JP6505101B2 - 計器の較正における及びこれに関する改善 - Google Patents
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Description
(a)(i)実質的に単分散であり(例えば、直径S.D.が、10%平均直径未満であり)、且つ、(ii)均質であり、且つ、(iii)単位容積当たりの数における既知の粒子の濃度を有する粒子の較正母集団の試料を装置内に導入するステップと、
(b)適切な条件下において試料を解析し、装置条件又は設定の特定の組合せにおいて、検出された粒子の数と、検出及び計測された粒子の個別の平均輝度と、を判定するステップと、
(c)装置を装置条件又は設定の新しい特定の組合せに対して調節し、且つ、同一の試料を、或いは、ステップ(a)におけると同一の較正母集団の別の試料を、解析し、且つ、ステップ(b)の解析を反復し、装置条件又は設定の新しい組合せの下において、検出された粒子の数と、検出された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
(d)任意選択により、装置条件又は設定の1つ又は複数の更なる新しい特定の組合せにおいて、ステップ(c)を反復するステップと、
(e)その濃度の推定値を判定するべく、未知の濃度の粒子の母集団の後続の解析のために装置を較正するべく使用される検出された粒子の数に照らした粒子の輝度の較正プロット又はルックアップテーブルを解析から導出するステップと、
を有する。
(i)先程定義した本発明の第1の態様による方法を使用して適切な装置を較正するか、或いは、そのように較正された装置を使用する、ステップと、
(ii)母集団の試料を解析し、且つ、検出された粒子の平均数と、粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
(iii)(ii)からの結果を較正プロット又はルックアップテーブルから予測されるものと比較し、試料中の実際の粒子濃度の推定値に到達するステップと、
を有する。
100nmポリスチレン標準品を使用した較正
まず、標準品が、例えば、108粒子/mlなどの適切な濃度に希釈され、且つ、適切な計測装置(例えば、NanoSight NS500システム、NanoSight,Amesbury,UK)内に注入される。いくつかの計測が、異なるカメラ設定(シャッタ及び利得)及び検出設定(検出閾値)の範囲において実施される。限られた統計情報又は大きなノイズを有する点が除去されるように、データがフィルタリングされる。残りのデータを使用することにより、既知の濃度と、カウントされた粒子の数と、を使用して観察容積が算出され、これが、図1において観察されるように、いくつかの検出閾値について、平均輝度に照らしてプロットされる。
以下、NTA装置に適用される本発明の較正方法の一例について説明する。
異なる試料タイプの数を判定しうるシステムを個数較正するために必要とされるステップ
個数較正
1.任意のビームプロファイル及びパワーのNanoSightシステムの場合に、その個数濃度が正確に判明している(例えば、10〜1000nmの、或いは、更に好ましくは、50〜300nmの、範囲のサイズを有する)単分散の且つ均質な較正品質粒子の適切に希釈された試料を(107〜109粒子/mlのいずれかになるように)追加する。
8.適切に希釈された、但し、それ以外においては未知である、試料を(アライメント又は倍率を変更することなしに)計器に追加し、且つ、観察されている粒子の平均輝度が、上述の較正グラフ内において使用されている粒子によって示されている強度の範囲内に位置する時点まで、設定(例えば、カメラの利得/シャッタ又はレーザーパワー)を調節する。
12.異なる試料タイプ/サイズ範囲の2つ以上の別個の母集団を含む試料の場合に、上述のステップ8及び9を実行する。
それぞれの粒子に関する更なる情報(例えば、ブラウン運動によって判定されるサイズ、印加された電界下における電気泳動による移動性、特定のラベル(例えば、抗体媒介)などによって生成される蛍光)を追加することによって弁別されうる複数のサブ母集団を含む試料の場合に、3つの次元(輝度対濃度対サイズ/蛍光信号/移動性など)において再プロットし、且つ、較正グラフから、補正済みの個数推定値を取得する)。
Claims (13)
- 小さなサイズの粒子の試料を光学的に特徴判定する装置を較正する方法であって、
(a)(i)実質的に単分散であり、且つ、(ii)均質であり、且つ、(iii)単位容積当たりの数において既知の粒子の濃度を有する粒子の較正母集団の試料を前記装置内に導入するステップと、
(b)適切な条件下において前記試料を解析し、装置条件又は設定の特定の組合せについて、検出された粒子の数と、個々に検出及び計測された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
(c)前記装置を装置条件又は設定の新しい特定の組合せに調節し、且つ、同一の試料を、或いは、ステップ(a)における同一の較正母集団の別の試料を、解析し、且つ、ステップ(b)の前記解析を反復し、装置条件又は設定の前記新しい組合せの下において、前記検出された粒子の数と、前記検出された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
(d)任意選択により、装置条件又は設定の1つ又は複数の更なる新しい特定の組合せにおいて、ステップ(c)を反復するステップと、
(e)その濃度の推定値を判定するべく、未知の濃度の粒子の母集団の後続の解析のために前記装置を較正するべく使用される検出された粒子の数に照らした粒子の輝度の較正プロット又はルックアップテーブルを前記解析から導出するステップと、
を有する方法。 - ステップ(c)は、カメラ設定及び/又は輝度検出閾値を調節するステップを有する請求項1に記載の方法。
- 前記調節されるカメラ設定は、カメラの利得、シャッタ速度、又はフレームレートを有する請求項2に記載の方法。
- ステップ(e)において導出された前記較正プロット又はルックアップテーブル、或いは、そのデジタル的な情報の観点における均等物は、前記装置と動作可能に装着された又はこれと関連付けられたデジタルメモリ装置内において保存される請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 小さなサイズ粒子の母集団内の粒子の濃度を推定する方法であって、
(i)請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法を使用して適切な装置を較正するか、或いは、すでにそのように較正された装置を使用する、ステップと、
(ii)前記母集団の試料を解析し、且つ、検出された粒子の平均数と、前記粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
(iii)(ii)からの結果を前記較正プロット又はルックアップテーブルから予想されるものと比較し、前記試料内の実際の粒子濃度の推定値に到達するステップと、
を有する方法。 - 前記粒子の試料は、ウイルス(バクテリオファージを含む)、弱毒化又は非活化されたウイルス又はウイルス様の粒子及びこれらに類似したものを有するワクチン製剤、タンパク質集合体、エクソソーム、メンブレイン集合体及びリポソーム、インク及び顔料、量子ドット、及び化学機械研磨/平坦化(「CMP」)スラリのうちの1つを有する請求項5に記載の方法。
- ステップ(ii)において解析される前記試料は、多分散であり、且つ/又は、計測されるパラメータにおいて変化する請求項5に記載の方法。
- ステップ(ii)において前記試料から取得される計測データは、異なる分解能の2つ
以上のグループに分割され、前記グループは、別個であるか、又は重複しており、且つ
、任意選択により、それぞれ、前記2つ以上のグループのそれぞれのグループの前記粒子の濃度を推定する請求項7に記載の方法。 - ステップ(ii)は、平均数及び平均輝度に加えて、前記粒子の1つ又は複数のパラメータに関するデータを取得するステップを有する請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の更なる計測パラメータは、偏光特性、蛍光、形状、及び、推進力の印加下における運動から選択される請求項9に記載の方法。
- 前記装置は、NTAを実行するように適合及び構成されている請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装置は、CCD、EMCCD、及び/又は顕微鏡と、試料チャンバと、試料処理流体装置と、試料照明装置と、ナノ粒子トラッキング画像解析ソフトウェアによってプログラムされた処理手段と、デジタルメモリ装置とのコンポーネントうちの1つ又は複数を有する請求項11に記載の方法。
- 液体試料において懸濁する小さなサイズの粒子の試料を光学的に特徴判定するために適したナノ粒子トラッキング解析(NTA)装置であって、前記装置は、
試料を受けるための試料チャンバと、
前記粒子からの散乱光を生成するために前記試料チャンバを照らすための光源と、
顕微鏡構成およびビデオカメラとを備え、前記顕微鏡構成は、前記粒子による前記散乱光の一部を前記ビデオカメラによって撮像することをもたらし、前記装置はさらに、
撮像および粒子トラッキング解析を用いNTA解析を実行するように構成され、検出された粒子の数に対する粒子の輝度の軟正プロットまたはルックアップテーブルで軟正されるコンピュータ処理手段を備え、前記コンピュータ処理手段は、未知の濃度の粒子の母集団において補正された粒子の濃度の推定値を決定するために前記軟正プロットまたはルックアップテーブルを使用するように構成され、補正された前記推定値は、前記軟正プロットまたはルックアップテーブルから軟正係数を適用することによって決定され、前記装置はさらに、
デジタルメモリ装置を備え、前記軟正プロットまたはルックアップテーブルは、前記デジタルメモリ装置に格納される、装置。
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