JP6478378B2

JP6478378B2 - 抗菌剤

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Publication number: JP6478378B2
Application number: JP2014160596A
Authority: JP
Inventors: 禅久保原; 大島　吉輝; 吉輝大島; 晴久菊地
Original assignee: 禅久保原
Priority date: 2014-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: JP2016037456A; WO2016021695A1

Description

本発明は、新規抗菌剤、当該抗菌剤を有効成分として含有する医薬組成物に関する。

細菌が引き起こす感染症は人類を苦しめてきた。ペニシリンの発見以来、これまでに多くの治療薬（抗生物質）が開発されているが、薬剤耐性菌に対する対応が宿命的な課題となっている。臨床現場では常に新たな抗生物質の開発が求められている。

細胞性粘菌Dictyostelium discoideum（以後、粘菌）は、森の落ち葉の下などに生息する下等真核生物で、カビによく似た子実体（胞子と柄から成る）を形成する。しかし、粘菌とカビ（真菌）類は、進化的にかけ離れた生物群である。本発明者らは、粘菌に着目し、実際に、いくつかの薬剤候補物質を報告してきた。
一方、粘菌の生活史は非常に単純で扱いが簡単なことから、粘菌は「発生生物学・細胞生物学のモデル生物」として、各種細胞機能の研究が進められている。胞子から発芽した粘菌細胞は、単細胞アメーバとして周囲のバクテリアをエサとして増殖する。エサが無くなると、それがシグナルとなって、細胞は集合し多細胞体（10万個ほどの細胞から成る）を形成し、最終的に子実体を形成する。粘菌の発生、分化を制御している生理活性因子としていくつかの低分子化合物が知られている。

Differentiation-inducing factor-1 (DIF-1)は、粘菌の柄細胞分化誘導因子として単離、同定された低分子化合物である（非特許文献１、２）。同時に単離されたDIF-3は分化誘導活性が低く、DIF-1の分解産物であることがわかっている（非特許文献３、４、５）。

前述のように、DIF-1とDIF-3はもともと粘菌自身の柄細胞分化を誘導する粘菌の分化誘導因子、そしてその分解産物として単離された化合物であるが、本発明者らはDIF-1、DIF-3（以下、これらを総称してDIF化合物ということがある）およびそれらの誘導体（以下、DIF誘導体ということがある）が哺乳類細胞において、腫瘍細胞増殖阻害活性、糖代謝促進活性、インターロイキン-２産生制御活性を有すること、さらに、トリパノソーマ原虫に対する増殖阻害活性を有すること等を発見した（特許文献１〜５）。
一方、細菌に対する抗菌活性は、DIF-1についてのみ検討されていたが、S. aureus (209P株)に対するMIC値が100 μMと高く、「DIF-1は有効な抗菌活性を有し無い」とされてきた（非特許文献６）。したがって、DIF誘導体の抗菌活性については詳細な検討が為されていなかった。

特開２００６−３４０６１５号公報特開２００６−２９０８１０号公報ＷＯ／２０１０／１２８６６３特開２０１０−１８０１６０号公報特開２０１２−２５６７１号公報

Morris et al. (1987) Nature 328: 811-814. Morris et al. (1988) Biochem. J. 249: 903-906. Masento et al. (1988) Biochem. J. 256: 23-28. Wurster & Kay (1990) Dev. Biol. 140: 189-195. Kay et al. (1999) Semin. Cell Dev. Biol. 10: 577-585. Kuno et al. (2002) Kitakanto Med. J. 52: 253-256.

本発明は、新規な抗菌剤を提供することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。すなわち、いくつかの細菌株（多剤耐性菌MRSAを含む）の増殖に対するDIF化合物及び各種DIF誘導体の作用を検討し、DIF化合物及びDIF誘導体がin vitroで細菌の増殖を強く阻害することを見出したことにより、上記の課題に合致した抗菌剤が達成されることを知見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］下記一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される化合物またはその塩からなる抗菌剤。

式（Ｉ）中、Ｒ¹は水素、炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は水素または炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹は水素またはハロゲンを示す。
式（ＩＩ）中、Ｒ¹は水素、炭素数２〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は水素または炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹、Ｘ²は独立して水素またはハロゲンを示す。
［２］Ｒ²が炭素数３〜１０のアルキル基である、［１］に記載の抗菌剤。
［３］化合物が式（Ｉ）で表される化合物であり、Ｘ¹が塩素である、［１］または［２］に記載の抗菌剤。
［４］化合物が下記いずれかの化合物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗菌剤。

［５］グラム陽性細菌に対するものである、［１］〜［４］のいずれかに記載の抗菌剤。
［６］スタフィロコッカス属またはバチルス属に属する細菌に対するものである、［１］〜［５］のいずれかに記載の抗菌剤。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の抗菌剤を含有する、抗菌医薬組成物。

式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物は、スタフィロコッカス属、バチルス属等に属する細菌に対する抗菌剤として、好適に用いることができる。

S. aureus（野生型）に対するDIF 化合物及び各種DIF 誘導体並びに市販抗菌剤の効果を示す図（写真）である。 S. aureus（MRSA）に対するDIF 化合物及び各種DIF 誘導体並びに市販抗菌剤の効果を示す図（写真）である。

以下、本発明の実施の形態について、説明する。
（１）抗菌剤
本発明は、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物（以下、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物ということがある）またはその塩からなる抗菌剤に関する。

式（Ｉ）中、Ｒ¹は水素、炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は水素、炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹は水素またはハロゲンを示す。
ここで、Ｒ¹は水素、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基またはフェニル基を示し、好ましくは炭素数１〜６のアルキルまたはフェニルを示し、より好ましくは炭素数２〜６のアルキルまたはフェニルを示し、さらに好ましくは炭素数４〜５のアルキル基またはフェニル基を示す。
Ｒ²は水素、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、好ましくは炭素数５〜１０のアルキル基を示し、より好ましくは炭素数６〜８のアルキル基を示す。
Ｘ¹は水素またはハロゲンを示す。ハロゲンとしては塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などであり、好ましくはＣｌである。

式（ＩＩ）中、Ｒ¹は水素、炭素数２〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は水素、炭素数１〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹、Ｘ²は独立して水素またはハロゲンを示す。
ここで、Ｒ¹は水素、炭素数２〜１０の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基またはフェニル基を示し、好ましくは炭素数２〜６のアルキルまたはフェニルを示し、より好ましくは炭素数４〜５のアルキル基またはフェニル基を示す。
Ｒ²は水素、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、好ましくは炭素数５〜１０のアルキル基を示し、より好ましくは炭素数６〜８のアルキル基を示す。
Ｘ¹、Ｘ²は独立して水素またはハロゲンを示す。ハロゲンとしては塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などであり、好ましくはＣｌである。

式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物としては、下記の化合物が好ましい。

式（Ｉ）の化合物としては、下記の化合物がより好ましい。

上記式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、例えばBiochem. Pharmacol. 2005, 70, 676-685.に記載された方法によって合成することができる。

式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物またはその塩は、スタフィロコッカス属、バチルス属等に属するグラム陽性細菌等の細菌の増殖を阻害する効果を有する。したがって、抗菌剤、抗生剤、抗生物質、抗菌医薬組成物の有効成分、実験用試薬、日用品等として用いることができる。なお、本発明において、抗菌医薬組成物とは、細菌による症状を根治する医薬のみならず、症状を改善する医薬や症状が出るのを防ぐ医薬も含む。

式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。なお、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は水和物であってもよい。

本発明において「抗菌剤」とは、細菌数を減少させる薬剤、細菌数の増加（増殖）を抑制する薬剤、細菌を不活性化させる薬剤等が含まれる。本発明において「細菌を不活性化させる」とは、細菌が再生する能力を減少、抑制させることを含み、不活性化させる手段としては例えば殺すことが挙げられる。
本発明の抗菌剤は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその塩以外の抗菌剤と組み合わせて、用いることもできる。

（２）医薬組成物
本発明は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその塩からなる抗菌剤抗菌剤を含有する、抗菌医薬組成物に関する。

本発明の「抗菌剤」は抗菌医薬組成物として使用することができる。抗菌医薬組成物は、スタフィロコッカス属、バチルス属、クロストリジウム属、プロピオン酸菌属、ミクロコッカス属、ストレプトコッカス属、ペプトコッカス属、ラクトバチルス属、アクチノマイセイス属、ストレプトミセス属等に属するグラム陽性細菌等の細菌による感染症に使用することができる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、好ましくは、Staphylococcus aureusが挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、好ましくは、Bacillus subtilisが挙げられる。

本発明の抗菌医薬組成物を投与する対象は、細菌に感染した動物あるいは細菌による感染症を発症している動物である。そのような動物には、例えば、ヒトだけでなく、家畜、家禽、実験動物、ペット（愛玩動物）等の非ヒト動物も含まれる。例えば本発明の非ヒト動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ等の家禽、マウス、ラット、モルモット、イヌ、サル、魚類等の実験動物、イヌ、ネコ、トリ等のペットを挙げることができる。投与対象は、上述のように細菌に感染した、あるいは細菌による感染症を発症した動物以外にも、細菌に感染する可能性のある動物に対して予防的に投与することもできる。

式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有してなる医薬組成物は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、該化合物またはその薬学的に許容される塩を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤、（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。

薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤
及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
なお、本発明の抗菌医薬組成物はその他の薬剤と併用してもよい。

式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその塩の抗菌医薬組成物中の含有量は、製剤全体の約０.０１〜約１００重量％である。
式（Ｉ）の化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより異なり特に制限されないが、一般的に、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.１〜５ｇ、好ましくは約０．１〜１ｇ、より好ましくは約０．１〜０．５ｇである。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。

＜製造例１＞
下記表１に記載のDIF 化合物及びDIF 誘導体を、Biochem. Pharmacol. 2005, 70, 676-685.に記載された方法によって合成した。

＜実施例１＞S. aureusに対する効果の検討
黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（209P 株）およびS. aureus（MRSA：多剤耐性株又はMS29202株：群馬大学大学院医学系研究科附属薬剤耐性菌実験施設）を用いて、DIF
化合物及び各種DIF 誘導体並びに市販抗菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、インペネム、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、クリンダマイシン）の抗菌作用をdisc法にて検討した。寒天培地に前培養したS. aureus（209P）又はS. aureus（MRSA）を塗布した
後、溶媒（各2μL）又は薬剤（DIF 化合物及びDIF 誘導体: 10 mM溶液を各2μL /disc、ペニシリン／ストレプトマイシン: 1U・1 μg/disc、インペネム: 10 μg/disc、ゲンタマイシン: 10 μg/disc、レボフロキサシン: 5 μg/disc、クリンダマイシン: 2 μg/disc）を浸み込ませたろ紙discを置き、37℃で20時間培養を行った。

結果を図１及び図２に示す。
ペニシリン／ストレプトマイシンは、野生株には有効であったが、耐性株にはほぼ無効であった。クリンダマイシン、インペネム、ゲンタマイシン、レボフロキサシンも耐性株に無効であった。一方、DIF-1は野生株、耐性株ともに有効であった。DIF 誘導体も耐性株に有効であった。このメチシリン耐性株は、多くの抗菌剤（クリンダマイシン、インペネム、ゲンタマイシン、レボフロキサシン）に対しても耐性を示しているが、DIF 化合物及び各種DIF 誘導体がこの耐性株に有効であったことから、新規抗菌剤として有用と考えられる。

＜実施例２＞MIC (minimal inhibitory concentration：最小発育阻止濃度)の検討
黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（209P 株）およびS. aureus（MRSA：多剤耐性株又はMS29202株：群馬大学）、枯草菌Bacillus subtilis（ATCC6633 株）（以上は、グラム陽性菌）、大腸菌Escherichia coli（NIHJ 株）（グラム陰性菌）について、DIF 化合物及び各種DIF 誘導体の抗菌活性（MIC 値）を以下のごとく検討・測定した。
それぞれの細菌をミュラーヒントンS 培地に懸濁し（10⁷ cells/ml：細菌濃度は低いため培地は淡黄色でほぼ透明）、この懸濁液100 μl を96-well plate（丸底）に分注した。各well に製造例１で合成したDIF 化合物及びDIF 誘導体を添加後（DIF の最終濃度は、0.2 μM〜100 μM）、plate を37℃で20 時間程培養した。Well中の細菌の増殖（well 底に目視可能な濁り/コロニーが出現するかどうか）をチェックし、細菌の増殖が完全に阻害されている最小DIF 濃度（MIC）を測定した。

DIF 化合物及び各種DIF 誘導体の抗菌活性：MIC 値（μM）を下記表１に示す。

試験したDIF 化合物及び各種DIF 誘導体は、Staphylococcus aureusおよび／またはBacillus subtilisに対し、抗菌活性を有することが分かる。参考までに、たとえば、日本の臨床分離腸球菌におけるバンコマイシンのMIC値は通常 1μg/ml（約0.7μM）以下である（国立感染症研究所感染情報センター：http://idsc.nih.go.jp/disease/vre/vre02.html）。また、バンコマイシンのMICが4〜8μg/ml を低度耐性菌、MICが16μg/ml以上を耐性菌と認定している。
抗生物質に対する耐性菌の出現は宿命的な出来事であり、新たな抗生物質の開発の意義は大きい。一部のDIF 誘導体は、実際にS. aureus（MRSA）に対する優れた抗菌活性を有
しており、新規抗菌剤として臨床応用が期待される。

本発明は医療等の分野で有用である。

Claims

下記一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される化合物またはその塩からなる抗菌剤。
式（Ｉ）中、Ｒ¹は水素、炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は炭素数３〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹は水素またはハロゲンを示す。
式（ＩＩ）中、Ｒ¹は水素、炭素数２〜１０のアルキル基またはフェニル基を示し、Ｒ²は炭素数３〜１０のアルキル基を示し、Ｘ¹、Ｘ²は独立して水素またはハロゲンを示す。
化合物が式（Ｉ）で表される化合物であり、Ｘ¹が塩素である、請求項１に記載の抗菌
剤。
化合物が下記いずれかの化合物である、請求項２に記載の抗菌剤。
グラム陽性細菌に対するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗菌剤。
スタフィロコッカス属またはバチルス属に属する細菌に対するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌剤。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌剤を含有する、抗菌医薬組成物。