JP6427485B2

JP6427485B2 - 抗非膜ウイルス剤およびその用途

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Publication number: JP6427485B2
Application number: JP2015508761A
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Inventors: より子開發; 邦宏開發; 田中　伸幸; 伸幸田中
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Publication date: 2018-11-21
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Description

本発明は、非膜ウイルスの膜融合を阻害する阻害剤に関する。

ノロウイルス感染は、他のウイルス感染と比較して、下痢だけではなく嘔吐を伴う症状が特徴的であり、乳幼児から高齢者に至る広い年齢層で急性胃腸炎を引き起こすことが知られており、集団感染や再感染も問題視されている。このため、抗ウイルス剤の適用が試みられているが、ノロウイルスが強い薬剤抵抗性を示し、有効な薬剤が存在しないというのが現実である。これは、ノロウイルスが、エンベロープを有さない非膜ウイルスであり、アルコールや高温に対して抵抗性が強く、また、乾燥や酸にも強い耐性を示し、水中でも長期間生存できるという性質を有していることが原因と考えられる。

このため、非膜ウイルスであるノロウイルスに優れた抗非膜ウイルス効果を示す新たな薬剤の提供が、強く求められている（特許文献１および２）。このような問題は、ノロウイルスに限らず、他の非膜ウイルスについても同様である。

ＷＯ２０１０／０６７８７３ＪＰ２００９−２９２７３

そこで、本発明は、安全性および抗非膜ウイルス効果に優れる、抗非膜ウイルス剤の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の抗非膜ウイルス剤は、下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とする。
前記化学式（１）中、
Ｒ^１〜Ｒ^６は、それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたは直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基であり、同一でも異なっていてもよく、前記アシル基は、さらに１または複数の置換基で置換されていてもよく、前記Ｒ^１〜Ｒ^６の少なくとも１つが前記アシル基であり、Ｒ^７〜Ｒ^１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていてもよい。

本発明の非膜ウイルス感染防止方法は、非膜ウイルス感染を防止する方法であって、被検体に前記本発明の抗非膜ウイルス剤を投与することを特徴とする。

本発明によれば、非膜ウイルスの感染を、安全且つ効果的に防止できる。このため、本発明は、医療分野、食品衛生分野等において、有用といえる。

図１は、本発明の実施例１において、ネコカリシウイルスに対するＥＧＣＧ誘導体の抗非膜ウイルス効果を示すグラフである。図２は、本発明の実施例１において、ネコカリシウイルスに対するＥＧＣＧ誘導体の抗非膜ウイルス効果を示すグラフである。図３は、本発明の実施例２において、ロタウイルスに対するＥＧＣＧ誘導体の抗非膜ウイルス効果を示すグラフである。

＜抗非膜ウイルス剤＞
本発明の抗非膜ウイルス剤は、前述のように、下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレートの誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とする。
前記化学式（１）中、
Ｒ^１〜Ｒ^６は、それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたは直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基であり、同一でも異なっていてもよく、前記アシル基は、さらに１または複数の置換基で置換されていてもよく、前記Ｒ^１〜Ｒ^６の少なくとも１つが前記アシル基であり、Ｒ^７〜Ｒ^１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていてもよい。

なお、前記化学式（１）において、「Ａ〜Ｄ」は、エピガロカテキンガレートにおける各環の表記である。本発明において、以下、エピガロカテキンガレートは、「ＥＧＣＧ」といい、ＥＧＣＧの誘導体は、「ＥＧＣＧ誘導体」という。

本発明において、ＥＧＣＧ誘導体には、例えば、前記化学式（１）で表される化合物の塩、互変異性体、立体異性体、光学異性体、幾何異性体等の異性体、異性体混合物も含まれる。前記塩とは、特に制限されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩等があげられる。前記異性体は、例えば、各種クロマトグラフィー等の従来公知の分離方法により、精製することも可能である。また、本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、前記化学式（１）で表される化合物を、酸化、還元、加水分解、抱合等の代謝をうけて、生成する化合物も含む。

Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基の主鎖長は、特に制限されず、例えば、カルボニル炭素を含み原子数２〜２０であり、好ましくは４〜２０であり、より好ましくは８〜１８であり、さらに好ましくは１２〜１８、１４〜１８であり、特に好ましくは、１６〜１８である。なお、前記アシル基の主鎖長とは、アシル基において最も長い鎖の原子数をいい、例えば、前記炭素原子の他に、窒素原子、硫黄原子、リン原子、酸素原子、ホウ素原子等を含んでもよい。

Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基の原子数は、特に制限されない。前記アシル基の原子数（例えば、炭素原子数）は、例えば、カルボニル炭素を含み２〜２０であり、好ましくは４〜２０、より好ましくは８〜１８、さらに好ましくは、１２〜１８、１４〜１８であり、特に好ましくは１６〜１８である。また、前記原子数（例えば、炭素原子数）は、例えば、４、８、１２、１６、１８または２０であり、好ましくは１２、１６または１８であり、より好ましくは１６または１８である。なお、前記アシル基が、さらに前記置換基で置換されている場合、前記炭素原子数は、例えば、前記置換基の炭素原子数を含まない数であることが好ましい。また、前記不飽和アシル基は、例えば、シスでもトランスでもよい。

前記アシル基は、特に制限されず、例えば、ホルミル基（Ｃ１）、アセチル基（Ｃ２）、プロピオニル基（Ｃ３）、ブチリル基（Ｃ４）、イソブチリル基（Ｃ４）、バレリル基（Ｃ５）、イソバレリル基（Ｃ５）、ピバロイル基（Ｃ５）、ヘキサノイル基（Ｃ６）、オクタノイル基（Ｃ８）、ゲラノイル基（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエノイル基）（Ｃ１０）、トランス−８−メチル−６−ノネノイル基（Ｃ１０）、ウンデカノイル基（Ｃ１１）、ラウロイル基（ドデカノイル基）（Ｃ１２）、トリデカノイル基（Ｃ１３）、１２−（ジメチルアミノ）ラウロイル基（１２−（ジメチルアミノ）ドデカノイル基）（Ｃ１４）、ファルネソイル基（３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエノイル基）（Ｃ１５）、パルミトイル基（ヘキサデカノイル基）（Ｃ１６）、ヘプタデカノイル基（Ｃ１７）、ステアロイル基（オクタデカノイル基）（Ｃ１８）、リノレイル基（Ｃ１８）、リノレニル基（Ｃ１８）、ノナデカノイル基（Ｃ１９）、エイコサノイル基（イコサノイル基）（Ｃ２０）等があげられる。なお、列挙したアシル基のかっこ内の「Ｃ」は、カルボニル炭素を含む炭素原子数を示す。

前記アシル基の中でも、例えば、下記化学式に示すアシル基等が特に好ましい。下記アシル基のうち不飽和アシル基における不飽和結合の位置は、これらには制限されない。具体例として、トランス−８−メチル−ノネノイル基（Ｃ１０）の不飽和結合（二重結合）は、以下に示す６位には制限されず、例えば、２〜５位および７位のいずれであってもよい。

前記アシル基の種類は、特に制限されず、前述のように、不飽和のアシル基、飽和のアシル基のいずれであってもよい。前記アシル基における不飽和結合の数は、特に制限されず、例えば、１、２、３である。

前記化学式（１）において、前記アシル基の数は、特に制限されず、例えば、Ｒ^１〜Ｒ^６のうちいずれか１カ所のみが前記アシル基でもよいし、いずれか２カ所以上が前記アシル基でもよい。２カ所以上が前記アシル基の場合、各部位における前記アシル基は、例えば、同一でも異なってもよい。前記化学式（１）において、前記アシル基以外のＲは、特に制限されず、例えば、水素原子が好ましい。

前記化学式（１）において、Ｒ^１〜Ｒ^６のうち、アシル基の部位は、特に制限されない。具体例として、例えば、Ｂ環のＲ^１およびＲ^２ならびにＤ環のＲ^５およびＲ^６のうち少なくとも１カ所が前記アシル基を有することが好ましく、特に、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６のうちいずれか１カ所が前記アシル基を有することが好ましい。この際、前記アシル基以外のＲは、特に制限されず、例えば、水素原子が好ましい。

また、前記化学式（１）において、Ｂ環のＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３のうち少なくとも１カ所が前記アシル基であることが好ましく、より好ましくは、Ｂ環のＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３のうち１カ所のみがアシル基であることが好ましい。

前記化学式（１）において、Ｂ環は、例えば、Ｂ環とＣ環との間の単結合を軸に回転する。このため、Ｒ^１にアシル基を有する誘導体は、例えば、Ｒ^３にアシル基を有する誘導体と実質的に同一である。また、前記化学式（１）において、Ｄ環は、例えば、Ｄ環とエステルとの間の単結合を軸に回転する。このため、Ｒ^６にアシル基を有する誘導体は、例えば、Ｒ^４にアシル基を有する誘導体と実質的に同一である。

前記化学式（１）において、Ｒ^７〜Ｒ^１６は、前述のように、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていてもよく、例えば、下記化学式（２）に示すように、水素原子であることが好ましい。下記式（２）において、例えば、Ｒ^１〜Ｒ^６のいずれが前記アシル基であってもよい。具体例として、例えば、Ｒ^１〜Ｒ^６のうち、いずれか１カ所のみまたは２カ所以上が、前述したアシル基であることが好ましく、より好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６のうち、いずれか１カ所のみまたは２カ所以上が、前述したアシル基であることが好ましく、前記アシル基の中でも、例えば、ブチリル基、オクタノイル基、トランス−８−メチル−６−ノネノイル基、ゲラノイル基、ラウロイル基、１２−（ジメチルアミノ）ラウロイル基、ファルネソイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、リノレイル基、リノレニル基、または、エイコサノイル基が好ましい。

前記化学式（１）のＲ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基は、前述のように、１または複数の置換基で置換されてもよく、具体的には、例えば、前記アシル基の水素原子が、前記置換基で置換されてもよい。前記置換基は、特に制限されず、例えば、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基等があげられる。

前記アルキル基は、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはメチル基である。また、前記アルキルアミノ基におけるアルキル基は、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはメチルアミノ基である。前記ジアルキルアミノ基におけるアルキル基は、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基があげられ、好ましくはジメチルアミノ基である。これらは、同一でも異なっていてもよい。

本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンは、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素があげられる。また、本発明において、「アルキル基」とは、特に限定されない。前記アルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。アルキル基を構造中に含む基またはアルキル基から誘導される基（アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、アルコキシアルキル基、アルケノキシアルキル基等）についても同様である。

置換基等が鎖状構造を有する基の場合、具体的に、例えば、アルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、アルコキシアルキル基、アルケノキシアルキル基等の場合、特に制限しない限り、直鎖状でも分枝状でもよい。置換基等の一部に鎖状構造を含む場合、例えば、置換アルキル基または置換アリール基等における置換基が鎖状構造を含む場合も同様である。置換基等に異性体が存在する場合、特に制限しない限り、どの異性体でもよい。例えば、単に「プロピル基」という場合、n−プロピル基およびイソプロピル基のどちらでもよく、単に「ブチル基」という場合、n−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基およびｔｅｒｔ−ブチル基のいずれでもよく、単に「ナフチル基」という場合、１−ナフチル基および２−ナフチル基のどちらでもよい。

本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、１種類のＥＧＣＧ誘導体でもよいし、２種類以上のＥＧＣＧ誘導体の混合物でもよい。例えば、Ｒ^１〜Ｒ^６のうち異なる部位にアシル基を有する２種類以上のＥＧＣＧ誘導体の混合物でもよいし、異なるアシル基を有する２種類以上のＥＧＣＧ誘導体の混合物でもよい。具体例として、Ｂ環のＲ^１が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ^２が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ^３が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体のうち、いずれか２種類以上、または、３種類全てを含む混合物であってもよく、Ｄ環のＲ^４が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ^５が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体、Ｒ^６が前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体のうち、いずれか２種類以上、または、３種類全てを含む混合物であってもよい。また、Ｂ環のＲ^１〜Ｒ^３の少なくともいずれかが前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体と、Ｄ環のＲ^４〜Ｒ^６の少なくともいずれかが前記アシル基であるＥＧＣＧ誘導体との混合物であってもよい。

本発明の抗非膜ウイルス剤は、前述のように非膜ウイルスに対して使用できる。前記非膜ウイルスとは、いわゆるエンベロープ（膜）を有していないウイルスである。前記非膜ウイルスは、特に制限されず、例えば、ノロウイルス属、ネコカリシウイルス属、ロタウイルス属、ベータノダウイルス属、アクアビルナウイルス属、ラナウイルス属、エンテロウイルス属、マストアデノウイルス属およびベシウイルス属等があげられる。ネコカリシウイルス属の株は、特に制限されず、例えば、ＦＣＶ−Ｆ４、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−２５５、ＦＣＶ−２２８０、ＦＣＶ−Ｄｉｖａ、ＦＣＶ−Ｋａｏｓ、ＦＣＶ−Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−ＤＤ１、ＦＣＶ−２５５等があげられる。ロタウイルスの種類は、特に制限されず、内殻タンパク質（ＶＰ６）の抗原性に基づき分類する場合、例えば、Ａ群ロタウイルス、Ｂ群ロタウイルス、Ｃ群ロタウイルス、Ｄ群ロタウイルス、Ｅ群ロタウイルス、Ｆ群ロタウイルス、Ｇ群ロタウイルス等があげられる。

本発明の抗非膜ウイルス剤は、前記ＥＧＣＧ誘導体を含んでいればよく、その形態は、特に制限されない。前記形態は、例えば、溶液や分散液等の液体、固体、粉末等があげられる。また、剤形は、特に制限されず、例えば、投与方法に応じて適宜設定でき、液剤、カプセル剤、錠剤、粒剤（細粒剤）、散剤等があげられる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与、非経口投与があげられる。前記非経口投与は、例えば、経皮投与、腹腔内投与、静脈注射等の静脈内投与、筋肉投与、皮下注射等の皮下投与、直腸投与等があげられ、好ましくは、経皮投与である。本発明の抗非膜ウイルス剤は、特に制限されず、これらの投与形態に応じて、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む内服薬、舌下剤、点鼻薬、うがい薬、塗り薬等として投与できる。また、ＥＧＣＧ誘導体やそれを含む溶液または分散液として、例えば、注射、ネブライザー、吸引器等を用いて投与できる。また、前記ＥＧＣＧ誘導体やそれを含む粉末として、例えば、ネブライザー、吸引器等を用いて投与できる。また、本発明の抗非膜ウイルス剤は、非膜ウイルスの感染能力を低下できることから、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む、手洗い剤、ふき取り剤等の洗浄剤の形態もあげられる。このような本発明の抗非膜ウイルス剤によって、例えば、手や机等、非膜ウイルスが存在すると思われる箇所を処理することで、存在する非膜ウイルスの感染能力を低下させ、非膜ウイルス感染の予防を図ることも可能である。また、本発明の抗非膜ウイルス剤は、例えば、マスクに担持させてもよい。

本発明の抗非膜ウイルス剤は、例えば、非膜ウイルス感染の予防ならびに非膜ウイルス感染の治療に使用することができる。本発明の抗非膜ウイルス剤を投与する対象は、例えば、ヒト、または非ヒト動物があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、ブタ、フェレット、ラット、マウス、ウシ等の非ヒト哺乳類、アヒル、ニワトリ等の鳥類等があげられる。

本発明の抗非膜ウイルス剤において、前記ＥＧＣＧ誘導体の含有量は、特に制限されず、例えば、投与の目的や投与方法に応じて適宜決定できる。本発明の抗非膜ウイルス剤がうがい薬の場合、例えば、一回あたり２０〜２０００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ＥＧＣＧ誘導体を含むことが好ましい。また、本発明の抗非膜ウイルス剤が点鼻薬の場合、例えば、一回あたり２０〜２０００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ＥＧＣＧ誘導体を含むことが好ましい。

本発明の抗非膜ウイルス剤は、例えば、その剤形や投与方法に応じて、適宜、添加剤や基剤等をさらに含んでもよい。前記添加剤は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等があげられる。これらの添加割合は、特に制限されず、前記ＥＧＣＧ誘導体の効果を損なわない範囲で添加することができる。

本発明の抗非膜ウイルス剤は、さらに、その他の非膜ウイルス活性を有する物質を含んでもよく、具体例として、例えば、アルコール、ブロアントシアニン等の天然カテキン類があげられる。

本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体の製造方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、有機合成法、酵素等を利用する化学合成法等、従来公知の方法が採用できる。前記酵素を利用する化学合成法は、特に制限されず、例えば、ＷＯ２００７／１０５２８０に開示された、リパーゼを利用する方法があげられる。すなわち、有機溶媒中、ＥＧＣＧとアシル基供与体とを基質としてリパーゼにより酵素反応を行い、ＥＧＣＧをアシル化する方法である。この方法によれば、例えば、ＥＧＣＧを選択的にアシル化することができる。なお、以下に、一例として、リパーゼを使用する方法を例示するが、本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体の製造方法は、特に制限されない。

前記リパーゼは、例えば、ＩＵＢＮｏ．３．１．１．３．のリパーゼが使用できる。具体例として、Aspergillus niger等のAspergillus属由来リパーゼ；Candida rugosa、Candida cylindracea、Candida antarctica等のCandida属由来リパーゼ；Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas stutzeri等のPseudomonas属由来リパーゼ；Alcaligenes属由来リパーゼ；Burkholderia cepacia等のBurkholderia属由来リパーゼ；ブタ膵臓由来のリパーゼ等があげられる。これらは、従来公知の方法により調製することもできるが、例えば、Lipase AS“AMANO”、Lipase AYS“AMANO”、Lipase PS“AMANO”、Lipase AK“AMANO”20、Lipase AH“AMANO”（全て商品名：天野エンザイム社製）、Lipase MY、Lipase OF、Lipase PL、Lipase PLC、Lipase PLG、Lipase QLM、Lipase QLC、Lipase QLG、Lipase SL、Lipase TL（全て商品名：名糖産業社製）、Lipase PPL、L4777 Lipase acrylic resin from Candida Antarctica、L3126 Lipase from porcine pancreas（全て商品名：シグマアルドリッチ社製）等の市販品も使用できる。なお、各市販品の物理化学的性質は、それぞれの商品説明書に記載の通りであり、同様の物理化学的性質を示す酵素も同様に使用できる。

また、以下に示すような（１）〜（８）の何れかの物理化学的特性および酵素学的特性を有するリパーゼであってもよい。
（１）分子量３５，０００、等電点４．１０（例えば、Aspergillus niger由来）
（２）分子量６４，０００、等電点４．３０、８０℃１０分間の処理で不活性化（例えば、Candida rugosa由来）
（３）至適ｐＨ８、至適温度６０℃、ｐＨ４〜１０の範囲で特に安定、７０℃以下で特に安定（例えば、Pseudomonas fluorescens由来）
（４）分子量６０，０００、至適ｐＨ６〜７、ｐＨ安定性３〜８、至適温度４０〜５０℃、３７℃以下において溶液状態で特に安定（例えば、Candida cylindracea由来、Candida rugosa由来）
（５）分子量３０，０００、等電点４．５、至適ｐＨ８〜９．５、ｐＨ安定性７〜１０、至適温度５０℃、４０℃以下において特に安定（例えば、Alcaligenes属由来）
（６）分子量３１，０００、等電点４．９、至適ｐＨ７〜９、ｐＨ安定性６〜１０、至適温度６５〜７０℃、５０℃以下において特に安定（例えば、Alcaligenes属由来）
（７）分子量３１，０００、等電点５．２、至適ｐＨ７〜９、ｐＨ安定性６〜１０、至適温度６５〜７０℃、６０℃以下において特に安定（例えば、Pseudomonas cepacia由来、Burkholderia cepacia由来）
（８）分子量２７，０００、等電点６．６、至適ｐＨ７〜８、ｐＨ安定性６〜９、至適温度５０℃、４０℃以下において特に安定（例えば、Pseudomonas stutzeri由来）

前記有機溶媒は、特に制限されず、例えば、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用できる。また、例えば、疎水性を示すパラメータ（ｌｏｇＰ値）が−０．３５〜０．２８の範囲の有機溶媒でもよく、このような有機溶媒は、例えば、前述のアセトニトリル（ｌｏｇＰ値：−０．４５〜０．１９）、アセトン（ｌｏｇＰ値：−０．１６〜０．１９）、ＤＭＦ（ｌｏｇＰ値：−１．０１〜０．２８）、ＤＭＳＯ（ｌｏｇＰ値：−１．３５〜０．２８）があげられる。これらの他にも、前記パラメータを満たす従来公知の溶媒が使用できる。前記ｌｏｇＰは、溶媒固有の値であるため、当該技術分野における当業者であれば、前記パラメータを満たす溶媒を選択することが可能である。なお、ｌｏｇＰとは、目的物質をオクタノールと水との混合溶液に添加し、平衡に達した時のオクタノール層と水層とにおける前記目的物質の濃度比を常用対数で表示したものであり、前述のように、物質の疎水性を示すパラメータとして一般的である。

本発明において、アシル基（Ｒ−ＣＯ−）供与体は、例えば、カルボン酸ビニルエステル（Ｒ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ_２）があげられる。なお、前記アシル基は、前述のような直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基があげられる。

前記酵素反応溶液にＤＭＦを用いた場合、ＥＧＣＧの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。アシル基供与体の添加割合は、特に制限されず、例えば、反応液におけるＥＧＣＧの添加割合に応じて適宜決定できる。具体例として、ＥＧＣＧとアシル基供与体との添加割合（モル比）は、例えば、１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１〜１：５、より好ましくは１：１〜１：３である。また、反応液におけるリパーゼの添加割合は、例えば、ＥＧＣＧやアシル基供与体の添加割合、リパーゼの比活性等に応じて適宜決定でき、特に制限されず、例えば、ＥＧＣＧ１ｍｍｏｌ／Ｌに対して、例えば、５００〜５０,０００Ｕ／Ｌであり、好ましくは５００〜５,０００Ｕ／Ｌ、より好ましくは１,０００〜２,５００Ｕ／Ｌである。

酵素反応の条件は、特に制限されず、反応温度は、例えば、４５〜７５℃の範囲である。前記反応時間は、特に制限されず、基質や酵素の量によって適宜決定でき、例えば、３０分〜２４時間（１４４０分）であり、好ましくは１時間（６０分）〜３時間（１８０分）、より好ましくは１．５時間（９０分）〜３時間（１８０分）である。

前記反応液には、さらに、塩基性触媒を添加してもよい。前記塩基性触媒は、例えば、トリエチルアミン等の３級アミン、ピリジン等があげられる。反応液における塩基性触媒の添加割合は、特に制限されず、例えば、５〜７２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１２〜２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１２〜４８ｍｍｏｌ／Ｌである。

ＥＧＣＧにおいて前記アシル基が導入される位置は、例えば、使用するリパーゼの種類によって選択できる。また、ＥＧＣＧに導入するアシル基の数は、例えば、使用する有機溶媒の種類や反応時間によって決定することが可能である。例えば、有機溶媒の疎水性が相対的に高い程（親水性が相対的に低い程）、導入されるアシル基の数を相対的に低減でき、有機溶媒の親水性が相対的に高い程（疎水性が相対的に低い程）、導入されるアシル基の数を相対的に増加できる。また、２種類以上の有機溶媒を混合して用いることによっても、導入されるアシル基の数を調節することができる。具体例として、例えば、１個のアシル基を導入する際には、アセトニトリル等を使用することが好ましく、例えば、１〜２個のアシル基を導入する際には、アセトン、アセトニトリル等を使用することが好ましく、例えば、３〜５個のアシル基を導入する際には、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等を使用することが好ましい。

さらに、同じ有機溶媒を用いる場合でも、温度時間や反応温度の制御と組合せること等によって、導入するアシル基の数を調節することもできる。以下にその例を示すが、これには限定されない。ＤＭＦを使用する場合、例えば、反応温度を約５７℃〜約７０℃の範囲に設定し、反応温度を長くする（例えば、約３〜５時間）ことによって、ＥＧＣＧに２個のアシル基が選択的に導入された誘導体を優先的に得ることができ、他方、反応温度を低下させ（例えば、５７℃から約５℃低い温度）、反応時間を短くする（例えば、約１〜３時間）ことによって、１個のアシル基を選択的に導入することができる。また、アセトンとＤＭＦとを同量（質量）混合した混合溶媒を使用することによっても、ＥＧＣＧに１個のアシル基を選択的に導入することができる。

また、導入するアシル基の数は、反応液に前述の塩基性触媒を添加することによって増加させることができる。この場合、ＥＧＣＧにおけるどの部位にアシル基がさらに導入されるかは、例えば、リパーゼの位置選択性に依存する。

前記酵素反応によるＥＧＣＧ誘導体の収率は、例えば、反応温度を相対的に高く設定することによって、相対的に向上させることができる。反応温度は、通常、前述のように、４５〜７５℃であるが、収率向上の点から、好ましくは５７〜７５℃であり、より好ましくは５７〜７０℃である。特に、反応温度が、５７〜７０℃の場合、前記ＥＧＣＧアシル化誘導体の収率は、約３５〜４５％を実現することが可能である。なお、前記収率とは、反応に使用したＥＧＣＧを１００％とした場合のＥＧＣＧアシル化誘導体（例えば、全モノアシル化誘導体）の割合（変換効率）を意味する。

本発明において、前記ＥＧＣＧ誘導体は、例えば、前述のように、いずれか１種類のＥＧＣＧ誘導体でもよいし、２種類以上のＥＧＣＧ誘導体の混合物でもよい。前記混合物から１種類のＥＧＣＧ誘導体を単離する場合は、例えば、クロマトグラフィー等を用いる従来公知の方法により、調製可能である。

＜感染防止方法＞
本発明の感染防止方法は、非膜ウイルス感染を防止する方法であって、被検体に前述のＥＧＣＧ誘導体を投与することを特徴とする。本発明においては、前記ＥＧＣＧ誘導体を使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、特に制限されない。前記ＥＧＣＧ誘導体やその使用方法等は、例えば、前述と同様である。また、本発明においては、前記ＥＧＣＧ誘導体として、例えば、前記本発明の抗非膜ウイルス剤を投与してもよい。

本発明において、被検体は、特に制限されず、前述と同様であり、ヒトまたは非ヒト動物があげられる。また、前記被検体は、例えば、生体そのものでもよいし、生体から採取した細胞や組織、それらの培養物でもよい。

前記被検体が生体の場合、前記投与方法は、特に制限されず、例えば、非経口投与および経口投与があげられる。前記非経口投与は、例えば、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与等があげられ、好ましくは、経皮投与である。前記非経口投与の場合、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を、内服、点鼻、うがい、注射、ネブライザーや吸引器等を用いて投与できる。また、前記経皮投与の方法は、例えば、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む洗浄剤による手洗い、前記ＥＧＣＧ誘導体を含む拭き取り剤等による拭き取り等も含まれる。

また、前記被検体が生体から採取した細胞や組織等の場合、前記投与方法は、特に制限されず、例えば、培地等への添加があげられる。

前記被検体に対する前記ＥＧＣＧ誘導体の投与時期は、特に制限されず、例えば、前記非膜ウイルス感染前でもよいし、前記非膜ウイルス感染後でもよい。

＜エピガロカテキンガレート誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩の使用＞
本発明は、非膜ウイルス感染を防止するための前記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩である。また、本発明は、非膜ウイルス用医薬の製造のための前記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩の使用である。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。

［実施例１］
（１）ＥＧＣＧ誘導体の調製
抗非膜ウイルス剤として、下記方法によりＥＧＣＧ誘導体を調製した。

ＤＭＦ１００ｍＬに、ＥＧＣＧ１ｇ、以下に示すアシル基供与体９２７ｍｇおよびリパーゼ（商品名ＬｉｐａｓｅＰＬ、名糖産業社製）５００００Ｕを混合し、５７℃で２時間インキュベートして酵素反応を行った。

そして、インキュベート後の反応液をろ過、濃縮後、カラムクロマトグラフィー（球状、中性、４０−５０μｍ、商品名ＳｉｌｉｃａｇｅｌＮ６０、関東化学株式会社製）に供し、不純物である未反応アシル基供与体を除去した。得られた反応生成物についてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った結果、ＥＧＣＧのＢ環のＲ^１もしくはＲ^２、または、Ｄ環のＲ^５もしくはＲ^６に、エステル結合によって、前記表１に示すアシル基が１個（Ｎｏ．１〜４）導入されたモノエステル、前記アシル基が２個（Ｎｏ．５〜７）導入されたジエステルであることが確認できた。

さらに、前記モノエステルについて、ＥＧＣＧのどの位置がエステル化されたかを確認するため、前記反応生成物をプロトン核磁気共鳴（Ｈ^１ＮＭＲ）で分析した。この結果を下記表に示す。

前記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．７のアシル基が導入されたＥＧＣＧ誘導体を、以下、それぞれ、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１８ＤＥ、Ｃ１８ＴＥ、Ｃ１２×２、Ｃ１６×２、Ｃ１８ＤＥ×２という。これらのＥＧＣＧ誘導体は、前記化学式（２）に示すＥＧＣＧ誘導体であり、前記各部位（Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５またはＲ^６）が、前記表２に示す構造式のアシル基である。これらのＥＧＣＧ誘導体を用いて、以下の実験を行った。

（２）既知抗ウイルス剤との比較
前記ＥＧＣＧ誘導体Ｎｏ．１（Ｃ１６）をＤＭＳＯに溶解後、滅菌水で希釈し、前記ＥＧＣＧ誘導体４０μｍｏｌ／Ｌ、２％ＤＭＳＯのサンプル液を調製した。前記サンプル液８００μＬに、０．２％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで懸濁した１×１０^６ｐｆｕ／ｍＬのネコカリシウイルス（Ｆ−９型ネコカリシウイルス）２００μＬを添加し、混合した後、２０℃で３０秒間反応させた。次に、前記反応液を０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１０００倍希釈した。

他方、ネコ腎臓培養細胞（ＣＲＦＫ）を、１０％ＦＣＳ含有ＥＭＥＭ培地を入れた６ウェルプレートでＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した。前記プレートから前記培地を除去し、得られた細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前記希釈後のサンプル液１ｍＬをアプライした。そして、３７℃下で１時間インキュベートした後、６．０ｘ１０^−４％Ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．２％ＢＳＡを含有する０．８％アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ_２存在下、３７℃で５２−６０時間インキュベートした後、前記細胞シートに現れたプラーク数をカウントした。コントロールとして、前記ＥＧＣＧ誘導体無添加の状態で、同様にして、プラーク数のカウントを行った。そして、前記コントロール（ＥＧＣＧ誘導体無添加：０μｍｏｌ／Ｌ）のプラーク数を１００％として、プラーク形成比（％）を算出した。プラーク形成比（％）は、ウイルス感染力価（％）を意味する。

比較例は、前記ＥＧＣＧ誘導体に代えて、公知の抗ウイルス剤である、アシル基未導入のＥＧＣＧ、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジンを使用した以外は、同様の処理を行った。なお、前記ＥＧＣＧ誘導体の前記サンプル液に代えて、前記ＥＧＣＧは、４０μｍｏｌ／Ｌの液を、塩化ベンザルコニウムは、０．２％液を、クロルヘキシジンは、０．５％液を用いた。

これらの結果を、図１に示す。図１は、ウイルス感染力価（％）を示すグラフであり、値が相対に低い程、抗非膜ウイルス効果が優れることを意味する。図１に示すように、前記ＥＧＣＧ誘導体Ｃ１６は、コントロール（２％ＤＭＳＯ）および公知の抗ウイルス剤と比較して、各段に優れる抗非膜ウイルス効果を示した。この結果から、公知の抗ウイルス剤では、非膜ウイルスの感染防止が困難であるが、本発明の抗非膜ウイルス剤によれば、効果的に非膜ウイルスの感染を防止できることが分かった。

（３）抗非膜ウイルス効果
前記（２）と同様にして、各ＥＧＣＧ誘導体のサンプル液を調製し、ウイルス感染力価（％）を測定した。

これらの結果を、図２に示す。図２は、ウイルス感染力価（％）を示すグラフであり、値が相対に低い程、抗非膜ウイルス効果が優れることを意味する。図２に示すように、前記各ＥＧＣＧ誘導体は、コントロール（２％ＤＭＳＯ）および公知の抗ウイルス剤と比較して、各段に優れる抗非膜ウイルス効果を示した。特に、モノエステルは、炭素数１６以上の不飽和アシル基および飽和アシル基のモノエステル（Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１８ＤＥ、Ｃ１８ＴＥ）が、より優れた効果を示し、また、ジエステルは、炭素数が１６以上のアシル基のジエステルが、より優れた効果を示した。

［実施例２］
（１）ＥＧＣＧ誘導体の調製
抗非膜ウイルス剤として、Ｎｏ．８およびＮｏ．９のアシル基が導入されたＥＧＣＧ誘導体を、前記実施例１（１）と同様にして調製した。

そして、得られた反応生成物についてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った結果、ＥＧＣＧに、エステル結合によって、前記表３に示すアシル基が１個（Ｎｏ．８）導入されたモノエステル、前記アシル基が２個（Ｎｏ．９）導入されたジエステルであることが確認できた。

そして、前記実施例１の前記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．７のアシル基が導入されたＥＧＣＧ誘導体、ならびに前記Ｎｏ．８およびＮｏ．９のアシル基が導入されたＥＧＣＧ誘導体を用いて、以下の実験を行った。

（２）抗ロタウイルス活性
前記ＥＧＣＧおよび前記ＥＧＣＧ誘導体（Ｃ１２、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１８ＤＥ、Ｃ１８ＴＥ、Ｃ８ｘ２、Ｃ１２ｘ２、Ｃ１６ｘ２）を、それぞれＤＭＳＯに溶解後、滅菌水で希釈し、前記ＥＧＣＧ誘導体４０μｍｏｌ／Ｌ、２％ＤＭＳＯのサンプル液を調製した。他方、ロタウイルス（Ｗａ株）は、１０μｇ／ｍＬトリプシン含有ＥＭＥＭにおいて、３７℃で１時間インキュベートし、活性化処理した。そして、前記処理液を、トリプシン濃度が２μｇ／ｍＬとなるようＥＭＥＭで希釈し、１×１０^４ｐｆｕ／ｍＬのロタウイルス液を調製した。前記サンプル液１３５ｕＬに、前記ロタウイルス液１５μＬを添加し、混合した後、２０℃で１０分間反応させた。つぎに、前記反応液を、１μｇ／ｍＬトリプシン含有ＥＭＥＭで１０倍希釈した。

他方、アカゲザル胎児腎細胞（ＭＡ１０４）を、１０％ＦＣＳ含有ＥＭＥＭ培地を入れた６ウェルプレートでＣｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養した。前記プレートから前記培地を除去し、得られた細胞シートをＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前記希釈後のサンプル液１ｍＬをアプライした。そして、３７℃下で１時間インキュベートした後、１．０μｇ／ｍＬトリプシンおよび０．０１％ＤＥＡＥデキストランを含有する０．６％精製アガロースゲルを前記細胞シートに重層した。さらに、ＣＯ_２存在下、３７℃で５２−６０時間インキュベートした後、前記細胞シートに現れたプラーク数をカウントした。コントロールとして、前記ＥＧＣＧ誘導体無添加（２％ＤＭＳＯ）の状態で、同様にして、プラーク数のカウントを行った。そして、前記コントロール（ＥＧＣＧ誘導体無添加：０μｍｏｌ／Ｌ）のプラーク数を１００％として、プラーク形成比（％）を算出した。プラーク形成比（％）は、ウイルス感染力価（％）を意味する。

これらの結果を図３に示す。図３は、ウイルス感染力価（％）を示すグラフであり、値が相対に低い程、抗非膜ウイルス効果が優れることを意味する。図３に示すように、前記各ＥＧＣＧ誘導体は、コントロール（２％ＤＭＳＯ）およびＥＧＣＧと比較して、各段に優れる抗非膜ウイルス効果を示した。特に、モノエステルは、炭素数１２以上の不飽和アシル基および飽和アシル基のモノエステル（Ｃ１２、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１８ＤＥ、Ｃ１８ＴＥ）が、より優れた効果を示した。また、ジエステルは、炭素数が１２以上のアシル基のジエステルが、より優れた効果を示し、さらに、炭素数が長くなるにつれて、抗非膜ウイルス効果が向上した。

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

この出願は、２０１３年３月２８日に出願された日本出願特願２０１３−０７００３１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims

下記化学式（１）で表されるエピガロカテキンガレート誘導体、もしくはその異性体またはそれらの塩を含むことを特徴とする、抗非膜ウイルス剤。
前記化学式（１）において、
Ｒ^１〜Ｒ^６は、
それぞれ水素原子、ハロゲン、ナトリウム、カリウムまたは直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和アシル基であり、同一でも異なっていてもよく、
前記アシル基は、さらに１または複数の置換基で置換されていてもよく、
前記Ｒ^１〜Ｒ^６の少なくとも１つが前記アシル基であり、
Ｒ^７〜Ｒ^１６は、水素原子、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、同一でも異なっていてもよい。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基の主鎖長が、原子数１２〜１８である、請求項１記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基の主鎖長が、原子数１６〜１８である、請求項１または２記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アシル基の炭素数が、原子数８〜１８である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６の少なくとも１つが、前記アシル基である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６の少なくとも１つが、前記アシル基であり、その他が、水素原子である、請求項５記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６の少なくとも２つが、前記アシル基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^６の少なくとも２つが、前記アシル基であり、その他が、水素原子である、請求項７記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^７〜Ｒ^１６が、水素原子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ ^１〜Ｒ ^６の１つが、炭素数１２以上の不飽和アシル基もしくは飽和アシル基である、またはＲ ^１〜Ｒ ^６の２つが、炭素数１２以上のアシル基である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ ^１〜Ｒ ^６において、前記アシル基の炭素数が、原子数１２〜１８である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
前記アシル基が、直鎖飽和アシル基である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
前記アシル基が、ブチリル基、オクタノイル基、トランス−８−メチル−６−オクテノイル基、ゲラノイル基、ラウロイル基、１２−（ジメチルアミノ）ラウロイル基、ファルネソイル基、パルミトイル基、ステアロイル基（Ｃ１８）、リノレイル基、エイコサノイル基およびそれらの異性体からなる群から選択された少なくとも１つのアシル基である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
前記アシル基が、ラウロイル基、パルミトイル基、ステアロイル基（Ｃ１８）、リノレイル基、およびリノレニル基からなる群から選択された少なくとも１つのアシル基である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記置換基が、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アルキル基が、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基であり、前記アルキルアミノ基におけるアルキル基が、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基であり、前記ジアルキルアミノ基におけるアルキル基が、炭素原子数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基であり、同一でも異なっていてもよい、請求項１５記載の抗非膜ウイルス剤。
Ｒ^１〜Ｒ^６において、前記アルキル基がメチル基であり、前記アルキルアミノ基がメチルアミノ基であり、前記ジアルキルアミノ基がジメチルアミノ基である、請求項１５または１６記載の抗非膜ウイルス剤。
前記抗非膜ウイルス剤が、ノロウイルス属、ネコカリシウウイルス属、ロタウイルス属、ベータノダウイルス属、アクアビルナウイルス属、ラナウイルス属、エンテロウイルス属、マストアデノウイルス属およびベシウイルス属からなる群から選択された少なくとも１つのウイルスに対する抗非膜ウイルス剤である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤。
非膜ウイルス感染を防止する方法であって、
非ヒト動物に請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗非膜ウイルス剤を投与することを特徴とする、非膜ウイルス感染防止方法。