JP6478448B2 - 酸素含有培地溶解液、細胞培養培地、細胞培養方法および酸素含有培地溶解液の製造システム - Google Patents

Description

本発明は、酸素含有培地溶解液、細胞培養培地、細胞培養方法および酸素含有培地溶解液の製造システムに関するものである。

従来より、動物細胞、植物細胞、細菌などを対象として培養容器（槽）内に張り込んだ培養液（培地）で培養することで細胞自体あるいは細胞が産生する有用物質（インターフェロン、ホルモン、モノクローナル抗体など）を製造することが行われており、特に培養規模を大きくしてより生産性を高めることが望まれている。このような細胞培養においては、嫌気性の細胞を対象とする以外、培地中に酸素を供給する必要がある。

特許文献１には、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える細胞培養装置を使用し、上記培養槽内に対して、上記筒状部材の一方端部が液外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ、細胞を培養する方法であって、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として上記散気手段から供給することが記載されている。

特開2011-177046号公報

しかしながら、特許文献１の細胞培養方法に使用される培養装置の場合、酸素含有ガスを供給する散気手段（酸素含有ガスの供給装置）を備える必要があり、装置の大型化、複雑化が避けられないという問題がある。また、特許文献１の細胞培養方法の場合、培地中の溶存酸素濃度を調整するための制御装置を使用する必要があり、さらなる装置の大型化を招いている。

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、特別な散気手段（酸素供給手段）や制御装置を必要とせず、細胞培養に好適な溶存酸素濃度において効率的に細胞を培養することができる細胞培養培地、細胞培養方法を提供することを課題としている。また、細胞培養培地を構成する酸素含有培地溶解液と、この酸素含有培地溶解液の製造システムを提供することを課題としている。

本発明は、上記の課題を解決するため、以下の酸素含有培地溶解液の製造システムを提供する。
＜１＞酸素と水を混合する円盤状の混合部を備えた混合装置と加圧手段とを含む、酸素含有培地溶解液の製造システムであって、混合装置の混合部は、供給孔と、排出孔と、供給孔と排出孔を連通する流路、および流路から突出し、供給された水との接触に伴って超振動する、円柱形の複数のピンを有し、混合部の中央付近に供給孔、外周縁付近に排出孔、または、中央付近に排出孔、外周縁付近に供給孔が配置され、同心の仮想円上に複数配置されたピンによって形成される環状列が、混合部の中央から外周縁へ向かって複数列配置され、ピンが混合部の中央から外周縁へ向かって放射状に配置されており、ピンは、直径Ｄが、０．５ｍｍ≦Ｄ≦４．００５ｍｍであるものを含み、加圧手段によって酸素を含む水が供給孔から流路へと供給され、ピンとの接触を伴って酸素を含む水が流路を通過し、ピンが超振動することで酸素と水とが混合されて生成された酸素水が排出孔から排出されることを特徴とする酸素含有培地溶解液の製造システム。
＜２＞加圧手段は、酸素を含む水を、０．１Mpa以上の圧力で供給可能であることを特徴とする前記酸素含有培地溶解液の製造システム。

本発明の酸素含有培地溶解液を用いた細胞培養培地によれば、例えば酸素含有ガスを供給するための特別な装置などを必要とせず、細胞培養に好適な溶存酸素濃度において効率的かつ安定に細胞を培養することができる。また、溶存酸素濃度の調整のための装置や手間が不要であり、培養に伴うコストも抑制することができる。

本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置を例示した斜視図である。 図１に例示した混合装置の混合部を例示した斜視図である。 図１、図２に例示した混合装置の主体（混合部）を例示した断面図である。 （Ａ）は、図１、図２に例示した混合装置の主体の混合部の形態を例示した正面図である。（Ｂ）は、（Ａ）の部分拡大図である。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した説明図であり、混合の原理を模式的に示している。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した組立図である。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した組立図である。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの一実施形態を例示したブロック図である。 酸素含有培地溶解液の製造システムにおける一実施形態を例示したブロック図である。 実施例で使用した混合装置の主体の形態を模式的に示した斜視図である。 実施例で使用した混合装置の主体の形態を模式的に示した正面図である。 実施例で使用した混合装置の主体の形態を模式的に示した断面図である。 実施例で使用した混合装置の形態を模式的に示した断面図である。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムによって製造された酸素を含む水の溶存酸素濃度の経時変化示すグラフである。 本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムによって製造された酸素を含む水の溶存酸素濃度の経時変化示すグラフである。

本発明者らは、高濃度に溶解した酸素水に関する研究を進める中で、従来の酸素水とは全く異なる特徴を有する酸素水の製造方法を見出し、この方法によって製造された酸素水を細胞培養における培地溶解液に応用することを着想して、本発明を完成させるに至った。

例えば、従来から市販されている酸素水などの場合には、容器を開栓後直ちに加圧溶解していた酸素が抜けてしまうものがほとんどであるが、本発明の酸素含有培地溶解液は、水の中に高次元で酸素が練り込まれて混合されているため、解放された大気下で、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が３５日以上持続するという全く異質な特徴を有している。ここで「解放」とは、例えば、酸素含有培地溶解液が大気に曝されている状態をいう。ただし、例えば、酸素含有培地溶解液が密閉容器などに封止された状態であれば、より長期に亘って高い溶存酸素濃度の状態が維持されることは言うまでもない。

また、溶存酸素濃度は、例えば、隔膜電極法、ウインクラー法などの公知の方法で測定することができ、市販の溶存酸素計などを適宜使用することができる。さらに、本発明の酸素含有培地溶解液中の溶存酸素濃度は温度にも影響されるが、基準となる温度としては、例えば、０℃〜４０℃程度の範囲が考慮され、このような温度では、解放された大気下において、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が３５日以上持続し、好適な条件下では、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が少なくとも１８０日間持続する。

さらに、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、温度などの条件にもよるが、およそ２０℃においては、比重が1.004〜1.007である。このことは、酸素含有培地溶解液（酸素水）の酸素と水が高次元の状態で練り合わされており、水素結合が破壊され、包接化が起こっていると推測される。したがって、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）によれば、高次元に練り込まれた溶存酸素によって、効率的かつ安定な細胞培養が実現される。

このような特徴を有する酸素含有培地溶解液に培地成分を溶解させることで細胞培養培地を構成することができ、この細胞培養培地によって所望の細胞を培養することで、細胞培養に好適な溶存酸素濃度において効率的かつ安定に細胞を培養することができる。本発明の酸素含有培地溶解液は、酸素水（酸素が溶解した水）のみによって構成されてもいてもよいし、例えば、アミノ酸類、ビタミン類、糖類などの添加物を含んでいてもよい。

さらに、酸素含有培地溶解液の製造時において酸素含有培地溶解液に含まれる溶存酸素濃度を所望の濃度に調整することが可能であるため、細胞培養培地での細胞培養時には、例えば酸素含有ガスを供給するための特別な装置や、溶存酸素濃度の調整のための装置や手間が不要であり、装置がシンプルな構成となり、培養に伴うコストも抑制することができる。

発明の酸素含有培地溶解液に溶解させる培地成分は特に限定されず、例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地などの公知の基礎培地に含まれる成分が含まれる。したがって、例えば、本発明の酸素含有培地溶解液によって、前記の基礎培地を溶解させて細胞培養培地を構成することもできる。また、細胞培養培地には、必要に応じて、血清、アミノ酸類、ビタミン類、糖類、抗生物質、増殖促進剤などの成分などを添加することもできる。細胞培養培地中の培地成分の濃度などは、培養対象となる細胞の種類や数などに応じて適宜設定することができる。

この細胞培養培地では、所望の細胞を適宜な条件（温度、ｐＨなど）で培養することができる。本発明において培養対象となる細胞は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、例えば医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞の培養にも好ましく適用することができ、生産対象の物質としては、例えば、培養した細胞自体、細胞が産生する抗体や酵素などのタンパク質、低分子化合物若しくは高分子化合物などの生理活性物質およびウイルスなどを例示することができる。さらに、例えば動物細胞であれば、付着性細胞、浮遊性細胞のいずれもが含まれる。付着性細胞の例としては、例えば、ＣＨＯ細胞、各種の線維芽細胞、各種の腎細胞、各種の癌細胞、マクロファージなどが例示され、また浮遊性細胞の例としては、例えば、ハイブリドーマ、ミエローマなどが例示される。

また、細胞を培養する際には、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ガラス、セルロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドなどを素材とする多孔質性担体（キャリア）に細胞を付着させて培養することもできる。

本発明の酸素含有培地溶解液は、水の中に高次元で酸素が練り込まれて混合されているため、解放された大気下で、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が３５日以上持続する。このため、所望の溶存酸素濃度に調整した酸素含有培地溶解液と培地成分とを含む細胞培養培地によって細胞を培養することで、培養細胞に酸素が確実に供給され、効率的かつ安定に細胞を培養することができる。また、例えば酸素含有ガスを供給するための特別な装置などを必要とせず、また、溶存酸素濃度の調整のための装置や手間が不要であるため、細胞の培養が容易であるとともに、コストも抑制することができる。

以下、本発明の酸素含有培地溶解液の製造方法、製造システムについて説明する。

本発明の酸素含有培地溶解液は、酸素と水を混合する混合部を備えた混合装置と、加圧手段とを含む製造システムによって製造することができる。

混合装置の混合部は、供給孔と、排出孔と、供給孔と排出孔を連通する流路および流路から突出し、供給された水との接触に伴って超振動する複数のピンを有している。

混合部の形状は特に限定されず、円盤状、円柱状、方形状、球状などの形状に適宜設計することができる。また、混合部を複数有するものとすることもできる。混合部を構成する材料としては、硬質系の金属・合金（例えば、鉄、鋼）、ダイヤモンドやセラミックスのようなシリコン系材料（ガラスやカーボン等も包含する）、樹脂材料等が選択可能である。ここで、樹脂材料（例えば、フッ素樹脂）は、有機性の柔軟な材料同士の混合や乳化のために適用するのであれば、十分な強度を有している。

供給孔および排出孔の形状、配設位置、配設数も特に限定されず、混合部の全体形状や、加圧手段による圧力条件などを考慮して適宜設計することができる。供給孔からは、酸素を含む水が混合部内へ供給され、排出孔からは、混合された酸素水としての酸素含有培地溶解液が排出される。

流路は、例えば、直線状、曲線状などであってよく、その形状、長さ、幅などは特に限定されず、適宜設計することができる。また、例えば、混合部の全体形状が凹部を有する円盤状であり、混合部の中央と外周縁に供給孔と排出孔とがそれぞれ形成されている場合には、流路は、混合部の中央から外周縁へと広がる円形空間として形成することができる。

ピンは、供給孔および排出孔の配設位置や流路の形状、水量、酸素の含有量などを考慮して、配設数、配設位置、隣接するピンとの間隔などを適宜設計することができる。また、ピンの形状は、円柱形、角柱形などの形状に適宜設計することができるが、流体（酸素を含む水）とピンの接触効率や流体（酸素を含む水）の流れなどの観点からは、円柱形とすることが好ましい。さらに、ピンの高さ、幅（径）なども流路の形状、水量、酸素の含有量などを考慮して適宜設計することができ、異なる幅（径）を有するピンを組み合わせて使用することもできる。

さらに、ピンは、加圧供給された酸素を含む水との接触に伴って超振動することによって、酸素を含む水にキャビテーションを生じさせることができる。これによって、酸素と水とが均質に分散化されて、溶解する。ここで、「超振動」とは、超音波域（例えば、振動数が２０kHz以上）での振動をいい、「キャビテーション」とは、水の流れの中で、短時間に酸素による微細な気泡の発生と消滅が起こる物理現象をいう。

加圧手段は、酸素を含む水を混合部の供給孔から所定の圧力で供給可能なものであればよく、例えば、公知のポンプなどを例示することができる。例えば、加圧手段は、好ましくは０．１Ｍｐａ以上、実際的には０．１Ｍｐａ〜１０Ｍｐａ程度の圧力で酸素を含む水を圧送できるものが好ましい。

加圧手段によって所定の圧力で圧送された酸素と水が、混合装置の混合部の供給孔から圧入されてピンと接触することでピンの超振動が生じ、酸素を含む水にキャビテーションを生じさせることができる。このため、酸素と水とが均質に分散化されて溶解した酸素水として酸素含有培地溶解液が生成される。

例えば、従来から市販されている飲料用の酸素水などの場合には、容器を開栓後直ちに加圧溶解していた酸素が抜けてしまうのに対し、本発明の酸素含有培地溶解液は、水の中に高次元で酸素が練り込まれて混合されているため、解放された大気下で、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が３５日以上持続するという全く異質な特徴を有している。

さらに、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態について詳しく説明する。

図１は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した斜視図である。図２は、図１に例示した混合装置の混合部を例示した斜視図である。図３は、図１、図２に例示した混合装置の主体（混合部）を例示した断面図である。

混合装置１０は、多数の突起Ｐを有する混合部Ｇと、混合部Ｇに被覆する蓋部２０を有している。

混合装置１０は、主体Ｍと、蓋部２０とを有している。

主体Ｍは略円盤状であり、略板状の中央部３と、この中央部３の表面側および裏面側に混合部Ｇとを有している。

混合部Ｇは、主体Ｍの内側に形成された略円形の領域であり、半径方向外周縁部１よりも半径方向内方の領域において全体的に凹んでおり、凹部２が形成されている。その凹部２は、酸素を含む水の流路として機能する。また、この凹部２の内側に多数のピン（突起）Ｐが突出している。

また、図１では示されていないが、図３に示したように、主体Ｍの裏面側にも同様の混合部Ｇが形成されている。すなわち、裏面側に形成された凹部２の内側に多数のピンＰを有しており、この混合部Ｇの裏面側も図１では図示しない蓋部２０で被覆される。

主体Ｍの表面側のピンＰが形成されている領域と、裏面側の多数のピン（図示せず）が形成されている領域の間（円盤の厚み方向の中央）には、略板状の中央部３が設けられている。すなわち、中央部３からは、混合部の表面側および裏面側において多数のピンが突出している。

図２に例示したように、中央部３の半径方向外縁部には、複数（第１実施形態では４個）の貫通孔４が形成されている。この貫通孔４は、表面側（図３では上側）のピンＰが形成されている領域と、裏面側（図３では下側）のピンＰ（図３では下側）が形成されている部分を連通している。

蓋部２０は、主体Ｍと略等しい外径を有する略円盤状であり、主体Ｍの表面側の混合部Ｇ、裏面側の混合部Ｇを覆うように嵌着可能に形成されている。

また、蓋部２０の中心には開口２１が形成されており、蓋部２０によって混合部Ｇの凹部２を被覆した際には、当該開口２１と、凹部の中心Ｏ（図２）とは、対応した位置となる。

そして、蓋部２０の開口２１と、混合部Ｇの中央部４の半径方向外縁部に形成された貫通孔４は、酸素を含む水の排出孔または供給孔として機能する。具体的には、例えば、蓋部２０の開口２１からは、酸素を含む水を混合部Ｇへ供給することができる。したがって、この場合、蓋部２０の開口２１は、混合部Ｇへと酸素を含む水が供給されるための供給孔として機能する。そして、混合部Ｇへ供給された酸素を含む水は、蓋部２０の開口２１から混合部Ｇの貫通孔４を連通する流路（凹部２）上でピンＰとの接触を繰り返しながら流路（凹部２）を通過し、半径方向外縁部に形成されている貫通孔４から裏面側へと排出されるとともに、裏面側の混合部Ｇへと供給される。したがって、この場合、貫通孔４は、酸素を含む水の排出孔および供給孔の両方として機能する。そして、裏面側の混合部Ｇへと供給された酸素を含む水は、再び流路（凹部２）上でピンＰとの接触を繰り返しながら流路（凹部２）を通過し、蓋部２０の中央に形成された開口２１から排出される。この場合、裏面側に配設された蓋部２０の開口２１は、酸素を含む水の排出孔として機能する。

なお、混合部Ｇを成形する方法としては、例えば、円板状の金属を切削して形成する方法（いわゆる「削り出し」）、円板状の金属を切削して凹部２を形成し、凹部２に多数（ピンと同数）の雌ネジを設け、この雌ネジに雄ネジを切ったピンを螺合させる方法、硬質セラミックの材料（粘土状の柔軟な材料）を型取りし、焼成して、硬質セラミック化する方法、 樹脂（例えば、フッ素樹脂）を切削する（削り出しを行なう）方法、樹脂（例えば、フッ素樹脂）を射出成形する方法などを例示することができる。

図２に例示したように、多数のピンＰ１〜Ｐ８が形成されている凹部２の中心点が符号Ｏで示されている。

ここで、ピンを表す記号Ｐは、多数のピンのうち、一部のピンを例示的に示しており、その他のピンの符号の図示は省略している。

ここで、凹部２は平面形状が円形に形成されているが、正多角形などに形成しても良い。

凹部２の中心から外周縁部１の内壁面まで距離、すなわち、混合部Ｇの凹部２の平面形状である円の半径は、図２では符号Ｒで示されている。混合部の半径Ｒは、供給する流体の圧力やピンＰの超振動などを考慮して、例えば、１０ｍｍ〜１００ｍｍ程度の範囲で適宜設計することができる。

次に、凹部２に形成された多数のピンＰ１〜Ｐ８の配置の一例について、図４、図５を用いて説明する。

図４（Ａ）は、図１、図２に例示した混合装置の主体の混合部の形態を例示した正面図である。図４（Ｂ）は、図４（Ａ）の部分拡大図である。

多数のピンＰ１〜Ｐ８は、直径が異なる８つの同心の仮想円上に、均等のピッチ（円周方向間隔）で配置されている。

混合部Ｇの凹部２では、同心の仮想円上に複数配置されたピンＰによって形成される環状列Ｓ１〜Ｓ８（図４（Ｂ）に図示）が、混合部Ｇの中央から外周縁（半径方向外方）へ向かって複数列配置されている。このため、ピンＰが混合部Ｇの中央から外周縁へ向かって放射状に配置されている。

詳細は後述するが、ピンＰ１は、最小径のピッチ円（中心点Ｏに最も接近しているピッチ円）上に１０本形成されている。また、ピンＰ８は、最大径のピッチ円（中心点Ｏに最も離隔しているピッチ円）上に２４本形成されている。

多数のピンＰ１〜Ｐ８は、蓋部２０の開口２１から供給された酸素を含む水が、凹部２の中心Ｏから半径方向外方に進行する場合、あるいは、凹部２の外周縁部１の貫通孔４から半径方向内方へ中心Ｏに向って酸素を含む水が進行する場合において、酸素を含む水が、ピンＰ１〜Ｐ８と段階的に接触するように配置されている。

具体的には、ピンＰ１〜Ｐ８の配置は、例えば、以下のような基準を考慮することができる。以下に例示する数値は、酸素を含む水をピンＰ１〜Ｐ８と確実に接触させ、効率的に酸素と水とを混合するための設計の一例であり、これに限定されるものではない。
図２において、当該多数のピンＰ１〜Ｐ８は、複数（図示では８つ）の同心円の円周上に配置されている。

多数のピンＰ１〜Ｐ８の直径Ｄは、例えば、下式で示される。

０．００４Ｒ≦Ｄ≦０．０８９Ｒ
中心点Ｏに最も近接しているピンＰ１は、点Ｏを中心とするピッチ円の円周上に等間隔に１０本配置されている。

円周上に１０本のピンＰ１を配置したピッチ円の半径寸法φ１は、下式で示される。

０．１３Ｒ≦φ１≦０．１７Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ１＝７ｍｍである。そして、ピンＰ１の直径Ｄ１は、例えば２．０ｍｍである。

ピンＰ１の半径方向外方に隣接するピンＰ２は、下式で示される半径寸法φ２（＞φ１）円（点Ｏを中心とする円）の円周上に、１０本、等間隔で配置されている。

０．１７Ｒ≦φ２≦０．２３Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ２＝９ｍｍである。そして、ピンＰ２の直径Ｄ２は、例えば２．５ｍｍである。

ピンＰ２の半径方向外方に隣接するピンＰ３は、点Ｏを中心として、半径寸法φ３（＞φ２）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法φ３は下式で示される。

０．３３Ｒ≦φ３≦０．３８Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ３＝１６ｍｍである。そして、ピンＰ３の直径Ｄ３は、例えば４．０ｍｍである。

第１実施形態では、ピンＰ３より半径方向外方の領域に位置するピンＰ４〜Ｐ８の直径は、ピンＰ３の直径Ｄ３と等しい。

ピンＰ３の半径方向外方に隣接するピンＰ４は、点Ｏを中心として、半径寸法φ４（＞φ３）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法φ４は下式で示される。

０．４４Ｒ≦φ４≦０．４９Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ４＝２１ｍｍである。

ピンＰ４の半径方向外方に隣接するピンＰ５は、点Ｏを中心として、半径寸法φ５（＞φ４）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法φ５は下式で示される。

０．５７Ｒ≦φ５≦０．６３Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ５＝２７ｍｍである。

ピンＰ５の半径方向外方に隣接するピンＰ６は、点Ｏを中心として、半径寸法φ６（＞φ５）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法Ｒｒ６は下式で示される。

０．６６Ｒ≦φ６≦０．７２Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ６＝３１ｍｍである。

ピンＰ６の半径方向外方に隣接するピンＰ７は、点Ｏを中心として、半径寸法φ７（＞φ６）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法φ７は下式で示される。

０．８Ｒ≦φ７≦０．８５Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ７＝３７ｍｍである。

半径方向外方に配置されているピンＰ８は、点Ｏを中心として、半径寸法φ８（＞φ７）の同心円の円周上に、等間隔で２４本配置されている。半径寸法φ８は下式で示される。

０．９１Ｒ≦φ８≦０．９６Ｒ
例えば、Ｒ＝４５ｍｍの場合、φ８＝４２ｍｍである。

そして、酸素を含む水がピンＰ１〜Ｐ８と段階的に接触を繰り返すためには、図２、図４（Ａ）（Ｂ）に例示したように、ピンＰ１〜Ｐ８の中心と、凹部２の中心Ｏとを結ぶ直線（半径方向に延在する直線、或いは放射線状に延在する直線）は、ピンＰ１〜Ｐ８の半径方向内方に隣接するピンの中心と、凹部２の中心Ｏを結ぶ直線と一致しない様に配置することが好ましい。

すなわち、ピンＰ１〜Ｐ８の中心と、当該ピンＰ１〜Ｐ８の半径方向内方に隣接するピンの中心とは、凹部２の円周方向について偏奇する（ずれている）様に配置することが好ましい。例えば、図２、図４（Ａ）（Ｂ）において、ピンＰ５の中心と、ピンＰ５の半径方向内方に隣接するピンＰ４の中心とは、凹部２の円周方向について偏奇している（ずれている）。そのため、ピンＰ５の中心と中心Ｏを結ぶ直線と、ピンＰ４の中心と中心Ｏを結ぶ直線は、一致していない。

さらに言い換えれば、図４（Ｂ）に例示したように、例えば、環状列Ｓ６〜Ｓ８のピンを例にとると、環状列Ｓ７における複数のピンＰ７のうち、隣り合う２本のピンＰ７の中心と混合部Ｇの中心とを結ぶ２本の直線Ｔ１、Ｔ２に囲まれる領域に、混合部Ｇの半径方向に隣接する他の環状列Ｓ６、Ｓ８のピンＰ６、Ｐ８が少なくとも配置されていることが好ましい。流路（凹部２）では、このようなピンの配列が連続的に形成されている。

例えばこのようなピンの配置によって、図４（Ｂ）中の矢印に模式的に例示したように、加圧手段によって所定圧（例えば、０．１ＭＰａ）以上に加圧して供給された酸素を含む水は、ピンとの接触を伴って、環状列（例えばＳ６）において隣り合うピンの間を通過し、さらに、隣接する他の環状列（例えばＳ７）のピンと接触する。そして、再び、隣り合うピンの間を通過し、さらに、隣接する他の環状列（例えばＳ８）のピンと接触する。このように、酸素を含む水は、混合部の中央付近（供給孔付近）から外周縁付近（排出孔付近）の間の流路（凹部２）において、突出するピンとの接触を繰り返しながら流路を通過し、この際、複数のピンＰは、酸素を含む水との衝突によって超音波域で振動する。このようなピンＰの超振動は、酸素を含む水にキャビテーションを惹起させ、そのキャビテーションによって、酸素と水を効果的且つ均質に分散化させて混合を促進させることができる。

なお、図１、図２、図３、図４（Ａ）（Ｂ）に例示したピンの配置は、「凹部２の中心Ｏから半径方向外方に酸素を含む水が進行する場合、或いは、凹部２の外周縁部１から半径方向内方へ中心Ｏに向って酸素を含む水が進行した場合において、酸素を含む水が段階的にピンＰと接触し、酸素と水を効果的且つ均質に分散化させるための一例であり、この配置に特に限定されるものではない。

図５は、混合装置を含む混合ユニットの一実施形態を例示した概要図である。

図５で例示する混合ユニット１００は、混合装置１０（主体Ｍと蓋体２０）をケーシング５（供給側のケーシング）、６（吐出側のケーシング）内に収容して構成されている。供給側のケーシング５と吐出側のケーシング６とは、公知の手段によって気密性を保つ様に接続されている。

供給側のケーシング５には、供給管７が設けられ、吐出側のケーシング６には吐出管８が設けられている。

供給管７は、第１の貫通部７１を介して、供給側の蓋部２０（図５では上方の蓋部）の開口２１と連通している。第１の貫通部７１は、供給管７が設けられている供給側のケーシング５中にも形成されている。

吐出管８は、第２の貫通部８１を介して、排出側の蓋部２０（図５では下方の蓋部）の開口２１と連通している。第２の貫通部８１は、吐出管８が設けられている吐出側ケーシング６中にも形成されている。

図５で示す混合ユニット１００において、混合される酸素と水は、供給管７、第１の貫通部７１、蓋部２０の開口２１（供給孔）を介して、図１、図２で示す表側の凹部２（図３における上側の凹部２：図５では符号Ａで示す）の中心点Ｏ近傍の領域に流入する。

流入した酸素を含む水は、凹部２の半径方向外側に向かって流れるが、その際に、多数のピンＰ１〜Ｐ８と接触することで、水に酸素が均質に分散し、混合が促進される。

半径方向外方に流れた酸素を含む水は、図２で例示した凹部２の貫通孔４（排出孔、供給孔）を介して、図１、図２では図示しない裏側の凹部２（図３における下側の凹部２：図５では符号Ｂで示す）の半径方向外方縁部に流入する。

裏側の凹部２の外方縁部１側に流入した酸素を含む水は、中心Ｏに向かって凹部２の内を半径方向内方に流れる。その際にも、酸素を含む水は多数のピンＰ１〜Ｐ８と接触して効率的に混合される。

裏側の凹部２の中心Ｏに到達した酸素を含む水は、酸素と水が高次元で練り合わされた混合状態となっており、裏側の凹部２を被覆する蓋部２０の開口２１（排出孔、供給孔）、第２の貫通部８１を介して、吐出管８から吐出され、例えば、適宜な貯蔵ユニットなどに送られる。

図５において、混合装置１０は、主体Ｍの表裏面（上下両端面）には、蓋部２０が密着する様に収容された状態となっている。

図５は、１個の主体Ｍと２個の蓋部２０からなる１モジュールの混合装置１０が含まれるが、この１モジュールの混合装置１０においても、酸素と水の接触と分散とが効率的に行われる。

図６は、本発明の酸素水の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した組立図である。

図５は、単一の混合装置１０をケーシング５、６内に収容しているが、図６に例示した混合ユニット１００Ａでは、２つの混合装置１０Ａ、１０Ｂをケーシング５６内に収容している。

図６では、酸素を含む水の流れを明確にするために、供給管７、吐出管８と、ケーシング５６を別体に示している。

供給管７は、第１の蓋部２０Ａにおける一方の面（図示の上面）の中央に第１の蓋部２０Ａと一体に接続している。

供給管７の端部から第１の蓋部２０Ａにおける他方の面（図示の下面）を貫通する貫通孔（供給孔）７Ａが設けられている。

吐出管８は、第３の蓋部２０Ｃにおける一方の面（図示の下面）の中央に第３の蓋部２０Ｃと一体に接続している。

吐出管８の端部から第３の蓋部２０Ｃにおける他方の面（図示の上面）を貫通する貫通孔（吐出孔）８Ａが設けられている。

混合装置１０Ａ、１０Ｂは、図１、図２で例示したように、中央部の表面側および裏面側に混合部を有している。

図６に例示したように、酸素を含む水は、供給管７、第１の蓋部２０Ａの貫通孔（供給孔）７Ａを通じて、混合装置１０Ａの表面側の混合部の凹部（図示を省略）の中央に流入する。そして、この凹部の中央から半径方向外方へ移動する際にピンＰ（図示を省略）に接触し、酸素と水の混合が促進される。混合された酸素と水は、凹部（図示を省略）の半径方向外方縁部に位置する貫通孔（図示を省略）から排出されるとともに、第１の混合装置１０Ａの裏面側（下側）の混合部（例えば、図１、図２で示されていない側の混合部）の凹部の外周縁部（図示を省略）に供給される。したがって、この場合、貫通孔は、酸素と水の排出孔として機能する一方で、酸素と水の供給孔としても機能する。そして、この凹部の半径方向内方へ流れ、ピンＰと接触し、酸素と水の混合がさらに促進される。

第１の混合装置１０Ａにおける裏面側（下側）の混合部の凹部（図示を省略）の中心部に到達した酸素を含む水は、第２の蓋部２０Ｂの開口（供給孔）２１Ｂを介して、第２の混合装置２０Ｂの表面側（上側）の混合部の凹部（図示を省略）の中央に供給される。この凹部の中央から半径方向外方へ酸素と水が流れる際にピンＰ（図６では図示せず）に接触し、酸素と水の混合が促進される。そして、混合された酸素と水は、凹部の半径方向外方縁部（図示を省略）から、第２の混合装置１０Ｂの裏面側（下側）の混合部の凹部の外周縁部（図示を省略）に供給される。さらに、混合された酸素と水は、この凹部の半径方向内方へ流れ、再びピンＰと接触し、酸素と水の混合がさらに促進される。

第２の混合装置１０Ｂにおける裏面側（下側）の混合部の凹部（図示を省略）の中心部に到達した酸素を含む水は、第３の蓋部２０Ｃの貫通孔８Ａを介して、吐出管８内を流過する。

図７は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の一実施形態を例示した組立図である。

図７に例示した混合ユニット１００Ｂは、さらに多数の段（４段）の混合装置１０Ａ〜１０Ｄをケーシング内に収容している。

図７において、供給管７を介して供給された酸素と水は、第１の蓋部２０Ｄの開口１２Ｄ、第１の混合装置１０Ａの表裏（図１、図２で示されている側と示されていない側）の混合部、第２の蓋部２０Ｅの開口２１Ｅ、第２の混合装置１０Ｂにおける表裏の混合部、第３の蓋部２０Ｆの開口２１Ｆ、第３の混合装置１０Ｃにおける表裏の混合部、第４の蓋部２０Ｇの開口２１Ｇ、第４の混合装置１０Ｄにおける表裏の混合部、第５の蓋部２０Ｈの開口２１Ｈを経由して、吐出管８から吐出される。

そして、酸素と水が、第１〜第４の混合装置１０Ａ〜１０Ｄにおける表裏の混合部を通過する際に、その各々において酸素を含む水とピンＰとが連続的に接触して、酸素と水の混合が確実かつ効率的に行われる。第１〜第４の混合装置１０Ａ〜１０Ｄが連設されていることで、より効率的は混合を可能としている。

図８は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの一実施形態を例示した概要図である。

酸素含有培地溶解液の製造システム２００は、混合装置（図示していない）を含む混合ユニット１００（例えば図６、図７に例示した１００Ａ,１００Ｂ）と、材料貯留槽１１０と、高圧ポンプ（加圧手段）１２０と、三方弁Ｖ３を介装した材料搬送ラインＬとを有している。

材料搬送ラインＬは、ラインＬ１、ラインＬ２、ラインＬ３、ラインＬ４及び戻しラインＬｂを有している。

ラインＬ１は、材料貯留槽１１０と高圧ポンプ１２０とを接続し、ラインＬ２は高圧ポンプ１２０と混合ユニット１００とを接続し、ラインＬ３は混合ユニット１００と三方弁Ｖ３とを接続している。また、ラインＬ３は三方弁Ｖ３でラインＬ４と戻しラインＬｂとに分岐させられている。

三方弁Ｖ３は、混合ユニット１００に含まれる混合装置（図示していない）で混合した酸素水を供給先（次工程）に供給する場合は、ラインＬ３とラインＬ４とを連通させる。一方、材料の供給を一時的に停止させたい場合は、ラインＬ３と戻しラインＬｂとを連通させ、混合ユニット１００から吐出された酸素水を、材料貯留層１１０に戻して、循環させることが出来る。

材料貯留層１１０には、例えば、混合する水（海水／淡水）、酸素を貯蔵することができる。材料貯留層１１０は、材料貯留層１１０で貯蔵されている段階では、水と酸素が完全に分離していてもかまわない。

酸素含有培地溶解液の製造システム２００においては、加圧手段としての高圧ポンプ１２０の吐出圧は、例えば０．１ＭＰａ以上に設定することができる。

発明者の実験では、混合ユニット１００の供給管７に０．１ＭＰａ以上の圧力で複合材料を供給すれば、十分に混合が行なわれることが確認されている。

また、発明者の計測によれば、混合ユニット１００の圧損は、高圧ポンプ１２０の吐出圧の約１割〜２割程度に抑制されることが判明している。

酸素含有培地溶解液の製造システム２００は、例えば冷却装置などを含むことができる。混合ユニット１００の混合装置の混合部のピンは、高圧ポンプ１２０によって供給された酸素を含む水との接触に伴って超振動することによって、酸素を含む水にキャビテーションを生じさせることができる。これによって、酸素と水が均質に分散化されて、水中に酸素が溶解、分散等する。この際、キャビテーションにより酸素水が加熱されてしまう場合には、冷却装置による冷却処理を行なうことができる。冷却装置としては、例えば、混合ユニット１００全体を水没させ（いわゆる「どぶ漬け」）て冷却するための、冷却槽などを例示することができる。

このような酸素含有培地溶解液の製造システム２００によって製造された酸素含有培地溶解液（酸素水）は、培地成分とともに、細胞培養培地として好適に使用することができる。

図９は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの構成を例示した概略図である。

図９の酸素含有培地溶解液の製造システム２０２は、図８の酸素含有培地溶解液の製造システム２００に対して、材料貯留槽１１０を、貯水タンク１１０Ａに代え、ラインＬ１に気液混合装置１３０を配設し、ラインＬ２に気液混合率調整機構１４０を配設している。

ここで、気液混合装置１３０は、ラインＬ１の負圧を用いて、酸素を吸い込むタイプのものが使用されている。ここで、酸素側の圧力を高くして、貯水タンクからの水と酸素とを混合すると、高圧ポンプを破損する場合がある。これに対して、発明者の実験では、負圧により酸素を吸い込むタイプ（図９で示すタイプ）の気液混合装置１３０を用いれば、高圧ポンプ１２０を破損する可能性が極めて低くなることが確認されている。

気液混合装置１３０は、酸素容器１５０と接続されて、ラインＬ１の負圧（高圧ポンプ１２０で水が吸引されるためラインＬ１には負圧が発生）によって、酸素容器１５０内の酸素をラインＬ１に吸引する。

この酸素水製造システム２０２では、酸素と水が混合ユニット１００の混合装置（図示していない）内を流れることにより、酸素を含む水がピンＰと衝突して、酸素が水中に均一に分散する。その結果、酸素含有培地溶解液中の溶存酸素濃度が非常に高くなる。具体的には、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上、好ましくは３５ｐｐｍ以上の状態を長期（例えば、３５日以上）維持可能な水を製造することができる。

また、この混合ユニット２０２において、ラインＬ４に例えば、図示しない冷却貯水タンクを接続すれば、混合ユニット１００の混合装置によって生成された酸素水を冷却貯水タンク内に一旦貯留することもできる。

このような酸素含有培地溶解液の製造システム２０２によって製造された酸素含有培地溶解液（酸素水）は、培地成分とともに、細胞培養培地として好適に使用することができる。

気液混合率調整機構１４０は、ラインＬ２以降の脈動を抑制するための機構であり、酸素含有率を調整する機構である。

混合装置１０に供給する直前の段階で、酸素含有率を一定にしておくことが、溶存酸素濃度の高い水を生成するためには望ましい。しかし、水循環系統に脈動が生じると、酸素含有率を一定にすることが困難になる。

気液混合率調整機構１４０を設けることにより、図９の混合ユニット１００の水循環系統に脈動が生じたとしても、当該脈動を抑制して、酸素含有率を一定に維持できる。

気液混合率調整機構１４０は、図９は２個の容器が示されているが、１個でも良い。また、容器の形状は円筒状とは限らない。

図示は省略するが、ラインＬ１への気液混合装置１３０の配設を省略して、酸素容器１５０を酸素供給ラインによってラインＬ２（高圧ポンプの吐出側）に接続することも可能である。

その場合、酸素をラインＬ２に混入するためには、高圧ポンプ１２０の吐出圧以上の高圧が必要になる。

図９の酸素含有培地溶解液の製造システム２０２は、三方弁Ｖ３を切り替えることにより、混合ユニット１００から吐出された酸素含有培地溶解液（酸素水）を、ラインＬｂによって貯水タンク１１０Ａに戻して、循環させることができる。あるいは、酸素含有培地溶解液（酸素水）を循環させること無く、そのまま、次工程に供給することができる。

本発明の酸素含有培地溶解液、細胞培養培地、細胞培養方法および酸素含有培地溶解液の製造システムは、以上の形態に限定されることはない。例えば、本発明の細胞培養方法では、必要に応じてアミノ酸類、ビタミン類、糖類などの添加物を添加する工程や、ｐHを調整する工程なども含まれる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜１＞溶存酸素濃度の比較実験１
図９に概略を示した酸素含有培地溶解液の製造システムの作用効果、製造された酸素含有培地溶解液（酸素水）の特徴を確認するための実験を行った。

具体的には、図１０〜図１３に示した混合装置を使用し、図９に示した酸素含有培地溶解液の製造システムによって酸素含有培地溶解液（酸素水）を製造した。

この酸素含有培地溶解液の製造システムにおける混合装置の基本的な構成は、図１、図２などに例示した混合装置の構成を踏まえているが、混合部ＧのピンＰの本数、配置などは、本実施例に適した形態に設計されている。

実施例１で使用した混合装置は、図１０、図１１に示したように、円盤状の主体Ｍの内径Ｒ１が２８．０ｍｍ、外径Ｒ２が３０．０ｍｍに設計されている。また、主体Ｍの厚み（凹部以外の部分の厚み）Ｗ（図１２に図示）は５．０ｍｍに設計されている。

図１０〜図１２に示したように、ピンＰが凹部２（中央部３）の表裏面から突出し、混合部Ｇが形成されている（ピンＰの符号は一部のみに付し、その他のピンの符号は便宜的に省略している）。具体的には、ピンＰは円柱状であり、混合部Ｇの凹部２の中央から、仮想円上に、それぞれ１２本のピンＰが配置されて形成された環状例（符号は省略、図４（Ｂ）など参照）が、混合部Ｇの外周縁方向に８列配置されている。混合部Ｇの凹部２の中央から外側の第１、第２の環状列のピンＰの直径Ｄ１は、０．５ｍｍに設計されている。その外側の第３の環状列のピンＰの直径Ｄ２は１．０ｍｍに設計されている。さらにその外側の第４の環状列のピンＰの直径Ｄ３は１．５ｍｍに設計されている。さらにその外側の第５〜８の環状列のピンの直径Ｄ４は２．０ｍｍに設計されている。また、ピンＰはいずれも高さＨ（図１２に図示）が１．０ｍｍに設計されており、混合部Ｇの外周壁部１１（図１２に図示）の高さと一致している。

混合部Ｇの外周縁付近の４箇所に形成された貫通孔４（排出孔、供給孔）の直径ｄ１は、１．０ｍｍに設計されている。

さらに、図１３は、主体Ｍの表裏面（上下）の混合部Ｇに蓋部２０を嵌着させて形成した混合装置１０を示した斜視図である。蓋部２０は、混合部Ｇと同様に直径が３０．０ｍｍに設計されている。また、蓋部２０の中央には円形の開口２１（供給孔、排出孔）が形成されており、開口２１の直径ｄ２は４．０ｍｍに設計されている。

上記のように設計された混合装置を、図７に例示したのと同様の方法で上下に２段重ねて配設し、加圧手段（高圧ポンプ）、気液混合装置などとともに、酸素含有培地溶解液の製造システム（図９参照）を構成した。

この酸素含有培地溶解液の製造システムにおいて、約１０Ｌの純水と、酸素（純酸素を１．０Ｌ／min程度）とを、圧力手段としての高圧ポンプによって０．３Ｍｐａでの圧力で混合装置内へ供給し、およそ５分間循環処理させて（循環量１０Ｌ/min）、酸素含有培地溶解液（酸素水）を製造した。

図１４および図１５は、酸素含有培地溶解液の製造システムによって製造された酸素含有培地溶解液（酸素水）の溶存酸素濃度の経時変化示すグラフである。溶存酸素濃度の測定には、市販の溶存酸素測定計（セントラル科学社製：タフネスＤＯ ＣＧＳ５型）を使用した。

図１４および図１５の縦軸には溶存酸素濃度（単位は「ｐｐｍ」）を目盛り、横軸には、混合装置１０により酸素と水とを混合して、酸素を可溶化して吐出した後の経過時間（単位は「日」）を目盛っている。

図１４において、「黒三角」のプロットは２０℃の水における飽和溶存酸素濃度の平均値である。

「黒丸」のプロットの曲線は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの混合装置により酸素と水を混合することで、溶存酸素濃度を３５．６２ｐｐｍとした水を、開放容器（例えば、ビーカー）に貯蔵した場合における溶存酸素濃度の経時変化を示す。

「黒四角」のプロットの曲線は、本発明の酸素水製造システムの混合装置により酸素と水を混合することで、溶存酸素濃度を３５．６３ｐｐｍとした水を、開口部が蓋により閉鎖された容器（例えば、蓋で閉鎖されたビン）に貯蔵した場合における溶存酸素濃度の経時変化を示す。

図１５において、「黒三角」のプロットは、２０℃の水における飽和溶存酸素濃度の平均値である。

「黒丸」のプロットの曲線は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの混合装置１０により酸素と水を混合することで、溶存酸素濃度を５０．９６ｐｐｍとした水を、開放容器（例えば、ビーカー）に貯蔵した場合における溶存酸素濃度の経時変化を示す。

「黒四角」のプロットの曲線は、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムの混合装置により酸素と水を混合することで、溶存酸素濃度を５０．９６ｐｐｍとした水を、開口部が蓋により閉鎖された容器（例えば、蓋で閉鎖されたビン）に貯蔵した場合における溶存酸素濃度の経時変化を示す。

「×」のプロットの曲線は、従来の加圧方法で製造された酸素水（表記されている溶存酸素濃度は４０ｐｐｍ）を、溶存酸素測定のため開封した際の溶存酸素濃度を示している。従来の加圧方法では、市販の高濃度酸素溶解装置（大栄株式会社：製品名「酵素ファイター、ＯＤ−１１０型」）を使用し、この装置のタンク内に純酸素を送り込み、タンク内の内圧を０．１〜０．５Ｍｐａに設定して、酸素と水を圧力混合した。

図１４、図１５より、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムで製造された酸素含有培地溶解液（酸素水）は、溶存酸素濃度が高く、混合後、解放された大気下で長時間（３５日以上）が経過したとしても、水の飽和溶存酸素濃度を遙かに上回る溶存酸素濃度（２５ｐｐｍ以上）となっていることが確認された。一方、従来の加圧方法により製造された製品（酸素水）では、加圧時の溶存酸素濃度が４０ｐｐｍであっても、開封した時点で溶存酸素濃度は８ｐｐｍ〜９ｐｐｍに激減して、通常の水の飽和溶存酸素濃度と変わらなくなった（図１５）。すなわち、本発明の酸素含有培地溶解液の製造システムによれば、従来技術では実現できない様な、溶存酸素濃度が安定した水を生成することができることが確認された。

＜２＞溶存酸素濃度の比較実験２
さらに、上記＜１＞と同様の方法で製造された本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）と、市販品の酸素水との比較実験を行った。

具体的には、上記＜１＞と同様の方法で製造された本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）が封入された容器と、市販の酸素水（市販品１〜４）が封入された容器の蓋を開けて解放し、解放された大気下での溶存酸素濃度の変化を計測した。溶存酸素濃度の測定には、市販の溶存酸素測定計（セントラル科学社製：タフネスＤＯ ＣＧＳ５型）を使用した。

なお、市販品１では、「溶存酸素量１２０ｐｐｍ以上」との表示があり、市販品２では、「１２倍酸素充填」との表示があり、市販品３、４では、「溶存酸素量４０ｐｐｍ」との表示があった。

結果を表１に示す。

市販品１〜４は、容器を解放したと同時に酸素が大気に放出され、溶存酸素濃度が激減することが確認された（０日）。その後、市販品２〜４では、解放後１〜３日で８ｐｐｍ以下（飽和溶存酸素濃度）にまで減少した。また、市販品１も、解放後徐々に溶存酸素濃度は減少していき、解放後１０日で７ｐｐｍ以下（飽和溶存酸素濃度）にまで減少した。

一方、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、解放直後の溶存酸素濃度はおよそ５０ｐｐｍと高く、その後４日後においても４８．１ｐｐｍの溶存酸素濃度が維持されていた。その後は徐々に溶存酸素濃度の減少傾向が見られるものの、解放後３１日の段階においても溶存酸素濃度は３４．５ｐｐｍの状態が維持されていることが確認された。

したがって、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、酸素と水が高次元で練り合わされた混合状態となっており、従来の市販品とは全く異なる特徴を有し、解放された大気下で長期間に亘って溶存酸素濃度が高い状態が維持されることが確認された。

なお、溶存酸素濃度について、図１４、図１５、表１において示した経時変化に若干の差があるのは、混合した酸素の量、水温、水量などの条件の違いによるものと考えられるが、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、いずれの場合においても、解放された大気下、常温において、溶存酸素濃度が２５ｐｐｍ以上の状態が３５日以上持続することが確認された。
＜３＞動物細胞の培養実験
上記＜１＞と同様の方法で製造された本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）と純水による培養細胞への影響を比較検討した。

具体的には、細胞培養における通常の培地を使用し、この培地を、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）および純水のそれぞれに溶解させて細胞培養培地とした。

この細胞培養培地に、動物細胞を播種し、３７℃で７日間培養した。

結果を表２に示す。表２において、本発明の酸素含有培地溶解液の細胞増殖率および生存率は、純粋（対照）の場合を基準（＝１）として示している。

表２に示した通り、本発明の酸素含有培地溶解液を用いた細胞培養培地では、純水を用いた細胞培養培地と比較して、細胞増加率が１．６８倍、生存率が１．０３倍であり、本発明の酸素含有培地溶解液の優位性が確認された。また、細胞の生存率は、純水（対照）では、培養開始翌日をピークに経日的に減少したが、本発明の酸素含有培地溶解液の場合には、培養開始以降、生存率(細胞数)は、経日的に上昇することが確認された。

本発明の酸素含有培地溶解液を用いた細胞培養培地によれば、例えば酸素含有ガスを供給するための特別な装置などを必要とせず、細胞培養に好適な溶存酸素濃度において効率的かつ安定に細胞を培養することができることが示された。
＜４＞比重の測定
上記＜１＞と同様の方法で製造された酸素水について比重の測定を行った。

具体的には、室温を２０℃に保ち、上記＜１＞と同様の方法で製造された本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）を約２５０ｍｌをアクリル製の計量カップに取り、アルコール式温度計で温度が２０℃であることを確認した後、この酸素水を浮標式比重計（東亜計器製）で比重を測定した。この測定方法によって、測定日を変えて計２４回、酸素水の比重を測定した（試料No.1〜No.24）。

試料No.1〜No.24の比重の測定結果を表３に示す。なお、比重は、4℃の水の密度（g/cm³）を基準とし、例えば、20℃の水の比重は0.998230であることが知られている（化学便覧）。

また、比較として、市販のミネラル水、市販の水素水、市販の酸素水およびRO水（逆浸透膜を通した純水）についても同様の条件で比重を測定した結果を表４に示す。

表４に示したように、従来の気体を含む水（水素水、酸素水）は、比重が１.000を超えることはないが、表３に示したように、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、比重が1.004〜1.007に増加していることが確認された。

このことは、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、製造の過程で使用される混合装置のピンの形状、ピンの直径などが特徴的に設計されていることで、様々なエネルギーが水と酸素に繰り返し何度も加わり、これによって、ピンの超振動によるキャビテーションが生じて、水と酸素とが効果的かつ均一に分散し、高次元の状態で練り合わされることで、水素結合が破壊され、包接化が起こっていることを示唆している。したがって、本発明の酸素含有培地溶解液（酸素水）は、従来の市販の酸素水などとは全く異なる物性を有しており、溶存酸素によって効率的かつ安定な細胞培養が実現される。

１ 外周縁部
２ 凹部
３ 中央部
４ 貫通孔
５ ケーシング／供給側のケーシング
６ ケーシング／吐出側のケーシング
７ 供給管
８ 吐出管
１０ 混合装置
２０ 蓋部
１００ 酸素水製造システム
Ｇ 混合部
Ｍ 主体
Ｐ、Ｐ１〜Ｐ８ ピン

Claims (2)

1. 酸素と水を混合する円盤状の混合部を備えた混合装置と加圧手段とを含む、酸素含有培地溶解液の製造システムであって、
   混合装置の混合部は、
   供給孔と、
   排出孔と、
   供給孔と排出孔を連通する流路、および
   流路から突出し、供給された水との接触に伴って超振動する円柱形の複数のピン
   を有し、
   混合部の中央付近に供給孔、外周縁付近に排出孔、または、中央付近に排出孔、外周縁付近に供給孔が配置され、
   同心の仮想円上に複数配置されたピンによって形成される環状列が、混合部の中央から外周縁へ向かって複数列配置され、ピンが混合部の中央から外周縁へ向かって放射状に配置されており、
   ピンは、直径Ｄが、
   ０．５ｍｍ≦Ｄ≦４．００５ｍｍであるものを含み、
   加圧手段によって酸素を含む水が供給孔から流路へと供給され、ピンとの接触を伴って酸素を含む水が流路を通過し、ピンが超振動することで酸素と水とが混合されて生成された酸素水が排出孔から排出されることを特徴とする酸素含有培地溶解液の製造システム。
2. 加圧手段は、酸素を含む水を、０．１Mpa以上の圧力で供給可能であることを特徴とする請求項１の酸素含有培地溶解液の製造システム。