CN104390895B - 基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，该方法在显微镜上拍摄离散的标准尺寸颗粒图像，然后沿x或者y方向测量颗粒边缘的灰度分布曲线与背景灰度水平线的交点的间距，逐行/逐列扫描间距，最大值为该方向上测量的图像直径。沿z方向扫描不同离焦区域，测量颗粒离焦成像时的图像直径，最小的图像直径为颗粒在显微图像上的等效直径。采用测量等效直径的方法，测量一系列尺寸标准颗粒的等效直径，建立颗粒等效直径和真实直径的特征曲线，该曲线表征了拍摄显微图片仪器的测量颗粒的特性。对尺寸落在特征曲线范围内的待测颗粒，直接测量其等效直径，根据特征曲线即可精确地得到未知颗粒的真实直径。
Description
技术领域
本发明属于图像处理和微观粒径检测的技术领域，特别涉及一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法。
背景技术
微观颗粒粒径检测技术在生物、物理和化学等领域有着广泛的应用，如测量细胞大小，检测粉体粒度，控制药剂中的悬浮颗粒粒径，特别是在生物大分子实验中检测单分子手柄小球的粒径。目前测量颗粒粒径有筛析法、沉降天平法、电阻法、显微图像测量法和激光散射法，除此之外，还有通过追踪液相中颗粒的布朗运动反演扩散系数，从而获得颗粒的流体力学半径。尽管已有很多方法可以测量颗粒粒径，但廉价的仪器测量精度差，只能用于定性表征，而能高精度表征颗粒粒径的仪器，如动态光散射仪和透射电镜，则仪器昂贵不宜普及。
用显微图像法测量粒径的系统，一般由显微镜、视频相机和计算机等部分组成。颗粒经过显微镜放大后用视频相机拍摄显微图像，然后将这些图像进行边缘识别等处理，获得颗粒图像围绕的面积计算出颗粒的粒径。这种方式检测的粒径与真实的颗粒粒径之间存在差异，虽然通过多次更换视场提高测量的精度，但其测量结果大于电镜测量的结果。测量的粒径与颗粒真实粒径之间差异还依赖颗粒大小，因此基于边沿识别的方法多用于定性分析颗粒粒度及形貌。
本发明提出了一种基于图像灰度分析测量颗粒粒径的测量方法，即为图像灰度颗粒粒径测量法。用新方法测量颗粒粒径达到误差<1％的高精度测量。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于显微成像的图像高精度检测颗粒粒径的方法，该方法适于各种干粉颗粒，或悬浊液和乳状液中的微小颗粒的粒径。
本发明的原理在于：
首先建立测量显微图像中颗粒的等效直径De方法，具体流程见图1。根据颗粒的等效直径检测方法，测量一系列标准尺寸颗粒(已知真实直径Ds)相应的等效直径，建立显微成像系统的De-Ds特征曲线，并在该特征曲线下查找待测样品测量等效直径所对应的真实的颗粒直径，见图2。
本发明采用的技术方案为：一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法的步骤如下：
步骤1.将样品稀释为稀溶液，在光学显微镜下采用视频相机观察视场，保持在相机成像视场中样品中的微粒为分散状态，调节颗粒成像的轴向位置，拍摄在离焦下颗粒的显微图像；
步骤2.对所拍摄的图片沿x或者y方向进行灰度扫描，计算颗粒边缘的灰度分布曲线，用灰度峰值分布最宽的位置确定为颗粒的中心位置；
步骤3.围绕颗粒中心，分别沿x和y方向选取小范围，该小范围为最大峰宽的10％至20％，选取某一点过颗粒图像的线作出灰度分布，测量该灰度分布曲线与图像的灰度背景直线相交点的间距，由于颗粒成像灰度分布范围内必然存在两个及两个以上的交点，选取靠近衍射环边沿的两个交点，间距最大值为颗粒在该方向上颗粒的图像直径Di；这样在两个方向上确定出Dix和Diy，圆形颗粒有Dix～Diy，它们的平均值为检测颗粒的图像直径Di；
步骤4.按步骤2和步骤3分析颗粒沿轴向离焦即z方向时图像灰度，测量不同z方向位置时颗粒的图像直径，用这一系列图像直径中最小值为颗粒的等效直径De；
步骤5.拍摄一系列已知直径Ds的颗粒图像，用步骤2-4检测它们对应的De，将直径比例De/Ds与Ds进行曲线拟合，该曲线为此成像系统检测颗粒直径的特征曲线；
步骤6.拍摄不同z方向位置的待测样品颗粒的显微图像，测量颗粒的等效直径，通过查找系统的特征曲线得出真实直径。
其中，对颗粒的不同轴向位置进行图像直径检测，可用于构建颗粒的三维成像。
其中，等效直径检测方法可用于检测颗粒二维平面全方位角度上的颗粒真实边沿。这种边沿检测方式可适于不规则颗粒边沿检测，则可将颗粒边沿围绕的面积，与标准颗粒的围绕面积，建立成像系统的特征曲线去检测待测样品的粒径，此方式均受权利1的保护。
其中，该方法适用于以荧光修饰在一系列标准颗粒表面，采用等效直径检测方法建立荧光显微成像系统中真实粒径与图像检测结果的特征曲线，从而测量荧光发光颗粒的粒径。
其中，以球形颗粒校准成像系统的特征曲线，同样适于检测椭偏度较低的椭球形颗粒。
其中，该方法适于不同折射率样品，包括透明和不透明颗粒。
其中，该方法测量微粒的图像，适用于基于光学成像显微镜的各类显微镜的显微图像；
其中，该方法适于待测样品为干粉或溶液保存的样品。
其中，该方法适于高数值孔径物镜，包括油浸、水浸和空气系物镜所拍摄的显微图像中颗粒粒径检测。
本发明的优点和积极效果为：
1)、本发明方法测量精度误差<1％(2μm颗粒)。与电镜等昂贵仪器测量精度相当，但费用相对低，且方法简单；对比基于颗粒边沿检测技术得到的颗粒直径更准确。
2)、本发明所采用的粒径检测方法不依赖显微镜成像质量高低，只要具备显微成像条件，并且在不同成像条件下都可使用本方法。
3)、显微图像法测量颗粒粒径，每个人判断最佳成像均有差别，很难量化出标准仪器的特征曲线。边沿检测方法受仪器稳定性和操作人员的影响，很难量化出该仪器的特征曲线。本发明图像灰度颗粒粒径测量法，首先校准颗粒的离焦量，不存在操作人员主观因素导致的测量误差，检测的等效直径几乎不变，因此本发明方法可以表征仪器的特征曲线。
4)、本发明可测量的粒径范围>0.2μm，颗粒粒径的越大检测结果越精确，而边沿检测方法检测粒径>1μm。
附图说明
图1为图像灰度检测等效直径De流程图。
图2为待测样品颗粒真实直径的检测流程。
图3为图像法测量颗粒的图像直径。其中，(a)图为颗粒的显微图像；(b)图为(a)图黑色横线灰度分布曲线，图中直线为显微图像的背景灰度值，直线与灰度分布曲线相交两点，两点间隔Di为测量的图像直径。
图4为沿z方向不同位置时颗粒成像的图像直径。
图5为标准尺寸颗粒的真实直径Ds与等效直径De的依赖关系。拟合曲线为其中a、b和c为拟合参数。
图6为根据De-Ds特征曲线测量待测样品(SVP-20-5，spherotech)的真实直径分布。商品标称值为平均直径2.16μm，测量结果平均值为2.154μm。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于下面实施例，应包括权利要求书中的全部内容。
本发明为基于图像灰度测量颗粒粒径，首先需要制备样品，获得样品的显微图像。将直径为4.987μm的聚苯乙烯颗粒(4205A)原液稀释抽取5μl离心重悬在酒精中，溶液稀释比例为200倍，抽取50ul滴在清洗干净的玻片上。采用光学显微镜(IX71，Olympus)的60倍物镜(NA 0.9)观察，找到待测颗粒图像，用CCD相机记录图像信息。
采集到颗粒图像后，便可检测颗粒在图像中的等效直径De，检测流程见图1。由于颗粒在显微图像上为离散成像，使用软件(如matlab)读取图片的灰度值分布。对所成像图片进行灰度扫描，根据灰度高度和灰度分布的连续性，确立颗粒分布区域，即将图片分割成每个颗粒所在图像区域。对颗粒所在区域的灰度矩阵逐行扫描，将灰度分布最高的双峰间距记录下来，其中最大的间距所对应的行序号为颗粒在x方向的中心。对颗粒所在区域的灰度矩阵逐列扫描，同样的原理找双峰间距的最大值，记录所对应的列序列为y方向的中心。在空白图像区域对灰度做统计平均为整体图像的平均灰度值。
围绕颗粒中心位置，选取<20％的偏差范围，逐行扫描图像的灰度分布，并将该灰度分布曲线与图像平均灰度值直线相交，在颗粒灰度分布范围内必然存在两个及两个以上的交点。选取在靠近成像边沿灰度峰值附近的两个交点，记录出它们之间的间距。对逐行扫描范围内所有这样的间距找出最大值，这个值为颗粒为x方向检测的图像直径Dix，见图3。同样道理，对颗粒成像区域逐列扫描灰度分布，采用同样判断标准测量出颗粒沿y方向检测的图像直径Diy。对于圆形颗粒有Dix～Diy，它们的平均值为被检颗粒的图像直径Di。
采用压电平台沿z方向每移动100nm拍摄一张显微图像，并测量每张图像的图像直径Di，即可得到颗粒沿z方向上图像直径的变化，见图4。在不同z方向位置的所有图像直径中，最小值为颗粒的等效直径De。
根据颗粒的等效直径检测方法，测量一系列标准尺寸颗粒(已知真实直径Ds)相应的等效直径，建立显微成像系统的De-Ds特征曲线。在该特征曲线下查找待测样品测量等效直径所对应的真实的颗粒直径，即可得到待测样品的颗粒尺寸，具体流程见图2。
实验拍摄了Duke Scientific公司标准尺寸为0.491μm(3495A)，0.993μm(4009A)、1.998μm(4202A)和3.005μm(4203A)颗粒分布的显微图像，采用上述分析方法获得它们在此物镜下成像的等效直径De，将这5种颗粒的等效直径De与真实直径Ds的比值作图，即可得到特征曲线，见图5。将拟合曲线为其中a、b和c为拟合参数。将待测样品(SVP-20-5，spherotech)测量的De，根据特征曲线即可计算出颗粒的真实直径，见图5。该样品商品说明书标注的直径分布为2.0-2.9μm，平均直径为2.16μm，测量结果的平均值为2.154μm。可见采用发明的图像灰度测量颗粒粒径法测量结果接近于标称值，达到测量误差<1％的高精度。
本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。
Claims (9)
1.一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法的步骤如下：
步骤1.将样品稀释为稀溶液，在光学显微镜下采用视频相机观察视场，保持在相机成像视场中样品中的微粒为分散状态，调节颗粒成像的轴向位置，拍摄在离焦下颗粒的显微图像；采用光学显微镜的60倍物镜观察，找到待测颗粒图像，用CCD相机记录图片信息；
步骤2.对颗粒所在区域的灰度矩阵逐行扫描，将灰度分布最高的双峰间距记录下来，其中最大的间距所对应的行序号为颗粒在x方向的中心，对颗粒所在区域的灰度矩阵逐列扫描，同样的原理找双峰间距的最大值，记录所对应的列序列为y方向的中心，即确定颗粒的中心位置；
步骤3.围绕颗粒中心，分别沿x和y方向选取小范围，选取某一点过颗粒图像的线作出灰度分布，测量该选取某一点过颗粒图像的线作出的灰度分布曲线与图像的灰度背景直线相交点的间距，由于颗粒成像灰度分布范围内必然存在两个及两个以上的交点，选取靠近衍射环边沿的两个交点，间距最大值为颗粒在该方向上颗粒的图像直径Di；对逐行扫描范围内所有这样的间距找出最大值，这个值为颗粒为x方向检测的图像直径Dix，对颗粒成像区域逐列扫描灰度分布，采用同样判断标准测量出颗粒沿y方向检测的图像直径Diy，圆形颗粒直径范围为Dix～Diy，它们的平均值为被检颗粒的图像直径Di；
步骤4.按步骤2和步骤3分析颗粒沿轴向离焦即z方向时图像灰度，测量z方向不同位置时颗粒的图像直径，用这一系列图像直径中最小值为颗粒的等效直径De；
步骤5.拍摄一系列已知直径Ds的颗粒图像，用步骤2-4检测它们对应的De，将直径比例De/Ds与Ds进行曲线拟合，该曲线为此成像系统检测颗粒直径的特征曲线；
步骤6.拍摄不同z方向位置的待测样品颗粒的显微图像，测量颗粒的等效直径，通过查找系统的特征曲线得出真实直径。
2.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：对颗粒的不同轴向位置进行图像直径检测，可用于构建颗粒的三维成像。
3.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：等效直径检测方法可用于检测颗粒二维平面全方位角度上的颗粒真实边沿；这种边沿检测方式可适于不规则颗粒边沿检测，则可将颗粒边沿围绕的面积，与标准颗粒的围绕面积，建立成像系统的特征曲线去检测待测样品的粒径。
4.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法适用于以荧光修饰在一系列标准颗粒表面，采用等效直径检测方法建立荧光显微成像系统中真实粒径与图像检测结果的特征曲线，从而测量荧光发光颗粒的粒径。
5.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：以球形颗粒校准成像系统的特征曲线，同样适于检测椭偏度较低的椭球形颗粒。
6.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法适于不同折射率样品，包括透明和不透明颗粒。
7.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法测量微粒的图像，适用于基于光学成像显微镜的各类显微镜的显微图像。
8.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法适于待测样品为干粉或溶液保存的样品。
9.根据权利要求1所述的一种基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法，其特征在于：该方法适于高数值孔径物镜，包括油浸、水浸和空气系物镜所拍摄的显微图像中颗粒粒径检测。
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