JP6446624B2 - 脳卒中の治療法におけるｐｋｃ活性化因子および抗凝血剤 - Google Patents

Description

本出願は、米国特許仮出願第６１／３６２，４６４号（２０１０年７月８日出願）、同第６１／４１２，７５３号（２０１０年１１月１１日出願）、および同第６１／４１２，７４７号（２０１０年１１月１１日出願）の優先権を主張するものであり、その開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、全般には、抗凝血剤（たとえば組換え型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒＴＰＡ））およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子の投与に続いて少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を治療継続期間にわたり投与して、虚血性脳卒中発症後の対象（subject following ischemic stroke）を治療することに関する。本明細書において開示する方法は、ｒＴＰＡ投与単独の場合と比較して、虚血性脳卒中に起因する梗塞のサイズを限定し、ならびに／または、死亡率、血液脳関門の破損、および／もしくは出血性損傷を低下させると考えられる。本明細書において開示する方法は、さらに、脳卒中発症後にｒＴＰＡを投与してその有効性を保ち続けることができる治療可能域（therapeutic window）を拡大すると考えられる。ｒＴＰＡおよびＰＫＣ活性化因子を含む組成物およびキットも開示する。

脳卒中
脳卒中（脳血管発作（ＣＶＡ）としても公知である）は、医学的緊急事態であり、迅速に診断および治療が行われなければ、永続的な神経損傷、または死亡すら引き起こす恐れがある。脳卒中は、合衆国および欧州先進工業国において、死亡原因の第３位、成人における身体的障害の原因の第１位である。平均すると、脳卒中は４５秒毎に発生し、３分毎に誰かが死亡している。脳卒中による死亡５件のうち、２件は男性、３件は女性において発生している。

脳卒中は、脳の一部への血液供給が中断され、その結果ニューロンの機能が突然喪失する、急性の神経障害である。脳への血液供給は、いくつかの様式で中断されると考えられ、灌流障害は、通常は動脈で生じるが、静脈で生じる場合もある。

異なるタイプの脳卒中としては、虚血性脳卒中および出血性脳卒中が挙げられる。虚血性脳卒中または脳虚血は、たとえば塞栓（embolis）が原因（塞栓性脳卒中）または血栓が原因（血栓溶解性（thrombolyic）脳卒中）で脳血流および酸素供給が一時的または永続的に制限されることにより生じる。これに対し、出血性脳卒中は、血管破裂（たとえば動脈瘤破裂）が脳内での大量出血を引き起こすことにより生じる。

脳卒中においては、灌流が妨げられた脳部分は、もはや十分な酸素を受容しない（低酸素症）。これにより、脳細胞が死ぬかまたは著しく損傷される原因となる虚血カスケードが開始され、局所的な脳機能が損なわれる。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または「小規模脳卒中（mini-stroke）」は、普通、２４時間以上継続することはないが、脳卒中と同じ症状、たとえば、顔、腕、もしくは脚の突発性の無感覚もしくは脱力感；突発性の混乱、発語もしくは理解困難；単眼もしくは両眼における突発性の視覚困難；および／または、突発性の歩行困難、眩暈、平衡もしくは協調の喪失を伴う。典型的には、ＴＩＡは、急性梗塞による永続的な脳障害（すなわち組織死）という結果をもたらすことはないが、続発性脳卒中の重大なリスクの徴候である場合もある。梗塞性（infarctive）脳卒中は、介入されなければ２４時間を超えて継続する恐れのあるより深刻な血管遮断を典型的に伴う。脳梗塞の重症度は多様であるが、症例の約３分の１が死に至る。

虚血は、脳の特定の領域に限局される場合もあり（局所虚血）、または、脳組織の大きな領域を冒す場合もある（全虚血）。即時型の虚血事象後には、重大な脳障害が発生する可能性がある。脳虚血後のニューロン死および障害は、壊死および遅延型アポトーシスに関連する病理学的な変化を伴う。局所的な重度の脳卒中の梗塞コアにおけるニューロンは即時に死んでおり、薬理学的介入では救うことができない。虚血性ペナンブラ（ischemic penumbra）は、局所性の虚血性脳卒中におけるコア周囲の脳組織から成るが、全脳虚血においては、敏感なニューロン／ネットワークは、減少した血液供給により維持される。このペナンブラにある脳組織への損傷は、「遅延した」形で発生し、虚血性脳卒中の後、４〜６時間に第２期として、または、数日後および数週間後に、いわゆる第３期として、始まる。

ヒトおよび他の哺乳動物における脳虚血／低酸素症の共通した帰結は中枢神経系機能不全であり、その性質は、障害の位置および程度によって決まる。全脳虚血／低酸素症は背側海馬ＣＡ１領域における錐体ニューロンを選択的に障害または損傷するが、このニューロンは、エピソード記憶に不可欠であり、虚血性の損傷および回復を機能的にモニターするための高感度の尺度となる。約１５分の脳虚血後には、たとえば海馬ＣＡ１錐体細胞は、２〜３日以内に変性し始め、虚血事象の１週間後、細胞死の規模は最大となる。全脳虚血および虚血性ペナンブラにおける敏感なニューロン構造は、「危険な状態にある」組織である。後続の数日または数週間で、このニューロンが介入を通して救済されるかまたはさらに損傷されるかにより、長期的な身体的障害における劇的な差が決定される。

虚血性脳卒中の発症後、血液脳関門（ＢＢＢ）の機能が一過性に喪失するが、この喪失は、血流の中断に伴い虚血事象の数分または数時間以内に生じ、酸素の欠乏は、ＢＢＢ透過性の増加につながる。ＤｉＮａｐｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ、（２００８）、第２９巻、７５３〜７６４ページ。ＢＢＢが破損すると、続いて、イオンのホメオスタシスが喪失し、神経伝達物質のホメオスタシスが喪失する結果となる。その期間中に免疫細胞および毒性化合物が脳に入り、さらに神経毒性障害がもたらされる恐れがある。浮腫は、虚血の初期段階中に、血液から脳へのナトリウム輸送の速度に関連する速度で形成される恐れがある、すなわち、ＢＢＢを越えるナトリウム輸送量の増加が脳浮腫形成を助長する。ＢｅｔｚおよびＣｏｅｓｔｅｒ、Ｓｔｒｏｋｅ、（１９９０）、第２１巻、１１９９〜１２０４ページ。したがって、脳における浮腫とイオン取込みの両方の測定値が、脳卒中発症後の脳病理の指標である。関門の完全性が喪失している場合、血栓溶解療法、たとえば組換え型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒＴＰＡ）の投与の帰結として、有害な出血が引き起こされる恐れがある。Ｔａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、（２００８）、第４巻、６４４〜６４５ページ。

脳卒中により医学的緊急事態が生じており、関与する病理過程の抑止に有効と考えられる薬剤を提案する前臨床試験があるにもかかわらず、脳卒中の治療に対する選択肢は、未だに限定されている。利用可能な主要な治療は、ｒＴＰＡ、すなわち、血栓溶解剤であり虚血性脳卒中の急性／緊急治療用として米国食品医薬品局により現在認可されている唯一の薬物である。ｒＴＰＡタンパク質は、フィブリンにより増強される変換（fibrin-enhanced conversion）を介した、プラスミノーゲンからプラスミンへの局所的な線維素溶解を開始する酵素（セリンプロテアーゼ）である。ｒＴＰＡは、神経学的な回復を改善し身体的障害の発生を抑えるために使用される。脳卒中の実験モデルでは、たとえば、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を介して局所的な塞栓性虚血を誘導した後、再灌流時にｒＴＰＡを使用する。ＤｉＮａｐｏｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２００６）、第１５４巻、２３３〜２３８ページ。

ｒＴＰＡおよび他の潜在的薬剤が梗塞発症の抑止に有効であるか否かは、早期に、または可能であれば虚血事象の前であっても投与されるか否かにかかっている。ｒＴＰＡでの治療は、早期の動脈再開通を達成するように設計されることから、ｒＴＰＡは、有効とするためには、虚血事象後３時間以内に投与しなければならない。この時間依存性がｒＴＰＡの臨床有用性を限定しており、狭い治療可能時間域、および、虚血性脳卒中の治療における除外基準により、候補患者の約５％しか、有効な経静脈的血栓溶解療法を受けられない状況となっている。たとえば、ある試験では、急性虚血性脳卒中後３０日時点での死亡率は１３％、死亡の３分の２超が最初の脳卒中に関連があったと報告された。Ｎｅｄｅｌｔｃｈｅｖａら、Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ．Ｗｋｌｙ、（２０１０）、第１４０巻、２５４〜２５９ページ。ｒＴＰＡの推奨用量は、０．９ｍｇ／ｋｇ（最大用量９０ｍｇ）であり、このとき、１０％は急速な（約１分）ＩＶ注射により、残りは６０分かけた一定注入により投与する。アスピリン、ヘパリン、またはワルファリンは、ｒＴＰＡに続く２４時間は、一切投与すべきではない。ｒＴＰＡは、アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））およびストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ（登録商標））の名称で販売されている。

脳卒中発症後のｒＴＰＡの使用については議論が分かれるが、その理由は、ｒＴＰＡは、頭蓋内出血、再灌流障害、および脳動脈反応性低下のリスクの増加をもたらすからである。したがって、ｒＴＰＡは、出血性脳卒中を治療するために投与すべきではない。残念ながら、患者が虚血性または出血性脳卒中のいずれに罹患したかが即時に明らかでない場合もあり、そのことが、ｒＴＰＡの限定された治療可能時間域内でのその有用性をさらに限定している。加えて、出血性変化が自然に虚血性脳卒中に続発する恐れがある。たとえば、ある試験では、大規模な脳卒中に罹患した患者の６．４％が、ｒＴＰＡの投与を受けたことによる合併症として相当な脳出血を発症したことがわかった。Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ｒｔ−ＰＡ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、（１９９５）、第３３３巻、１５８１〜１５８７ページ。

ｒＴＰＡは、以下の患者集団においては禁忌とされ、または、投与しないよう勧告されている：
・治療前のＣＴスキャン時に頭蓋内出血が認められる
・正常なＣＴスキャンであっても、くも膜下出血を示唆する臨床的所見がある
・内出血が発生中である
・公知の出血性素因。たとえば以下が挙げられるが、これらに限定されない：血小板数が１００，０００／ｍｍ未満である；４８時間以内にヘパリン投与を受け、臨床検査の正常上限値を超える活性化部分トロンボプラスチン（ａＰＴＴ）が上昇している；および、経口抗凝血剤（たとえばワルファリンナトリウム）を現在使用中または最近使用したことがあり、プロトロンビン時間が１５秒超に上昇している
・３カ月以内に何らかの頭蓋内手術、重大な頭部外傷を受けた、または過去に脳卒中を発症した
・２１日以内に胃腸管または尿路の出血歴がある
・最近、圧迫不能部位（noncompressible site）での動脈穿刺を受けた
・最近、腰椎穿刺を受けた
・反復測定した際、治療を開始しようとする時点での収縮期血圧が１８５ｍｍＨｇ超または拡張期血圧が１１０ｍｍＨｇ超であり、患者には、この制限値以内に血圧を下げるための積極的治療が必要である。

・頭蓋内出血歴がある
・血糖値異常がある（５０ｍｇ／ｄＬ未満または４００ｍｇ／ｄＬ超）
・心筋梗塞後心膜炎に罹患している
・脳卒中症状の発症が観察されたと同時に、てんかん性の発作を有することが観察された患者
・公知の動静脈奇形、または動脈瘤に罹患している
たとえば、ＴＰＡ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、Ｔｈｅ Ｂｒｉａｎ Ａｔｔａｃｋ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ（入手可能先は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒｏｋｅ−ｓｉｔｅ．ｏｒｇ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｔｐａ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍｌ）を参照のこと。

試験により、ヘマトクリットと再灌流減少と梗塞サイズ増加との間、および、ヘモグロビンレベル上昇と全死因死亡率の上昇との間の関連が示唆されている。Ｔａｎｎｅら、ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、（２０１０）、第１０巻、２２、１〜７ページ。糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルの上昇は、糖尿病患者における心臓発作および脳卒中のリスクを増加させる。糖化ヘモグロビンは、正常範囲にあるとみなされるレベルであっても、非糖尿病の成人における虚血性脳卒中の独立予測因子である可能性もある。Ｓｅｌｖｉｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、（２０１０）、第３６２巻、８００〜８１１ページ。ヘモグロビン上昇は、慢性腎疾患患者における脳卒中のリスクも増加させると考えられる。

低ヘモグロビンレベル（たとえば、レベルが６．０％または８．８ｇ／ｄＬ超、貧血）も、特に心臓外科手術を受けた後の虚血性脳卒中のリスク因子として同定されている。加えて、貧血は、急性虚血性脳卒中に続発する脳虚血を悪化させる恐れがあり、貧血ではない脳卒中患者（ヘモグロビンが男性で１３ｇ／ｄＬ未満、女性で１２ｇ／ｄＬ未満）と比較して、１年後の予後不良および死亡率増加と関連がある。Ｔａｎｎｅら、ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、（２０１０）、１０、２２。試験により、鎌状赤血球性貧血を有する小児の脳卒中リスクが増加していることも報告されている。

タンパク質キナーゼＣ
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）は、非受容体型のセリン−トレオニンタンパク質キナーゼのうち最大の遺伝子ファミリーの１つである。８０年代前半にＰＫＣが発見され、ホルボールエステルの主要受容体として同定されて以来、多数の生理学的なシグナル伝達機序はこの酵素によるものとされてきた。Ｋｉｋｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９８２）、第２５７巻、１３３４１〜１３３４８ページ；Ａｓｈｅｎｄｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（１９８３）、第４３巻、４３３３〜４３３７ページ。ＰＫＣに対する関心は、カルシウムおよびジアシルグリセロール（およびホルボールエステル模倣体）、すなわち、その形成が、成長および分化因子の作用によるリン脂質のターンオーバーと関連しているエフェクターによりｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化され得るという独特の能力から生まれた。ＰＫＣの活性化は、異なる結合部位での１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／または１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ホスファチジル−Ｌ−セリン、ＰＳ）の結合を伴う。ＰＫＣの直接的な活性化に代わるアプローチは、間接的なＰＫＣ活性化を通じたもの、たとえば、ホスホリパーゼ（たとえばホスホリパーゼＣγ）を活性化することにより、またはホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を用いてＳｅｒ／ＴｈｒキナーゼＡｋｔを刺激することにより、または内在性活性化因子であるＤＡＧのレベルを向上させることによるものである。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、（２００９）、第３４巻、１３６〜１４５ページ。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤は、たとえば、内因性リガンドであるジアシルグリセロールのレベルを高め、それによりＰＫＣの活性化をもたらすと考えられる。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、（２００２）、第１３巻、７２５〜７３３ページ。ホルボールエステルは、最終的な薬物開発に適した化合物ではないが、その理由は、腫瘍促進活性を有することである。Ｉｂａｒｒｅｔａら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、（１９９９）、第１０巻、１０３５〜１０４０ページ）。

ＰＫＣ遺伝子ファミリーは１１個の遺伝子から成り、これらの遺伝子は４つのサブグループに分けられる：（１）古典的ＰＫＣα、β１、β２（β１およびβ２は、同じ遺伝子の選択的スプライシングされた形態である）およびγ、（２）新規のＰＫＣδ、ε、η、およびθ、（３）非定型のＰＫＣζおよびι／λ、ならびに（４）ＰＫＣμ。ＰＫＣμは、新規のＰＫＣアイソフォームに似ているが、推定膜貫通ドメインを有する点で異なる。Ｂｌｏｂｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、（１９９４）、第１３巻、４１１〜４３１ページ；Ｈｕｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、（１９９３）、第２９１巻、３２９〜３４３ページ；Ｋｉｋｋａｗａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９８９）、第５８巻、３１〜４４ページ。古典的ＰＫＣアイソフォームα、β１、β２、およびγは、Ｃａ^２＋、リン脂質、およびジアシルグリセロール依存性であり、他のアイソフォームは、リン脂質、ジアシルグリセロールにより活性化されるがＣａ^２＋依存性ではなく、活性化因子を必要としないと考えられる。すべてのアイソフォームは、５つの可変（ＶＩ〜Ｖ５）領域を包含し、α、β、およびγアイソフォームは、高度に保存されている４つの（Ｃ１〜Ｃ４）構造ドメインを含有する。すべてのアイソフォーム（ＰＫＣα、β、およびγを除く）はＣ２ドメインを欠いており、ι／λ、およびηアイソフォームは、ジアシルグリセロールが結合するＣ１においても、システインに富む２つの亜鉛フィンガードメインのうち９つを欠いている。Ｃ１ドメインは、すべてのアイソフォーム間で高度に保存されている偽基質配列も含有しており、この偽基質配列は、基質結合部位を遮断して不活性な立体配座の酵素を作り出すことにより自己調節機能を果たしている。Ｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８７）、第２３８巻、１７２６〜１７２８ページ。

こうした構造的特徴があることから、多種多様なＰＫＣアイソフォームは、生理的刺激に応答したシグナル伝達において、ならびに新生物の形質転換および分化において、高度に特殊化された役割を有すると考えられている。Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｃａｎｃｅｒ、（１９８９）、第１０巻、１８９２〜１９０３ページ；Ｇｌａｚｅｒ、１７１〜１９８ページ、収録先：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ、Ｉ．Ｆ．Ｋｕｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９９４。ＰＫＣ調節因子の考察については、たとえば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１４１号（ＷＯ９７／４３２６８）、ならびに米国特許第５，６５２，２３２号、同第６，０８０，７８４号、同第５，８９１，９０６号、同第５，９６２，４９８号、同第５，９５５，５０１号、同第５，８９１，８７０号、および同第５，９６２，５０４号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

ＰＫＣ活性化因子としての脂肪酸
いくつかの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、たとえばアラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）は、公知の天然のＰＫＣ活性化因子である。たとえば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（ａｌｌ−ｃｉｓ−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸）はＰＫＣ活性化因子であり、脳を詰まらせるプラークに関連するＡβおよびタウタンパク質、ならびにアルツハイマー病に関与する神経原線維変化（tangle）の蓄積を低速化させることが示されている。Ｓａｈｌｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、（２００７）、第２６巻、８８２〜８８９ページ。いくつかのＰＵＦＡ誘導体もＰＫＣ活性を有することが報告されている。Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、（２００７）、第４７巻、１１４６〜１１５６ページ。

ＰＵＦＡのＰＫＣ活性化因子としての使用に伴う問題としては、効果を達成するためには高濃度が必要であること、ＰＫＣアイソフォームの非特異的な活性化、および、修飾されていないＰＵＦＡは急速に代謝されて脂肪組織および他の臓器中に隔離され、そこでトリグリセリドおよびカイロミクロン中に組み込まれることが挙げられる。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ、（１９８８）、第１１巻、２５１〜２６１ページ。ＰＵＦＡは、有害な副作用の原因になる場合もある。たとえば、アラキドン酸は、強力な炎症促進効果を有するプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンの生化学的な前駆体である。アラキドン酸は、いくつかの疾患、たとえば、その病理学が炎症に関与している可能性が高いアルツハイマー病の治療には望ましくない場合がある。他の必須脂肪酸は、さらに、生物学的な効果、たとえば一酸化窒素シグナル伝達の増強、抗炎症効果、およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害（これにより、コレステロール生合成を妨げることができよう）をもたらす場合もある。

ＰＫＣを活性化すると、学習および記憶力が改善されることが示されている。たとえば、Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（２００７）、第１０４巻、１９５７１〜１９５７８ページ；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００７１０１号（ＷＯ２００３／０７５８５０）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０８２０号（ＷＯ２００４／００４６４１）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８５２２号（ＷＯ２００６／０３１３３７）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９１１０号（ＷＯ２００７／０１６２０２）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２４５４号（ＷＯ２００８／０１３５７３）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１７５５号（ＷＯ２００８／１００４４９）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６１５８号（ＷＯ２００８／１４３８８０）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１９２７号（ＷＯ２０１０／０１４５８５）；および同ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３１５号；ならびに米国出願第１２／０６８，７３２号；同第１０／１６７，４９１号（現在は米国特許第６，８２５，２２９号）；同第１２／８５１，２２２号；同第１１／８０２，７２３号；同第１２／０６８，７４２号；および同第１２／５１０，６８１号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＰＫＣ活性化因子は、脳卒中により誘導される記憶障害および学習障害を治療するために使用されており、その手段は、２本の血管閉塞と短期間（約１４分）の全身低酸素状態とを組み合わせることにより全脳虚血を誘導した後、２４時間以上投与することによるものであった。Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（２００８）、第１０５巻、１３６２０〜１３６２５ページ；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（２００９）、第１０６巻、１４６７６〜１４６８０ページ。

本開示は、虚血事象に罹患している対象を治療する方法であって、（ａ）該虚血事象後約２４時間以内に抗凝血剤および少なくとも１種のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を該対象に投与することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に、少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を治療継続期間にわたり投与することとを含み、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の該ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なる方法に関する。

本開示は、さらに、それを必要とする対象における脳卒中を治療する方法であって、（ａ）脳卒中に罹患している対象を同定することと、（ｂ）該対象に治療有効量のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を投与することと、（ｃ）該対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中の何れに罹患したか決定することと、（ｄ）該対象が虚血性脳卒中に罹患した場合は、治療有効量の抗凝血剤を投与することと、（ｅ）少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を治療継続期間にわたり投与することとを含み、ステップ（ｂ）およびステップ（ｅ）の該ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なる方法に関する。

ｒＴＰＡ（脳卒中発症後６時間時点）、または、ブリオスタチン−１（脳卒中の２時間後に投与）とｒＴＰＡ（続いて６時間後）との組合せのいずれかで治療したラットにおける、虚血性脳卒中発症後の同側および対側皮質中のヘモグロビン量を示すグラフ。 ｒＴＰＡ（脳卒中発症後６時間時点）、または、ブリオスタチン−１（脳卒中の２時間後に投与）とｒＴＰＡ（続いて６時間後）との組合せのいずれかで治療したラットにおける、虚血性脳卒中発症後の脳浮腫の比率（％）を示すグラフ。 ｒＴＰＡ（脳卒中発症後２時間時点）、または、ｒＴＰＡ（２時間時点）とブリオスタチン−１（続いて６時間後）との組合せで治療したラットにおける、同側および対側皮質中のエバンスブルー染料の取込み結果を示すグラフ。 ｒＴＰＡ（脳卒中発症後２時間時点）、または、ｒＴＰＡ（２時間時点）とブリオスタチン−１（続いて６時間後）との組合せで治療したラットにおける、同側および対側皮質中のフッ化ナトリウムの取込み結果を示すグラフ。 本開示による多様な脂肪酸誘導体（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）の構造を示す図。 ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、ＢＲ−１０２、およびＢＲ−１０３によるＰＫＣε活性化を示すグラフ。 多様な濃度のＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５エステル）、およびＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル）によるＰＫＣε活性化を示すグラフ。 多様な濃度のシクロプロパン化およびエポキシ化脂肪酸メチルエステル：シクロプロパン化リノレニルアルコール（ＢＲ−１０４）、シクロプロパン化リノレイルアルコール（ＢＲ−１０５）、エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）、ベルノル酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）、およびシクロプロパン化ベルノル酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）によるＰＫＣε活性化を示すグラフ。 Ｈ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲラット海馬のニューロンにおける、多様な濃度のブリオスタチンによる経時的なＰＫＣ活性化を示すグラフ。 ラット海馬の一次ニューロンにおける、ブリオスタチンおよびＤＣＰ−ＬＡによる経時的なＰＫＣ活性化を示すグラフ。 ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）に曝露させたｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２Ａ）細胞における、細胞内Ａβ（図１１ａ）および分泌されたＡβ（図１１ｂ）のレベルを示すグラフ。 ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）に曝露させたｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２Ａ）細胞における、細胞内Ａβ（図１１ａ）および分泌されたＡβ（図１１ｂ）のレベルを示すグラフ。 ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．１μＭ〜１０μＭ）が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞において外因性に接触させたＡβの分解に及ぼす効果を示すグラフ。 （図１３ａ）ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）がヒトＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１Ｄを形質移入したＮ２ａ神経芽細胞腫細胞におけるＴＡＣＥ活性に、（図１３ｂ）多様な濃度のブリオスタチンがラット皮質の一次ニューロンにおけるＴＡＣＥ活性に、ならびに、（図１３ｃ）ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）がラット皮質の一次ニューロンにおけるＴＡＣＥ活性に、及ぼす効果を示すグラフ。 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μＭ）、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μＭ）、およびエタノールによるエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）の活性化を示すグラフ。 ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１〜１００μＭ）がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の細胞生存および細胞増殖に及ぼす効果を示すグラフ。 訓練試行を通じたラットの水迷路による空間学習成績（spatial water maze performance）を示すグラフ。データを平均値±ＳＥとして示す。Ｂｒｙ：ブリオスタチン−１、Ｉｓｃｈ：脳虚血、ＭＣＤＡ：４−メチルカテコール二酢酸。 プローブテスト中の標的象限率（target quadrant ratio）を示すグラフ。Ｂｒｙ：ブリオスタチン−１、Ｉｓｃｈ：虚血、ＭＣＤＡ：４−メチルカテコール二酢酸、^＊：ｐ＜０．０５、ＮＳ：ｐ＞０．０５。

本開示の特定の実施態様（aspect）を、以下に、より詳細に記載する。本出願において使用し本明細書において明確にする用語および定義は、本開示内での意味を表すことを意図している。本明細書において言及する特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる用語および／または定義と矛盾する場合は、本明細書中に記載する用語および定義が優先される。

文脈により特に規定されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形についての言及が含まれる。

用語「およそ」および「約」は、言及した数または値とほぼ同じであることを意味し、測定値の性質または精度を考慮すれば、言及した数または値には、測定された量についての許容される程度の誤差が含まれている。本明細書において使用する場合、用語「およそ」および「約」は、一般に、特定した量、頻度、または値の±２０％を包含すると理解されるべきである。本明細書中で示される数量は、特に指定しない限り近似値であり、このことは、用語「約」または「およそ」は、明示的に指定されない場合には推測できることを意味する。

用語「〜を投与する」、「投与」、または「〜を投与すること」は、本明細書において使用する場合、（１）医療関係者もしくはその権限を与えられた代行者いずれかにより、またはその指示下で、本開示による組成物を提供すること、与えること、投薬すること、および／または処方すること、ならびに（２）患者または人物自身により、本開示による組成物を取り込むこと、服用すること、または摂取することを指す。本明細書において使用する場合、組成物の「投与」は、任意の投与経路、たとえば経口、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内経路を包含する。

本明細書において使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物、すなわち、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を意味する。

語句「治療有効量」は、測定可能な治療応答を結果としてもたらす治療剤の量を指す。治療応答は、使用者（たとえば臨床家）が当該療法への有効な応答と認めるであろう任意の応答、たとえば、症状および代理臨床マーカーの改善であってもよい。したがって、治療応答は、一般に、疾患または状態、たとえば、脳卒中の１つ以上の症状の向上または阻害であろう。測定可能な治療応答には、症状または疾患が防止されもしくはその発症が遅延している、または、当該治療剤により他の形で軽減されているとの所見も含まれる。したがって、「治療有効量」は、本明細書において使用する場合、虚血性脳卒中に伴う１つ以上の症状または状態を低減するだけ十分な量を指し、このような症状または状態としては出血性変化、血液脳関門の破損、ヘモグロビンレベルの増加、および死亡率が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用する場合、「タンパク質キナーゼＣ活性化因子」または「ＰＫＣ活性化因子」は、タンパク質キナーゼＣと結合することによって、タンパク質キナーゼＣにより触媒される反応の速度を増加させる物質を意味する。

本明細書において使用する場合、「大環状ラクトン」は、マクロライド環を含む化合物、すなわち、１つ以上のデオキシ糖が結び付いていてもよい大きな大環状ラクトン環を指す。

本開示による脂肪酸は、飽和または不飽和、分枝または無分枝、天然に存在するまたは合成のものであってもよい。

用語「一不飽和脂肪酸」（ＭＵＦＡ）は、単一のＣ＝Ｃ二重結合を含み、鎖中の残りの炭素原子が単結合されている脂肪酸を指し、ＭＵＦＡは、「モノエン脂肪酸」とも呼ばれる。ＭＵＦＡの例としては、オレイン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「ｃｉｓ−ＭＵＦＡ」は、Ｃ＝Ｃ二重結合に隣接する水素原子が二重結合の同じ側にあるＭＵＦＡを指す。

用語「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）は、２つ以上のＣ＝Ｃ二重結合を含む脂肪酸を指し、ＰＵＦＡは、「ポリエン脂肪酸」とも呼ばれる。ＰＵＦＡとしては、限定するものではないが、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸、およびω−９脂肪酸が挙げられ、これらの脂肪酸において、１つ目のＣ＝Ｃ二重結合は、鎖の中でカルボン酸基から最も遠い最後の炭素（「ω炭素」として公知である）からそれぞれ３番目、６番目、および９番目の炭素に位置する。省略形Ｘ：Ｙは、Ｘ個の炭素原子とＹ個の二重結合とを含有するアシル基を指す。たとえば、リノール酸であれば、１８：２と省略されよう。ＰＵＦＡの例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：リノール酸（９，１２−オクタデカジエン酸）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ；６，９，１２−オクタデカトリエン酸）、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）（ＥＰＡ；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタン酸）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸（docosahexanoic acid）、およびステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）。ＰＵＦＡ源としては、海産魚、および、油糧種子作物に由来する植物油が挙げられる。商業的に開発された植物油中のＰＵＦＡは、たとえばリノール酸および／またはリノレン酸を含んでいてもよい。

用語「ｃｉｓ−ＰＵＦＡ」は、Ｃ＝Ｃ二重結合に隣接する炭素原子が二重結合の同じ側にあるＰＵＦＡを指す。

用語「メチレン中断型ポリエン」は、単一のメチレン（−ＣＨ_２−）基により互いに隔てられている２つ以上のｃｉｓ型Ｃ＝Ｃ二重結合を含むＰＵＦＡを指す。用語「非メチレン中断型ポリエン」および「ポリメチレン中断型脂肪酸」は、２つ以上のメチレン基により隔てられた２つ以上のｃｉｓ型Ｃ＝Ｃ二重結合を有するＰＵＦＡを指す。

共役脂肪酸、たとえば共役リノール酸（９−ｃｉｓ，１１−ｔｒａｎｓ−オクタデカジエン酸、ａｌｌ−ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエン酸の異性体）は、共役ジエン、すなわち、隣接する炭素上のＣ＝Ｃ二重結合を有する。いくつかの証拠から、共役リノール酸は抗腫瘍活性を有する場合があることが示唆される。

用語「シクロプロピル基」は、連結されて三員環（−ＣＨＣＨ_２ＣＨ−）を形成する炭素原子３個のシクロアルカン基を指す。

用語「エポキシル（epoxyl）基」は、連結されて三員環（−ＣＨＯＣＨ−）を形成する、２個の炭素原子と酸素原子とを含む複素環基を指す。

用語「ＰＵＦＡ誘導体」は、ＰＵＦＡまたはそのアルコールもしくはエステルを指し、この誘導体において、Ｃ＝Ｃ二重結合のうち少なくとも１つはシクロプロパン化またはエポキシ化されている。

用語「ＭＵＦＡ誘導体」は、ＭＵＦＡまたはそのアルコールもしくはエステルを指し、この誘導体において、Ｃ＝Ｃ二重結合はシクロプロパン化またはエポキシ化されている。

本明細書において使用する場合、「選択的な活性化」は、１つのＰＫＣアイソザイム、たとえばＰＫＣεが、任意の他のＰＫＣアイソザイムより検出しやすい規模まで活性化されることを意味する。

用語「神経変性」は、ニューロンの構造または機能が進行性に喪失することを指し、ニューロン死も含まれる。

用語「薬学的に許容される」は、生理学的に忍容性があり、対象に投与した際、典型的には不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。

本開示は、全般にはｒＴＰＡの使用について記載するが、脳卒中の治療に適した他の抗凝血剤および抗凝血療法も企図される。さらに、本開示は、特定の人工型のＴＰＡ（たとえばｒＴＰＡ）に限定されず、ＴＰＡを全般に包含することは理解される。

本開示は、全般に、脳卒中を治療する方法であって、抗凝血剤（たとえばｒＴＰＡ）およびＰＫＣ活性化因子を投与する初期治療、それに続く、ＰＫＣ活性化因子を投与する後続治療を含む方法に関する。いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子の初期投与により、脳卒中後（たとえば虚血事象後）にｒＴＰＡを投与でき有効性も保持され続ける時間が拡大されると考えられる。ＰＫＣ活性化因子の後続投与は、保護、防止、および／または再生に関する付加的利益、たとえば、抗アポトーシス、抗シナプス喪失、および／またはシナプス形成をもたらすと考えられる。本明細書において開示する方法は、たとえば、死亡率を低下させ、出血性変化を低下させ、血液脳関門（ＢＢＢ）の破損を低下させ、および／または、ヘモグロビン分析値レベルを低下させると考えられ、この場合、ヘモグロビン値上昇は、脳卒中に起因する、再灌流の減少、梗塞サイズの増大、および／または死亡のリスク因子である。さらに、本明細書において開示する方法は、脳卒中発症後の認知能力、学習、および／または記憶力を改善すると考えられ、脳卒中により誘導される脳障害および／または脳卒中により誘導される記憶障害を回復させると考えられる。

変動的時間域（sliding temporal window）
本明細書において開示する方法では、ＰＫＣ活性化因子は、初期治療用のｒＴＰＡの前、後、および／またはそれと同時に、投与してもよい。本開示のいくつかの態様では、ｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子とを同時に投与する。したがって、本開示は、対象へのＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡの投与についての「変動的時間域」を企図する。用語「変動的時間域」は、脳卒中に罹患している対象に、ＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡを、任意の順序で、互いに対して任意の時点で、および、脳卒中が発生した時期に対して任意の時点で、投与できるという概念を指す。

以下のとおり、少なくとも４つのシナリオが企図される。

シナリオ１：本開示のいくつかの態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にＰＫＣ活性化因子を、続いて、さらに期間を置いた後でｒＴＰＡを、対象に投与してもよい。ＰＫＣ活性化因子は、脳卒中発生後の任意の時点で、一般には約２４時間以内に、投与してもよい。たとえば、ＰＫＣ活性化因子は、脳卒中の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。次いで、ｒＴＰＡを、ＰＫＣ活性化因子の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。

たとえば、いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、虚血事象後２４時間以内、たとえば、虚血事象の約１時間〜約１２時間後、または約２時間〜約６時間後に投与する。次いで、ｒＴＰＡを、ＰＫＣ活性化因子の投与後２４時間以内、たとえば、ＰＫＣ活性化因子の投与の約１時間〜約１２時間後、または約２時間〜約６時間後に投与する。一態様において、ＰＫＣ活性化因子は、虚血事象後約６時間以内に投与し、ｒＴＰＡは、ＰＫＣ活性化因子の投与後約２時間以内に投与する。別の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、虚血事象の約３時間後に投与し、ｒＴＰＡは、ＰＫＣ活性化因子の約２時間後に投与する。

シナリオ２：いくつかの態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にｒＴＰＡを対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でＰＫＣ活性化因子を投与してもよい。ｒＴＰＡは、脳卒中発生後の任意の時点で、一般には約２４時間以内に、投与してもよい。たとえば、ｒＴＰＡは、脳卒中の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。次いで、ＰＫＣ活性化因子を、ｒＴＰＡの投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。

たとえば、いくつかの態様では、ｒＴＰＡは、虚血事象後２４時間以内、たとえば、虚血事象の約１時間〜約１２時間後、または約２時間〜約６時間後に投与する。次いで、ＰＫＣ活性化因子を、ｒＴＰＡの投与後の２４時間以内、たとえば、ｒＴＰＡの約１時間〜約１２時間後、または約２時間〜約６時間後に投与する。一態様において、ｒＴＰＡは、虚血事象後約６時間以内に投与し、ＰＫＣ活性化因子は、ｒＴＰＡの後、約２時間以内に投与する。別の態様では、ｒＴＰＡは、虚血事象の約３時間後に投与し、ＰＫＣ活性化因子は、ｒＴＰＡの約２時間後に投与する。

シナリオ３：本開示の他の態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にＰＫＣ活性化因子を対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でｒＴＰＡを１回以上、さらに続いて、一定の期間後にＰＫＣ活性化因子を１回以上、投与してもよい。たとえば、ＰＫＣ活性化因子は、脳卒中の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。次いで、ｒＴＰＡを、ＰＫＣ活性化因子の投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に、対象に投与してもよい。その後、別のＰＫＣ活性化因子を、ｒＴＰＡの投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間後に投与してもよい。ｒＴＰＡの前および後に投与するＰＫＣ活性化因子は、同じであっても異なっていてもよい。

同様に、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にｒＴＰＡを１回以上対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でＰＫＣ活性化因子を１回以上、さらに続いて、一定の期間後に同じまたは異なるＰＫＣ活性化因子を１回以上、投与してもよい。

シナリオ４：また他の態様では、ＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡは、脳卒中に罹患した後の対象に同時に投与してもよい。この投与は、ＰＫＣ活性化因子とｒＴＰＡとを含む組成物を直接投与すること、または、ＰＫＣ活性化因子を含む組成物とｒＴＰＡを含む別個の組成物とを、順序は問わないが（すなわち、ＰＫＣ活性化因子を含む組成物を最初に投与してもｒＴＰＡを含む組成物を最初に投与してもよい）次々に素早く連続して投与することにより行なってもよい。

いくつかの態様では、本開示は、ｒＴＰＡで虚血性脳卒中を治療するための治療可能域を拡大する方法であって、ｒＴＰＡの前、後、またはそれと同時にＰＫＣ活性化因子を投与することを含む方法を提供する。ｒＴＰＡ（たとえばＡｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））を投与するための推奨期間は、約３時間である。本開示の一態様において、たとえば、ＰＫＣ活性化因子を脳卒中の約２時間後に対象に投与し、続いて、ｒＴＰＡを約６時間後（すなわち、脳卒中の約８時間後）に投与する。別の態様では、ｒＴＰＡを脳卒中の約６時間後に対象に投与し、続いて、ＰＫＣ活性化因子を約２時間後（すなわち、脳卒中の約８時間後）に投与する。

本開示の少なくとも１つの態様は、脳卒中に罹患している対象の治療法であって、該対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中のいずれに罹患したかが判明する前の治療法を提供する。たとえば、本開示は、脳卒中に罹患している対象を同定し、治療有効量のＰＫＣ活性化因子を投与し、該対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中の何れに罹患したか決定する方法を提供する。罹患した脳卒中の型についての決定は、医療分野において公知の任意の適当な手段、たとえば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンにより、行なってもよい。対象が虚血性脳卒中に罹患した場合は、治療有効量のｒＴＰＡを投与してもよい。しかし、対象が出血性脳卒中に罹患した場合は、ｒＴＰＡは投与しない。したがって、本開示のいくつかの態様では、ｒＴＰＡで脳卒中を治療するための治療可能時間域を拡大することにより、対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中のいずれに罹患したかの決定が可能になる。

本明細書において開示する方法において、ｒＴＰＡおよびＰＫＣ活性化因子から成る初期治療（たとえば、シナリオ１〜４に記載してある）に続いて、ＰＫＣ活性化因子から成る後続治療を行う。ＰＫＣ活性化因子から成る後続治療は、たとえば、虚血事象の約１０時間〜約３２時間後、たとえば虚血事象の約２４時間後に開始してもよい。初期治療および後続治療において投与するＰＫＣ活性化因子は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、１週間当たり１〜３回投与する。いくつかの態様では、治療継続期間は約１週間〜約１０週間、たとえば約１週間〜約６週間の範囲、たとえば約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、または約６週間である。

ＰＫＣ活性化因子
本開示のいくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、ＰＫＣεを他のＰＫＣアイソザイムの少なくとも１倍、２倍または５倍（たとえば、本明細書に記載のＰＫＣ活性化アッセイによって測定する場合）、活性化してもよい。活性化されると、ＰＫＣ酵素は、ＲＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼ受容体）タンパク質により原形質膜に移動させられるが、ＲＡＣＫタンパク質は、活性化ＰＫＣの膜結合型受容体である。一般には、活性化されると、ＰＫＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質により原形質膜に移動させられる。ＰＫＣ活性化の他の徴候としては、ホスファチジルイノシトール三リン酸依存性キナーゼ（ＰＤＫ１）による特定のＣ末端セリン／トレオニン残基でのリン酸化が挙げられ、ＰＫＣファミリーの各酵素中のよく保存された配列が、少なくとも２つの追加的なリン酸化および／または自己リン酸化を起こしている。ＰＫＣの活性化は、たとえば、Ｓｕｎら、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、（２００６）、第１巻、１４７〜５６ページに記載されている。

本明細書において開示する方法、組成物およびキットに適したＰＫＣ活性化因子としては、例として、大環状ラクトン、たとえばブリオスタチンおよびネリスタチン（neristatin）クラスが挙げられ、これらは、ＰＫＣを刺激するように作用する。ブリオスタチンクラスの化合物のうち、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣを活性化しても腫瘍を促進しないことが示されている。ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ活性化因子としてとりわけ有用と考えられるが、その理由は、用量応答曲線が二相性であり、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣアイソザイム、たとえばＰＫＣα、ＰＫＣδ、およびＰＫＣεの分化調節を行うことが実証されているからである。ブリオスタチン−１については、動物およびヒトにおける毒性および安全性試験が行われており、抗癌剤として積極的に調査されている。

大環状ラクトンは、一般に、１４、１５または１６員のラクトン環を含む。マクロライドは、ポリケチドクラスの天然生成物に属する。大環状ラクトンおよびその誘導体は、たとえば、米国特許第６，１８７，５６８号、同第６，０４３，２７０号、同第５，３９３，８９７号、同第５，０７２，００４号、同第５，１９６，４４７号、同第４，８３３，２５７号、および同第４，６１１，０６６号、および第４，５６０，７７４号に記載されており、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの特許には、大環状ラクトンについての多様な化合物および多様な使用（抗炎症剤または抗腫瘍剤としての使用を含む）が記載されている。Ｓｚａｌｌａｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９９４）、第２６９巻、２１１８〜２１２４ページ；Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（１９９６）、第５６巻、８０２〜８０８ページ；Ｈｅｎｎｉｎｇｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、（１９８７）、第８巻、１３４３〜１３４６ページ；Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（２０００）、第６巻、８２５〜８２８ページ；Ｍｕｔｔｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、（２０００）、第８巻、１８４１〜１８６０ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ブリオスタチンおよびネリスタチン化合物は、初めは、海洋性のコケムシＢｕｇｕｌａ ｎｅｒｉｔｉｎａ Ｌから単離された。

一態様において、例としては、ＰＫＣ活性化因子は、大環状ラクトン、たとえばブリオスタチンまたはネリスタチンである。ブリオスタチンとしては、たとえば以下が挙げられる：ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、およびブリオスタチン−１８。少なくとも１つの態様では、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−１である。本開示に適したネリスタチンとしては、たとえばネリスタチン−１が挙げられる。

ブリオスタチンの類似体は、一般にブリオログ（bryolog）と称され、本開示における使用に適した特定の１クラスのＰＫＣ活性化因子である。表１は、いくつかのブリオログの構造的特徴をまとめたものであり、ＰＫＣ親和性にばらつきがあることが実証されている（範囲は０．２５ｎＭ〜１０μＭ）。構造的には、ブリオログはすべて類似している。ブリオスタチン−１は２つのピラン環と１つの６員環アセタールとを有するが、大半のブリオログにおいては、ブリオスタチン−１のピランのうち１つは、第２の６員アセタール環で置きかえられている。この修飾により、ブリオログの安定性はブリオスタチン−１に比して、たとえば強酸中でも塩基中でも低下するが、生理学的なｐＨではそれほどでもない。ブリオログは、ブリオスタチン−１（９８８）と比較して分子量も小さく（範囲は約６００ｇ／ｍｏｌ〜７５５ｇ／ｍｏｌ）、その特性が、血液脳関門を越える輸送を容易にする。

類似体１は、最も高いＰＫＣ親和性を呈する。Ｗｅｎｄｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、（２００４）、第１巻、１〜１１ページ；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９９８）、第９５巻、６６２４〜６６２９ページ；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、（２００２）、第１２４巻、１３６４８〜１３６４９ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。唯一、類似体１は、ブリオスタチンより高いＰＫＣ親和性を呈する。類似体２は、ブリオスタチン−１のＡ環を欠くが、高いＰＫＣ親和性を維持する最も単純な類似体である。活性のあるブリオログに加え、類似体７ｄは、２６位でアセチル化されているが、実質的にＰＫＣ親和性がない。

本開示において、Ｂ環ブリオログを使用してもよい。これらの合成ブリオログは、低ナノモル範囲で親和性を有する。Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．、（２００６）、第８巻、５２９９〜５３０２ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｂ環ブリオログは、完全に合成のものである利点を有し、天然源から精製する必要がない。

第３のクラスの適当なブリオスタチン類似体は、Ａ環ブリオログである。これらのブリオログは、ブリオスタチン−１と比較してＰＫＣ親和性がわずかに低く（ブリオログ３、４、および５についてそれぞれ、６．５ｎＭ、２．３ｎＭ、および１．９ｎＭ）、分子量が小さい。

ブリオスタチン類似体は、米国特許第６，６２４，１８９号および同第７，２５６，２８６号に記載されている。

ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のいくつかの誘導体は、ＰＫＣと結合し、これを活性化させる。Ｎｉｅｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９８３）、第８０巻、３６〜４０ページ；Ｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９８２）、第９１巻、４２７〜４３１ページ；Ｋａｉｂｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９８３）、第２５８巻、６７０１〜６７０４ページ。しかし、ＤＡＧおよびＤＡＧ誘導体は、薬物としての価値は限定されている。ジアシルグリセロールによるＰＫＣの活性化は一過性のものであるが、その理由は、ジアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールキナーゼおよびリパーゼにより速やかに代謝されるからである。Ｂｉｓｈｏｐら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９８６）、第２６１巻、６９９３〜７０００ページ；Ｃｈｕａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、（１９９３）、第２６５巻、Ｃ９２７〜Ｃ９３３ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。脂肪酸の置換により、活性化の強度が決定される。不飽和脂肪酸を有するジアシルグリセロールは、最も活性が高い。立体異性配置は重要であり、１，２−ｓｎ配置を有する脂肪酸は活性があるが、２，３−ｓｎ−ジアシルグリセロールおよび１，３−ジアシルグリセロールはＰＫＣと結合しない。ｃｉｓ−不飽和脂肪酸は、ジアシルグリセロールと相乗性を有する場合がある。少なくとも１つの態様では、用語「ＰＫＣ活性化因子」は、ＤＡＧまたはＤＡＧ誘導体を明示的に除外する。

イソプレノイドも、本開示に適したＰＫＣ活性化因子である。たとえば、ファルネシルチオトリアゾールは合成イソプレノイドであり、Ｋ_ｄ値２．５μＭでＰＫＣを活性化する。たとえば、ファルネシルチオトリアゾールは、ジオレオイルグリセロールと等効力であるが、脂肪酸の加水分解性エステルを有さない。Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９５）、第３４巻、３９１６〜３９２０ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファルネシルチオトリアゾールおよび関連化合物は、安定で難分解性のＰＫＣ活性化因子を代表する。低分子量（３０５．５ｇ／ｍｏｌ）であり荷電基が不在であることから、ファルネシルチオトリアゾールであれば、血液脳関門を容易に通過すると期待される。

オクチルインドラクタムＶは、テレオシジンと関連する非ホルボールタンパク質キナーゼＣ活性化因子である。オクチルインドラクタムＶ（具体的には（−）−エナンチオマー）の利点としては、より大きな代謝安定性、より高い効力（ＥＣ_５０＝２９ｎＭ）、および低分子量（これにより、血液脳関門を越える輸送が容易になる）が挙げられる。Ｆｕｊｉｋｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（１９８７）、第４９巻、２２３〜２６４ページ；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、（１９８２）、第１０４巻、１１５９〜４１６６ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

グニジマクリンは、ダフナン型ジテルペンであり、０．１ｎＭ〜１ｎＭの濃度で、ネズミ科動物の白血病および充実性腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示す。グニジマクリンは、Ｋ５６２細胞において濃度０．３ｎＭでＰＫＣ活性化因子として作用し、Ｃｄｃ２５Ａの抑制、および、続いて起こるサイクリン依存性キナーゼ２（Ｃｄｋ２）の阻害（５ｎｇ／ｍｌで１００％の阻害が達成される）を通して、Ｇ１／Ｓ期の細胞周期進行を調節する。グニジマクリンは、ブリオスタチンに類似した複素環の天然の生成物であるが、いくらかそれより小さい（分子量＝７７４．９ｇ／ｍｏｌ）。

イリパリダル（Iripallidal）は、イリスパリダ（Iris pallida）から単離された二環式のトリテルペノイドである。イリパリダルは、ＮＣＩ６０細胞株スクリーンにおいて抗増殖活性を示し、ＧＩ_５０（成長を５０％阻害するために必要な濃度）値はマイクロモル〜ナノモルの範囲である。イリパリダルは、高い親和性（Ｋ_ｉ＝７５．６ｎＭ）でＰＫＣαと結合する。イリパリダルは、ＲａｓＧＲＰ３依存的に、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を誘導する。その分子量は、４８６．７ｇ／ｍｏｌである。イリパリダルは、ブリオスタチンの約半分のサイズであり、荷電基を欠く。

インゲノールは、ホルボールに関連するジテルペノイドであるが、より毒性は低い。インゲノールは、白い乳液を分泌する植物であるチャボタイゲキ（Euphorbia peplus）から誘導される。たとえば、インゲノール３，２０−ジベンゾエートは、ＰＫＣとの結合について［３Ｈ］ホルボールジブチレートと競合する（Ｋ_ｉ＝２４０ｎＭ）。Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９５）、第６０巻、１３８１〜１３９０ページ、参照により本明細書に組み込まれる。インゲノール−３−アンゲレートは、局所使用すると、扁平上皮癌およびメラノーマに対して抗腫瘍活性を呈する。Ｏｇｂｏｕｒｎｅら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、（２００７）、第１８巻、３５７〜３６２ページ、参照により本明細書に組み込まれる。

ナプタレンスルホンアミド（napthalenesulfonamide）、たとえばＮ−（ｎ−ヘプチル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミド（ＳＣ−１０）およびＮ−（６−フェニルヘキシル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミドは、別クラスのＰＫＣ活性化因子に属する。ＳＣ−１０は、ホスファチジルセリンの機序と類似の機序を用いて、カルシウム依存的にＰＫＣを活性化する。Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９８６）、第２５巻、４１７９〜４１８４ページ、参照により本明細書に組み込まれる。ナフタレンスルホンアミドは、ブリオスタチンとは異なる機序により作用し、ブリオスタチン、または、別のクラスのＰＫＣ活性化因子に属する物質と相乗効果を示す場合がある。構造的には、ナフタレンスルホンアミドはカルモジュリン（ＣａＭ）拮抗剤Ｗ−７と類似しているが、ＣａＭキナーゼには効果を及ぼさないことが報告されている。

ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤も、ＰＫＣを間接的に活性化することにより、本開示におけるＰＫＣ活性化因子として適当と考えられる。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）および［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）。

さまざまな成長因子、たとえば線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）およびインスリン成長因子は、ＰＫＣ経路を通して機能する。ＦＧＦ−１８発現は学習に際して上方調節され、インスリン成長因子受容体は学習に関与している。これらのまたは他の成長因子によるＰＫＣシグナル伝達経路の活性化は、ＰＫＣ活性化の追加的な手段となる可能性がある。

成長因子（たとえばＮＧＦおよびＢＤＮＦ）の合成および／または活性化を刺激する成長因子活性化因子（４−メチルカテコール誘導体、たとえば４−メチルカテコール酢酸（ＭＣＢＡ）など）は、ＰＫＣ、ならびに、シナプス形成および／または神経突起の枝分かれに関与する収束型経路も活性化する。

本開示によるＰＫＣ活性化因子としては、脂肪酸、たとえば不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡおよび／またはＰＵＦＡなど）、ならびに、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合がシクロプロピル基に置きかえられている（すなわち「シクロプロパン化された」二重結合）またはエポキシル基に置きかえられている（すなわち「エポキシ化された」二重結合）その誘導体が挙げられる。いくつかの態様では、不飽和脂肪酸のＣ＝Ｃ二重結合はすべて、シクロプロピル基および／またはエポキシル基に置きかえられている。いくつかの態様では、脂肪酸誘導体は、シクロプロピル基とエポキシル基の両方を含んでいてもよい。

本開示のいくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、脳卒中を治療するための脂肪酸誘導体を含む。いくつかの態様では、たとえば、脂肪酸誘導体（ＰＵＦＡおよび／またはＭＵＦＡ誘導体など）は、低い（たとえばナノモルの）濃度でＰＫＣεを活性化すると考えられる。

脂肪酸誘導体の末端官能基は、例としては、遊離カルボン酸（−ＣＯ_２）、アルコール（−ＣＨＯＨ）、またはエステル（−ＣＯ_２Ｒ）、たとえばモノエステルもしくはポリエステルであってもよい。エステルのアルキル基（Ｒ）は、直鎖または分枝状のもの、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、およびテトラデシル基などであってもよい。エステルは、脂肪アルコールにエステル連結の形で連結している脂肪酸から形成してもよい。企図される他のアルキルエステルとしては、脂肪族アルコールエステルおよび芳香族アルコールエステルが挙げられる。一態様において、たとえば、アルコールエステルは、プロピレングリコールエステルである。別の態様では、アルコールエステルは、グリセロールエステルである。脂肪酸のグリセロールエステルとしては、たとえば以下が挙げられる：グリセロール脂肪酸エステル、グリセロール酢酸脂肪酸エステル、グリセロール乳酸脂肪酸エステル、グリセロールクエン酸脂肪酸エステル、グリセロールコハク酸脂肪酸エステル、グリセロールジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、グリセロール酢酸エステル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、およびポリグリセロール縮合リシノール酸エステル。グリセロール誘導体は生物学的に重要であるが、その理由は、脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸の形態でグリセロールにコンジュゲートされると考えられるからである。たとえば、トリアシルグリセロール（またはトリグリセリド）は、３つの脂肪酸のカルボキシル基が、グリセロールの３個の炭素すべてのヒドロキシル基にエステル連結している化合物である。カルボン酸をエステル化すると、負電荷が除去されることにより、血液脳関門を越える輸送が容易になるが、アルコール基も、血液脳関門を越える輸送を容易にする。

本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるＭＵＦＡとしては、限定するものではないが、次の構造：
ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｘＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ_２）ｙＣＯＯＨ
（式中、ｘおよびｙはそれぞれ、互いに独立性に、３〜１１の奇数の整数である）を有する脂肪酸が挙げられる。例としては、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−ＭＵＦＡ、たとえばオレイン酸、エライジン酸、オブツシル酸、カプロレイン酸、ラウロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびペトロセリン酸が挙げられる。ＭＵＦＡアルコールの例としては、たとえば、エライジンアルコール（elaidic alcohol）、オレイルアルコール、および１−モノリノレイルｒａｃ−グリセロールが挙げられる。シクロプロパン化およびエポキシ化ＭＵＦＡ誘導体の具体例としては、エリアジン（eliadic）アルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エリアジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、およびエポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）が挙げられる。図５を参照のこと。

本明細書において開示する方法のために企図される、天然にシクロプロパン化またはエポキシ化されたＭＵＦＡＳまたはそのエステルまたはアルコール誘導体としては、マルベン酸（malvenic acid）、ベルノル酸、およびステルクリン酸が挙げられる。例示的な化合物は、ベルノル酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）である。

本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるＰＵＦＡとしては、限定するものではないが、次の構造：
ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）ｘ（ＣＨ_２）ｙＣＯＯＨ
（式中、ｘおよびｙは、それぞれ独立に、２〜６の範囲の整数である）を有する脂肪酸が挙げられ、メチレン中断型および／またはポリメチレン中断型ポリエンを包含する。これがω−６ＰＵＦＡである。例としては、限定するものではないがリノール酸、γ−リノール酸、アラキドン酸、およびアドレン酸が挙げられ、その構造は次のとおりである：
リノール酸 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_２（ＣＨ_２）_６ＣＯＯＨ
γ−リノレン酸 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_３（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨ
アラキドン酸 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_４（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ
アドレン酸 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_４（ＣＨ_２）_４ＣＯＯＨ
リノール酸誘導体ＤＣＰ−ＬＡ（２−［（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］シクロプロパンオクタン酸）（ＢＲ−１０１）は、公知のＰＫＣの、あまり知られていないアイソフォーム特異的な活性化因子の１つである。図５を参照のこと。ＤＣＰ−ＬＡは、ＰＫＣεを選択的に活性化し、１００ｎＭで最大の効果を有する（Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、（２００６）、第４７巻、１１４６〜１１５６ページ）。ＳＣ−１０と同様、ＤＣＰ−ＬＡは、ジアシルグリセロール結合部位ではなく、ＰＫＣのホスファチジルセリン結合部位と相互作用する。

本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるＰＵＦＡのさらなる例としては、次の構造：
ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）ｘ（ＣＨ_２）ｙＣＯＯＨ
（式中、ｘおよびｙは、それぞれ独立に、２〜６の範囲の整数である）が挙げられ、メチレン中断型および／またはポリメチレン中断型ポリエンを包含する。これがω−３ＰＵＦＡである。例としては、限定するものではないがα−リノール酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびエイコサテトラエン酸が挙げられ、その構造は次のとおりである：
α−リノレン酸 ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_３（ＣＨ_２）_６ＣＯＯＨ
エイコサテトラエン酸 ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_４（ＣＨ_２）_５ＣＯＯＨ
エイコサペンタエン酸 ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_５（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ
ドコサヘキサエン酸 ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）_６（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ
ＰＵＦＡ誘導体としては、Ｃ＝Ｃ二重結合のうち少なくとも１つがシクロプロパン化またはエポキシ化されているＰＵＦＡ（カルボン酸、アルコール、またはエステル末端基）が挙げられる。ｃｉｓ−ＰＵＦＡエステルの例としては、次の構造：
ＣＨ_３（ＣＨ_２）_４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）ｘ（ＣＨ_２）ｙＣＯＯＲ
ＣＨ_３ＣＨ_２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２）ｘ（ＣＨ_２）ｙＣＯＯＲ
（式中、ｘおよびｙは、それぞれ独立に、２〜６の範囲の整数であり、Ｒはアルキル基である）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｒは、アルコール、たとえば一価または多価アルコールのアルキル基である。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。このような場合、アルコールは、分枝または無分枝のアルキル鎖を含んでいてもよく、または、芳香族アルキルを含んでいてもよい（たとえばフェノールアルコール）。ＰＵＦＡ誘導体の例としては、リノール酸アルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）、リノレン酸アルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）、およびベルノル酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）が挙げられるが、これらに限定されない。図５を参照のこと。

いくつかの態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、Ｃ＝Ｃ二重結合のうち少なくとも１つがシクロプロパン化（cyclpropanated）またはエポキシ化されているＰＵＦＡまたはそのエステルもしくはアルコールである。いくつかの態様では、たとえば、ＰＵＦＡ誘導体は、２〜６個のシクロプロパン化またはエポキシ化された二重結合を有するＰＵＦＡまたはそのエステルもしくはアルコールを含む。少なくとも１つの態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、３つのシクロプロパン化またはエポキシ化された二重結合を有するＰＵＦＡまたはそのアルコールもしくはエステルを含む。本開示のＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロピル基とエポキシル基の両方を含んでいてもよい。

いくつかの態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、エポキシ化ｃｉｓ−ＰＵＦＡアルコール、たとえばリノール酸アルコールジシクロプロパンまたはリノレン酸アルコールトリシクロプロパンを含んでいてもよい。

本開示によるシクロプロパン化および／またはエポキシ化脂肪酸の基礎を形成してもよいＰＵＦＡとしては、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＵＦＡ誘導体としては、ドカヘキサノン酸（docahexaenonic acid）メチルエステルヘキサシクロプロパン（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステルペンタシクロプロパン（ＢＲ−１１４）、およびアラキドン酸メチルエステルテトラシクロプロパン（ＢＲ−１１５）が挙げられる。図５を参照のこと。

一態様において、ＰＫＣ活性化因子は、次の構造：

（式中、Ｒは、Ｈまたはアルキル基である）を有する、ＤＨＡのシクロプロパン化ＰＵＦＡ誘導体を含む。一態様において、Ｒは、メチル（ＢＲ−１１１またはＤＨＡ−ＣＢ６メチルエステル）、またはメチル−３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエートである。

別の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、次の構造：

を有するＰＵＦＡ誘導体を含む。

この化合物は、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５またはメチル４−（２（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。

さらなる別の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、次の構造：

を有するＰＵＦＡ誘導体を含む。

この化合物は、ＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４またはメチル４−（２−（（２−（（２−（（−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。

別の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、次の構造：

を有するＰＵＦＡ誘導体（erivative）を含む。

（式中、Ｒは、Ｈまたはアルキルエステルである）。一態様において、Ｒは、メチルである。

合成方法
脂肪酸ならびにそのエステルおよびアルコールは、天然源、たとえば魚油、亜麻仁油、大豆、菜種油、もしくは藻類を精製することにより得るもしくは生成させる、または、微生物の酵素的合成と化学合成との組合せを用いて合成することができる。一例として、脂肪酸メチルエステルは、メタノールおよび均一系アルカリ触媒を使用して、精製された／食用タイプの油のトリグリセリドをエステル交換することにより生成させることができる。

炭化水素中の二重結合のシクロプロパン化の方法は、当技術分野において公知である。たとえば、改変型のシモンズ−スミス反応は、二重結合をシクロプロパンに変換するための標準的な方法である。ＴａｎａｋａおよびＮｉｓｈｉｚａｋｉ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、（２００３）、第１３巻、１０３７〜１０４０ページ；ＫａｗａｂａｔａおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、（１９６７）、第２４巻、５３〜５８ページ；ＤｅｎｍａｒｋおよびＥｄｗａｒｄｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９１）、第５６巻、６９７４〜６９８１ページ。この反応においては、アルケンを金属カルベノイド、たとえばヨウ化メチレンおよびジエチル亜鉛で処理すると、結果として、アルケンがシクロプロパン化される。ｌｔｏら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、（１９８８）、第６巻、３２７ページも参照のこと。メチルエステルのシクロプロパン化も、触媒としてのパラジウム（ＩＩ）アセテートの存在下でジアゾメタンを使用して達成された。Ｇａｎｇａｄｈａｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、（１９８８）、第６５巻、６０１〜６０６ページ。

エポキシ化の方法も当技術分野において公知であり、典型的には、有機溶媒中での脂肪酸ジオキシランの反応が含まれる。Ｓｏｎｎｅｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、（１９９５）、第７２巻、１９９〜２０４ページ。一例として、ＰＵＦＡ二重結合のエポキシ化は、ジメチルジオキシラン（ＯＭＤ）をエポキシ化剤として用いて達成できる。Ｇｒａｂｏｖｓｋｉｙら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、（２００６）、第８９巻、２２４３〜２２４５３ページ。

本開示は、脳卒中に伴う神経障害および／または疾患の治療を企図する。いかなる特定の機序にも限定されるものではないが、ＰＫＣεを選択的に活性化させると、結果として、α−セクレターゼ、たとえば腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）の活性化が促進されると共に、Ａβの産生が減少すると考えられる。しかし、このことは、非神経細胞、たとえば線維芽細胞中で主に起こるようである。ＰＫＣεを活性化させると、さらに、シナプス形成が誘導され、または、脳卒中発症後またはアルツハイマー病におけるアポトーシスが防止されると考えられる。ＰＫＣεを活性化させると、さらに、ＧＳＫ−３βの阻害を通したＡβ媒介性の神経毒性からニューロンが保護されると考えられる。

本明細書において開示する方法は、脳卒中後２４時間の死亡率を低下させると考えられる。たとえば、２４時間後の死亡率を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低下させると考えられる。少なくとも１つの態様では、ＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡを初期投与し、続いてＰＫＣ活性化因子を後続投与することにより、脳卒中後２４時間の死亡率が少なくとも４０％低下する。

いくつかの態様では、本明細書において開示する治療の方法は、脳卒中後の血液脳関門の破損を減少させると考えられ、および／または、出血性変化を減少させると考えられる。いくつかの態様では、たとえば、脳卒中後にＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡを投与し、続いてＰＫＣ活性化因子を後続投与することにより、ヘモグロビンレベルが低下すると考えられ、この場合のヘモグロビンの低下は、出血性変化の低下および／または血液脳関門の破損の低下の指標となる。いくつかの態様では、ヘモグロビン（hemoglovin）レベルは、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％低下する。少なくとも１つの態様では、たとえば、ヘモグロビンレベルは、約５０％低下する。血液脳関門の破損の低下は、アルブミンの血管外遊出を測定することにより評価してもよい。ＤｉＮａｐｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ、（２００８）、第２９巻、７５３〜７６４ページ。

さらに、本開示のいくつかの態様では、脳卒中に起因する梗塞（たとえば、虚血事象が原因で生じる組織損傷）のサイズを、限定および／または低下させると考えられる。

製剤および投与
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知の任意の適当な方法により調製してもよい。一般には、そのような調製方法には、活性成分を担体または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで、必要または所望により、製品を所望の単回または複数回投与用の単位に成形または包装することが含まれる。

本明細書において提供される医薬組成物の記載は、主として、ヒトへの医療用としての投与に適した医薬組成物に向けたものであるが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることは、当業者には理解されよう。多様な動物への投与に適した組成物にするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変することは十分理解され、通常の技能を有する獣医薬理学者は、そのような修飾を、（あったとしても）通常の実験作業のみを用いて設計および実施できる。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象としては、ヒトおよび他の霊長動物、および他の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子と抗凝血剤、たとえばｒＴＰＡとは、一緒に製剤化される。他の態様では、ＰＫＣ活性化因子とｒＴＰＡとは、別々に製剤化される。

本明細書において開示する組成物は、任意の適当な経路、たとえば経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮経路により、投与してもよい。非経口経路としては、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が挙げられる。血液脳関門を通過させるための適当な投与経路を選んでもよい。Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、（２００１）、第４２巻、６７８〜６８５ページ。

本明細書において開示する組成物は、従来の方法により製剤化してもよく、任意の薬学的に許容される添加物、たとえば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、香味料（flavorant）、着色料、緩衝剤、および崩壊剤を含んでいてもよい。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２０００を参照のこと。

いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、固体の経口用剤形で製剤化する。経口投与用には、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤を用いた従来の手段により調製された錠剤またはカプセルの形態をとっていてもよく、そのような賦形剤は、たとえば、結合剤（たとえばアルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（たとえば乳糖、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（たとえばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）である。錠剤は、当技術分野で一般に公知の方法によりコーティングされていてもよい。経口投与用の液体調製物は、たとえば、溶液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとっていてもよく、または、使用前に水または他の適当なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、薬学的に許容される添加物を用いた従来の手段により調製してもよく、そのような添加物は、たとえば、懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油）；および保存剤（たとえばメチルまたはプロピル−フィドロキシベンゾエート（phydroxybenzoate）またはソルビン酸）である。本調製物は、必要に応じ、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含んでいてもよい。

本開示の他の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、非経口投与、たとえばボーラス注射または持続注入用に製剤化してもよい。注射用製剤は、単位剤形で、たとえば、アンプル、または、保存剤が添加された複数回投与用容器の形態で、提供してもよい。本組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、分散系、またはエマルションなどの形態をとっていてもよく、製剤化剤（formulatory agent）、たとえば懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤を含有していてもよい。

いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、投与のための薬学的に許容される担体を用いて製剤化してもよい。薬学的に許容される担体としては次のうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；生理的分解性の組成物（たとえばゼラチン）；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれていてもよい他の「添加成分」は、当技術分野で一般に公知であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている場合がある。

いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、投与のための疎水性担体を用いて製剤化してもよい。疎水性担体としては、包接錯体、分散系（たとえばミセル、マイクロエマルション、およびエマルション）、ならびにリポソームが挙げられる。例示的な疎水性担体としては、包接錯体、ミセル、およびリポソームが挙げられる。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２００３を参照のこと。本明細書において開示するＰＫＣ活性化因子は、疎水性担体中に、たとえば、担体全体の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（重量比）として組み込んでもよい。加えて、たとえば製剤を安定化させるために、他の化合物を疎水性担体または溶液のいずれかに含ませてもよい。

いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、デポ調製物として製剤化してもよい。そのような長時間作用製剤は、埋込み（たとえば皮下もしくは筋肉内）により、または筋肉内注射により、投与してもよい。したがって、たとえば、ＰＫＣ活性化因子は、適当なポリマー性もしくは疎水性材料（たとえば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは、やや溶けにくい誘導体として、たとえばやや溶けにくい塩として、製剤化してもよい。

別の態様では、ＰＫＣ活性化因子は、ベシクル、たとえばミセル、リポソーム、または人工の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の形態で送達してもよい。たとえば、米国特許第７，６８２，６２７号を参照のこと。

投与する用量は、適切には、１日当たり約１ｍｇ〜約１０ｇ、たとえば約１０ｍｇ〜約１ｇ、またはたとえば約２５０ｍｇ〜約５００ｍｇのＰＫＣ活性化因子を送達するように調製してもよい。局所投与または非経口投与用に調製する際は、本製剤は、最終的な製剤の約０．０１重量％〜約６０重量％、たとえば約０．１重量％〜約３０重量％、たとえば約１重量％〜約１０重量％を含有する調合物の形態で作製してもよい。適当な用量は、当技術分野において公知の方法により、および、臨床的に意義のある因子、たとえば患者の年齢により、決定できる。

少なくとも１つの態様では、ＰＫＣ活性化因子は、静脈内投与用に製剤化する。ＰＫＣ活性化因子は、約５μｇ／ｍ^２〜約５０μｇ／ｍ^２、たとえば約１０μｇ／ｍ^２〜約３０μｇ／ｍ^２、または約２５μｇ／ｍ^２〜約５０μｇ／ｍ^２の範囲の用量で投与してもよい。いくつかの態様では、たとえば、ＰＫＣ活性化因子の初期投与は、約２５μｇ／ｍ^２〜約５０μｇ／ｍ^２の範囲である。いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子の後続投与は、約５μｇ／ｍ^２〜約３０μｇ／ｍ^２の範囲、たとえば約１０μｇ／ｍ^２、約１５μｇ／ｍ^２、または約２０μｇ／ｍ^２である。いくつかの態様では、ＰＫＣ活性化因子およびｒＴＰＡは、両方とも静脈内投与用に製剤化する。ｒＴＰＡは、約０．９ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内投与用に製剤化してもよい。ＰＫＣおよびｒＴＰＡは、静脈内投与用に一緒に製剤化してもよく、または、静脈内投与用に別々に製剤化してもよい。

キット
本開示は、さらに、本明細書において開示する抗凝血剤（たとえばｒＴＰＡ）とＰＫＣ活性化因子の医薬組成物を調製し、それを必要とする対象に投与するために利用し得るキットに関する。キットは、さらに、本明細書に記載の医薬組成物を投与するための器具、たとえば注射器を含んでいてもよい。

いくつかの態様では、キットは、本明細書において開示するｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の組成物を保存および／または続いて混合するための１つ以上のバイアル、注射器、針、アンプル、カートリッジ、瓶、または他の当該容器を含んでいてもよい。一定の態様では、本明細書において開示するｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の組成物を保存および／または続いて混合するための器具、注射器、アンプル、カートリッジ、瓶または他の当該容器は、２つ以上の室を有するか否かを問わない。

またさらなる態様では、本明細書において開示するｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の組成物は、１つ以上の目盛り付き容器（たとえば、体積の測定に有用な１つ以上の注射器または他の器具）中で保存してもよい。

一定の態様では、キットは、同じまたは別々のアンプル、バイアル、注射器、カートリッジ、瓶、または他の当該容器内に保存されるｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の医薬組成物を含んでいてもよい。

本キットは、さらに、１つ以上の麻酔剤、好ましくは局所麻酔剤を含んでいてもよい。一定の態様では、麻酔剤は、即時使用可能な製剤、たとえば、注射可能な製剤（予め製剤を充填してある１つ以上の注射器の形態であってもよい）、または、本明細書において開示するｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の組成物を投与しようとする領域に局所施用してもよい製剤の形態である。

麻酔剤の局所用製剤は、パッド、スワブ、ウェットティッシュ、使い捨てのナプキン、布、パッチ、包帯、ガーゼ、綿ボール、Ｑ−ｔｉｐ（商標）に塗布される麻酔剤；軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、液剤、または任意の他の局所施用される製剤の形態であってもよい。本発明と共に使用するための麻酔剤としては、たとえばリドカイン、マーカイン、コカイン、およびキシロカインを挙げてもよいが、これらに限定されない。

本キットは、さらに、ｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の医薬組成物の使用、およびｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の製剤を混合、希釈、または合わせるための手順に関する取扱説明書を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、混合後であるが投与に先立ち、ｒＴＰＡおよび／またはＰＫＣ活性化因子の製剤を正しく希釈して所望のｐＨまたはｐＨ範囲および／または所望の特定の活性および／またはタンパク質濃度を得るための指示書を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、用法・用量に関する情報を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、本明細書において開示するｒＴＰＡとＰＫＣ活性化因子の医薬組成物での治療の対象を選別する方法を指示してある材料を含有していてもよい。キットは、さらに、追加的な緩衝剤、注射器、針、無針注射器具、滅菌済のパッドまたはスワブを含んでいてもよい。

本開示のいくつかの態様では、キットは、ｒＴＰＡを含む組成物と、ＰＫＣ活性化因子を含む１つ以上の組成物、たとえば、それぞれがＰＫＣ活性化因子を含む少なくとも２つの組成物を含む。該２つ以上の組成物は、同じまたは異なるＰＫＣ活性化因子を含んでいてもよく、同じ用量または異なる用量のＰＫＣ活性化因子用に製剤化してもよい。

次の例は、本開示を例証することを意図しているが、決して限定的なものではない。当業者であれば、本明細書中に示す開示内容と一致する追加的な態様を想起するであろうということは理解される。

［実施例］
例１
脳卒中の局所脳虚血モデル
この実験には、一過性の局所脳虚血の動物モデルを使用した。結紮により、麻酔をかけたラットにおいて中大脳動脈（ＭＣＡ）を外科的に切断し閉塞させ、続いて、規定期間（約２時間）後に再灌流させた。ＭＣＡの閉塞（ＭＣＡＯ）による一過性虚血の動物モデルは周知であり、たとえば、ＳｉｃａｒｄおよびＦｉｓｈｅｒ、Ｅｘｐ．＆Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｔｒｏｋｅ Ｍｅｄ．、（２００９）、第１巻、１〜７ページに記載されている。

例２
薬物投与
第１の実験においては、虚血事象の６時間後にｒＴＰＡを静脈内投与し（約０．９ｍｇ／ｋｇ）、続いて２時間後にブリオスタチン−１を約２５μｇ／ｍ^２〜５０μｇ／ｍ^２の用量範囲で単回静脈内投与した。

第２の実験においては、虚血事象の２時間後にブリオスタチン−１を静脈内投与し（約２５μｇ／ｍ^２〜５０μｇ／ｍ^２）、続いて約６時間後にｒＴＰＡ（約０．９ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。

第３の実験においては、虚血事象の２時間後にｒＴＰＡを静脈内投与し（約０．９ｍｇ／ｋｇ）、続いて約６時間後にブリオスタチン−１を約２５μｇ／ｍ^２〜５０μｇ／ｍ^２の用量範囲で静脈内投与した。

例３
結果
１．死亡率。

脳卒中の６時間後にｒＴＰＡを、続いて２時間後にブリオスタチン−１を投与すると、２４時間後の死亡率は０％となった（Ｎ＝９匹）。これに対し、脳卒中の６時間後にｒＴＰＡを投与し、ブリオスタチンでの後続治療を行わなかった場合、４４％の死亡率が認められた（Ｎ＝６匹）。

２．出血、浮腫、および血液脳関門破損。

脳卒中の２時間後にブリオスタチン−１を、続いて６時間後にｒＴＰＡを投与すると、結果として、皮質および線条体におけるヘモグロビン分析値は、脳卒中の６時間後にｒＴＰＡを投与したが事前にブリオスタチン−１での治療を行わなかった場合と比較して５０％低下した（図１）。脳浮腫も、このｒＴＰＡとブリオスタチン−１との組合せを用いた場合には、顕著に減少した（図２）。

ＢＢＢ透過性は、局所虚血発症後に浮腫の出現に先立ち典型的に上昇することから、浮腫を用いて、虚血病変部位によるＢＢＢ破損の程度を測定することができる。加えて、出血過程は、ＢＢＢ破損および浮腫に関与している。１つの実験では、エバンスブルー染料の取込みを用いてＢＢＢ透過性、すなわち、脳卒中の虚血動物モデルにおける破損、および出血を測定した。図３は、ブリオスタチンと本開示の方法による投与との組合せが、同側および対側皮質においてエバンスブルー染料の取込み量を顕著に減少させたことを示している。

最後に、（ＢＢＢ）を越えるナトリウム輸送量の増加は、虚血性脳卒中における脳浮腫形成を助長する。図４は、同側および対側皮質におけるＮａＦの取込み量も、本開示によるブリオスタチン−１およびｒＴＰＡの投与法で減少することを示している。

前述の結果は、虚血性脳卒中発症後のブリオスタチン−１とｒＴＰＡとの組合せが、虚血性脳卒中発症後の死亡率および脳障害を予想外および顕著に低下させることを実証するものである。

例４
脂肪酸メチルエステルの合成
シクロプロパン化脂肪酸メチルエステル
シクロプロパン化脂肪酸の合成。クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を使用する、改変型のシモンズ−スミス反応を用いて、ＰＵＦＡのメチルエステルをシクロプロパン化した。Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、（２００３）、第１３巻、１０３７〜１０４０ページ；Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、（１９６８）、第２４巻、５３〜５８ページ；Ｄｅｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９１）、第５６巻、６９７４〜６９８１ページ。すべての装置を６０℃で１時間熱し、乾燥窒素と共に炎を用いて乾燥させた。撹拌子および温度プローブを備えた１００ｍｌの三つ首丸底フラスコに、氷−ドライアイス混合物を巻き、２５ｍｌのジクロロメタン中の１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）のリノール酸メチルエステルまたはドコサヘキサエン酸メチルエステルを充填し、Ｎ_２を通気させた。長さ２４インチの２０ゲージ針を用いて、ジエチル亜鉛の１Ｍ溶液（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）にヘキサンを嫌気的に加え、この溶液を−５℃に冷却した。ジヨードメタン（８．２ｍｌ、１０１．８８ｍｍｏｌ）またはクロロヨードメタン（ＣｌＣＨ_２Ｉ）を、絶えず撹拌しながら、１秒当たり１滴、滴加した。添加速度を必要に応じ減少させて、反応混合物を２℃未満に維持した。反応混合物は反応中に曇った状態になり、不溶性の白色の亜鉛生成物が遊離した。フラスコを密封し混合物を１時間反応させ、次いで、２時間かけて徐々に室温に戻した。

フード内での爆発性残留物の形成を防止するために、ジエチル亜鉛を蒸発させて除去することはしなかった。混合物を１００ｍｌの水の中に撹拌下でゆっくり注いで、一切の過剰なジエチル亜鉛を分解させた。エタンを放出させた。混合物をガラス遠心管中にて５０００ｒｐｍで遠心分離し、上部の水層を捨てた。

白色の沈殿物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心分離した。ヘキサン＋１％酢酸エチルを使用したシリカゲルＧ ＴＬＣにより生成物を分析し、ｎ−ヘキサン中の漸増濃度の１〜１０％酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、窒素下で蒸発させると、メチルエステルが無色の油として残った。

シモンズ−スミス反応は、出発物質の立体化学を維持する。Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、（１９６８）、第２４巻、５３〜５８ページ。ドコサヘキサエン酸メチルエステルを９０〜９５％の収率でＤＨＡ−ＣＰ６に変換させた。生成物は無色の油であり、シングルビームでの吸光度はエタノール中では２０２ｎｍで最大であり、Ｉ_２とは反応しなかった。ＩＲスペクトルは、３０７０ｃｍ^−１および１４５０ｃｍ^−１でのシクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件下で、エイコサペンタエン酸メチルエステルをＥＰＡ−ＣＰ５に変換させ、アラキドン酸メチルエステルをＡＡ−ＣＰ４に変換させた。リノール酸メチルエステルをＤＣＰ−ＬＡメチルエステルに変換させたところ、公知の試料と同一であった。

メチルエステルの加水分解。メチルエステル（０．１５ｇ）を１ｍｌの１Ｎ ＬｉＯＨおよび１ｍｌのジオキサンに溶解した。ジオキサンおよびメタノールを加えると、やがて均質になり、この溶液を６０℃で一晩撹拌した。生成物をＣＨ_２Ｃｌ_２中で抽出し、遠心分離した。水層および白色の界面を水で再抽出し、白色の層がそれ以上形成されなくなるまで洗浄した。生成物をＮ_２下で蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物である無色の油を、ｎ−ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃで溶出した。その純度を、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのＴＬＣにより、および、２０５ｎｍでのＵＶ検出を用いたＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣにより、確認した。

エポキシド基は、従来の手段により、たとえば、適切なアルケンをｍ−クロロ過安息香酸またはｔ−ブチルヒドロペルオキシドで酸化することにより、導入できる。合成した他の化合物としては、図５に示すものが挙げられる（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）。

例５
ドコサヘキサン酸（Docosahexanoic acid）を使用した精製ＰＫＣεの活性化
ＰＫＣアッセイ。組換えＰＫＣ（１ｎｇのＰＫＣαまたはＰＫＣεアイソフォーム）をＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）と、以下の存在下で混合した：１０マイクロモルのヒストン、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＡＧ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭのベンズアミジン。０．５マイクロＣｉの［^γ３２Ｐ］ＡＴＰを加えた。インキュベーション混合物を、総体積１０マイクロリットルで３７度にて１５分間インキュベートした。反応は、１×２ｃｍ片のリン酸セルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１）上に反応混合物を付け、直ちに０．５％Ｈ_３ＰＯ_４中で１時間ずつ２回洗浄することにより停止させた。リン酸セルロース片をシンチレーションカウンターで計数した。いくつかの実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、および／またはカルシウムを除去した。

ＤＨＡメチルエステルをＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ＰＫＣアイソザイムはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製であった。精製ＰＫＣεをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。

結果
精製ＰＫＣεを使用したＰＫＣ測定から、テストした最低濃度（１０ｎＭ）では、化合物ＢＲ−１０１はＰＫＣεを２．７５倍活性化させることが示された（図６）。ＰＫＣαは影響を受けなかった（データは示していない）。化合物ＢＲ−１０２も、活性化されていないＰＫＣεの約１．７５倍まで、ＰＫＣεの活性化を選択的に導いた。ＰＫＣεの活性化における低濃度での有効性から、これらの化合物は良好な治療薬候補であろうということが示唆される。

例６
他のＰＫＣ活性化因子を使用した、精製ＰＫＣεまたは細胞ＰＫＣεの活性化
材料。培養培地を、Ｋ−Ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。Ａβ１−４２をＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。多価不飽和脂肪酸メチルエステルをＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手した。他の化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ＰＫＣアイソザイムはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製であった。精製ＰＫＣεをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。

細胞培養。ラット海馬のＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をポリ−Ｌ−リジンコーティングしたプレート上に蒔き、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で３５℃にて数日間育てると、やがて約５０％の被覆率が得られた。次いで、細胞を、ニューロン表現型に分化するように誘導したが、この際の手段は、培地を、基礎となる線維芽細胞成長因子１０ｎｇ／ｍｌを含有する３９℃のＮ_２培地５ｍｌに置きかえ、３７℃のＴ−７５フラスコ中で育てることによった。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）は、４５％Ｆ１２Ｋ／４５％ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。マウスＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（グルタミン酸を加えていない）中で培養した。生後１８日のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット胎仔の脳に由来するラット海馬ニューロンを、０．５ｍＭのグルタミンと２５μＭのグルタミン酸とを含有するＢ−２７ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングした１２または９６ウェルプレート上で蒔いてから、グルタミン酸を加えていない培地で３日間培養した。ニューロン細胞をインキュベーター中で５％ＣＯ_２下で育て、３７℃で１４日間維持した。

培養細胞に対する実験はすべて、特に指定しない限り３回ずつ実施した。すべてのデータ点は、平均値±ＳＥとして示す。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、すべての実験においてその遊離酸として使用したが、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１６（ＡＡ−ＣＰ４）は、そのメチルエステルとして使用した。

タンパク質キナーゼＣアッセイ。ラット海馬細胞を培養し、０．２ｍｌのホモジナイゼーション緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、および０．１ｍＭのＰＭＳＦ）中でこすり取り、Ｍａｒｓｏｎｉｘマイクロプローブ超音波処理器を用いた超音波処理（５秒、１０Ｗ）によりホモジナイズした。ＰＫＣを測定するために、１０μｌの細胞ホモジネートまたは精製ＰＫＣアイソザイム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）を３７℃で１５分間、以下の存在下でインキュベートした：１０μＭのヒストン、４．８９ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭのベンズアミジン。０．５Ｃｉの［^γ３２Ｐ］ＡＴＰを加え、先に記載のとおりホスホセルロース上に吸着させることにより、^３２Ｐ−リンタンパク質の形成を測定した。ＮｅｌｓｏｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９５）、第６５巻、２３５０〜２３５７ページ。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）および類似の化合物による活性化の測定については、ＰＫＣ活性はジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの不在下で測定し、ＰＫＣδ、ε、η、およびμは、Ｋａｎｎｏら（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００６、第４７巻、１１４６〜１１５０ページ）による記載のとおり、ＥＧＴＡおよびＣａＣｌ_２を加えずに測定した。低濃度のＣａ^２＋を使用するが、その理由は、高濃度のＣａ^２＋はＰＫＣホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を妨げるからである。ブリオスタチン活性化の測定については、特に指定しない限り、１，２−ジアシルグリセロールを除いた。

結果および考察
脂肪酸誘導体のＰＫＣアイソザイム特異性を決定するために、精製ＰＫＣで脂肪酸誘導体を５分間プレインキュベートし、放射線測定法によりＰＫＣ活性を測定した。先に例５に示したように、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、１０μＭでＰＫＣεの有効な活性化因子であったが、他のＰＫＣアイソフォームに及ぼす効果は比較的小さかった（データは示していない）。より高い濃度では、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、部分的にＰＫＣδ（約１〜１００μＭ）および活性化ＰＫＣγ（５０〜１００μＭ）を阻害した（データは示していない）。

ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４）、すなわち、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸のシクロプロパン化誘導体は、それぞれ同程度まで、精製ＰＫＣεを活性化した（図７）。ＰＫＣを活性化するために必要な濃度は、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）の場合よりおよそ１００倍低く、より高い親和性が示唆された。シクロプロパン化リノレニルおよびリノレイルアルコール（ＢＲ−１０４およびＢＲ−１０５）、エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）、およびベモル酸（vemolic acid）メチルエステル（ＢＲ−１１７）は、ＰＫＣにはほとんどまたは全く効果を及ぼさなかった（図８）。シクロプロパン化ベモル酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）は、前述の濃度１μＭでＰＫＣεを阻害した（図８）。

ジアシルグリセロール結合部位と結合するＰＫＣ活性化因子、たとえばブリオスタチン、グニジマクリンおよびホルボールエステルは、ＰＫＣ活性の一過性の活性化、続いて、長時間に及ぶ下方調節をもたらす。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、（２００９）、第３４巻、１３６〜１４５ページ。このことは、培養したラット海馬細胞において確認された。ラットＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞を（０．０４ｎＭおよび０．２ｎＭの）ブリオスタチンでインキュベートすると、３０分続く２倍の活性化、続いて、２４時間のうちにベースラインに戻る２０％の下方調節がもたらされた（データは示していない）。これに対し、ＤＣＰ−ＬＡに曝露させたＰＫＣは、少なくとも４時間にわたり高値のままであった（図９）。この活性化の持続は、一次ニューロンにおいてのみ観察された。

ブリオスタチンはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）よりＰＫＣ親和性が高いとはいえ（ＥＣ５０＝１．３５ｎＭ対１０ｎＭ）、ブリオスタチンは、ＰＫＣの下方調節という点では、ＰＭＡよりはるかに有効性は低かった。ＰＫＣ活性は、８時間時点ではホルボールエステルにより強く下方調節されるが、ブリオスタチンで処理した細胞中のＰＫＣは、ベースラインまたはその付近である（データは示していない）。この差は、ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、（２００９）、第１０８巻、３１９〜３３０ページにより報告された、ＰｄＢｕによりもたらされるＡβの増加を説明し得る。この研究者らは、１μＭのＰｄＢｕを培養ＣＯＳ細胞に８時間接触させて、Ａβの増加を観察した。この増加は、ホルボールエステルによりＰＫＣが下方調節されたことに起因したものであったが、そのことは、今回の結果と一致している。下方調節は、ＤＣＰ−ＬＡおよび関連化合物については測定できなかった。

例７
ＰＫＣ活性化因子がＡβの産生および分解に及ぼす効果
細胞培養。細胞培養を、例６に記載したとおりに実施した。

Ａβ測定および細胞生存アッセイ。Ａβ１−４２ヒト蛍光測定ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの取扱説明書に従って使用して、Ａβを測定した。結果は、メーカーの取扱説明書に従い、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅおよびＣｙＱｕａｎｔ ＮＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定した。

結果および考察
ＰＫＣε活性化がＡβ産生に及ぼす効果を測定するために、ヒトＡＰＰＳｗｅ／ＰＳＩＤを形質移入した、大量のＡβを産生するマウスｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２ａ）神経芽細胞腫細胞を使用した。Ｐｅｔａｎｃｅｓｋａら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、（１９９６）、第７４巻、１８７８〜１８８４ページ。この細胞を多様な濃度のＰＫＣ活性化因子ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）で２４時間インキュベートすると、細胞内Ａβ（図１１ａ）と分泌されたＡβ（図１１ｂ）の両方のレベルが著しく低下した。ブリオスタチン（ジアシルグリセロール結合部位と結合することによりＰＫＣを活性化する）を用いると、阻害は二相性であり、２０ｎＭ以上の濃度では正味の効果をもたらさなかった。このことは、このクラスのＰＫＣ活性化因子は、高濃度で使用するとＰＫＣを下方調節することができるということにより説明し得る。これに対し、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、ＰＫＣのホスファチジルセリン部位と結合し、最大１０μＭ〜１００μＭの濃度で単調に増加する阻害を示したが、より高い濃度で下方調節する証拠はなかった。

ＰＫＣ活性化因子によりもたらされたＡβのレベル低下が、Ａβ合成の阻害またはＡβ分解の活性化のいずれに起因するものであったかを決定するために、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．０１μＭ〜１０μＭ）および低濃度（１００ｎＭ）の外因性のモノマーとしてのＡβ−４２を、培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に接触させた。Ａβのこの濃度は非常に低いことから、測定可能な毒性または細胞死を生じさせることはない。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は微量のＡβのみを産生するので、この実験は、ＰＫＣ活性化因子がＡβ分解を増進する能力の有効なテストであった。２４時間のうちにＡβの大半は細胞により取り込まれており、培養培地中のＡβの濃度は検出できなかった。０．０１μＭ〜１０μＭのＤＨＡ−ＣＰ６を細胞に加えると、Ａβの細胞レベルは４５％〜６３％低下し、このことから、ＰＫＣε活性化因子は外因性のＡβの分解速度を増加させたことが示された（図１２）。

ＤＨＡ−ＣＰ６、ブリオスタチン、およびＤＣＰ−ＬＡは、ａｌａｍａｒ ＢｌｕｅおよびＣｙＱｕａｎｔ染色により測定したとおり（図１５ａおよび図１５ｂ）細胞生存にも増殖にも効果を及ぼさなかったが、このことから、Ａβ産生量の減少は、細胞増殖、または、細胞生存の変化の結果生じたものではないことが示された。

例８
ＰＫＣ活性化因子がＴＡＣＥ活性に及ぼす効果
ＴＡＣＥアッセイ。ＴＡＣＥは、５μｌの細胞ホモジネート、３μｌの緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ７．４＋２５ｍＭのＮａＣｌ＋４％グリセロール）、および１μｌの１００μＭ ＴＡＣＥ基質（Ａβｚ−ＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＤＰａ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１．５ｍｌポリプロピレン遠心管中で３７℃にて２０分間インキュベートすることにより測定した。Ｊｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（２００２）、第３０２巻、２６９〜２７５ページ。４℃に冷却することにより反応を停止させた。試料を１ｍｌに希釈し、Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ２分光蛍光光度計で蛍光を速やかに測定した（ｅｘ＝３２０ｎｍ、ｅｍ＝４２０ｎｍ）。

結果および考察
先行研究者らは、ＰＫＣ活性化因子、たとえばホルボール１２−ミリステート１３−アセテートはＴＡＣＥ活性を大きく増加させ、その増加はｓＡＰＰαの増加およびＡβの減少と相関し、このことから、ＴＡＣＥとＢＡＣＥ１とはＡＰＰ基質の利用能について競合すること、および、ＰＫＣ活性化因子はこの競合をＴＡＣＥに有利に転じさせることが示唆されると報告した。Ｂｕｘｂａｕｍら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９９８）、第２７３巻、２７７６５〜２７７６７ページ；Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（２００６）、第１０３巻、８２１５〜８２２０ページ。しかし、これらの先行試験のうち多くは、線維芽細胞、およびニューロン以外の他の細胞型において実施されたものであり、こうした細胞型は、ニューロンとは異なる形でＰＫＣ活性化因子に応答するようである。たとえば、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙらは、１０ｐＭ〜１００ｐＭのブリオスタチンによりヒト線維芽細胞においてＰＫＣを活性化させると、α−セクレターゼ活性の初速度がそれぞれ１６倍および１３２倍増加することを見出した。しかし、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞、Ｎ２ａマウス神経芽細胞腫細胞（図１３ａ）、およびラット海馬由来の一次ニューロン（図１３ｂおよび図１３ｃ）においては、ＰＫＣ活性化因子ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、および／またはＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）のみが、活性をわずかに増加させた。このことから、ＰＫＣ活性化因子によるニューロンにおけるＡβレベルの低下は、ＴＡＣＥの活性化以外に何らかの他の機序が原因で生じるに違いないということが示唆される。

例９
ＰＫＣ活性化因子がエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）活性に及ぼす効果
ＥＣＥアッセイ。ＳＨ−Ｓ７５７神経芽細胞腫細胞をブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μＭ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μＭ）でインキュベートした。エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＡｈｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（２０００）、第２８６巻、１１２〜１１８ページ）の方法を用いた蛍光測定法により測定した。細胞ホモジネート（２０μｌ）の試料を５０ｍＭのＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０、０．０１％Ｃ１２Ｅ１０（ポリオキシエチレン−１０−ラウリルエーテル）、および１５μＭのＭｃａＢＫ２（７−メトキシクマリン−４−アセチル［Ａｌａ７−（２，４−ジニトロフェニル）Ｌｙｓ９］−ブラジキニントリフルオロ酢酸塩）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中でインキュベートした。３７℃で６０分後、０．５％までトリフルオロ酢酸を加えることにより反応をクエンチした。試料を水で１．４ｍｌに希釈し、蛍光をｅｘ＝３３４ｎｍ、ｅｍ＝３９８ｎｍで測定した。

結果および考察
いくつかの酵素、たとえばインスリン分解酵素（インスリシン）、ネプリリシン、およびＥＣＥにより、Ａβをｉｎ ｖｉｖｏで分解できる。ＰＫＣεの過剰発現は、ＥＣＥを活性化すると報告されている。Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（２００６）、第１０３巻、８２１５〜８２２０ページ。そこで、脂肪酸誘導体ＰＫＣ活性化因子がＥＣＥに及ぼす効果を調べた。ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、すべて、ＥＣＥ活性の持続的な増加をもたらした（図１４）。ＥＣＥはジアシルグリセロール結合Ｃ１ドメインを有さないので、このことから、ブリオスタチンによる活性化は、ＥＣＥの直接活性化に起因するのではなく、ＰＫＣによるＥＣＥまたはいくつかのＥＣＥ活性化中間体のリン酸化の結果生じたに違いないことが示唆される。この結果から、ＰＫＣ活性化因子による間接的なＥＣＥの活性化は、患者のＡβのレベルを低下させる有用な手段である可能性があることも示唆される。

ＰＫＣεを特異的に活性化する化合物の利点は、そのような化合物は、ホルボールエステルおよび類似の１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）類似体ほどには下方調節をもたらさないと考えられることである。ＤＡＧベースの活性化因子に対するＰＫＣの二相性の応答は、ＰＫＣ活性化因子が、ある時点ではＡβレベルを低下させ、別の時点では上昇させる場合もあることを意味する。Ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、（２００９）、第１０８巻、３１９〜３３０ページ。意図した効果と逆の効果を回避するには、慎重な投与と患者のモニターとが必要であろう。化合物がＰＫＣ（たとえば、本明細書において開示する脂肪酸誘導体）を下方調節する能力は相対的にないことから、そのような意図しない効果が回避される。

例１０
脳卒中の全虚血モデル
ラット（オス、Ｗｉｓｔａｒ、２００〜２２５ｇ）をランダムに６群（各８匹）に分け、１週間飼育した後で実験を行った。脳血流および酸素供給を一過性または永続性に制限すると、結果として虚血性脳卒中となる。血管性の記憶障害を誘導するために用いる全虚血モデルは、２本の血管の閉塞と短期間の全身低酸素状態とを組み合わせたものであった。両側総頸動脈の結紮を麻酔下（ペントバルビタール、６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で実施した。外科手術から１週間の回復期間の後、ラットを１４分間の低酸素状態に曝露させた（５％酸素、ガラス瓶中）。対照ラット（偽手術対照およびビヒクル対照）に同じ切開術を施して両方の総頸動脈を切り離し、１４分間大気にさらした（ガラス瓶中）。体温は、外科的処置の間、また、動物が完全に回復するまで、加熱光源を用いて３７〜３７．５℃に保った。

例１１
ブリオスタチンおよびＭＣＤＡ治療
ブリオスタチン−１を２０）μｇ／ｍ^２で投与した（尾静脈内、２回投与／週で１０回投与）が、開始は、低酸素事象の終了の２４時間後とした。４−メチルカテコール二酢酸（ＭＣＤＡ、潜在的なＮＧＦおよびＢＤＮＦブースター）を、別々のラット群において１．０ｍｇ／ｋｇで投与した（腹腔内、同じ５週間にわたり毎日）。

最後のブリオスタチン−１、ＭＣＤＡ、またはビヒクル投与の１週間後、ラットに、水迷路の空間学習課題（１日当たり２回の訓練試行を４日間）、続いてプローブテストの訓練を行った。プローブテスト後に、視認可能プラットフォームテスト（visible platform test）を行った。結果を図１６に示す。

全体的に見ると、６群間で有意な学習差があった（図１６、Ｆ_{５，３８３}＝２７．４８０、ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。詳細な分析から、虚血群は空間迷路課題を学習しないことが明らかになったが、その理由は以下のとおりである：試行を通じて逃避潜時に有意差はなく（Ｆ_７，６３＝０．１０２、Ｐ＞０．０５）、対照ラットと比較して学習が有意に障害された（群間差：Ｆ_{１，１２７}＝７９．７５１、ｐ＜０．００１）が、他の５群のラットはすべて、課題を学習した（試行を通じて、ＭＣＤＡ治療を行った虚血ラット：ｐ＜０．０５、他の４群：ｐ＜０．００１）。ブリオスタチン−１療法は、成績を大幅に改善し（虚血群（ブリオスタチン−１治療あり）対虚血ラット：Ｆ_{１，１２７}＝７２．７８２、ｐ＜０．００１）、対照ラットと統計的に差がない成績レベルとなった（虚血群（ブリオスタチン−１治療あり）対対照ラット：Ｆ_{１，１２７}＝０．００１、ｐ＞０．０５）。ＭＣＤＡ治療も、虚血ラットの学習を改善した（虚血ラット（ＮＣＤＡ治療あり）対虚血ラット：Ｆ_{１，１２７}＝１５．５８４、ｐ＜０．００１）が、虚血ラット（ＭＣＤＡ治療あり）と対照ラットとの間の差は、５週間の治療後も有意なままであった（虚血ラット（ＮＣＤＡ治療あり）対対照ラット：Ｆ_{１，１２７}＝１６．６１８、ｐ＜０．００１）。対照群とブリオスタチン−１のみの群との間（ブリオスタチン−１対対照：Ｆ_{１，１２７}＝０．０１０、ｐ＞０．０５）、および、対照群とＭＣＤＡのみの群との間（ＭＣＤＡ対対照：Ｆ_{１，１２７}＝０．２７２、ｐ＞０．０５）には、差がなかった。

虚血群のラットは、プローブテストにおいて標的嗜好性（target preference）を示さなかった（Ｆ３，３１＝０．０９６、ｐ＞０．０５）が、他の５群のラットはすべて、プローブテストにおいて標的象限嗜好性（target quadrant preference）を示した（すべてｐ＜０．００５）。標的象限率（標的象限の距離を、プローブテスト中の非標的象限の距離の平均値で割る。図１７）を用いてデータを分析した。標的象限率には群間で有意差があった（Ｆ５，４７＝５．０８１、ｐ＜０．００１）。詳細な分析から、対照と虚血ラットとの間（Ｆ_１，１５＝９．４５１、ｐ＜０．０１）、虚血ラットと虚血ラット（ブリオスタチン−１治療あり）との間（Ｆ１，１５＝１０．３２８、ｐ＜０．０１）、および、虚血ラット（ＭＣＤＡ治療あり）と虚血ラットとの間（Ｆ_１，１５＝５．６２３、ｐ＜０．０５）では群間差が明らかになったが、対照と虚血ラット（ブリオスタチン−１治療あり）との間（Ｆ_１，１５＝０．０１３、ｐ＞０．０５）、虚血群（ＭＣＤＡ治療あり）と対照群との間（Ｆ_１，１５＝２．９９７、ｐ＞０．０５）、対照とブリオスタチン−１のみのラットとの間（Ｆ_１，１５＝０．０６４、ｐ＞０．０５）、および、対照とＭＣＤＡのみのラットとの間（Ｆ_１，１５＝０．０３９２、ｐ＞０．０５）では差がなかった。プローブテスト後に決定された視認可能プラットフォームテストでは、群間に有意差はない（Ｆ_５，４７＝０．１１５、ｐ＞０．０５）ことが明らかになり、このことから、ラットの感覚運動に有意な群間差はないことが示された。

例１２
ブリオスタチン治療
オスのＷｉｓｔａｒラット（２２５〜２５０ｇ）において全脳虚血／低酸素症を誘導したが、その際の手段は、両側総頸動脈を永続的に閉塞させることと、約１４分間の低酸素状態（約５％）とを組み合わせることによった。ブリオスタチン−１を１５μｇ／ｍ^２で投与した（尾静脈経由、２回投与／週で１０回投与）が、開始は、虚血／低酸素事象の終了の２４時間後とした。空間学習（２試行／日を４日間）および記憶（１分のプローブテスト、最終試行後２４時間）課題を、最終投与の９日後に実施した。全体として、群間（Ｆ３，２５５＝３１．８５６、ｐ＜０．００１）および群×試行間（Ｆ２１，２５５＝１．６４８、ｐ＜０．０５）で有意差があった。全脳虚血は、空間学習を障害した（虚血群対偽手術群：Ｆ_{１，１２７}＝７９．７５１、ｐ＞０．００１）。学習障害はブリオスタチン−１治療により回復した（ブリオスタチン−１＋虚血群対虚血群：Ｆ１，１２７＝５０．２３３、ｐ＜０．００１）が、ブリオスタチン−１単独は、学習に影響しなかった（ブリオスタチン−１群対偽手術群：Ｆ１，１２７＝２．２５８、ｐ＞０．０５、最終投与の９日後）。

記憶保持テストにおいて、偽手術を受けたラットは、標的象限嗜好性を示した。そのような良好な記憶保持は虚血ラットにおいては観察されず、このことから、空間記憶の障害が示される。ブリオスタチン−１療法は、虚血後の記憶保持を、偽手術を受けたラットのレベルまで有効に回復させた。ブリオスタチン−１単独では、標的象限嗜好性において、偽手術を受けた対照ラットの結果と比較して有意な効果がなかった。象限率では群間で有意差があった（標的象限遊泳距離（target quadrant swim distance）を非標的象限における平均遊泳距離で割ることにより算出。Ｆ３，３１＝６．１８１、ｐ＜０．００５）。詳細な分析から、虚血ラットと偽手術を受けた対照ラットとの間（Ｆ１，１５＝９．４５１、ｐ＜０．００１）、虚血ラットと虚血ラット（ブリオスタチン−１治療あり）との間（Ｆ１，１５＝１０．３２８、ｐ＜０．００１）の有意差が明らかになったが、虚血ラット（ブリオスタチン−１治療あり）と偽手術を受けた対照との間（Ｆ１，１５＝０．０１３１、ｐ＞０．０５）、および、偽手術を受けた対照ラットとブリオスタチン−１単独ラットとの間（Ｆ１，１５＝０．１６１、ｐ＞０．０５）に有意差はなかった。これらの結果から、脳虚血／低酸素症が空間学習および記憶の障害をもたらしたことが実証される（虚血事象の約７週間後にテスト）。この障害は、時間域の間に適切な介入が行われなければ継続し、回復不可能であったが、長期的なブリオスタチン−１治療により、治療を虚血事象後２４時間という広い治療可能時間域で開始した場合であっても回復した。
以下に実施形態の例を記す。
［１］ 虚血事象に罹患している対象を治療する方法であって、
（ａ）前記虚血事象後約２４時間以内に抗凝血剤およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を前記対象に投与することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の後に、治療継続期間にわたり少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を投与することと
を含み、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なる方法。
［２］ ［１］に記載の方法であって、前記抗凝血剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である方法。
［３］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＰＫＣ活性化因子が、それぞれ独立に、ＰＫＣの１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ホスファチジル−Ｌ−セリン、ＰＳ）部位のうち少なくとも１つと結合する、またはＰＫＣを間接的に活性化させる方法。
［４］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＰＫＣ活性化因子が、それぞれ独立に、大環状ラクトン、ホルボールエステル以外のジアシルグリセロール誘導体、イソプレノイド、ダフナン型ジテルペン、二環式のトリテルペノイド、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、成長因子活性化因子、および脂肪酸、ならびにそれらの誘導体から選ばれる方法。
［５］ ［４］に記載の方法であって、前記大環状ラクトンが、ブリオスタチン、ブリオログ、およびネリスタチンから選ばれる方法。
［６］ ［５］に記載の方法であって、前記ブリオスタチンが、ブリオスタチン−１である方法。
［７］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子の前に前記抗凝血剤が投与される方法。
［８］ ［７］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記虚血事象後２４時間以内に投与される方法。
［９］ ［８］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約１時間〜約１２時間後に投与される方法。
［１０］ ［９］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約２時間〜約６時間後に投与される方法。
［１１］ ［７］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の投与後２４時間以内に投与される方法。
［１２］ ［１１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の投与の約１時間〜約１２時間後に投与される方法。
［１３］ ［１２］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の約２時間〜約６時間後に投与される方法。
［１４］ ［７］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記虚血事象後約６時間以内に投与され、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の後、約２時間以内に投与される方法。
［１５］ ［１４］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約３時間後に投与され、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の約２時間後に投与される方法。
［１６］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記抗凝血剤の前に投与される方法。
［１７］ ［１６］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象後２４時間以内に投与される方法。
［１８］ ［１７］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象の約１時間〜約１２時間後に投与される方法。
［１９］ ［１８］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象の約２時間〜約６時間後に投与される方法。
［２０］ ［１６］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与後２４時間以内に投与される方法。
［２１］ ［２０］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与の約１時間〜約１２時間後に投与される方法。
［２２］ ［２１］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与の約２時間〜約６時間後に投与される方法。
［２３］ ［１６］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象後約６時間以内に投与され、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与後約２時間以内に投与される方法。
［２４］ ［２３］に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象の約３時間後に投与され、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の約２時間後に投与される方法。
［２５］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ｂ）における前記治療が、前記虚血事象の約１０時間〜約３２時間後に開始される方法。
［２６］ ［２５］に記載の方法であって、ステップ（ｂ）の前記治療が、前記虚血事象の約２４時間後に開始される方法。
［２７］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ｂ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、１週間当たり１〜３回投与される方法。
［２８］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ｂ）における前記治療継続期間が約１週間〜約１０週間の範囲に亘る方法。
［２９］ ［１］に記載の方法であって、ステップ（ｂ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、静脈内注射により投与される方法。
［３０］ ［１］に記載の方法であって、死亡率が、前記抗凝血剤単独の投与に比して低下する方法。
［３１］ ［３０］に記載の方法であって、脳卒中後２４時間の死亡率が少なくとも４０％低下する方法。
［３２］ ［１］に記載の方法であって、出血性変化が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して低下する方法。
［３３］ ［３２］に記載の方法であって、出血性変化の前記低下が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して、前記対象のヘモグロビンレベルを測定することにより決定される方法。
［３４］ ［３３］に記載の方法であって、前記ヘモグロビンレベルが約５０％低下する方法。
［３５］ ［１］に記載の方法であって、血液脳関門の破損が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して低下する方法。
［３６］ ［１］に記載の方法であって、前記治療が、脳卒中により誘導される脳障害を回復させる方法。
［３７］ ［１］に記載の方法であって、前記治療が、脳卒中により誘導される記憶障害を回復させる方法。
［３８］ それ必要を必要とする対象における脳卒中を治療する方法であって、
（ａ）脳卒中に罹患している対象を同定することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を投与することと、
（ｃ）前記対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中の何れに罹患したか決定することと、
（ｄ）前記対象が虚血性脳卒中に罹患した場合は、治療有効量の抗凝血剤を投与することと、
（ｅ）少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を治療継続期間にわたり投与することと
を含み、
ステップ（ｂ）およびステップ（ｅ）の前記ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なる方法。
［３９］ ［３８］に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを撮影することを含む方法。

Claims (18)

1. 虚血事象に罹患している対象を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、該方法は以下のステップを含み、
   （ａ）前記虚血事象後約２４時間以内に抗凝血剤およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を前記対象に投与することであって、前記ＰＫＣ活性化因子を抗凝血剤の前に投与すること、
   （ｂ）ステップ（ａ）の後に、治療継続期間にわたり少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を投与することと
   を含み、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なる、医薬組成物。
2. 請求項１に記載の医薬組成物であって、前記抗凝血剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である医薬組成物。
3. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＰＫＣ活性化因子が、それぞれ独立して、大環状ラクトン、ホルボールエステル以外のジアシルグリセロール誘導体、イソプレノイド、ダフナン型ジテルペン、二環式のトリテルペノイド、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、成長因子活性化因子、および脂肪酸、ならびにそれらの誘導体から選ばれる医薬組成物。
4. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与の約１時間から約１２時間後に投与される医薬組成物。
5. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象後２４時間以内に投与される医薬組成物。
6. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与後２４時間以内に投与される医薬組成物。
7. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ｂ）における前記治療が、前記虚血事象の約１０時間〜約３２時間後に開始される医薬組成物。
8. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ｂ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、１週間当たり１〜３回投与される医薬組成物。
9. 請求項１に記載の医薬組成物であって、ステップ（ｂ）における前記治療継続期間が約１週間〜約１０週間の範囲に亘る医薬組成物。
10. それを必要とする対象を治療する方法において使用するための医薬組成物であって、該方法は以下のステップを含み、
    （ａ）虚血性脳卒中に罹患している対象を同定することと、
    （ｂ）前記対象に治療有効量のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を投与することと、
    （ｃ）治療有効量の抗凝血剤を投与することと、
    （ｄ）少なくとも１種のＰＫＣ活性化因子を治療継続期間にわたり投与することとを含み、
    ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）の前記ＰＫＣ活性化因子が同一であるかまたは異なり、
    前記ステップ（ｂ）とステップ（ｄ）で投与される医薬組成物はＰＫＣ活性化因子を含み、前記ステップ（ｃ）で投与される医薬組成物は抗凝固剤を含む、医薬組成物。
11. 抗凝血剤およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を含む虚血事象に罹患している対象を治療するための医薬組成物であって、該医薬組成物を該対象に投与することを含む、医薬組成物。
12. 請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記抗凝血剤が組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である医薬組成物。
13. 請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記ＰＫＣが、大環状ラクトン、ホルボールエステル以外のジアシルグリセロール誘導体、イソプレノイド、ダフナン型ジテルペン、二環式のトリテルペノイド、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、成長因子活性化因子、および脂肪酸、ならびにその脂肪酸誘導体から選ばれる医薬組成物。
14. 前記大環状ラクトンがブリオスタチン、ブリオログ、およびネリスタチンから選ばれる、請求項３に記載の医薬組成物。
15. ブリオスタチンがブリオスタチン−１である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象の約１時間〜約１２時間後に投与される、請求項５に記載の医薬組成物。
17. ステップ（ａ）において、前記ＰＫＣ活性化因子が、前記虚血事象の約２時間〜約６時間後に投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. ステップ（ａ）において、前記抗凝血剤が、前記ＰＫＣ活性化因子の投与の約２時間から約６時間後に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。

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