JP6509833B2 - 免疫応答性を増強するための哺乳動物乳オステオポンチン - Google Patents

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Description

本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト被験者における感染症に対する免疫応答性の向上、並びにヒトなどの哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置のためのワクチン接種の効力の増強に関する。哺乳動物乳オステオポンチン(OPN)、又はその活性切断部分の経口投与が、哺乳動物の免疫応答性を増強すると共に、哺乳動物においてワクチン接種により誘導される免疫応答を増強し、これによって、ワクチン接種の予防又は治療効果を増強することが判明している。
免疫系は、生存生物において疾患に対する一次防御機構を賦与し、これによって、病原体及び外来生物が免疫系の成分により検出され、排除される。自然免疫応答は、感染に対する第1防御ラインとして機能し、これは、顆粒球(好塩基球、好酸球及び好中球)、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞(NKC)並びにマクロファージ及び樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)、並びに補体タンパク質などの液性因子を含む。第2防御ラインとしての適応免疫応答は、発生が遅く、病原体排除のための細胞性及び体液性応答の選択を含む。細胞性免疫は、主としてTh1誘導性であり、易感染性宿主細胞(例えば、ウイルス若しくは病原体感染細胞)を破壊する役割を果たす細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー細胞(NKC)及び活性化マクロファージの分化を引き起こす。体液性免疫は、抗原特異性及び抗原記憶の増大として発現し、それによって、Th2活性化及びサイトカイン生成が、抗体産生B細胞及び記憶細胞の生成をもたらし、これらは、病原体由来抗原の認識及び病原体排除を促進する。
新生哺乳動物の自然免疫は、未発達であるため、新生児における疾患耐性は、母乳、特に初乳から受ける移行抗体の受動獲得に大きく依存する。同時に、乳児の免疫系の発達は、母乳中に存在する免疫刺激成分により誘導される。母乳ではなく、調合乳を与えた新生哺乳動物における免疫系の発達は、そうでなければ母乳中に供給されたであろう主要な免疫誘導及び免疫賦与成分の不足のために遅れる。
免疫系の維持は、一生涯の健康に不可欠であり続けることから、あらゆる年齢の免疫無防備状態の個体、並びに免疫が徐々に低下する高齢の個体は、疾患関連死のリスクが高い患者群の典型である。
感染症に対する免疫耐性を高めるためのワクチン接種は、公衆衛生を改善する最も有効な方法である。ワクチンが入手可能である疾患の種類は、絶えず増加しており、成人集団、特に、増大する高齢者集団を防御するための上記ワクチンの使用が増加している。ワクチン接種は、予防又は治療目的の何れも、身体の免疫系を刺激して、所与の病原体に類似した抗原因子を認識し、それを破壊し、それを「記憶」することによって、免疫系が、再曝露時に病原体を容易に認識して、それを破壊することができるようにする。典型的には、このような因子は、病原性微生物の弱毒化若しくは死滅形態、その毒素又はその表面タンパク質の1つから作製される。
ワクチン接種の効力は、ワクチン接種を受けた被験者が、有効な免疫応答を高める能力に依存することから、ワクチン接種の有益性は、新生児又は乳幼児のように、免疫系が十分に発達していない個体、又は、一部の成人及び高齢者のように、免疫系が抑制、無防備状態、若しくは低下している個体では低減する。従って、これらの患者群における免疫応答性、特にワクチン接種に対する免疫応答を増強することができる薬剤が求められる。これらの大きな患者集団にワクチン接種するための公衆衛生計画は、極めて安全でなければならず、従って、ワクチン接種に対する免疫応答を増強するのに用いる薬剤と、その投与に用いられる手段との両方が、これらの安全要件を満たしていなければならない。
オステオポンチン(OPN)は、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化T細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞を含むいくつかの細胞型により発現される細胞外基質タンパク質である。これは、骨、腎臓、胎盤、平滑筋及び分泌上皮などの数種の組織に存在する。OPNは、細胞接着及び移動を媒介することができ、骨再吸収、血管新生、創傷治癒及び組織外傷などの正常な組織再生過程に関連する。OPNはまた、特定の病態、例えば、再狭窄、アテローム性動脈硬化、腎疾患及び腫瘍形成にも発現される。OPNをコード化する遺伝子の修飾された転写が認められており、ここで、選択的スプライシング転写物によって、特定の病態における様々なOPNの発現が起こる(Bissonnette et al 2012)。OPNは、インテグリン(細胞−細胞及び細胞−基質相互作用の両方を媒介するヘテロ二量体膜貫通受容体の大きなファミリーを含む)と相互作用することにより、その生物学的作用の多くを発揮し、炎症性疾患において役割を果たし得る。
国際公開第98/56405A1号パンフレットは、オステオポンチン活性を改変(増大若しくは低減)することにより、個体の免疫応答を調節(増大若しくは低減)する方法に関するが、OPN(例えば、組換えOPN)を投与する治療効果を支持するエビデンスが不足している。
国際公開第00/63241A2号パンフレットは、免疫応答の調節物質としてのEta−1/オステオポンチンに関するが、OPNの投与によって、感染症に対する免疫耐性を増強することを証明することができていない。
Khajoee V et al.,2006 CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,143(2):260−268は、ヒト単球由来のマクロファージ細胞培養物を用いて実施した研究に基づく、細菌感染症の防御におけるオステオポンチンの役割に関する。
図1は、動物試験集団及び試験設計を示す。仔豚を、母乳代用調合乳(FF;n=10)若しくは140mg/Lのオステオポンチンを補給した調合乳(OPN;n=12)の何れかを受けるか、又は雌豚授乳(SR;n=7)の3つの食餌群に分けた。 図2は、母乳代用調合乳(FF;n=10)若しくは140mg/Lのオステオポンチンを補給した調合乳(OPN;n=12)を受ける食餌群に属する仔豚の出産後の毎日の平均体重を示し、雌豚授乳の仔豚(SR;n=7)を差し込みグラフに示す。 図3は、ELISAにより測定した7、14及び21日齢の仔豚由来の血清中のFluzone(商標)特異的IgG力価を示す。非ワクチン接種仔豚におけるFluzone特異的IgGレベルを差し込みグラフに示す。データは、平均値±SDとして表す。様々な添え字は、p<0.05の統計的有意性を指す。非ワクチン接種群の添え字は、統計的に有意な時間の差を指し;ワクチン接種グラフの添え字は、21日目の食餌処置群同士の差を示す。 図4は、ELISAにより測定したワクチン接種及び非ワクチン接種仔豚の血清中の全IgG濃度を示す。血清は、7、14及び21日齢で採取した仔豚の血液サンプルから取得した。21日目に採取したサンプル中で測定した全IgGレベルは、差し込みグラフに示す。データは、平均値±SDとして表す。添え字は、時間経過による統計的に有意な差を指す。 図5は、ELISAにより測定した7、14及び21日齢の仔豚由来の血清中の全IgM濃度を示す。データは、平均値±SDとして表す。添え字は、時間経過による統計的に有意な差を指す。 図6は、CD4(クローン74−12−4)及びCD8(クローン76−2−11)について染色したPBMC T−リンパ球集団のフローサイトメトリー散布図を示す。4つの象限は、CD8+リンパ球(CD3+CD4+CD8+プロフィールを有する細胞傷害性T細胞);CD4+リンパ球(CD3+CD4+CD8−プロフィールを有するヘルパーT細胞)、CD4+CD8+リンパ球(CD3+CD4+CD8+プロフィールを有するメモリーT細胞)をプロットする。 図7は、21日目のPBMC中のT−ヘルパーCD4+細胞(パネルA)、細胞傷害性CD8+T細胞(パネルB)及びCD4+/CD8+比(パネルC)の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全CD3+T細胞の%として表示する。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、p<0.05の統計的有意差を示す。*は、p<0.1の統計的傾向を示す。 図8は、21日目のMLN中の細胞傷害性CD8+T細胞(パネルA)及びCD4+/CD8+T細胞比(パネルB)の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全CD3+T細胞の%として表示する。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、p<0.05の統計的に有意な差を示す。*は、p<0.1の統計的傾向を示す。 図9は、21日目の脾臓中のメモリー(CD4+CD8+)T細胞の存在量に対する食餌の効果を示す。細胞集団は、全CD3+T細胞の%として表示する。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、ワクチン接種群内の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図10は、PBMC細胞によるIL−12分泌を示す。PBMC細胞を72時間ex vivoで培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図11Aは、PBMCのIL−12分泌に対するフィトヘマグルチニン(PHA)刺激の効果を示す。図11Bは、PBMCのIL−10分泌に対するフィトヘマグルチニン(PHA)刺激の効果を示す。PBMC細胞をPHAの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.1の統計的傾向を示す。 図12Aは、PBMCのIL−12分泌に対するリポ多糖(LPS)刺激の効果を示す。図12Bは、PBMCのIL−6分泌に対するリポ多糖(LPS)刺激の効果を示す。図12Cは、PBMCのIL−10分泌に対するリポ多糖(LPS)刺激の効果を示す。PBMC細胞をLPSの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−6、IL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図13Aは、PBMCのIL−12分泌に対するFluzone刺激の効果を示す。図13Bは、PBMCのIL−10分泌に対するFluzone刺激の効果を示す。PBMC細胞をFluzoneの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士でp<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図14Aは、脾細胞によるIL−12分泌を示す。図14Bは、脾細胞によるIL−10分泌を示す。脾細胞をex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−6、IL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p=0.07の傾向を示す。 図15Aは、脾細胞のIL−12分泌に対するフィトヘマグルチニン(PHA)刺激の効果を示す。図15Bは、脾細胞のIL−10分泌に対するフィトヘマグルチニン(PHA)刺激の効果を示す。脾細胞をPHAの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し;様々な添え字は、処置群同士で、p=0.07の統計的傾向を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図16Aは、脾細胞のIL−12分泌に対するリポ多糖(LPS)刺激の効果を示す。図16Bは、脾細胞のIL−10分泌に対するリポ多糖(LPS)刺激の効果を示す。脾細胞をLPSの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図17Aは、脾細胞のIL−12分泌に対するFluzone刺激の効果を示す。図17Bは、脾細胞のIL−10分泌に対するFluzone刺激の効果を示す。脾細胞をFluzoneの存在下、ex vivoで72時間培養し、ならし培地を回収して、ELISAによりIL−10及びIL−12を分析した。データは、平均値±SDとして表し、様々な添え字は、処置群同士の食餌効果について、p<0.05の統計的有意差を示し;*は、ワクチン接種効果について、p<0.05の統計的有意性を示す。 図18は、1)母乳;2)OPNを添加しない標準調合乳(RF)(F0);3)約65mgのOPN/LでウシOPNを添加したRF(F65)及び4)約130mgのOPN/LでウシOPNを添加したRF(F130)の何れかを与えた場合の、1〜6月齢の乳児における発熱の発生率を示す。発生率は、各治療群に属する乳児が、1暦月の期間中に熱を有するとして記録された時間のパーセンテージとして表示する(暦月当たりの記録時間は、臨床試験の期間にわたって記録された値の平均値である)。
経口投与すると、哺乳動物乳オステオポンチン(OPN)及び/又は活性切断型は、意外なことに、哺乳動物被験者における特異的免疫応答性を増強し、これによって、ワクチン接種に対するその特異的免疫応答を改善することが判明している。本発明は、OPNの経口投与を用いて、ワクチン接種によって哺乳動物被験者に誘導される特異的免疫応答性を増強することができることを立証する最初の研究に基づくものである。
本発明は、例えば、疾患に対するワクチン接種によって誘導される免疫耐性を増強することにより、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する薬剤として使用するための哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型を提供し、ここで、OPN及び/又はその活性切断型は、経口投与用である。一実施形態によれば、活性切断OPNは、タンパク質分解切断による哺乳動物乳OPNから取得可能な少なくとも1種の活性OPNペプチドを含む。OPN又は活性切断型は、哺乳動物のワクチン接種の前;哺乳動物のワクチン接種と同時;若しくは哺乳動物のワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いることができる。
哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型は、哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。
哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの組み合わせの何れか1つに由来するものであってよい。
一実施形態によれば、哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型は、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するのに用いることを目的とし、ここで、哺乳動物はヒトである。一実施形態によれば、ヒトは、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84、及び84歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。
一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ;ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、B型肝炎、C型髄膜炎;ヒトパピローマウイルス;ロタウイルス;A型インフルエンザ;B型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。
本発明はさらに、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するための、ワクチンと哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型とを含むワクチン系を提供し、哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型は、ワクチン接種の前;ワクチン接種と同時;若しくはワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いる。哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型の経口投与は、ワクチン接種により誘導される、感染症に対する免疫耐性を増強する。哺乳動物乳オステオポンチン及び/又はその活性切断型は、ワクチン接種哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。
一実施形態によれば、ワクチン系は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ又はこれらの任意の組み合わせに由来するOPN及び/又はその活性切断型を含む。
ワクチン系の一実施形態によれば、哺乳動物は、ヒトである。
ワクチン系の一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、B型肝炎、C型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。
ワクチン系の一実施形態によれば、ワクチンは、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、若しくは組み合わせワクチン(例えば、TaP/IPVワクチン);麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹混合ワクチン(例えば、MMRワクチン);結核ワクチン(例えば、BCGワクチン);B型肝炎ワクチン;C型髄膜炎ワクチン);ロタウイルス(ロタウイルスワクチン);ヒトパピローマウイルス(HPV)ワクチン;A型インフルエンザ及びB型インフルエンザ(例えば、インフルエンザワクチン);肺炎球菌ワクチン;及び帯状疱疹ワクチンの中から選択される。
ワクチン系の一実施形態によれば、ヒトは、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84歳、及び84歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。
本発明はさらに、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する方法も提供し、これは、ワクチンと哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型とを哺乳動物に投与するステップを含み、ここで、OPN及び/又は1つ若しくは複数のその活性切断型は、経口投与される。哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型は、ワクチン接種哺乳動物における体液性免疫を強化することができる。
哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強する方法の一実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
方法の一実施形態によれば、OPN又はその活性切断型は、ワクチン接種の前;ワクチン接種と同時;若しくはワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与のために用いる。
方法の一実施形態によれば、OPN又はその活性切断型は、治療対象の被験者の体重kg当たり約0.05mg〜約5g/kgの範囲の毎日用量で投与する。
ヒトにおける感染症に対する免疫耐性を増強する方法の一実施形態によれば、ヒトは、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84歳、及び84歳超の年齢の中から選択される年齢群に属する。
方法の一実施形態によれば、OPN又はその活性切断型は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの任意の組み合わせから選択される哺乳動物を起源とする。
方法の一実施形態によれば、感染症は、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、B型肝炎、C型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス;A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択される。
方法の一実施形態によれば、ワクチンは、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、若しくは混合ワクチン(例えば、TaP/IPVワクチン);麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹混合ワクチン(例えば、MMRワクチン);結核ワクチン(例えば、BCGワクチン);B型肝炎ワクチン;C型髄膜炎ワクチン);ロタウイルス(ロタウイルスワクチン);ヒトパピローマウイルス(HPV)ワクチン;A型インフルエンザ及びB型インフルエンザ(例えば、インフルエンザワクチン);肺炎球菌ワクチン;及び帯状疱疹ワクチンの中から選択される。
本発明は、哺乳動物被験者、特に、調合乳が与えられる乳幼児;免疫能が低い成人(例えば、免疫無防備状態の被験者);及び高齢者における免疫応答を増強する必要性に対処する。本発明者らは、哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型が、被験者に経口投与されると、哺乳動物において免疫応答性を増強し、それによって哺乳動物のワクチン接種の効果を向上させることをみいだした。
I.哺乳動物乳オステオポンチン(OPN)及び/又はその活性切断型
I.i.哺乳動物乳OPNの構造
第1の実施形態によれば、本発明は、感染に対する免疫応答性、特に、哺乳動物における感染症に対してワクチンにより誘導される免疫耐性を増強するのに用いるための哺乳動物乳OPN及び/又はその活性切断型を提供する。
哺乳動物乳OPNは、乳腺からの分泌により生成される可溶性乳タンパク質である。哺乳動物乳OPNは、分子量が約60kDa(SDS−PAGEにより決定される)のポリペプチドとして分泌されるが、OPNの切断型と一緒に乳汁中に共存することが一般にみいだされている。他の組織に発現される選択的(転写)スプライシングOPNアイソフォームとは対照的に、乳腺からの乳OPNは、ただ1つのスプライシングアイソフォームとして存在し;乳OPNの切断型は、この分泌ポリペプチドアイソフォームのタンパク質分解切断の結果である。乳OPNは、全長ポリペプチド及びその切断型の何れも、高度にリン酸化及びグリコシル化したポリペプチドである。OPNのリン酸化及びグリコシル化の翻訳後パターンは、組織特異的であり、その生理学的特性を調節することがわかっている。乳OPNポリペプチドアイソフォームのリン酸化及びグリコシル化の高いレベル及びそのパターンは、その機能的特性に重要な際立った特徴である(Bissonnette et al 2012)。
本発明の乳OPNは、哺乳動物を起源とし、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ又はラマ乳汁に由来するものであってよい。乳OPNポリペプチドは、αインテグリン結合特性を特徴とする、いくつかの高度に保存された配列モチーフ、特にRGDモチーフを含む。哺乳動物乳OPNポリペプチドの間で保存されたこれらのモチーフの位置は、ウシOPNに関して特定されており、その一次翻訳産物アミノ酸配列を表1に記載する。
Figure 0006509833
哺乳動物乳OPNが、牛乳由来の場合、OPNは、成熟型完全長OPNポリペプチド以外に少なくとも1つの活性切断型OPNポリペプチドを含む。典型的に、1つ又は複数の活性切断型OPNポリペプチドは、分子量約40kDa(SDS−PAGEにより決定する)を有する。典型的に、1つ又は複数の切断型OPNポリペプチドは、RGDモチーフに対してC末端側の位置でのin vivoペプチド結合切断により完全長OPNポリペプチドから得られる。典型的に、少なくとも1つ又は複数の活性切断型牛乳OPNは、完全長成熟型OPNポリペプチドから得られ、成熟型OPNは、配列番号1の残基17〜278に対して決定された配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。牛乳OPNは、シグナルペプチド(配列番号1のアミノ酸残基1〜16に対応する)を有する分泌ポリペプチドであり、そのシグナルペプチドは、同時翻訳により除去されて、成熟型完全長ポリペプチドをもたらす。牛乳OPNが、完全長OPNポリペプチドを含む場合、これは、典型的に、配列番号1の残基17〜278のアミノ酸配列を有する。1つの活性切断型牛乳OPNは、トロンビン切断部位又はその近傍でのペプチド切断部位(表1)により、ウシOPNポリペプチド(配列番号1)から得られ、RGDモチーフを保持する、分子量が約40kDa(SDS−PAGEにより決定)のC末端切断型OPNポリペプチドをもたらすと推定される。
一実施形態によれば、配列番号1に対して少なくとも66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、88、90、92、94、96、98、100%のアミノ酸配列同一性を有する成熟型完全長OPNポリペプチド;及び/又は配列番号1のアミノ酸残基17〜161;17〜162;17〜163;17〜164及び17〜165の何れか1つの中から選択される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、88、90、92、94、96、98、100%のアミノ酸配列同一性を有する1つ又は複数の活性切断型OPNポリペプチド含む。
本発明に関して、「配列同一性」という用語は、好ましくは同じ長さの2つのアミノ酸配列同士又は2つの核酸配列同士の同一性の度合いの定量的測度である。比較しようとする2つの配列が等しい長さでなければ、これらは、可能な限り適合するようにアラインメントしなければならない。配列同一性は、(Nref−Ndif)*100)/(Nref)として計算することができ、ここで、Ndifは、アラインメントしたとき、2つの配列中の非同一残基の総数であり、Nrefは、標準配列の残基の数である。従って、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列同一性を有することになる(Ndif=2及びNref=8)。ギャップは、特定の残基の非同一性として計数する。すなわち、DNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAGTCと75%の配列同一性を有することになる(Ndif=2及びNref=8)。配列同一性は、例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI),USAにより提供されるBLASTpアルゴリズムなどの適切なBLASTプログラムを用いて計算することができる。
哺乳動物乳OPNは、活性切断型OPNポリペプチド(tOPN)又は完全長OPNポリペプチド(flOPN)を含んでもよく、又は2つの形態が、様々な比で存在してもよい。例えば、tOPN/flOPNの比は、0:100〜100:0の範囲であってよく;より好ましくは、上記の比は、5:95;10:90;15:85;20:80;25:75;30:70;35:65;40:60;45:55;50:50;55:45;60:40;65:35;70:30;75:35;80:20;85:15;90:10;及び95:5の何れか1つである。典型的に、牛乳中の比は、75%tOPN:25%flOPNであり、ここで、tOPNは、約40kDaの分子量(SDS−PAGEにより決定)を有する。
さらなる実施形態によれば、哺乳動物乳OPNは、切断型OPNであり、切断型OPNは、タンパク質分解切断により哺乳動物乳OPN(例えば、配列番号1を有する牛乳OPN)から誘導可能な少なくとも1つの活性OPNペプチドを含む。哺乳動物被験者の消化管を通過中に、哺乳動物OPNは、タンパク質分解酵素、とりわけエンドプロテアーゼペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンに曝露される。本発明の活性OPNペプチドは、哺乳動物の消化管中に典型的に存在するプロテアーゼへの曝露後も活性を保持するペプチドである。活性OPNペプチドは、典型的には5〜16アミノ酸残基の長さを有するインテグリン結合モチーフの一部又は全部を含むペプチドを一般に含み得る。
I.ii 哺乳動物乳OPNは、ワクチン接種により哺乳動物に誘導される特異的免疫応答性を増強する
本発明の哺乳動物乳OPNは、哺乳動物の免疫応答性を増強することができ、従って、感染症に対する曝露により(及び任意選択でそれに感染した哺乳動物において)又はワクチン接種により、哺乳動物に誘導される特異的免疫応答増大することができる完全長OPNポリペプチド(flOPN)及び/又は少なくとも1つの活性切断型OPNポリペプチドを含む。感染症に暴露された(感染した)哺乳動物又はワクチン接種哺乳動物における特異的免疫応答は、感染症の因子(感染症及びその因子の例は、IIiに詳しく記載する)又はワクチンに存在する抗原と選択的に反応する抗体分子の集団の産生を含む。本発明の切断型OPNポリペプチド又はペプチドに関して、「活性」という用語は、感染症又はワクチン接種に対する哺乳動物の特異的免疫応答を増強する能力として定義される。
ワクチン接種により誘導される特異的抗体の力価は、ワクチン接種時に統合的免疫応答のin vivo指標として一般に用いられ;また、所与のワクチンに対して特異的な、賦与され得る臨床的防御の指標でもある(Albers et al.2013)。
ワクチン接種により哺乳動物に誘導される特異的免疫応答に対する牛乳OPN投与の効果は、実施例1に例示する。この実施例では、牛乳OPNを補充した調合餌を給餌した仔豚は、21日間にわたってFluzone特異的IgGを産生することにより、Fluzoneワクチンに応答したが、仔豚の血清サンプル中のその力価は、対照調合餌供給仔豚からの血清より有意に高く、ネイティブブタOPNを含有するブタ乳汁を授乳された仔豚に認められたIgGレベルと一致した。
ワクチン接種哺乳動物における特異的免疫応答は、ワクチン抗原と複合体を形成することができる、哺乳動物由来の体液のサンプル中に存在する抗体を直接又は間接的に検出して、定量することにより、決定することができる。ワクチンが、微粒子、例えば、全細胞不活性化ワクチンである場合、定量的凝集(細胞集塊)試験を用いて、全細胞ワクチンの細胞集塊を誘導するのに十分な特異的抗体を含有する体液サンプル中の連続希釈を決定することができる。ワクチンが可溶性である、例えば、タンパク質サブユニット又はペプチドワクチンである場合、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)は、特異的抗体検出に好適な方法である。
抗体検出のためのELISAの使用は、実施例1.3に例示し、この実施例では、ブタ専用のELISAアッセイを用いて、Fluzoneワクチン特異的IgG抗体を検出する。
I.iii 哺乳動物乳OPNは、哺乳動物の体液性免疫応答性を増強する
驚くことに、例えば、食餌へのOPN補給という形態でのOPNの経口投与は、ワクチン接種哺乳動物における抗原特異的IgGのレベル増大、並びに一般により高レベルのIgGをもたらすなどの体液性免疫の強力な刺激を誘導する。これは、実施例1に例示しており、この実施例では、OPN補給調合餌を受けた仔豚を、調合餌を受けた仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較する。この応答の原因は、OPN調合餌を受けた仔豚に認められる免疫系のいくつかの修飾にあると考えられる。第1に、OPN補給餌を受けた仔豚は、対照調合餌を受けた仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較して、高レベルのIL−10を有し、Th2応答の誘導に寄与すると共に、より高いIgGレベルをもたらす抗体分泌細胞へのB細胞の分化を刺激する。OPN誘導によるIL−10の産生は、マクロファージ活性化又は炎症誘発応答のなどの下流Th1応答を阻害する上で重要な役割も果たす。
第2に、OPN調合餌供給仔豚の血清中に認められる高レベルのIL−12は、Th1細胞の分化を刺激し、これが今度は、分化したB細胞の活性化を引き起こし、これらを誘導して抗体(IgG)を分泌させる。OPN補給餌を受けた仔豚におけるこの体液性応答の誘導は、調合餌供給仔豚又は雌豚授乳の仔豚と比較して、有意に高いレベルのCD4分泌Tヘルパー細胞、及び比較的低いレベルのCD8分泌細胞傷害性T細胞に表される。Th1及びTh2系を介したTヘルパー細胞集団は、ワクチン接種後に、観測される体液性応答、並びに重要なことには、増大したレベルの抗原特異的IgGに寄与する。調合餌で飼育した仔豚の場合、餌にOPNを添加すると、ブタが育てた仔豚に認められるレベルに対して、ワクチン接種応答が向上する。これらの研究は、食餌にOPNを添加すると、ワクチン接種に対する免疫応答を増強及び促進することができ、これによって、投与したワクチンにおける抗原に対する免疫を向上させることができるというエビデンスを提供する。この結論は、ワクチン接種により誘導される抗体の力価は、ワクチン接種により賦与される疾患に対する防御と少なくとも相対的に相関するという事実により支持される(Plotkin,SA.,2008)。
I iv 哺乳動物乳OPNは、哺乳動物の感染症に対する免疫耐性を増強する
哺乳動物、特にヒト乳幼児への本発明の哺乳動物乳OPNの経口投与は、感染症に対するその免疫耐性を増強する。これは、実施例2に記載する臨床試験において明らかに立証され、この実施例では、感染因子(例えば、ウイルス、細菌、真菌又は真核生物病原体、例えば、原生動物感染など)を原因とする、乳幼児が罹患する感染症の診断症状として、幼児の体温を測定し、高い体温を検出することにより、感染イベントの頻度をモニターした。
I.v.投与に適した哺乳動物乳OPNの調製
泌乳哺乳動物の乳汁に存在する哺乳動物乳OPNを精製して、富化OPN供給源を提供してもよく、これは、少なくとも約50%〜約60%、少なくとも約60%〜約70%、又は少なくとも約70%〜約80%の純度であってよい。一部の実施形態では、少なくとも約80〜約90%の純度であり、他の実施形態では、乳OPNの供給源は、少なくとも約90%〜約95%、又はそれを超える純度である。いくつかの実施形態では、精製した乳OPN供給源は、少なくとも約95%の純度、例えば、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは99.5%、又はそれを超える純度である。
特定の実施形態では、OPNの供給源は、精製した牛乳OPN調製物、例えば、Lacprodan OPN−10(登録商標)(Arla Foods Ingredients,Viby,Denmark)である(また、米国特許第7,259,243号明細書も参照)。Lacprodan OPN−10(登録商標)は、約22%(w/w)の完全長牛乳OPNと、約65%(w/w)の牛乳OPNアイソフォーム(切断型OPN)を含む。
I vi 哺乳動物乳OPNの製剤化及び用量決定
本発明の哺乳動物乳OPN、例えば、牛乳OPNは、治療対象の被験者の体重kg当たり約0.05mg〜約5gの範囲の毎日用量で投与してよい。例えば、毎日のOPN用量は、典型的に、体重が3〜10kgの乳幼児の場合、約5〜50mg/kg(体重)、好ましくは25〜50mg/kg(体重)の範囲である。典型的に、成人の場合、例えば、100〜250mlの1日投与量中、1日当たり0.5〜5gのOPNを投与することが推奨される。投与形態は、投与形態当たり0.1mg〜10gの範囲で哺乳動物乳OPNを含有してよい。例えば、経口投与形態は、投与形態当たり1mg〜1gの範囲の量のOPNを含有してよい。あるいは、経口投与形態は、投与形態当たり10mg〜800mgの範囲の量のOPNを含有してよい。経口投与形態は、例えば、投与形態当たり25mg〜500mgの範囲の量のOPNを含有してよい。
哺乳動物乳OPNは、栄養補助食品の形態で投与してもよく、その場合、補助食品は、0.01〜90%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含む。例えば、栄養補助食品は、0.1〜80%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、1〜70%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。
本発明の一部の実施形態では、栄養補助食品は、5〜60%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含む。例えば、栄養補助食品は、10〜50%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、0.1〜20%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。
本発明の他の実施形態では、栄養補助食品は、0.001〜5%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含む。例えば、栄養補助食品は、0.005〜2%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。あるいは、栄養補助食品は、0.01〜1%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。栄養補助食品は、例えば、0.05〜0.5%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含んでよい。典型的に、すぐ飲める栄養飲料は、0.005%〜0.05%(w/w)の範囲の量の乳OPNを含む。
乳OPNを含む栄養補助食品は、液体又は粉末形態で予め包装することができる(例えば、缶詰め若しくは瓶詰め液体飲料)。一部の実施形態では、粉末形態を食品又は飲料に添加して、別の栄養食品を提供する。いくつかの実施形態では、栄養飲料は、例えば、果物、野菜、ヨーグルト、乳汁、及び/又はアイスクリームと一緒に調合する。一部の実施形態では、栄養補助食品は、スムージーの粘度まで混合する。特定の実施形態では、栄養飲料は、例えば、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、プロバイオティクス、及び/又はプレバイオティクスで強化する。いくつかの実施形態では、栄養飲料は、ラクトースフリー及び/又はグルテンフリーである。一部の実施形態では、栄養補助食品は、有機質である。小児用栄養飲料の例として、PEDIASURE(登録商標)、PEDIASMART(登録商標)、及びRESOURCE(登録商標)Just For Kidsが挙げられる。成人用栄養飲料の例としては、ENSURE(登録商標)、BOOST(登録商標)、NESTLE(登録商標)、CARNATION(登録商標)INSTANT BREAKFAST(登録商標)、GLUCERNA(登録商標)、GLYTROL(登録商標)、NUTREN(登録商標)、及びPEPTAMEN(登録商標)が挙げられる。栄養補助食品には、乳汁、豆乳及び牛乳の両方(例えば、全乳、セミスキム若しくは低脂肪、スキム若しくは脱脂乳(例えば、Cravendale)、ラクトースフリー(例えば、LACTOFREE(登録商標))も含まれる。
I vii.哺乳動物乳OPNの投与
I vに記載したように、哺乳動物に対する経口投与のために調合した哺乳動物乳OPN(哺乳動物乳OPNを含有する栄養補助食品若しくは飲料を含む)は、ワクチン接種の前、ワクチン接種と同時、ワクチン接種後、又はその組み合わせで、哺乳動物に投与してよい。好ましくは、乳OPNの経口投与は、ワクチン接種の前に開始し、少なくともワクチン接種が投与されるまで、投与を継続する。乳OPNの投与をワクチン接種の前に開始する場合、投与は、ワクチン接種の少なくとも1〜21日前、典型的には、ワクチン接種の少なくとも1〜7日前に開始し、少なくともワクチン接種が投与されるまで投与を継続するのが好ましい。有利には、乳OPNの投与期間は、ワクチン接種後に、さらに少なくとも1〜4週間延長してもよい。哺乳動物のワクチン接種が追加ワクチン接種を含む場合には、乳OPN(又はその製剤)の投与の期間は、少なくとも追加ワクチンの送達まで延長するのが好ましい。
II ワクチン
II.i 哺乳動物の予防又は治療的処置のためのワクチン
ワクチンは、予防及び治療機能の両方を果たすことができ、これによって、予防又は治療的処置を用いて、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強し、それにより感染症のリスクを低減するか、又は既存の感染症を治療することができる。
一実施形態によれば、ワクチンを用いて、感染症に対する免疫耐性を増大させ、ここで、ワクチンは、哺乳動物被験者における免疫原性応答を誘導することができる免疫原を含む。免疫原は、感染症を引き起こす生(好ましくは、弱毒化)又は死滅感染因子(例えば、細菌若しくはウイルス、寄生体、又は他の病原体などの微生物)の懸濁液を含んでもよい。あるいは、免疫原は、免疫原性ポリペプチド、例えば、抗原であってよく、従って、動物における免疫応答を活性化する感染因子に由来するポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、免疫原は、核酸、例えば、抗原をコード化する組換えベクター(DNAベクター又はプラスミド、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含む)であってもよく、例えば、DNAワクチンの一部として投与することができる。
一実施形態では、免疫原は、哺乳動物(例えば、ヒト)のウイルス、細菌、真菌、又は原生動物病原体から選択される病原体に由来する。本発明のワクチンで治療しようとする感染症としては、ジフテリア、破傷風、百日咳及びポリオ(典型的に、混合ワクチン、例えば、TaP/IPVワクチンにより治療される;MMR:麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹(例えば、MMRワクチン);結核(例えば、BCGワクチン);B型肝炎(B型肝炎ワクチン);C型髄膜炎(例えば、C型髄膜炎ワクチン);頸癌/肛門癌及び性器疣贅の病原体としてのヒトパピローマウイルス(HPV)(例えば、HPVワクチン);A型及びB型インフルエンザ(例えば、インフルエンザワクチン);肺炎球菌感染症肺炎球菌ワクチン);ロタウイルス(ロタウイルスワクチン)及び帯状疱疹(帯状疱疹ワクチン)が挙げられる。ワクチン接種は、主に乳幼児期の間に投与されるが、帯状疱疹に対するワクチン接種は主として高齢者に限定され、他の全ての列記される疾患に対するワクチン接種はあらゆる年齢群に関連する。
II ii.予防又は治療的処置のためのワクチンの製剤化
ワクチンは、一般に、治療に有効な用量の免疫原(例えば、感染因子の抗原、腫瘍抗原、固定した腫瘍細胞)と、好ましくは、アジュバント及び/又は薬学的に許容される担体とを含む。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物又は混合物を指す。アジュバントは、例えば、抗原を徐放する組織デポとして、並びにまた、免疫応答10を増強するリンパ系活性化物質としても役立つことができる(例えば、Hood et al.,Immunology,Second Ed.,1984,Benjamin/Cummings:Menlo Park,CA,p.384を参照)。アジュバントの例として、限定はしないが、フロイントアジュバント(完全及び不完全)、サポニン、ミネラルジェル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、界面活性物質(例えば、リソレシチン)、プルロニックポリオール(例えば、Carbopol)、ポリアニオン、ポリペプチド(例えば、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン)、油若しくは炭化水素エマルジョン(例えば、マンニドモノオレエート(Aracel A))、スカシガイ(keyhole limpet)ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びBCG(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
II iii.免疫プロトコル及び用量
ワクチンは、投与製剤と適合可能な方法で、しかも予防又は治療に有効かつ免疫原性となるような頻度及び量で投与する。ワクチンは、典型的に、感染前ワクチンとして投与されるが、感染後ワクチンとして投与することもできる。一実施形態によれば、標準的免疫プロトコルは、一次ワクチン接種を含み、これに続いて、その1、2、3、4、5、6、7、8週間後若しくはそれより後に投与される1回又は複数回の追加ワクチン接種を実施してもよい。投与しようとする量は、治療対象の被験者の年齢及び体重、例えば、被験者の免疫系が免疫応答を開始する能力、及び要望される防御度などに応じて変動する。好適な用量は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム程度の単一又は複数回サブユニットワクチンのポリペプチドであり、好ましい範囲は、0.1μg〜1000μgの範囲、例えば、1μg〜300μgの範囲で、特に約4μg〜100μgの範囲である。
II iv.ワクチンの投与
ワクチンの投与のための従来の方法の何れも適用可能であり、そのようなものとして、活性成分を含む固体形態(丸薬、座薬若しくはカプセルなど)、又は生理学的に許容可能な分散体、例えば、スプレー、粉末若しくは液体の何れかによる経口、鼻内若しくは粘膜投与、又は注射、例えば、皮下、内皮若しくは筋内若しくは経皮適用による非経口投与が挙げられる。
座薬としての投与に適したワクチン製剤は、従来の結合剤と担体(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリアルカレングリコール若しくはトリグリセリド)を含み;このような座薬は、0.5%〜10%、好ましくは1〜2%の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をしており、有利には、10〜95%、好ましくは25〜70%の活性成分を含有する。
III 哺乳動物乳OPNの経口投与に対して応答性の集団群
本発明は、感染症に対する曝露により(及び任意選択で感染した)又はワクチン接種により、哺乳動物において誘導される特異的免疫応答を増強するために哺乳動物乳OPNの経口投与に関連する。哺乳動物は、ブタ、反芻動物、ウマ、ネコ、イヌ、及び霊長類から選択され得る。好ましくは、哺乳動物は、ヒト被験者である。哺乳動物乳OPNの経口投与が特に有益な集団群は、特に、小児期疾患(Iiiを参照)のワクチン接種期間中の新生児若しくは乳幼児;並びに一部の成人及び高齢者の場合のように、免疫系が抑制、無防備状態であるか、又は低下している何れかの個体である。これらの集団群に属するヒト被験者は、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84、及び84歳超の年齢群に属する個体から選択され得る。
実施例1
1.プロトコル
1.1 動物試験集団及び試験設計
過去にワクチン接種を受けたことがない妊娠した雌豚(妊娠期間約84日;n=3)をMidwest Research Swine(Gibson,MN)から入取した。血液サンプルを雌豚から採取して、ELISAアッセイによりFZ特異的IgGについて試験した(FZは、ヒトインフルエンザワクチンFluzone(商標)である)。最も低いFZ特異的IgG力価を有する雌豚を上記試験のために選択した。受け取り後、選択した雌豚をLitterGuard LT−C(Clostridium perfringens Type C and Escherichia coli Bacterin−Toxoid;Pfizer Animal Health,Exton,PA)、RespiSure1 One(Mycoplasma hyopneumoniae Bacterin;Pfizer)、及びRhinogen BPE(Bordotella bronchiseptica,Erysipelothrix rhusiopathiae,Pateurella multocida Bacterin−toxoid;Intervet Inc.,Millsboro,DE)でワクチン接種した後、分娩の2週間前に追加ワクチン接種を行った。雌豚は、ブタインフルエンザウイルス(SIV)に対するワクチン接種は受けなかった。雌豚を分娩枠に収容し、抗生物質(BMD)に富んだ妊娠期食餌を与えた。雌豚を自然に分娩させ、出産後4時間にわたり仔豚に初乳を与え、この時間内に、仔豚は雌豚の初乳に存在する抗生物質を取り込み、雌豚がワクチン接種された一般的感染症に対する受動免疫を獲得する。
1.2 動物食餌群及びワクチン接種プログラム
次に、仔豚をランダムに3つの食餌群に分けられ、これらは、雌豚母乳代用調合乳(FF;n=10)又は140mg/Lの牛乳OPNを補給した調合乳(Lacprodan OPN−10;Arla Food Ingredients Group I/S,Sonderhoj 10−12,8260 Viby J,Denmarkにより供給)(OPN;n=12)(雌豚母乳代用調合乳は、LiquiWeanであり、Milk Specialties,Dundee,ILから入手した)の何れかを受け、第3の仔豚群(n=7)は、雌豚に授乳され(SR)、対照群として使用した(図1)。FF及びOPN仔豚は、環境が制御された室内(25℃)のカスタマイズしたケージ中に個別に収容した。雌豚代用調合乳(牛乳タンパク質に基づく)を毎日調製して、360mL/kg/日の割合で22回供給した。
7日目に、各食餌群(SR、FF、OPN)の仔豚の半分に、ヒトインフルエンザワクチン(Fluzone(商標),Sanofi Pasteur,Swiftwater,PA)の0.25mLの筋肉内注射でワクチン接種した(SRV、FFV、OPNV)。ワクチン接種した仔豚は、14日目に追加ワクチン接種(第1ワクチン接種と同じ用量)を受けた。
1.3 血液サンプルから得られる血清の血清抗体濃度の分析
7日目(ベースライン、ワクチン接種前)及び14日目に頸静脈穿刺により;さらに、21日目に心臓内穿刺によって(安楽死させる直前)、血液サンプルを収集した。
採取した全ての血液サンプルから得た血清中のFluzone特異的IgGを、本発明者らの研究室で開発したELISAを用いて評価した。手短には、平底プレート(Nunc,Rochester,NY)を、コーティングバッファー[0.5M Carb/Bicarbバッファー、pH9.6]中1:80希釈倍率の透析Fluzone(商標)ワクチンでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の10%胎仔ウシ血清(FBS)により1時間室温(RT)でウェルをブロックした。ウェルをPBS/0.05%Tween−20で3回洗浄した後、PBS/10%FBSで希釈した血清50μLを添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで再度洗浄した後、PBS/10%FBS中1:400の希釈倍率で、ペルオキシダーゼに結合したヤギ−ブタIgG(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)を37℃で1時間添加した。TMB(BD Biosciences,San Jose,CA)及び室温で20分間インキュベートした後、50μLの2N硫酸を添加した。SpectraMax M2e(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)により、各ウェルについて450nmで吸光度を測定した。既知量のFluzone特異的IgGを含む陽性ストック血清のサンプルを各プレートに1:2,000〜1:80,000の希釈倍率で添加し、これを用いて、Fluzone特異的IgG濃度の標準曲線を作製した。Fluzone特異的IgGは、標準曲線の直線部分から計算した任意単位で表した。
採取された血液サンプル由来の血清の全IgG及びIgM濃度を、市販されているELISAキットを用いて測定した(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)。
1.4 血清抗体濃度の統計分析
SAS内の時間に関する多項式対比(Version 9.2,SAS Institute Inc.,Cary,NC)と共に、反復測定分析を用いて、免疫グロブリンの循環レベル(FZ特異的IgG、全IgG及び全IgM)を試験した。この分析は、完全データセットを用いて、ワクチン接種及び非ワクチン接種群内で個別に実施した。21日目に採取した血液サンプルについて実施した測定結果を、確率変数として、本来の同腹仔でのProc Mixed分析を用いて試験した。分析した主要効果は、食餌、ワクチン接種、並びに食餌及びワクチン接種の相互作用であった。相互作用は、それが有意でない場合、モデルから除去した。データは、平均値±SDとして記録した。p<0.05の比較結果は有意とみなし、p<0.1のものを傾向(trend)とみなした。
1.5 動物試験群からの組織サンプル収集
出産から21日後に安楽死させる前に、仔豚に鎮静剤Telazol(7mg/kg(体重)、IM、Fort Dodge Animal Health,fort Dodge,IA)を投与してから、心臓内穿刺により、末梢血をヘパリン添加真空チューブ中に収集した。続いて、ナトリウムペントバルビタール(72mg/kg(体重)、Fatal Plus,Vortech Pharmaceuticals,Dearborn,MI)の注射により仔豚を安楽死させた。幽門括約筋及び回盲弁から小腸を切除し、小腸の全長を測定した後、近位末端から10%及び85%の地点で小腸を切断し、十二指腸、空腸及び回腸にそれぞれ対応する3つのセグメントを得た。単核細胞の単離のために、膵臓及び回腸腸間膜リンパ節(MLN)サンプルも切除した。
1.6 末梢血単核細胞(PBMC)の単離
末梢血をまずRPMI−1640(2:1;Life Technologies,Grand Island,NY)で希釈した後、Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare,Piscataway,NJ)に塗布した後、20℃、400×gで40分スピンした。勾配界面からPBMCを収集し、2%ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich,St.Louis,MO),0.01M EDTA(Sigma−Aldrich)、500μg/mLのゲンタマイシン(Life Technologies)、並びに1000U/mLのペニシリン(10000U/mlのストック、Sigma−Aldrich)及び100μg/mLのストレプトマイシン(10mg/mLのストック、Sigma−Aldrich)を補充した洗浄バッファー(ハンクス緩衝塩類溶液(Hanks Buffered Salt Solution)、Ca++なし、Mg++なし、Life Technologies)で3回洗浄した。ペレット中に残った赤血球を溶解バッファー(0.15MのNHCl、10mMのKHCO、及び0.1mMのNaEDTA)で溶解させた。PBMCを、10%FBS、2mMグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)、20mM HEPES(Life Technologies)、及び20mM 1000U/mLのペニシリン/100μg/mLのストレプトマイシンで補充したRPMI−1640中に懸濁させた。生存細胞の数をCountess(登録商標)Automated Cell Counter(Life Technologies)で評価した。次に、フローサイトメトリー又はex vivo細胞刺激による表現型細胞同定のために、細胞を用いた。
1.6 膵臓及びMLNからの全免疫細胞の単離
収集バッファー(ハンクス平衡塩類溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)(HBSS)、50μg/mLのゲンタマイシン、0.01M 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1000U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン)に、膵臓及びMLNサンプルを導入し、PBS(Life Technologies)+抗体(50μg/mLのゲンタマイシン、1000U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン)で3回洗浄した。次に、組織をHBSS中で均質化した後、Gentle MACS(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)を用いて細断した。100μm(BD Falcon,San Jose,CA)、続いて40μmセルストレーナ(BD Falcon)を通して、組織ホモジネートを濾した。単離した細胞を、赤血球細胞の溶解後に洗浄バッファーで3回洗浄してから、完全培地(PRMI−1640、10%FBS、2mMグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM HEPES、及び20mM 1000U/mLのペニシリン/100μg/mLのストレプトマイシン)に懸濁させた。前述したように、生存細胞の数を評価した。
1.7 PBMC、並びにMLN及び膵臓から単離した全免疫細胞の表現型同定
末梢血、MLN及び膵臓からの単核亜集団の表現型を、1群のフルオレセイン(FITC)又はフィコエリスリン(PE)標識mAbを用いたフローサイトメトリー(BD(商標)LSRII、Bioscineces)によりモニターした。T−リンパ球を、マウス抗ブタCD4(FITC、クローン74−12−4)及びマウス抗ブタCD8(PE、クローン76−2−11)抗体(BD Biosciences)により同定した。10μlの各抗体を各サンプルからの1×10細胞に添加した。氷上で染色手順を実施し、可能なときにサンプルを遮光した。手短には、各ウェルを5%マウス血清(Southern Biotec)及び200μg/mLの精製マウスIgG(Invitrogen)で各々5分間ブロックした。遠心分離後、CD3をウェルに添加し、20分間インキュベートした(50μL:CD3:PE−Cy5)後、再度遠心分離した。CD4:FITC及びCD8:PEを添加し(各々10μL)、さらに15分インキュベートしてから、遠心分離した。細胞をPBS/1% BSA/0.1%アジ化ナトリウムで洗浄した後、2%パラホルムアルデヒドで固定した。LSRIIフローサイトメトリー(BD(商標)、Bioscineces)を用いて、細胞を評価した。
FlowJo 7.9ソフトウェア(FlowJo,Ashland,OR)を用いて、T細胞亜集団のパーセンテージを決定した。CD3+イベントをT細胞とみなす。CD3+CD4+CD8−イベントはTヘルパー細胞、CD3+CD4−CD8+及びCD3+CD4+CD8+は、細胞傷害性T細胞及びメモリーT細胞とそれぞれみなした。CD3−CD4−CD8+イベントは、標識したナチュラルキラー細胞であった。
1.7 末梢血単核細胞及び膵細胞のex vivo刺激:
免疫系の機能的能力の指標として、ex vivo刺激アッセイを実施した。合計2×10/mLの血液由来単核細胞及び膵臓由来細胞を、96ウェルプレートにおいて、最終容量200μLの培地(20%胎仔ウシ血清、2mM L−グルタミン、100μg/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI培地)中で、5%CO下、37℃で72時間かけて平板培養した。10μg/mLのフィトヘマグルチニン(PHA)の50μLの溶液、0.8μg/mLのリポ多糖(LPS)の50μLの溶液、又は180μg/mLのFluzone(商標)の18μLの溶液の何れかを、OPN(10μg/mLで10μL)の存在若しくは非存在下でウェルに添加した。72時間のインキュベーション期間後、プレートを遠心分離して、上清をサイトカイン分泌の測定のために回収した。
1.8 ex vivo刺激した細胞によるサイトカイン分泌の測定
IL−10、IL−6及びIL−12/IL−23 p40について市販のキット(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いて、サイトカイン分泌を測定した。手短には、製造者により推奨される濃度を用いて、捕捉抗体で96ウェルプレートを4℃で一晩塗布した。プレートをPBS中の0.05%Tweenで洗浄した後、PBS中の1%BSAを用いて、室温で1時間ブロックした。PBS中の0.05%Tweenで3回洗浄した後、100μLの非希釈上清をウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。PBS中の1%BSAで1:180希釈した検出抗体の添加前に、ウェルを再度洗浄し、プレートを2時間インキュベートした。ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート溶液をウェルに添加して、20分間インキュベートした後、TMB基質反応物を添加した(OptEIA,BD Biosciences)。20分のインキュベーション後、反応を50μLの2N HSOで停止した。プレートリーダにより、450nmの波長で吸光度を測定した。
2.結果
2.1 調合乳供給仔豚へのOPN補給は、その体重増加に全く影響を与えない
全群の仔豚が、正常な体重増加であることが判明した。調合乳へのOPNの補給又はワクチン接種は、仔豚の体重増加に影響を与えなかった(図2)。SR群の体重(図2に差し込む)は、誕生から15日目まで調合乳供給と同等であったが、16日目までには体重が、FF又はOPNを上回った。
2.2 調合乳供給仔豚におけるFluzone(商標)特異的IgGは、食餌OPN補給により、雌豚授乳仔豚のレベルに対して増強される。
7、14及び21日齢仔豚からの血清中のFluzone特異的IgG力価をELISAにより測定した。陽性対照サンプルを、FZ特異的IgGの相対量の計算のための標準曲線として使用し、値を任意単位として記録した(図3)。全体的な反復測定統計は、ワクチン接種(p=0.0005)及び時間(p=0.0001)効果を示したが、食餌処置効果は全く示さなかった。時間効果のさらなる多項傾向分析は、有意な線形及び二次(p<0.05)対比を示した。非ワクチン接種群の事後統計分析は、循環FZ特異的IgGが一般に低く、食餌により影響されないことを示した。しかし、FZ特異的IgG濃度は、7日目から14日目及び21日目まで有意に低下した(p<0.05)。ワクチン接種は、FZの最初の投与後に、FZ特異的IgGの血清レベルに影響をもたらさなかった。14日目に投与した追加用量後、21日目までに、3つの処置群からの動物はすべて、FZワクチンに応答した。OPNV仔豚におけるFZ特異的IgGの濃度は、SRV仔豚と同等であり、何れも、FFV仔豚より有意に高かった(p<0.05)(3つの群における測定レベルは、それぞれ、371±329、400±171及び137±157である)。
2.3 ワクチン接種及び非ワクチン接種仔豚の血清中のIgG及びIgM総力価は、時間が経過と共に低下する。
ELISAにより測定した血清中の全IgGレベル(図4)は、食餌又はワクチン接種により影響されなかった。しかし、測定した全IgGレベルの時間経過による着実な低下は、統計的に有意であり(p<0.01)、反復測定分析後に有意な線形変化を伴った(p<0.002)。21日目のProc混合分析は、非ワクチン接種(それぞれ、7.5±2.5及び5.9±2.7mg/mL)と比較して、ワクチン接種仔豚で、より高い全IgGレベルの傾向パターン(p=0.09)を示した。さらに、ワクチン接種によって、OPN群における全IgGレベルは、約2倍(96%)増大したが、FF及びSR仔豚に観測された変化(それぞれ、0及び10%)は、かなり小さかった。この全IgGレベルの増大は、食餌によるOPN補給を受けた仔豚における適応免疫応答を生み出す優れた能力を表している。全IgM濃度は、食餌又はワクチン接種により影響されなかったが、出産後の期間の初めに低下した(p<0.001;p<0.0001での線形及び二次対比)。図5は、各食餌処置の非ワクチン接種及びワクチン接種群からのデータをプールした後の全IgMレベルを示す。
2.4 食餌及びワクチン接種は、リンパ球の表現型プロフィールに影響を与えた
21日目に採取した脾臓、PBMC及びMLNサンプル中の単核亜集団の表現型は、1群のフルオレセイン(FITC)又はフィコエリスリン(PE)標識mAbを用いたフローサイトメトリーにより同定した。細胞は、実施例1.7に記載したように、細胞傷害性T細胞、Tヘルパー細胞、二重陽性メモリーT細胞又はナチュラルキラー細胞(NKC)(図6)として同定した。PBMC及び統計分析(非有意の場合、食餌*ワクチン接種の相互作用を除去する)におけるリンパ球の表現型プロフィールを表1に記載する。適応免疫応答に積極的役割を有するT−ヘルパー(CD4+)細胞は、食餌に応答性であるが、ワクチン接種に対して応答性ではなかった。T−ヘルパー細胞は、FF及びSR動物より、OPNにおいて有意に高かった(それぞれ、42.2%及び41.3%に対して49.4%、図7A)。細胞質病原体に対する宿主防御に重要な細胞傷害性T細胞(CD8+)も、ワクチン接種によって影響されなかったが、食餌効果は、差の傾向を示した。最小二乗平均の差によって、SR群中のT細胞傷害性細胞の%がOPNより有意に高く(p=0.018)、傾向レベルのFFより高いことが判明した(p=0.06)(図7B)。単核細胞集団に対する食餌の効果をよりよく理解するために、T−ヘルパー:T−細胞傷害性の比を計算した(図7C)。OPN(2.73±0.89)及びFF(2.24±0.90)仔豚のPBMCにおけるT−ヘルパー:T−細胞傷害性の比は、SR仔豚(1.71±0.48)のそれより有意に高かった。T−ヘルパー:T−細胞傷害性の比のこのような増加は、ワクチン接種した動物、特に、OPN補給食餌を受けた仔豚で、免疫系が感作されて、ワクチン特異的抗体を生成することを示している。
メモリーT細胞の集団(CD4+及びCD8+について二重陽性)は、ワクチン接種により有意に影響を受け、食餌のみは、傾向を示した(p=0.052)。ワクチン接種は、CD4+CD8+メモリー細胞と同様に、CD3+細胞の%に21%の減少を招いた。PBMCにおけるNK細胞の集団(CD3+CD4+CD8−)は、ワクチン接種後に変化し、非ワクチン接種動物の14.8%からワクチン接種動物の23.7%への有意な(p<0.05)増加を示したが、食餌の効果はなかった。
Figure 0006509833
実施例1.7に記載したように、MLNから免疫細胞を単離し、細胞集団をCD3+の%及びCD3−の%として識別した(表2)。ワクチン接種は、調べたMLN細胞の何れにも有意な影響をもたらさなかった。OPN群(13.7%)におけるT−細胞傷害性細胞の数(13.7%)は、SR群の数(12.0%)に極めて類似しており、これらは何れも、FF動物と有意に相違した(16.6%、図8A)。食餌は、T−ヘルパーとして%CD3+細胞を変化させなかったが、T−細胞傷害性細胞の集団を有意に(p<0.05)改変した。同様に、OPN及びSRのT−ヘルパー/T−細胞傷害性の比の値は同等であり、しかも、FFの場合より有意に高かった(図8B)。PBMCにみられるCD4+/CD8+細胞の比の増加は、食餌OPNを受けた仔豚におけるワクチン接種に対する適応体液性応答の増強を表している。SR仔豚におけるNK細胞集団は、両方の調合乳群より高かったが、統計的有意性は傾向レベルで(p<0.06)到達した。
Figure 0006509833
脾臓から単離した単核細胞の分布を表3に示す。脾臓中のT−ヘルパー細胞及びT−細胞傷害性細胞は、ワクチン接種より影響を受けたが、食餌処置では受けなかった。メモリー細胞としてのCD3+の%は、食餌及びワクチン接種により影響された。ワクチン接種は、メモリー細胞の集団を増加したが、これは、適応(体液性)応答を定着させる上で重要である。特に、両方の調合乳供給群(OPN及びFF群)が、SRより有意に高いメモリー細胞のレベルを有した(図9)。NK細胞は、他の全ての処置群と比較して、非ワクチン接種SR動物において有意に高かった。ワクチン接種は、脾臓中のNKレベルに影響しなかった。T−ヘルパー(CD4+)/T−細胞傷害性(CD8+)比もまた、ワクチン接種仔豚の脾臓、特にSR又はOPNを供給した仔豚の脾臓において増加すると思われ、適応免疫応答の誘導をもたらす。
Figure 0006509833
2.5 ex vivo刺激及び単離免疫細胞によるサイトカイン分泌:
PBMC及び脾細胞の細胞免疫応答を評価するために、単離した細胞は、PHA、LPS若しくはフルゾン(fluzone)と一緒に72時間インキュベートした。植物レクチンであるフィトヘマグルチニン(PHA)と、細菌細胞壁成分であるリポ多糖(LPS)は、それぞれT細胞及びB細胞を活性化するマイトジェンである。免疫細胞の活性化により、サイトカインの分泌が起こる。インターフェロンβ2としても知られるインターロイキン6(IL−6)は、急性炎症から獲得免疫又は慢性炎症性疾患の何れかへの移行に不可欠な多面αへリカルサイトカインである。インターロイキン10(IL−10)は、抗炎症性Th2サイトカインであるが、インターロイキン−12(IL−12)は、ナチュラルキラー細胞刺激因子(NKSF)又は細胞傷害性リンパ球成熟因子としても知られる炎症性Th1サイトカインである。培地において10μg/mLのOPLの存在又は非存在下、ex vivo細胞培養を実施した。OPNの添加は、アッセイしたサイトカインの分泌に何ら有意な影響をもたらさなかったため、OPN処置及び非処置細胞からのデータをプールした。PBMC及び脾臓に対する全ての処置についてのサイトカイン濃度(pg/mL)のデータを表4及び5にそれぞれまとめる。次に、統計的有意差に基づき、統計的に有意なデータをプールし、図10〜17に示す。
末梢血単核細胞:非刺激PBMCにおいて、IL−6及びIL−10の濃度は、検出レベルに満たなかった(表4)。IL−12は、非刺激細胞の上清中に検出され、食餌及びワクチン接種の何れの効果も統計的に有意であった(p<0.05)(図10)。IL−12は、全ての他の処理群に対して、OPNV群のPBMCにおいて最も高かった。PBMC中のサイトカインのPHA刺激は、ワクチン接種により影響を受けなかった。しかし、IL−12分泌への食餌の影響は統計的に有意に高く、OPNVにおいて最も高い分泌が観測された(図11A)。IL−10分泌は、食餌群の間で異なる傾向を示し、OPN群から得られた細胞は、SR及びFF仔豚から得られた細胞より高い傾向にあった(図11B)。
IL−6及びIL−12の濃度は、ワクチン接種とは無関係に、SR及びFF群に関して、OPN給餌仔豚に由来するLPS刺激PBMCにおいて、有意により高かった(p<0.05)(それぞれ、図12A及びB)。類似のパターンが、IL−10分泌のLPS刺激に認められ、OPNに対する曝露によって、より高い濃度のIL−10が得られた。さらに、ワクチン接種により、OPN及びSR群に、より高いIL−10レベルがもたらされた(図12C)。
IL−12に対するFluzone刺激の効果は、ワクチン接種依存性であり、食餌及びワクチン接種の間に統計的に有意な相互作用があった(図13A)。ワクチン接種の結果、SRV及びFFVにはIL−12の分泌の低減が起こったが、OPN群は、不変のままであった。Fluzone刺激細胞におけるIL−10分泌は、SR及びFFと比較して、OPN給餌群の方が高かったが、ワクチン接種した仔豚のIL−10の濃度は低かった(図13B)。
脾臓免疫細胞:脾臓から単離した細胞をPHA、LPS及びFluzoneで刺激して、72時間のインキュベーション後に収集した上清中のサイトカイン産生を測定した(表5)。脾細胞は、本試験で使用した刺激因子に応答してIL−6を全く産生しなかった。反対に、IL−12は、非刺激細胞の上清中でみいだされた(図14A)。SR及びFF群からの細胞は、より高い量のIL−12を分泌したが、食餌OPN及びワクチン接種は、IL−12濃度を低減する傾向があった(p=0.07)。非刺激細胞の上清中のIL−10濃度は、SRV群中で最も高かった(図14B)。PHA刺激に応答した脾細胞によるIL−12及びIL−10分泌は、同等であった。ワクチン接種は、非ワクチン接種群で認められたレベルと比較して、IL−12(図15A)及びIL−10(図15B)の濃度を低減した。さらに、OPN群は、SR及びFF群より、何れのサイトカインのレベルも有意に低かった。同様に、IL−12分泌は、LPSに応答して、ワクチン接種仔豚より、非接種仔豚由来の細胞の上清中で有意に高かった(p<0.05)(図16A)。OPN群から得られた細胞は、SR及びFF群に比べて、最も低い量のIL−12を分泌した。LPS刺激細胞中のIL−10は、ワクチン接種により影響を受けなかったが、FF及びOPN群よりSR群の方が高かった(図16B)。Fluzone刺激時に、IL−12及びIL−10分泌は、ワクチン接種群において最も低く(p<0.05)、OPN動物から単離した細胞は、SR及びFFより低いIL−12を分泌した(図17)。
結論として、仔豚がOPNを補給した調合餌を受けると、その胃細胞は、一定濃度のOPNに曝露される。これは、雌豚授乳の仔豚とは対照的であり、その場合、雌豚の初乳の供給が雌豚の乳汁に代わるため、仔豚が受けるOPNのレベルは低下し、OPN補給調合餌中に供給される140mg/Lより低くなる。OPN補給調合餌を受ける仔豚は、調合餌供給又は雌豚授乳の仔豚由来の細胞と比較して、免疫刺激因子の非存在及び存在下の両方で、ex vivoでインキュベートすると、より多くのIL−12及びIL−10を分泌する免疫細胞を特徴とする(PBMC)。これは、食餌OPNが、PBMC細胞を感作して、IL−12及びIL−10を分泌する効果を有するというエビデンスを提供する。OPN調合餌供給仔豚からのPBMCが、PHA(T細胞活性化)及びLPS(B細胞活性化)による刺激時にIL−12(炎症性)及びIL−10(抗炎症性)を分泌する能力は、免疫均衡に向けて調整される免疫機構を示唆している。
実施例2
乳児に投与するLacprodan(登録商標)OPN−10を用いた臨床試験
2.1 試験設計
調合乳へのウシOPNの添加の効果を評価するために、中国上海で二重盲検式ランダム化臨床試験を実施した。母親は、1〜6月齢の乳児に母乳又は調合乳の何れを授乳するかを選択した。群分けは以下の通りであった(n=60/群):
1)母乳供給乳児
2)OPNを添加していない標準調合乳(RF)を供給される乳児(F0)
3)約65mgのOPN/LでウシOPNを添加したRF(F65)
4)約130mgのOPN/LでウシOPNを添加したRF(F130)
*(非補給)標準調合乳中に認められたOPNの基本レベルは、約15mgOPN/Lである。
人体測定を毎月記録し、静脈穿刺により1、4及び6月齢で静脈血サンプルを採取した。血液学、免疫パラメータ、血漿アミノ酸及び血液尿素窒素(BUN)を分析した。
2.2 試験結果
感染症(例えば、ウイルス、細菌、真菌若しくはアメーバ感染症)に応答した乳児の発熱の発生率は、母乳供給乳児と比較して、標準調合乳を受ける乳児(F0)において有意に増加した(図18)。65mgのOPN/L又は130mgのOPN/Lの量で標準調合乳にOPNを添加し、標準調合乳と一緒に供給すると、発熱の高い発生率が、母乳供給乳児にみられる低い発生レベルに接近するレベルまで低減することがみられた。標準調合乳を受ける乳児の群(F0)は、母乳供給乳児と比較して、発熱の発生率に統計的に有意な増加を示す唯一の群であった。
参照文献:
Albers et al.2013 Monitoring immune modulation by nutrition in the general population:identifying and substantiating effects on human health.British J Nutrition 110(2):1−22.
Bissonnette et al 2012;Proteomic analysis and immunodetection of the bovine milk osteopontin isoforms.Journal of Dairy Science,95(2):567−579、
Plotkin,SA,2008;Correlates of Vaccine−Induced Immunity.Vaccines 47:401−409
Sorensen et al 1995 Posttranslational modifications of bovine osteopontin:Identification of twenty−eight phosphorylation and three O−glycosylation sites;Protein Science 4:2040−2049

Claims (18)

  1. 哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物であって、前記栄養組成物が哺乳動物乳オステオポンチンを含み、当該オステオポンチンが経口投与用であることを特徴とする栄養組成物
  2. 請求項1に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記哺乳動物乳が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ及びこれらの任意の組み合わせの中から選択されることを特徴とする栄養組成物
  3. 請求項1に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンがウシ由来であり、かつ配列番号1の残基17〜278のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド;及びRGDモチーフのC末端である位置でのin vivoペプチド結合切断により前記OPNポリペプチドから得られる40kDaの活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含む栄養組成物
  4. 請求項1に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンがウシ由来であり、かつ配列番号1の残基17〜278のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド;及び前記アミノ酸配列が、配列番号1の残基17〜163である活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含む栄養組成物
  5. 請求項1又は2に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記オステオポンチンが前記哺乳動物における体液性免疫を強化することを特徴とする栄養組成物
  6. 請求項1乃至5の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする栄養組成物
  7. 請求項1乃至6の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記ヒトが、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84歳、及び84歳超の年齢の中から選択される年齢群に属することを特徴とする栄養組成物
  8. 請求項1乃至7の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、哺乳動物における感染症に対する前記免疫耐性が、ワクチン接種により誘導されることを特徴とする栄養組成物
  9. 請求項1乃至7の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症に対する免疫耐性を増強するための栄養組成物において、前記感染症が、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、B型肝炎、C型髄膜炎、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択されることを特徴とする栄養組成物
  10. 哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物が、ワクチン及び哺乳動物乳オステオポンチンを含み、前記オステオポンチンが、経口投与用であり;前記オステオポンチンの投与が、前記ワクチンにより誘導される免疫耐性を増強することを特徴とするワクチン組成物
  11. 請求項10に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記哺乳動物乳オステオポンチンが、前記哺乳動物における体液性免疫を強化することを特徴とするワクチン組成物
  12. 請求項10又は11に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、スイギュウ、ヒトコブラクダ、ラマ、及びこれらの任意の組み合わせの中から選択されることを特徴とするワクチン組成物
  13. 請求項10に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ由来であり、かつ配列番号1の残基17〜278のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド;及びRGDモチーフのC末端である位置でのin vivoペプチド結合切断により前記OPNポリペプチドから得られる40kDaの活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含むワクチン組成物
  14. 請求項10に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、ウシ由来であり、かつ配列番号1の残基17〜278のアミノ酸配列を有するオステオポンチンポリペプチド;及び前記アミノ酸配列が、配列番号1の残基17〜163である活性切断型オステオポンチンポリペプチドを含むワクチン組成物
  15. 請求項10乃至14の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記オステオポンチンが、前記哺乳動物のワクチン接種の前;前記哺乳動物のワクチン接種と同時;若しくは前記哺乳動物のワクチン接種後、又はこれらの組み合わせの経口投与用であることを特徴とするワクチン組成物
  16. 請求項10乃至15の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とするワクチン組成物
  17. 請求項10乃至16の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記感染症が、インフルエンザ;ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹、結核、B型肝炎、C型髄膜炎;ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス;A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、肺炎球菌感染症及び帯状疱疹の中から選択されることを特徴とするワクチン組成物
  18. 請求項10乃至17の何れか1項に記載の、哺乳動物における感染症の予防又は治療的処置に使用するためのワクチン組成物において、前記ヒトが、0〜5、6〜11、12〜18、19〜34、35〜44、45〜54、55〜64、65〜74、75〜84歳、及び84歳超の年齢の中から選択される年齢群に属することを特徴とするワクチン組成物
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