JP6486894B2 - 活性剤送達のための溶解性ゲル形成フィルム - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、2013年3月15日出願の米国特許仮出願第61/790,132号の恩典を主張する。

A．発明の分野
本発明は概して、溶解すると創傷部の上で酵素活性物質を放出する溶解性のゲル形成フィルムで創傷を処置するのに有用な方法および組成物に関する。

B．関連技術の説明
創傷における痂皮および他の壊死組織の存在は、治癒過程を妨げて、その創傷を回復が遅い創傷または「慢性」創傷にさせることがある。糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、火傷、および圧迫潰瘍は、こうした創傷の例である。

酵素的創傷デブリードマン剤(debridement agent)は、痂皮および他の壊死組織を消化し、それによって創傷の治癒過程を促進するために使用することができる。このような剤は、痂皮および他の壊死組織を消化することができる酵素である。痂皮性の創傷はしばしば、多様なタンパク質を含有することから、タンパク質分解酵素が好ましい。しかしながら、市販品においてこのような酵素の安定性を維持することは困難である。タンパク質分解酵素は自己消化することができるため、酵素の活性および安定性を維持する様式で創傷部にそれらを送達することは困難である。さらに、創傷部にデブリードマン剤を供給する現在の手段は、患部全体にデブリードマン剤を均一に送達しない。

よって、酵素活性と酵素安定性のバランスを効果的にとり、また、処置される部位全体にわたって酵素の均一な送達ももたらす解決策の必要性が残っている。

本発明者らは、創傷を処置するために用いられるものなど、活性剤を送達するための溶解性のゲル形成フィルムを提供する。本明細書において説明するように、フィルムは、固体かつ非流動性だが、水または他の水性媒体（例えば、緩衝液または生理食塩水または創傷自体からの水性媒体）と接触すると溶解して、創傷上に残存するヒドロゲルを形成する。このフィルムは、(1) 酵素機能に最適な状態を提供する製剤中で酵素活性と安定性とのバランスをとること、および(2)不十分な用量制御をもたらす、半固体製品の不均一な送達という問題を解決する。例として、水溶性エーテル、親水性レオロジー改質剤、およびタンパク質分解酵素（例えば、サーモリシン）を含む溶解性のゲル形成フィルムが提供される。このような組成物は、ドライフィルムとして創傷に容易に適用され、次いで、水または他の水性媒体で溶解されて、ヒドロゲルを形成し、酵素および／または他の薬剤物質を活性形態で創傷部に均一に放出する。

いくつかの局面において、水溶性セルロースエーテル；親水性レオロジー改質剤；およびタンパク質分解酵素を含み、15％w/w未満の含水量を有し、かつ水または他の水性媒体と接触するとヒドロゲルを形成することができる、溶解性のゲル形成フィルムを開示する。セルロースエーテルの非限定的な例は、本明細書を通じて提供される。このような例には、ヒドロキシアルキルセルロースエーテル(例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはこれらの任意の組み合わせ、または該セルロースエーテルの全て)が含まれる。いくつかの局面において、セルロースエーテルは、非イオン性セルロースエーテルでありうる。フィルム内の水溶性セルロースエーテルまたは親水性レオロジー改質剤の量は、フィルムが水和されると形成されるヒドロゲルにおいて特定の濃度を達成するために、必要に応じて変えることができる。フィルムは、それが15％w/w未満の含水量を有するときに「ドライ」または「脱水状態」と見なされる。フィルムは、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14％w/w、またはその中で導き出せる任意のパーセンテージの含水量を有しうる。ある特定の態様において、水または他の水性媒体中に溶解させたフィルムから生じるヒドロゲルは、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って測定した場合に、1,000から100,000 cpsの粘度を有する。例えば、水または他の水性媒体中に溶解させたフィルムから生じるヒドロゲルは、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って測定した場合に、1,000、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、もしくは100,000 cpsの粘度、またはその中で導き出せる任意の粘度を有しうる。

溶解性のゲル形成フィルムは、所望の効果のために当業者により選択される任意のタンパク質分解酵素を含有しうる。タンパク質分解酵素のある特定の非限定的な例には、サーモリシン、コラゲナーゼ、およびパパインが含まれる。特定の態様において、タンパク質分解酵素はサーモリシンである。ある特定の態様において、タンパク質分解酵素は結晶形態である。

フィルムの厚さは、所望の使用に基づき調整することができる。例えば、フィルムの厚さは、10から1000 μmの範囲にすることができる。特定の態様において、フィルムの厚さは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは100 μm、またはその中で導き出せる任意の厚さである。

溶解性のゲル形成フィルムは、水または他の水性媒体と接触させるとヒドロゲルを形成することができる。例えば、フィルムは、0.1から100 mg/分の速度で水または他の水性媒体中に溶解することができうる。いくつかの態様において、フィルムは、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9. 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100 mg/分の速度で、またはその中で導き出せる任意の速度で水または他の水性媒体中に溶解することができる。ある特定の態様において、溶解性のゲル形成フィルムは、0.5〜10 mg/分の速度で水または他の水性媒体中に溶解することができる。例えば、フィルムは、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、もしくは10.0 mg/分の速度で、またはその中で導き出せる任意の速度で水または他の水性媒体中に溶解することができうる。

溶解性のゲル形成フィルムは、所望の結果を達成するために当業者が選択する、任意の重量パーセントのタンパク質分解酵素を含有しうる。いくつかの態様において、重量パーセントは、フィルムの乾燥重量の0.1％以上であり、室温（20℃から25℃として定義される）で24ヶ月間保存したとき10％を超えて低下しない。いくつかの態様において、フィルムは、タンパク質分解酵素を結晶形態で含有しうる。

溶解性のゲル形成フィルムは、所望の結果を達成するために当業者により選択される、任意のパーセンテージの水溶性セルロースエーテルまたはそれらの組み合わせを含みうる。いくつかの局面において、フィルムは、50から70％w/wまたは55から65 ％w/wの水溶性セルロールエーテルまたはそれらの組み合わせを含む。例えば、フィルムは、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、もしくは70％、またはその中で導き出せる任意のパーセンテージ（w/w）の水溶性セルロースエーテルまたは水溶性セルロースエーテルの組み合わせを含みうる。例えば、いくつかの態様において、フィルムは、25から35％w/wのヒドロキシエチルセルロースおよび25から35％w/wのヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。

溶解性のゲル形成フィルムは、所望の結果を達成するために当業者により選択される、任意のパーセンテージの親水性レオロジー改質剤を含みうる。いくつかの局面において、フィルムは、15から25％w/wの親水性レオロジー改質剤を含む。親水性レオロジー改質剤の非限定的な例には、ポリオール（例えば、ポリエチレングリコール（PEG））、グリセリン、およびプロピレングリコールが含まれる。ある特定の態様において、ポリオールは、ポリエチレングリコール（PEG）である。いくつかの態様において、ポリエチレングリコールはPEG-400またはPEG-600である。

溶解性のゲル形成フィルムは、任意のパーセンテージのタンパク質分解酵素を含みうる。例えば、フィルムは、5から15％w/wのタンパク質分解酵素を含みうる。いくつかの局面において、フィルムは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15％、またはその中で導き出せる任意のパーセンテージ（w/w）のタンパク質分解酵素を含む。いくつかの態様において、フィルムはタンパク質分解酵素を結晶形態で含みうる。

いくつかの態様において、溶解性のゲル形成フィルムは金属塩を含む。例えば、金属塩は、塩化ナトリウムもしくは塩化カルシウムまたはそれらの混合物でありうる。フィルムはまた、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、もしくはフェノキシエタノール、またはそれらの混合物などの保存剤も含みうる。ある特定の態様において、フィルムは無菌状態である。

ある特定の局面において、溶解性のゲル形成フィルムは、（a）3から7％w/wのセルロースエーテルまたはそれらの組み合わせ、1から3％w/wの親水性レオロジー改質剤、およびトリス緩衝液（10 mM、pH=7.5）を含む第1の混合物を得る段階；（b）タンパク質分解酵素、金属塩、およびトリス緩衝液（10 mM、pH=7.5）を含む第2の混合物を得る段階；（c）第1の混合物および第2の混合物を一緒に混合して、ヒドロゲルを得る段階；ならびに（d）段階（c）からのヒドロゲルを乾燥させて、溶解性のゲル形成フィルムを得る段階により作製される。このように作製されたそのようなフィルムは、本明細書に記載の任意のタンパク質分解酵素（例えば、サーモリシン、コラゲナーゼ、またはパパイン）を含有しうる。ある特定の局面において、そのようなフィルムはサーモリシンを含む。

本明細書に記載の任意の溶解性のゲル形成フィルムを、デブリードマンを必要とする創傷に局所的に適用する段階を含む、創傷を処置するまたは郭清する方法も開示される。そのような創傷は慢性創傷でありうる。開示の組成物および方法から利益を得る可能性がある慢性創傷の非限定的な例には、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、火傷、または圧迫潰瘍が含まれる。郭清される創傷には、例えば、痂皮などの壊死組織が含まれうる。

開示の方法において、水または他の水性媒体は、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用される前に創傷に適用されうる。いくつかの局面において、水または他の水性媒体は、フィルムが創傷に適用された後に溶解性のゲル形成フィルムに適用される。いくつかの態様において、水または他の水性媒体は、溶解性のゲル形成フィルムの適用前に創傷に適用され、かつ水または他の水性媒体は、フィルムが創傷に適用された後に溶解性のゲル形成フィルムにも適用されうる。これらの場合それぞれにおいて、水または他の水性媒体は、フィルムと接触し、ヒドロゲルを形成させる。有用でありうる水性媒体の一例は生理食塩水である。加えて、いくつかの局面において、包帯、創傷ドレッシング材、またはガーゼが、フィルムが創傷に適用された後に溶解性のゲル形成フィルムの上に適用されうる。

「室温」という用語は、20℃から25℃として定義される。

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、〜に近いと定義され、非限定的な一態様では、この用語は10％以内、好ましくは5％以内、さらに好ましくは1％以内、および最も好ましくは0.5％以内であると定義される。

「阻害する」、「減少させる」、「処置する」という用語、またはこれらの用語の任意の変化形は、所望の結果を達成するための測定可能な任意の減少または完全な阻害を含む。例えば、ある特定の態様において、「処置する」は、創傷上の痂皮の減少を指す。同様に、「有効な」という用語は、望まれた、期待された、または意図された結果を成し遂げるために十分なことを意味する。

「1つの(a)」または「1つの(an)」という用語の使用は、「含む」という用語と共に使用される場合、「1つ」を意味しうるが、それはまた、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたはそれ以上」の意味とも一致する。

「含む(comprising)」(および含む(comprising)の任意の形、例えば「含む(comprise)」、「含む(comprises)」など)、「有する(having)」(および有する(having)の任意の形、例えば「有する(have)」、「有する(has)」など)、「含む(including)」(および含む(including)の任意の形、例えば「含む(includes)」、「含む(include)」など)、または「含有する(containing)」(および含有する(containing)の任意の形、例えば「含有する(contains)」、「含有する(contain)」など)という語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、記載されていない要素または方法段階を排除するものではない。

組成物およびその使用のための方法は、本明細書を通じて開示される成分または段階のいずれか「を含む」、「から本質的になる」、または「からなる」ことができる。「から本質的になる」という移行句に関して、非限定的な一局面では、本明細書に開示される組成物および方法の基本的かつ新規な特徴は、タンパク質分解酵素を安定させ、かつ活性タンパク質分解酵素の創傷部への均一な送達をもたらすフィルムの能力を含む。

本明細書で説明される任意の態様は、本発明のいずれかの方法または組成物に関して実施することができ、逆の場合も同様であることが企図される。また、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。

[本発明1001]
(a)水溶性セルロースエーテル；
(b) 親水性レオロジー改質剤；および
(c)タンパク質分解酵素
を含み、15％w/w未満の含水量を有し、かつ水または他の水性媒体と接触するとヒドロゲルを形成することができる、溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1002]
タンパク質分解酵素が結晶形態である、本発明1001の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1003]
形成されるヒドロゲルが、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って測定した場合に、1,000から100,000 cpsの粘度を有する、本発明1001〜1002のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1004]
タンパク質分解酵素が、サーモリシン、コラゲナーゼ、またはパパインである、本発明1001〜1003のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1005]
タンパク質分解酵素がサーモリシンである、本発明1004の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1006]
フィルムの厚さが10から1000 μmの範囲である、本発明1001〜1005のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1007]
100から0.1 mg/分の速度で水中に溶解することができる、本発明1001〜1006のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1008]
0.5から10 mg/分の速度で水中に溶解することができる、本発明1007の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1009]
タンパク質分解酵素の重量パーセントが、フィルムの乾燥重量の0.1％以上であり、室温で24ヶ月間保存したときに10％を超えて低下しない、本発明1001〜1008のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1010]
水溶性セルロースエーテルがヒドロキシアルキルセルロースエーテルである、本発明1001〜1009のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1011]
ヒドロキシアルキルセルロースエーテルが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせである、本発明1010の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1012]
50から70％w/wもしくは55から65％w/wの水溶性セルロースエーテルまたはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1011のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1013]
25から35％w/wのヒドロキシエチルセルロースおよび25から35％w/wのヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、本発明1001〜1012のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1014]
15から25％w/wの親水性レオロジー改質剤を含む、本発明1001〜1013のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1015]
親水性レオロジー改質剤がポリオールである、本発明1014の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1016]
ポリオールがポリエチレングリコールである、本発明1015の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1017]
ポリエチレングリコールがPEG-400である、本発明1016の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1018]
5 から15％w/wのタンパク質分解酵素を含む、本発明1001〜1017のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1019]
ヒドロゲルが、金属塩をさらに含む、本発明1001〜1018のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1020]
金属塩が、塩化ナトリウムもしくは塩化カルシウムまたはそれらの混合物である、本発明1019の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1021]
ヒドロゲルが保存剤をさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1022]
保存剤が、メチルパラベン、プロピルパラベン、もしくはフェノキシエタノール、またはそれらの混合物である、本発明1021の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1023]
(a)3から7％w/wのセルロースエーテルまたはそれらの組み合わせ、1から3％w/wの親水性レオロジー改質剤、およびトリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を含む第1の混合物を得る段階；
(b)タンパク質分解酵素、金属塩、およびトリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を含む第2の混合物を得る段階；
(c)第1の混合物および第2の混合物を一緒に混合して、ヒドロゲルを得る段階；および
(d)段階(c)からのヒドロゲルを乾燥させて、溶解性のゲル形成フィルムを得る段階
により作製される、本発明1001〜1022のいずれかの溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1024]
タンパク質分解酵素が、サーモリシン、コラゲナーゼ、またはパパインである、本発明1023の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1025]
タンパク質分解酵素がサーモリシンである、本発明1024の溶解性のゲル形成フィルム。
[本発明1026]
デブリードマンを必要とする創傷に、本発明1001〜1025のいずれかからの溶解性のゲル形成フィルムを局所的に適用する段階を含む、創傷を郭清する方法。
[本発明1027]
創傷が慢性創傷である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
慢性創傷が、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、火傷、または圧迫潰瘍である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
創傷が壊死組織を含む、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
壊死組織が痂皮である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
水性媒体が、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用される前に創傷に適用されるか、または水性媒体が、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用された後に該フィルムに適用される、本発明1026〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
水性媒体が生理食塩水である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
包帯、創傷ドレッシング材、またはガーゼが、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用された後に該フィルムの上に適用される、本発明1026〜1032のいずれかの方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本発明の精神および範囲の範囲内のさまざまな変更および修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の具体的な態様を示すが、単なる例示として与えられることを理解すべきである。

その後溶解してゲルを形成する、ドライフィルム製品の適用を示す例示である。 溶解したフィルムから形成されるゲルの物理的外観を図示する写真である。溶解したフィルムは、反転させた試験管の内部に示される。より粘度が高いゲルに溶解するフィルムは、創傷床にとどまる可能性がより高い。 コラーゲンまたはエラスチンを用いて調製した人工痂皮を用いてインビトロで行ったデブリードマン実験である。サーモリシンを含有するフィルムを、サーモリシンゲルおよびブロメラインゲルと比較した。フィルムとサーモリシンゲルの両方が、10％ブロメラインを含有したブロメラインゲルよりも効率的にコラーゲンおよびエラスチンを消化した。 フィブリンを用いて調製した人工痂皮を用いてインビトロで行ったデブリードマン実験である。サーモリシンを含有するフィルムを、サーモリシンゲルおよびブロメラインゲルと比較した。フィルムとサーモリシンゲルの両方が、10％ブロメラインを含有したブロメラインゲルよりも効率的にフィブリンを消化した。 創傷にフィルムを適用するための一手順の例示である。第一に、創傷を生理食塩水で湿らせる。第二に、フィルムを湿らせた創傷に適用する。フィルムを創傷に適用した後、それを生理食塩水で湿らせる。次いで、生理食塩水で予浸した非接着性創傷ドレッシング材をフィルムの上に適用する。次いで、ドレッシング材を、例えば、医療用ドレッシング材およびテープで固定する。 サーモリシンフィルムおよびゲル、パパイン-尿素軟膏、ならびにSANTYL(登録商標)コラゲナーゼ軟膏のデブリードマン効果に対するブタのインビボ試験である。

例示的な態様の説明
効果的な創傷洗浄およびデブリードマンは、治癒過程を促進するのに役立つ。創傷床に存在する失活組織は望ましくないものである。つまり、それは、細菌増殖のためのリザーバーとして機能し、創傷部で慢性炎症を促す炎症性メディエーターの上昇したレベルを含み、かつ細胞移動を弱める。創傷を郭清するために使用される4つの最も一般的な方法としては、外科的デブリードマン、自己分解的デブリードマン、酵素的デブリードマン、および機械的デブリードマンが含まれる。

酵素的デブリードマンに関しては、現在SANTYL(登録商標)コラゲナーゼ軟膏が米国市場で承認されている唯一の郭清薬物製品である。この製品は、デブリードマン剤としてコラゲナーゼを利用する疎水性軟膏である。他のものは、異なるデブリードマン剤および種々の製剤の使用を試みているが、直面する問題には、安定性の欠如および均一な送達の欠如が挙げられる。デブリードマン剤に付随するこれらの問題は、創傷を効果的に郭清するためのそれらの使用を制限する。

本発明者らは、創傷を処置するために用いられるものなど、活性剤を送達するための溶解性のゲル形成フィルムを提供する。このフィルムは、（1）酵素機能にとって最適な状態を提供する製剤中での酵素の活性および安定性のバランスをとること、および（2）不十分な用量制御をもたらす、半固体製品の不均一な送達という問題を解決する。例として、水溶性エーテル、親水性レオロジー改質剤、およびタンパク質分解酵素（例えば、サーモリシン）を含む溶解性のゲル形成フィルムが提供される。そのような組成物は、ドライフィルムとして創傷に容易に適用され、次いで、溶解してヒドロゲルを形成し、酵素および／または他の薬剤物質を活性形態で創傷部に均一に放出する。

A. フィルム
本発明の組成物はフィルムとして製剤化される。特に、結晶状態で酵素活性物質を含有する脱水フィルムが提供される。溶解すると、ヒドロゲルが形成され、酵素が活性状態となり、形成されたヒドロゲルから放出される。

1. タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素が、開示の方法および組成物、特に創傷処置に対する用途において有用でありうる。有用なタンパク質分解酵素には、サーモリシン、コラゲナーゼ、パパイン、および他のプロテアーゼが含まれる。

サーモリシンは、疎水性残基ロイシン、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、アラニンおよびメチオニンのN末端で切断する熱安定性メタロプロテイナーゼである。最適な消化温度範囲は30〜85℃である。サーモリシンの活性はpH 5.0〜8.5で最適である。この酵素には複数の商業的な供給源が存在する。そのような供給源の一つは、Promega Corporation (Madison, Wisconsin (USA))によって販売される凍結乾燥サーモリシンである。別の凍結乾燥サーモリシン製品は、Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri (USA))により販売される。両製品からのサーモリシンは、バチルス・サーモプロテオリチカス・ロッコー(Bacillus thermoproteolyticus rokko)から得られたものであった。サーモリシンのさらなる製造者および供給者は、日本のAmano Enzyme, Inc.である。サーモリシンのCAS番号は9073-78-3である。

コラゲナーゼは、細菌クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)由来のメタロプロテイナーゼである。それは、コラーゲンを消化するのに特に有用である。C. ヒストリチクムにおいて見いだされる2種類のコラゲナーゼ遺伝子、col Gおよびcol Hが存在する。両方とも、コラーゲン基質を分解するために共に働くことができる。コラゲナーゼの最適pHは6〜9であり、それは他のプロテアーゼと比べて概して安定である。米国市場にある現在のコラゲナーゼ製品は、Healthpoint Biopharmaceuticalsにより生産される。

パパインは、パパイアの木から得られる広く用いられている別のプロテアーゼである。サーモリシンおよびコラゲナーゼとは異なり、パパインはシステインプロテアーゼである。それは、多種多様なタンパク質を消化することができる非特異的プロテアーゼである。それは、サーモリシンまたはコラゲナーゼと比べて不安定であり、パパインの自己分解が大きな影響を与えていると予想される。パパインは、広範囲のpH条件において機能することができ、6の最適pHを有する。パパインは、創傷デブリードマンに対して歴史的に用いられていたが、米国において承認されている市販のパパイン製品は存在しない。

2. セルロースエーテル
セルロースエーテルは、セルロースのグルコース単位中のヒドロキシル基の水素原子をアルキル基、ヒドロキシアルキル基またはカルボキシアルキル基で置換することによって製造することができる高分子量化合物である。アルキルセルロースエーテルの非限定的な例には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびエチルメチルセルロース(EMC)が含まれる。ヒドロキシアルキルセルロースエーテルの非限定的な例には、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシメチルセルロース(HMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、エチルヒドロキシエチルセルロース(EHEC)、ヒドロキシエチルメチルセルロース(HEMC)、メチルヒドロキシエチルセルロース(MHEC)、メチルヒドロキシプロピルセルロース(MHPC)、およびヒドロキシエチルカルボキシメチルセルロース(HECMC)が含まれる。カルボキシアルキルセルロースエーテルの非限定的な例には、カルボキシメチルセルロース(CMC)およびカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース(CMHEC)が含まれる。いくつかの特定の局面において、セルロースエーテルは、非イオン性セルロースエーテルでありうる。サーモリシンと同様に、これらのセルロースエーテルのそれぞれについて広範囲の商業的供給元が存在する（例えば、Dow Chemical Company (USA)、Ashland (USA)、Samsung Fine Chemicals (USA))。これらのセルロースエーテルのさらなる商業的供給元は、International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、第12版(2008)、第1〜3巻に見出すことができる。

3. 親水性レオロジー改質剤
親水性レオロジー改質剤は、水に対する親和性を有し、それらを含有する組成物の流動性に影響をあたえる。親水性レオロジー改質剤の一例は、ポリエチレングリコール(PEG)である。他の例には、グリセリンおよびプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、および他のグリコール系賦形剤が含まれる。一部の親水性レオロジー改質剤は、フィルムの所望の特性を強化するための可塑剤としても働く。そのようなレオロジー改質剤の量は、15から25％w/wの範囲にすることができるが、所望の結果を達成する（例えば、フィルムを溶解させると結果として生じるヒドロゲルの粘度を変化させる）ために、それより多いまたは少ない量を添加することができる。

ポリエチレングリコール(PEG)は、エチレングリコールと水のホモポリマーであり、以下の式で表される：
H(OCH₂CH₂)_n OH
式中、nはオキシエチレン基の平均数を表す。ポリエチレングリコールは、その分子量に応じて、25℃で液体または固体のいずれかであることができる。

以下の非限定的な例は、開示の組成物および方法による使用に適しており、U.S. Pharmacopeial Convention (USP)命名法を用いて記載される：ポリエチレングリコール200、ポリエチレングリコール300、ポリエチレングリコール400、ポリエチレングリコール500、およびポリエチレングリコール600。

固体ポリエチレングリコールの以下の非限定的な例は、開示の組成物および方法による使用に適しており、USP命名法を用いて記載される：ポリエチレングリコール700、ポリエチレングリコール800、ポリエチレングリコール900、ポリエチレングリコール1000、ポリエチレングリコール1100、ポリエチレングリコール1200、ポリエチレングリコール1300、ポリエチレングリコール1400、ポリエチレングリコール1450、ポリエチレングリコール1500、ポリエチレングリコール1600、ポリエチレングリコール1700、ポリエチレングリコール1800、ポリエチレングリコール1900、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール2100、ポリエチレングリコール2200、ポリエチレングリコール2300、ポリエチレングリコール2400、ポリエチレングリコール2500、ポリエチレングリコール2600、ポリエチレングリコール2700、ポリエチレングリコール2800、ポリエチレングリコール2900、ポリエチレングリコール3000、ポリエチレングリコール3250、ポリエチレングリコール3350、ポリエチレングリコール3750、ポリエチレングリコール4000、ポリエチレングリコール4250、ポリエチレングリコール4500、ポリエチレングリコール4750、ポリエチレングリコール5000、ポリエチレングリコール5500、ポリエチレングリコール6000、ポリエチレングリコール6500、ポリエチレングリコール7000、ポリエチレングリコール7500、およびポリエチレングリコール8000。

そのような液体ポリエチレングリコールおよび固体ポリエチレングリコールは、CARBOWAX(商標)という商品名でDOW Chemical Companyから、およびLUTROL(登録商標)EおよびPLURACARE(登録商標)という商品名でBASF Corporationから市販されている。医薬品グレード(USP/NF)および化粧品グレードのポリエチレングリコールは両方とも、開示の組成物および方法での使用に適している。

4. 添加物
上記の酵素、セルロースエーテル、およびレオロジー改質剤に加えて、フィルムは追加の成分を含むことができる。例えば、NaCl₂またはCaCl₂などの塩を安定化剤として用いることができる。塩の量は0.01から1％w/wの範囲にすることができるが、所望の結果を達成するために、それより多いまたは少ない量を添加することができる。可塑剤も添加してもよい。メチルパラベン、プロピルパラベン、フェノキシエタノール、および当業者に公知の他のものなどの保存剤を使用することができる。このような保存剤の量は0.01から1％w/wの範囲にすることができるが、所望の結果を達成するために、それより多いまたは少ない量を添加することができる。所望の酵素活性にとって適切なpH範囲(例えば、5から9)を有する緩衝液を用いることができる。こうした緩衝液の例としては、トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)がある。フィルムを溶解させるための水または他の水性媒体の供給源は緩衝溶液または生理食塩水に由来しうる。さらなる添加物は、所定の触覚特性を達成するために、またはフィルムまたは結果として生じるヒドロゲルに追加の機能的局面を付加するために、添加することができる(例えば、抗菌剤、抗炎症剤、鎮痛剤などの、創傷治癒過程をさらに助けることができる剤)。

5. 溶解性のゲル形成フィルムの調製
本発明のフィルムは、当業者に公知の任意の方法により調製することができる。特定の態様において、セルロースエーテルの1つまたは複数の緩衝溶液または他の水性媒体を混合する。均質化時に、PEG、グリセリンおよびプロピレングリコールなどの種々の可塑剤およびレオロジー改質剤を添加することができる。次に、NaClおよびCaCl₂などの塩を適切な量で有する緩衝液中に溶液または分散として酵素を添加してもよい。最終混合物は、均質になるまで撹拌されうる。次いで、気泡を取り除くために混合物(粘性ゲル)を遠心分離することができ、適切な量をペトリ皿内に流し込みうる。皿は、通常のラボ条件下での適切な換気と共に、乾燥させるために平らな表面上に放置されうる。約48時間の乾燥後、フィルムは、使用向けのカスタムサイズに切り分けられうる。

いくつかの態様において、乾燥前の組成物は以下の成分を含む：(a) トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)中の3 w％ヒドロキシエチルセルロース(HEC、Natrosol 250 HX Pharm-Aqualon)；(b) トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)中の2.5 w％ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC、Methocel K-15M、DOW Chemical)；(c) ポリエチレングリコールPEG-600(Carbowax Sentry、DOW Chemical)；および(d) トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)中のNaClおよびCaCl₂を伴う酵素。

例えば、一態様において、79 gの3 w％ HEC、87 gの2.5 w％ HPMC、1.6のポリエチレングリコール600(PEG-400)が、均質になるまで機械的撹拌により混合される。活性相は、31.5 gのトリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)中に0.87 gの酵素(サーモリシン)、0.22 gのNaClおよび0.11 gのCaCl₂からなる。均質化時に、活性相を混合物に添加し、2時間以上撹拌した。次いで、混合物を15〜20分間脱気して気泡を取り除いた。次いで、混合物をペトリ皿(φ15 cm、1皿当たり約45 gmの混合物)内に移し、ゲルドライヤー中に一晩置いた。ドライフィルム中の構成要素の濃度は以下の通りであった：HEC 30〜32 w％；HPMC 29〜30 w％；PEG-400 21〜22 w％；酵素9〜11％；NaCl 2.5〜3.5 w％；およびCaCl₂ 1〜2 w％。

フィルムの水和後に形成されるヒドロゲルの粘度は概して、およそ1 gのドライフィルムが20 mlの水性媒体中に溶解化されたとき、5,000〜100,000の範囲である。例えば、図3および4に記載の実験で用いられるフィルム「A01」から生じるヒドロゲルは、59,400 cpsの粘度を有する。図6に記載の実験において用いられるより速溶性のフィルムと同様のフィルムから生じるヒドロゲルは、同様の条件下で22,600 cpsの粘度を有する。粘度は、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って測定した。

B. 溶解性のゲル形成フィルムを用いる方法
本発明の溶解性のゲル形成フィルムは、種々の方法において用いられうる。例えば、それらは、慢性創傷などの創傷を郭清するために用いることができる。そのような方法は、サーモリシンを含む組成物を創傷に適用する段階（例えば、局所適用による）を含む。適用後、創傷は、ガーゼパッドなどの創傷ドレッシング材で覆われうる。フィルムは、まず、ガーゼパッドなどのドレッシング材に適用され、次いで、創傷面に適用されうる。適用量は、創傷の重症度およびタイプ、ならびに対象の性質による。

ある特定の局面において、フィルムは、創傷に定期的に、例えば、必要に応じて1日1回、1日2回、1日おき、週に1回適用できる。壊死組織のデブリードマンが完了するまで、交換と交換の間に創傷洗浄および新鮮な組成物の適用を伴う定期的なドレッシング材の交換を含む、処置レジメンが用いられうる。

多様な創傷を本発明のフィルムで処置することができる。例には、火傷、急性創傷、または慢性創傷が含まれる。慢性創傷の非限定的な例には、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、火傷、および圧迫潰瘍が含まれる。

C. キット
キットもまた、本発明のある特定の局面での使用を意図される。例えば、本発明のフィルムをキットに含めることができる。キットは容器を含むことができる。容器は、ケース、サシェ、パウチ、ディスペンサー、パッケージ、コンパートメント、またはその中にフィルムが保持される他の容器を含むことができる。キットはその表面にしるしを含むことができる。しるしは、例えば、単語、語句、略語、絵、または記号であってよい。

容器は、所定のサイズのフィルムまたはフィルムロールを保存または分配することができる。容器は、個別包装された1枚のフィルムまたは複数の積み重ねられたフィルムを含有することができる。キットはまた、キットおよび/または組成物を使用するための説明書も含むことができる。

さらに、本発明のフィルムは、無菌状態であってもよく、そのようなフィルムを含有するキットは、無菌状態を保全するために用いることができる。フィルムは、無菌製造工程を介して無菌化されるか、または当技術分野において公知の方法により包装後に無菌化されうる。

以下の実施例は、本発明のある特定の非限定的な局面を明らかにするために含まれる。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するように本出願人らによって発見された技術であることを、当業者なら理解するはずである。一方で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示された特定の態様においてなされうること、および同様または類似の結果を依然として得ることができることを、当業者なら本開示に照らし理解するはずである。

実施例1
(溶解性のゲル形成フィルム)
溶解性のゲル形成フィルムを概して以下のように調製した。タンパク質分解酵素を親水性ゲル中に配合し、次いで、成形型に流し込み、乾燥させた。ドライフィルムを予め設計したサイズおよび形状で形成した。含水量を非常に低いレベルに、例えば、およそ5％に制御した。この乾燥状態は、特に酵素が結晶形態であるときに、酵素の安定性を向上させる。創傷適用前に、フィルムを適切なサイズおよび形状に切り分けることができる。適用前に、フィルムを水または他の水性媒体で湿らせ、続いてそれを創傷面上に置き、それを湿ったガーゼまたはドレッシング材で覆ってもよい（図1および5を参照）。次いで、フィルムは、ゆっくりと溶解し、創傷に酵素を容易に放出することができるヒドロゲルになる（図1を参照）。そのようなフィルムは、以下に説明するように動物モデルにおいて創傷を効果的に郭清する。安定性試験によって、ドライフィルムは40℃であっても、保存のあいだ安定した酵素活性を予想外に長期間維持できることが示された。

フィルムが水和するときに生じるヒドロゲルの粘度は概して、およそ1 gのドライフィルムが20 mlの水性媒体中に溶解化されたとき、5,000〜100,000の範囲である。例えば、(図3および4に記載の実験で用いられる)フィルム「A01」の水和から生じるヒドロゲルは、59,400 cpsの粘度を有する。粘度の測定は、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って取得した。以下の表1は、フィルムを生理食塩水に曝露したときの異なる組成を有するフィルムの溶解特性および粘度特性を提供する。

（表１）生理食塩水に曝露したときのゲル形成フィルムの溶解特性

溶解特性は、図2に図示するように、試験管中のゲルを反転させることにより視覚化できる。理想的なフィルムは、それが創傷から「リークオフ(leak off)」せず創傷床にとどまるのに十分な粘度があるヒドロゲルを提供する。

実施例2
（インビトロでの創傷デブリードマンのための溶解性のゲル形成フィルムの使用）
コラーゲン、エラスチンおよびフィブリンを用いて調製した人工痂皮を用いて、デブリードマン実験をインビトロで行った。サーモリシンを含有する溶解性のゲル形成フィルム(「フィルムA01」と呼ぶ、表2を参照)をサーモリシン濃厚フィルム(表3を参照)およびブロメラインゲル(表4を参照)と比較した。

（表２）サーモリシン^*を含有する「フィルムA01」の配合

^* DI水を用いて、脱水前にフィルムの成分を混合した。

（表３）サーモリシン^を含有する「濃厚フィルム」の配合

^ トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を用いて、脱水前にフィルムの成分を混合した。

（表４）ブロメラインゲルの配合

成分(酵素および塩を含まない)が均質になるまで混合することにより、フィルムを調製した。次に、規定された量の塩(例えば、NaClおよびCaCl₂)を有する緩衝液中に溶液または分散として酵素を添加した。全ての成分を含んだ最終混合物を均質になるまで撹拌した。次いで、混合物(粘性ゲル)を遠心分離して気泡を取り除き、ペトリ皿内に塗布した。通常のラボ条件下での適切な換気によって乾燥させるために平らな表面上に皿を放置した。約48時間の乾燥後、フィルムを使用向けのカスタムサイズに切り分けた。

溶解性のゲル形成フィルムならびにサーモリシン濃厚フィルム(図3および4において「濃厚」と表示)は、コラーゲンを同じ程度消化した。両方とも、10％ブロメラインを含有したブロメラインゲルより優れていた(図3および4を参照)。

実施例3
(インビボでの創傷デブリードマンのための溶解性のゲル形成フィルムの使用)
インビボ熱傷ブタモデルを用いて、本発明のフィルムを試験した。高温の金属棒で皮膚を焼くことにより、熱傷創をブタの背中に生じさせた。処置を開始する前に創傷に痂皮を形成させた。サーモリシンフィルム(表5)、サーモリシン薄層ゲル(表6)、パパイン-尿素軟膏(表7)、またはSANTYL(登録商標)コラゲナーゼ(白色ワセリンUSP 1グラム当たり250ユニットのコラゲナーゼを含有する滅菌酵素郭清軟膏、Healthpoint(登録商標) Biotherapeuticsから入手できる)のいずれかで1日1回、全ての創傷を処置した。図5は、このモデルにおいてフィルムを創傷に適用する方法を図示する。

（表５）サーモリシン^#を含有する速溶薄層フィルムの配合

^*トリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を用いて、脱水前にフィルムの成分を混合した。

（表６）サーモリシン薄層ゲルの配合

（表７）パパイン-尿素クリームの配合

フィルムを上記実施例2で記載したように調製した。(表2に記載のフィルムA01の2.2 mg/分と比較して)速溶フィルム(表5)は6 mg/分の速度で水中に溶解した。デブリードマンが完了した創傷の数を測定し、4種類の処置の効果を比較した。それぞれの処置について1〜5日後に完全に郭清された創傷のパーセンテージを図6に例示する。サーモリシン薄層ゲルおよびサーモリシン速溶フィルムは、その創傷を郭清する能力関して、パパイン-尿素軟膏またはSANTYL(登録商標)コラゲナーゼのどちらよりもはるかに優れていた。

Claims (27)

1. (a) 50から70％w/wの水溶性セルロースエーテル；
   (b)15から25％w/wの親水性レオロジー改質剤；および
   (c)タンパク質分解酵素
   を含む、溶解性のゲル形成フィルムであって、該溶解性のゲル形成フィルムが15％w/w未満の含水量を有し、該溶解性のゲル形成フィルムが水または他の水性媒体と接触するとヒドロゲルを形成することができ、該タンパク質分解酵素がサーモリシンまたはコラゲナーゼであり、該親水性レオロジー改質剤がポリエチレングリコールであり、かつ、該フィルムが該水溶性セルロースエーテル、該親水性レオロジー改質剤および該タンパク質分解酵素の均質な混合物である、溶解性のゲル形成フィルム。
2. タンパク質分解酵素が結晶形態である、請求項1記載の溶解性のゲル形成フィルム。
3. 形成されるヒドロゲルが、スピンドル#SC4-14およびチャンバ#SC4-6Rを有する少量サンプルアダプターを用いるブルックフィールドRVモデル粘度計を用い、室温において10 rpmで1分の時点で読み取って測定した場合に、1,000から100,000 cpsの粘度を有する、請求項1〜2のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
4. タンパク質分解酵素がサーモリシンである、請求項1〜3のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
5. フィルムの厚さが10から1000 μmの範囲である、請求項1〜4のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
6. 100から0.1 mg/分の速度で水中に溶解することができる、請求項1〜5のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
7. 0.5から10 mg/分の速度で水中に溶解することができる、請求項6記載の溶解性のゲル形成フィルム。
8. タンパク質分解酵素の重量パーセントが、フィルムの乾燥重量の0.1％以上であり、室温で24ヶ月間保存したときに10％を超えて低下しない、請求項1〜7のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
9. 水溶性セルロースエーテルがヒドロキシアルキルセルロースエーテルである、請求項1〜8のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
10. ヒドロキシアルキルセルロースエーテルが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項9記載の溶解性のゲル形成フィルム。
11. 25から35％w/wのヒドロキシエチルセルロースおよび25から35％w/wのヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
12. ポリエチレングリコールがPEG-400である、請求項1〜11のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
13. 5 から15％w/wのタンパク質分解酵素を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
14. ヒドロゲルが、金属塩をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
15. 金属塩が、塩化ナトリウムもしくは塩化カルシウムまたはそれらの混合物である、請求項14記載の溶解性のゲル形成フィルム。
16. ヒドロゲルが保存剤をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
17. 保存剤が、メチルパラベン、プロピルパラベン、もしくはフェノキシエタノール、またはそれらの混合物である、請求項16記載の溶解性のゲル形成フィルム。
18. (a)3から7％w/wのセルロースエーテルまたはそれらの組み合わせ、1から3％w/wの親水性レオロジー改質剤、およびトリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を含む第1の混合物を得る段階；
    (b)タンパク質分解酵素、金属塩、およびトリス緩衝液(10 mM、pH=7.5)を含む第2の混合物を得る段階；
    (c)第1の混合物および第2の混合物を一緒に混合して、ヒドロゲルを得る段階；および
    (d)段階(c)からのヒドロゲルを乾燥させて、溶解性のゲル形成フィルムを得る段階
    により作製される、請求項1〜17のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
19. タンパク質分解酵素がサーモリシンである、請求項18記載の溶解性のゲル形成フィルム。
20. デブリードマンを必要とする創傷を郭清するための請求項1〜19のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
21. 創傷が慢性創傷である、請求項20記載の溶解性のゲル形成フィルム。
22. 慢性創傷が、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、火傷、または圧迫潰瘍である、請求項21記載の溶解性のゲル形成フィルム。
23. 創傷が壊死組織を含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
24. 壊死組織が痂皮である、請求項23記載の溶解性のゲル形成フィルム。
25. 水性媒体が、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用される前に創傷に適用されるか、または水性媒体が、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用された後に該フィルムに適用される、請求項20〜24のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。
26. 水性媒体が生理食塩水である、請求項25記載の溶解性のゲル形成フィルム。
27. 包帯、創傷ドレッシング材、またはガーゼが、溶解性のゲル形成フィルムが創傷に適用された後に該フィルムの上に適用される、請求項20〜26のいずれか一項記載の溶解性のゲル形成フィルム。

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