＬの培地（２０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地）中で、５％ＣＯ_２下、３７℃で７２時間かけて平板培養した。１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の５０μＬの溶液、０．８μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）の５０μＬの溶液、又は１８０μｇ／ｍＬのＦｌｕｚｏｎｅ（商標）の１８μＬの溶液の何れかを、ＯＰＮ（１０μｇ／ｍＬで１０μＬ）の存在若しくは非存在下でウェルに添加した。７２時間のインキュベーション期間後、プレートを遠心分離して、上清をサイトカイン分泌の測定のために回収した。

１．８ ｅｘ ｖｉｖｏ刺激した細胞によるサイトカイン分泌の測定
ＩＬ−１０、ＩＬ−６及びＩＬ−１２／ＩＬ−２３ ｐ４０について市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、サイトカイン分泌を測定した。手短には、製造者により推奨される濃度を用いて、捕捉抗体で９６ウェルプレートを４℃で一晩塗布した。プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて、室温で１時間ブロックした。ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μＬの非希釈上清をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：１８０希釈した検出抗体の添加前に、ウェルを再度洗浄し、プレートを２時間インキュベートした。ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート溶液をウェルに添加して、２０分間インキュベートした後、ＴＭＢ基質反応物を添加した（ＯｐｔＥＩＡ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。２０分のインキュベーション後、反応を５０μＬの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で停止した。プレートリーダにより、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。

２．結果
２．１ 調合乳供給仔豚へのＯＰＮ補給は、その体重増加に全く影響を与えない
全群の仔豚が、正常な体重増加であることが判明した。調合乳へのＯＰＮの補給又はワクチン接種は、仔豚の体重増加に影響を与えなかった（図２）。ＳＲ群の体重（図２に差し込む）は、誕生から１５日目まで調合乳供給と同等であったが、１６日目までには体重が、ＦＦ又はＯＰＮを上回った。

２．２ 調合乳供給仔豚におけるＦｌｕｚｏｎｅ（商標）特異的ＩｇＧは、食餌ＯＰＮ補給により、雌豚授乳仔豚のレベルに対して増強される。
７、１４及び２１日齢仔豚からの血清中のＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。陽性対照サンプルを、ＦＺ特異的ＩｇＧの相対量の計算のための標準曲線として使用し、値を任意単位として記録した（図３）。全体的な反復測定統計は、ワクチン接種（ｐ＝０．０００５）及び時間（ｐ＝０．０００１）効果を示したが、食餌処置効果は全く示さなかった。時間効果のさらなる多項傾向分析は、有意な線形及び二次（ｐ＜０．０５）対比を示した。非ワクチン接種群の事後統計分析は、循環ＦＺ特異的ＩｇＧが一般に低く、食餌により影響されないことを示した。しかし、ＦＺ特異的ＩｇＧ濃度は、７日目から１４日目及び２１日目まで有意に低下した（ｐ＜０．０５）。ワクチン接種は、ＦＺの最初の投与後に、ＦＺ特異的ＩｇＧの血清レベルに影響をもたらさなかった。１４日目に投与した追加用量後、２１日目までに、３つの処置群からの動物はすべて、ＦＺワクチンに応答した。ＯＰＮＶ仔豚におけるＦＺ特異的ＩｇＧの濃度は、ＳＲＶ仔豚と同等であり、何れも、ＦＦＶ仔豚より有意に高かった（ｐ＜０．０５）（３つの群における測定レベルは、それぞれ、３７１±３２９、４００±１７１及び１３７±１５７である）。

２．３ ワクチン接種及び非ワクチン接種仔豚の血清中のＩｇＧ及びＩｇＭ総力価は、時間が経過と共に低下する。
ＥＬＩＳＡにより測定した血清中の全ＩｇＧレベル（図４）は、食餌又はワクチン接種により影響されなかった。しかし、測定した全ＩｇＧレベルの時間経過による着実な低下は、統計的に有意であり（ｐ＜０．０１）、反復測定分析後に有意な線形変化を伴った（ｐ＜０．００２）。２１日目のＰｒｏｃ混合分析は、非ワクチン接種（それぞれ、７．５±２．５及び５．９±２．７ｍｇ／ｍＬ）と比較して、ワクチン接種仔豚で、より高い全ＩｇＧレベルの傾向パターン（ｐ＝０．０９）を示した。さらに、ワクチン接種によって、ＯＰＮ群における全ＩｇＧレベルは、約２倍（９６％）増大したが、ＦＦ及びＳＲ仔豚に観測された変化（それぞれ、０及び１０％）は、かなり小さかった。この全ＩｇＧレベルの増大は、食餌によるＯＰＮ補給を受けた仔豚における適応免疫応答を生み出す優れた能力を表している。全ＩｇＭ濃度は、食餌又はワクチン接種により影響されなかったが、出産後の期間の初めに低下した（ｐ＜０．００１；ｐ＜０．０００１での線形及び二次対比）。図５は、各食餌処置の非ワクチン接種及びワクチン接種群からのデータをプールした後の全ＩｇＭレベルを示す。

２．４ 食餌及びワクチン接種は、リンパ球の表現型プロフィールに影響を与えた
２１日目に採取した脾臓、ＰＢＭＣ及びＭＬＮサンプル中の単核亜集団の表現型は、１群のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）標識ｍＡｂを用いたフローサイトメトリーにより同定した。細胞は、実施例１．７に記載したように、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、二重陽性メモリーＴ細胞又はナチュラルキラー細胞（ＮＫＣ）（図６）として同定した。ＰＢＭＣ及び統計分析（非有意の場合、食餌＊ワクチン接種の相互作用を除去する）におけるリンパ球の表現型プロフィールを表１に記載する。適応免疫応答に積極的役割を有するＴ−ヘルパー（ＣＤ４＋）細胞は、食餌に応答性であるが、ワクチン接種に対して応答性ではなかった。Ｔ−ヘルパー細胞は、ＦＦ及びＳＲ動物より、ＯＰＮにおいて有意に高かった（それぞれ、４２．２％及び４１．３％に対して４９．４％、図７Ａ）。細胞質病原体に対する宿主防御に重要な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）も、ワクチン接種によって影響されなかったが、食餌効果は、差の傾向を示した。最小二乗平均の差によって、ＳＲ群中のＴ細胞傷害性細胞の％がＯＰＮより有意に高く（ｐ＝０．０１８）、傾向レベルのＦＦより高いことが判明した（ｐ＝０．０６）（図７Ｂ）。単核細胞集団に対する食餌の効果をよりよく理解するために、Ｔ−ヘルパー：Ｔ−細胞傷害性の比を計算した（図７Ｃ）。ＯＰＮ（２．７３±０．８９）及びＦＦ（２．２４±０．９０）仔豚のＰＢＭＣにおけるＴ−ヘルパー：Ｔ−細胞傷害性の比は、ＳＲ仔豚（１．７１±０．４８）のそれより有意に高かった。Ｔ−ヘルパー：Ｔ−細胞傷害性の比のこのような増加は、ワクチン接種した動物、特に、ＯＰＮ補給食餌を受けた仔豚で、免疫系が感作されて、ワクチン特異的抗体を生成することを示している。

メモリーＴ細胞の集団（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋について二重陽性）は、ワクチン接種により有意に影響を受け、食餌のみは、傾向を示した（ｐ＝０．０５２）。ワクチン接種は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋メモリー細胞と同様に、ＣＤ３＋細胞の％に２１％の減少を招いた。ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の集団（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）は、ワクチン接種後に変化し、非ワクチン接種動物の１４．８％からワクチン接種動物の２３．７％への有意な（ｐ＜０．０５）増加を示したが、食餌の効果はなかった。

実施例１．７に記載したように、ＭＬＮから免疫細胞を単離し、細胞集団をＣＤ３＋の％及びＣＤ３−の％として識別した（表２）。ワクチン接種は、調べたＭＬＮ細胞の何れにも有意な影響をもたらさなかった。ＯＰＮ群（１３．７％）におけるＴ−細胞傷害性細胞の数（１３．７％）は、ＳＲ群の数（１２．０％）に極めて類似しており、これらは何れも、ＦＦ動物と有意に相違した（１６．６％、図８Ａ）。食餌は、Ｔ−ヘルパーとして％ＣＤ３＋細胞を変化させなかったが、Ｔ−細胞傷害性細胞の集団を有意に（ｐ＜０．０５）改変した。同様に、ＯＰＮ及びＳＲのＴ−ヘルパー／Ｔ−細胞傷害性の比の値は同等であり、しかも、ＦＦの場合より有意に高かった（図８Ｂ）。ＰＢＭＣにみられるＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比の増加は、食餌ＯＰＮを受けた仔豚におけるワクチン接種に対する適応体液性応答の増強を表している。ＳＲ仔豚におけるＮＫ細胞集団は、両方の調合乳群より高かったが、統計的有意性は傾向レベルで（ｐ＜０．０６）到達した。

脾臓から単離した単核細胞の分布を表３に示す。脾臓中のＴ−ヘルパー細胞及びＴ−細胞傷害性細胞は、ワクチン接種より影響を受けたが、食餌処置では受けなかった。メモリー細胞としてのＣＤ３＋の％は、食餌及びワクチン接種により影響された。ワクチン接種は、メモリー細胞の集団を増加したが、これは、適応（体液性）応答を定着させる上で重要である。特に、両方の調合乳供給群（ＯＰＮ及びＦＦ群）が、ＳＲより有意に高いメモリー細胞のレベルを有した（図９）。ＮＫ細胞は、他の全ての処置群と比較して、非ワクチン接種ＳＲ動物において有意に高かった。ワクチン接種は、脾臓中のＮＫレベルに影響しなかった。Ｔ−ヘルパー（ＣＤ４＋）／Ｔ−細胞傷害性（ＣＤ８＋）比もまた、ワクチン接種仔豚の脾臓、特にＳＲ又はＯＰＮを供給した仔豚の脾臓において増加すると思われ、適応免疫応答の誘導をもたらす。

２．５ ｅｘ ｖｉｖｏ刺激及び単離免疫細胞によるサイトカイン分泌：
ＰＢＭＣ及び脾細胞の細胞免疫応答を評価するために、単離した細胞は、ＰＨＡ、ＬＰＳ若しくはフルゾン（ｆｌｕｚｏｎｅ）と一緒に７２時間インキュベートした。植物レクチンであるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と、細菌細胞壁成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、それぞれＴ細胞及びＢ細胞を活性化するマイトジェンである。免疫細胞の活性化により、サイトカインの分泌が起こる。インターフェロンβ２としても知られるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、急性炎症から獲得免疫又は慢性炎症性疾患の何れかへの移行に不可欠な多面αへリカルサイトカインである。インターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、抗炎症性Ｔｈ２サイトカインであるが、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）又は細胞傷害性リンパ球成熟因子としても知られる炎症性Ｔｈ１サイトカインである。培地において１０μｇ／ｍＬのＯＰＬの存在又は非存在下、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養を実施した。ＯＰＮの添加は、アッセイしたサイトカインの分泌に何ら有意な影響をもたらさなかったため、ＯＰＮ処置及び非処置細胞からのデータをプールした。ＰＢＭＣ及び脾臓に対する全ての処置についてのサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）のデータを表４及び５にそれぞれまとめる。次に、統計的有意差に基づき、統計的に有意なデータをプールし、図１０〜１７に示す。

末梢血単核細胞：非刺激ＰＢＭＣにおいて、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の濃度は、検出レベルに満たなかった（表４）。ＩＬ−１２は、非刺激細胞の上清中に検出され、食餌及びワクチン接種の何れの効果も統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図１０）。ＩＬ−１２は、全ての他の処理群に対して、ＯＰＮＶ群のＰＢＭＣにおいて最も高かった。ＰＢＭＣ中のサイトカインのＰＨＡ刺激は、ワクチン接種により影響を受けなかった。しかし、ＩＬ−１２分泌への食餌の影響は統計的に有意に高く、ＯＰＮＶにおいて最も高い分泌が観測された（図１１Ａ）。ＩＬ−１０分泌は、食餌群の間で異なる傾向を示し、ＯＰＮ群から得られた細胞は、ＳＲ及びＦＦ仔豚から得られた細胞より高い傾向にあった（図１１Ｂ）。

ＩＬ−６及びＩＬ−１２の濃度は、ワクチン接種とは無関係に、ＳＲ及びＦＦ群に関して、ＯＰＮ給餌仔豚に由来するＬＰＳ刺激ＰＢＭＣにおいて、有意により高かった（ｐ＜０．０５）（それぞれ、図１２Ａ及びＢ）。類似のパターンが、ＩＬ−１０分泌のＬＰＳ刺激に認められ、ＯＰＮに対する曝露によって、より高い濃度のＩＬ−１０が得られた。さらに、ワクチン接種により、ＯＰＮ及びＳＲ群に、より高いＩＬ−１０レベルがもたらされた（図１２Ｃ）。

ＩＬ−１２に対するＦｌｕｚｏｎｅ刺激の効果は、ワクチン接種依存性であり、食餌及びワクチン接種の間に統計的に有意な相互作用があった（図１３Ａ）。ワクチン接種の結果、ＳＲＶ及びＦＦＶにはＩＬ−１２の分泌の低減が起こったが、ＯＰＮ群は、不変のままであった。Ｆｌｕｚｏｎｅ刺激細胞におけるＩＬ−１０分泌は、ＳＲ及びＦＦと比較して、ＯＰＮ給餌群の方が高かったが、ワクチン接種した仔豚のＩＬ−１０の濃度は低かった（図１３Ｂ）。

脾臓免疫細胞：脾臓から単離した細胞をＰＨＡ、ＬＰＳ及びＦｌｕｚｏｎｅで刺激して、７２時間のインキュベーション後に収集した上清中のサイトカイン産生を測定した（表５）。脾細胞は、本試験で使用した刺激因子に応答してＩＬ−６を全く産生しなかった。反対に、ＩＬ−１２は、非刺激細胞の上清中でみいだされた（図１４Ａ）。ＳＲ及びＦＦ群からの細胞は、より高い量のＩＬ−１２を分泌したが、食餌ＯＰＮ及びワクチン接種は、ＩＬ−１２濃度を低減する傾向があった（ｐ＝０．０７）。非刺激細胞の上清中のＩＬ−１０濃度は、ＳＲＶ群中で最も高かった（図１４Ｂ）。ＰＨＡ刺激に応答した脾細胞によるＩＬ−１２及びＩＬ−１０分泌は、同等であった。ワクチン接種は、非ワクチン接種群で認められたレベルと比較して、ＩＬ−１２（図１５Ａ）及びＩＬ−１０（図１５Ｂ）の濃度を低減した。さらに、ＯＰＮ群は、ＳＲ及びＦＦ群より、何れのサイトカインのレベルも有意に低かった。同様に、ＩＬ−１２分泌は、ＬＰＳに応答して、ワクチン接種仔豚より、非接種仔豚由来の細胞の上清中で有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図１６Ａ）。ＯＰＮ群から得られた細胞は、ＳＲ及びＦＦ群に比べて、最も低い量のＩＬ−１２を分泌した。ＬＰＳ刺激細胞中のＩＬ−１０は、ワクチン接種により影響を受けなかったが、ＦＦ及びＯＰＮ群よりＳＲ群の方が高かった（図１６Ｂ）。Ｆｌｕｚｏｎｅ刺激時に、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０分泌は、ワクチン接種群において最も低く（ｐ＜０．０５）、ＯＰＮ動物から単離した細胞は、ＳＲ及びＦＦより低いＩＬ−１２を分泌した（図１７）。

結論として、仔豚がＯＰＮを補給した調合餌を受けると、その胃細胞は、一定濃度のＯＰＮに曝露される。これは、雌豚授乳の仔豚とは対照的であり、その場合、雌豚の初乳の供給が雌豚の乳汁に代わるため、仔豚が受けるＯＰＮのレベルは低下し、ＯＰＮ補給調合餌中に供給される１４０ｍｇ／Ｌより低くなる。ＯＰＮ補給調合餌を受ける仔豚は、調合餌供給又は雌豚授乳の仔豚由来の細胞と比較して、免疫刺激因子の非存在及び存在下の両方で、ｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートすると、より多くのＩＬ−１２及びＩＬ−１０を分泌する免疫細胞を特徴とする（ＰＢＭＣ）。これは、食餌ＯＰＮが、ＰＢＭＣ細胞を感作して、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０を分泌する効果を有するというエビデンスを提供する。ＯＰＮ調合餌供給仔豚からのＰＢＭＣが、ＰＨＡ（Ｔ細胞活性化）及びＬＰＳ（Ｂ細胞活性化）による刺激時にＩＬ−１２（炎症性）及びＩＬ−１０（抗炎症性）を分泌する能力は、免疫均衡に向けて調整される免疫機構を示唆している。

実施例２
乳児に投与するＬａｃｐｒｏｄａｎ（登録商標）ＯＰＮ−１０を用いた臨床試験
２．１ 試験設計
調合乳へのウシＯＰＮの添加の効果を評価するために、中国上海で二重盲検式ランダム化臨床試験を実施した。母親は、１〜６月齢の乳児に母乳又は調合乳の何れを授乳するかを選択した。群分けは以下の通りであった（ｎ＝６０／群）：
１）母乳供給乳児
２）ＯＰＮを添加していない標準調合乳（ＲＦ）を供給される乳児（Ｆ０）
３）約６５ｍｇのＯＰＮ／ＬでウシＯＰＮを添加したＲＦ（Ｆ６５）
４）約１３０ｍｇのＯＰＮ／ＬでウシＯＰＮを添加したＲＦ（Ｆ１３０）
＊（非補給）標準調合乳中に認められたＯＰＮの基本レベルは、約１５ｍｇＯＰＮ／Ｌである。

人体測定を毎月記録し、静脈穿刺により１、４及び６月齢で静脈血サンプルを採取した。血液学、免疫パラメータ、血漿アミノ酸及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）を分析した。

２．２ 試験結果
感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌若しくはアメーバ感染症）に応答した乳児の発熱の発生率は、母乳供給乳児と比較して、標準調合乳を受ける乳児（Ｆ０）において有意に増加した（図１８）。６５ｍｇのＯＰＮ／Ｌ又は１３０ｍｇのＯＰＮ／Ｌの量で標準調合乳にＯＰＮを添加し、標準調合乳と一緒に供給すると、発熱の高い発生率が、母乳供給乳児にみられる低い発生レベルに接近するレベルまで低減することがみられた。標準調合乳を受ける乳児の群（Ｆ０）は、母乳供給乳児と比較して、発熱の発生率に統計的に有意な増加を示す唯一の群であった。

参照文献：
Ａｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １１０（２）：１−２２．
Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９５（２）：５６７−５７９、
Ｐｌｏｔｋｉｎ，ＳＡ，２００８；Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ４７：４０１−４０９
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｅｎｔｙ−ｅｉｇｈｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：２０４０−２０４９

Claims (18)

1. 哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物であって、前記栄養組成物が哺乳動物乳オステオポンチンを含み、当該オステオポンチンが経口投与用であることを特徴とする栄養組成物。
2. 請求項１に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記哺乳動物乳が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの任意の組み合わせの中から選択されることを特徴とする栄養組成物。
3. 請求項１に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンがウシ由来であり、かつ配列番号１の残基１７〜２７８のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド；及びＲＧＤモチーフのＣ末端である位置でのｉｎ ｖｉｖｏペプチド結合切断により前記ＯＰＮポリペプチドから得られる４０ｋＤａの活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含む栄養組成物。
4. 請求項１に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンがウシ由来であり、かつ配列番号１の残基１７〜２７８のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド；及び前記アミノ酸配列が、配列番号１の残基１７〜１６３である活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含む栄養組成物。
5. 請求項１又は２に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンが前記哺乳動物における体液性免疫を強化することを特徴とする栄養組成物。
6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする栄養組成物。
7. 請求項１乃至６の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記ヒトが、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４歳、及び８４歳超の年齢の中から選択される年齢群に属することを特徴とする栄養組成物。
8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、哺乳動物における感染症に対する前記免疫耐性が、ワクチン接種により誘導されることを特徴とする栄養組成物。
9. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記感染症が、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、Ｂ型肝炎、Ｃ型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択されることを特徴とする栄養組成物。
10. 哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物が、ワクチン及び哺乳動物乳オステオポンチンを含み、前記オステオポンチンが、経口投与用であり；前記オステオポンチンの投与が、前記ワクチンにより誘導される免疫耐性を増強することを特徴とするワクチン組成物。
11. 請求項１０に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記哺乳動物乳オステオポンチンが、前記哺乳動物における体液性免疫を強化することを特徴とするワクチン組成物。
12. 請求項１０又は１１に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ、及びこれらの任意の組み合わせの中から選択されることを特徴とするワクチン組成物。
13. 請求項１０に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ由来であり、かつ配列番号１の残基１７〜２７８のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド；及びＲＧＤモチーフのＣ末端である位置でのｉｎ ｖｉｖｏペプチド結合切断により前記ＯＰＮポリペプチドから得られる４０ｋＤａの活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含むワクチン組成物。
14. 請求項１０に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ由来であり、かつ配列番号１の残基１７〜２７８のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド；及び前記アミノ酸配列が、配列番号１の残基１７〜１６３である活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含むワクチン組成物。
15. 請求項１０乃至１４の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、前記哺乳動物のワクチン接種の前；前記哺乳動物のワクチン接種と同時；若しくは前記哺乳動物のワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与用であることを特徴とするワクチン組成物。
16. 請求項１０乃至１５の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とするワクチン組成物。
17. 請求項１０乃至１６の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記感染症が、インフルエンザ；ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、Ｂ型肝炎、Ｃ型髄膜炎；ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス；Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択されることを特徴とするワクチン組成物。
18. 請求項１０乃至１７の何れか１項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記ヒトが、０〜５、６〜１１、１２〜１８、１９〜３４、３５〜４４、４５〜５４、５５〜６４、６５〜７４、７５〜８４歳、及び８４歳超の年齢の中から選択される年齢群に属することを特徴とするワクチン組成物。

Images