JP6383334B2 - β‐セクレターゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品 - Google Patents
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特許文献2では、安全性の高いβ−セクレターゼ阻害剤を得るために、例えばコショウ、ゴマ、ターメリック等のスパイスとして一般的に用いられる天然物からβ−セクレターゼ阻害剤が抽出されている。特許文献2ではさらに抽出物に含まれる化合物の内β−セクレターゼ阻害活性を示す化合物が特定されている。
セサモリンはゴマの種子からヘキサン及び酢酸エチルによって好適に抽出される。その理由は、ゴマの種子をヘキサン及び酢酸エチルで抽出することにより、セサモリンを多く溶出させることができるからである。
エチル4−メトキシシンナメートはガランガルの根茎からヘキサンによって好適に抽出される。その理由は、ガランガルの根茎をヘキサンで抽出することにより、エチル4−メトキシシンナメートを多く溶出させることができるからである。
ピパタリンはヒハツの果実からヘキサン及び酢酸エチルによって好適に抽出される。その理由は、ヒハツの果実をヘキサン及び酢酸エチルで抽出することにより、エチル4−メトキシシンナメートを多く溶出させることができるからである。
このうち、賦形剤としては、これらに限定されないが例えば、微粒子二酸化ケイ素のような粉末類、ショ糖脂肪酸エステル、結晶セルロース・カルボキシメチルセルロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、小麦デンプン,米デンプン,トウモロコシデンプン,バレイショデンプン,デキストリン,シクロデキストリン等のでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖,ブドウ糖,砂糖,還元麦芽糖,水飴,フラクトオリゴ糖,ガラクトオリゴ糖,大豆オリゴ糖,イソマルトオリゴ糖,キシロオリゴ糖,マルトオリゴ糖,乳果オリゴ糖などの糖類、ソルビトール,エリストール,キシリトール,ラクチトール,マンニトール等の糖アルコール類が挙げられる。これらの賦形剤は、単独で又は二種以上組み合わせて使用することができる。
ゴマの種子1kgを粉砕し、40℃のヘキサン5000mlで1時間の攪拌抽出を行い、上澄み液4200mlをろ紙でろ過した。
次いで、その残渣に40℃のヘキサン2500mlで0.5時間の攪拌抽出を行い、ろ紙でろ過した。得られた抽出液に含まれる溶媒をエバポレーター(40℃)で留去し、ゴマのヘキサン抽出物を得た。
ヒハツの果実及びガランガルの根茎からも、同様の方法でヘキサン抽出物を得た。
ゴマのヘキサン抽出後の残渣を乾燥させ、40℃の酢酸エチル5000mlで1時間撹拌抽出し、上澄み液4800mlをろ紙でろ過した。次いで、残渣に40℃の酢酸エチル2500mlを加えて0.5時間撹拌抽出し、ろ紙でろ過した。得られた抽出液に含まれる溶媒をエバポレーター(40℃)で留去し、ゴマの酢酸エチル抽出物を得た。
ヒハツの果実からも、同様の方法で酢酸エチル抽出物を得た。
それぞれのヘキサン抽出物及び酢酸エチル抽出物の収率を以下の表1に示す。
上記のように抽出したヘキサン抽出物及び酢酸エチル抽出物の酵素阻害活性を、以下の方法により検討した。また、Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Pheを陽性対照として用いた。
具体的には、まず各抽出物及び陽性対照について、それぞれを含むDMSO溶液2μlを、0.02M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5、0.1%Triton X−100)78μlとともに0.6mlサンプルチューブに入れた。コントロールとして2μlのDMSOを上記の78μlの0.02M酢酸ナトリウム緩衝液とともに0.6mlサンプルチューブに入れた。
その後、酵素溶液(β−セクレターゼ、17.4 μg protein/ml)10 μlを入れて混合し、37℃で10分間前培養した。
基質としてMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH2 0.1 mmol/l溶液を10 μl加えて混合し、37℃で1時間培養した。反応後,2.5 M 酢酸ナトリウム溶液50 μlを加え、反応を停止させた。
・カラム;L-column ODS (4.6 id × 250 mm)
・移動相;water / 0.1% formic acid : acetonitrile(9:1 v/v)→17.50 min(11:9,v/v)→17.51 min(1:19,v/v)→22.50 min(1:19,v/v)→22.51(9:1,v/v)→27.50 min(STOP)
・カラム温度;40℃
・検出;Ex. 325 nm / Em. 395 nm
・注入量;20 μl
生成した蛍光ペプチド断片のピーク面積値から,下記の式より阻害率(%)を算出した。
β−セクレターゼ阻害率(%)= 100−〔(各抽出物由来のピークの面積値/コントロール由来のピーク面積値)×100〕
ゴマの酢酸エチル抽出物から、以下のHPLC条件でセサモリンを単離した;L-column ODS(4.6 i.d. × 20 mm),カラム温度:40℃,移動相 水:メタノール(30:70,v/v),流速:18.9 ml/分,検出:286 nm。セサモリンの保持時間(tR)は16.15分であり、収率は0.23%であった。
図1は、エチル4−メトキシシンナメートをガランガルのヘキサン抽出物から単離する工程を示す図である。
図1に示す如く、エチル4−メトキシシンナメートの単離を行った。
具体的には、ガランガルのヘキサン抽出物(5.0g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(No. 107734 silica gel 60,Merck,5.0 i.d. × 50 cm)に付した。以下のヘキサン/酢酸エチル混合溶媒系で溶出し、各画分を得た。
・画分1(ヘキサン:酢酸エチル(1:0,v/v))
・画分2(ヘキサン:酢酸エチル(20:1,v/v))
・画分3(ヘキサン:酢酸エチル(10:1,v/v))
・画分4(ヘキサン:酢酸エチル(5:1,v/v))
・画分5(ヘキサン:酢酸エチル(2:1,v/v))
・画分6(ヘキサン:酢酸エチル(0:1,v/v))
・カラム;Intertcap Pure Wax (0.25 i.d. × 0.25 μm × 60 m)
・注入量;1.0 μl
・昇温;50℃で2分保持、2.5℃昇温/分→240℃まで
・気化室温;250℃
・キャリーガス流量;ヘリウム 1.2 ml/分
・スプリット比;1/80
GCMS分析の結果から付属のライブラリー検索(wiley7nおよびNIST08)で化合物をエチル4−メトキシシンナメートと同定した。
画分5は、エチル4−メトキシシンナメートを90%含有していた。
図2は、ピパタリンをヒハツのヘキサン抽出物から単離する工程を示す図である。
図2に示す如く、ピパタリンの単離を行った。
具体的には、まずヒハツのヘキサン抽出物(5.0g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(No. 107734 silica gel 60,Merck,5.0 i.d. × 50 cm)に付した。以下のヘキサン/酢酸エチル混合溶媒系で流出し、各画分を得た。
・画分1(ヘキサン:酢酸エチル(1:0,v/v))
・画分2(ヘキサン:酢酸エチル(20:1,v/v))
・画分3(ヘキサン:酢酸エチル(10:1,v/v))
・画分4(ヘキサン:酢酸エチル(5:1,v/v))
・画分5(ヘキサン:酢酸エチル(2:1,v/v))
・画分6(ヘキサン:酢酸エチル(0:1,v/v))
カラム:YMC-Pack ODS-AM323(10 i.d. × 250 mm),カラム温度:40℃,移動相 水:アセトニトリル(1:1,v/v),→15.00分(0:1,v/v)→20.00分(0:1,v/v)→25.00分(1:1,v/v)→30.00分(1:1,v/v)→30.01(停止),流速:1.0 ml/分,検出;260 nm。
画分2の有効成分として無色結晶を単離した。
1H-NMRより、δ =5.84 (2H,s) にジオキソ−ル、6.81 (1H,d,J =1.6 Hz)、6.72 (2H,m,J =1.6 Hz) にベンゼン環プロトン、δ = 6.21 (1H,t,J =1.2 Hz)、5.97 (1H,m,J =3 Hz) に二重結合、δ =0.79 (3H,t,7.6 Hz) にメチルを示したため、文献値(Chibuike C他、Glutathion S-Transferase Inhibitiong Chemical Constituents of Caesalpinia bonduc ,Chem.Pharm.Bull.55(3)442-445(2007))との比較からピパタリンと同定した。
セサモリン:0.14mM
エチル4−メトキシシンナメート:0.676mM
ピパタリン:0.304mM
上記IC50値により、セサモリン、ピパタリン及びエチル4−メトキシシンナメートが、非常に高いβ‐セクレターゼ阻害活性を有することがわかった。
Claims (6)
- セサモリン、エチル4−メトキシシンナメート、ピパタリンからなる群から選択される1以上の化合物のみを有効成分として含有するβ‐セクレターゼ阻害剤。
- セサモリンが、ゴマの抽出物から得られるものであることを特徴とする請求項1記載のβ‐セクレターゼ阻害剤。
- エチル4−メトキシシンナメートが、ガランガルの抽出物から得られるものであることを特徴とする請求項1記載のβ‐セクレターゼ阻害剤。
- ピパタリンが、ヒハツの抽出物から得られるものであることを特徴とする請求項1記載のβ‐セクレターゼ阻害剤。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載のβ‐セクレターゼ阻害剤を含む、β‐セクレターゼ阻害用の医薬製剤。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含む、β‐セクレターゼ阻害用の飲食品。
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