JP6348976B2 - 検体評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、検体評価方法に関し、特に、生検において採取された検体が検査に適しているか否かを、検体に含まれる細胞数に基づいて評価する方法に関するものである。

生検においては、検査に必要な量の検体を確実に採取することが重要である。もし検体の採取量が不十分であった場合には正確な検査結果を得ることができず、検体の再採取および再検査が必要となる。しかしながら、検査対象がマイクロメートルスケールの細胞である場合には、検体の量が十分であるか否かを目視のみで確認することが難しい。そこで、検体を懸濁した液体の濁度を測定することによって、採取された検体中の細胞数を確認する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。

特表２０１２−５２９０４８号公報

しかしながら、検体が、細胞以外にも様々な他の生体物質、例えば、血液成分や組織成分等を含む混合試料である場合、濁度の測定において他の生体物質に由来する濁度が高いバックグラウンドとなる。このような場合には、細胞に由来する正確な濁度を知ることが難しく、検体の採取量が十分であるか否かを正確に判断することができないという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、検体が細胞と他の生体物質との混同試料であっても、十分な細胞を含む検査に適切な検体であるか否かを正確に評価することができる検体評価方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体から採取された検体を含む測定液を撹拌することによって、前記検体に含まれる細胞を前記測定液中に均一に分散させる撹拌工程と、該撹拌工程における撹拌終了後、前記測定液の所定の深さ位置における濁度を第１の時刻において測定する測定工程と、前記第１の時刻から時間間隔を空けた第２の時刻において、前記測定液の前記所定の深さ位置における濁度を再度測定する再測定工程と、前記測定工程において測定された濁度と前記再測定工程で測定された濁度との差分を算出する変化算出工程と、前記変化算出工程において算出された濁度の差分に基づいて前記細胞の数を推定し、前記検体の良否を評価する評価工程とを含む検体評価方法を提供する。

本発明によれば、撹拌工程において撹拌された測定液の同一の深さ位置における細胞の密度を、時間間隔を空けて２回、測定工程と再測定工程とで測定する。測定液中の細胞は時間の経過に伴って沈降するので、測定液の各深さ位置における細胞の密度は、継時的に変化する。したがって、測定工程と再測定工程とでは、互いに異なる細胞の密度の測定値が得られる。ここで、検体が、細胞以外にも他の生体物質を含む混合試料である場合に、測定工程と再測定工程とで得られる測定値には、正味の細胞の密度の測定値に加えて、他の物質に由来するバックグラウンド値が含まれる。

細胞は他の生体物質に比べてはるかに重く、細胞の沈降速度に比べて他の生体物質の沈降速度は、無視できる程度に極めて小さい。すなわち、２回の測定で得られた２つの測定値に含まれるバックグラウンド値は、互いに同一となる。したがって、変化算出工程において、２つの測定値の差分を算出することによって、バックグラウンド値の影響を除去した、第１の時刻から第２の時刻までの正確な細胞の密度の時間変化量が検出される。細胞の密度の時間変化量は、検体に含まれる細胞数と相関する。評価工程においては、変化算出工程において得られた測定値の差分から、検体に含まれる正確な細胞数を推定し、推定された細胞数に基づいて、検体が検査に適したものであるか否かを正確に評価することができる。

上記発明においては、前記測定工程および前記再測定工程において、前記測定液の前記所定の深さ位置における濁度を測定し、前記変化算出工程において、前記測定工程において得られた濁度と、前記再測定工程において得られた濁度との差分を算出する。
このようにすることで、測定液の濁度は測定液中の細胞の密度に対して正比例するので、濁度に基づいて、細胞の密度を非接触にかつ簡単に測定することができる。

上記発明の参考例においては、前記測定工程および前記再測定工程において、前記測定液の前記所定の深さ位置における画像を取得し、前記変化算出工程において、前記測定工程において取得された画像と、前記再測定工程において取得された画像との間で変化している領域の面積を算出してもよい。
このようにすることで、測定液の画像には測定液中の細胞の像が含まれるので、画像内の細胞の数に基づいて、細胞の密度を非接触にかつ簡単に測定することができる。

上記発明においては、前記所定の深さ位置が、測定容器に収容された前記測定液の底面もしくはその近傍、または、液面もしくはその近傍であることが好ましい。
このようにすることで、細胞の密度の単位時間当たりの変化量が最も大きくなる底面もしくは液面、またはこれら近傍において細胞の密度を測定することによって、細胞の密度の時間変化量を高精度に検出することができる。

上記発明においては、前記第１の時刻は、前記撹拌工程における撹拌終了直後であることが好ましく、前記第２の時刻は、前記撹拌工程における撹拌終了から１２０秒以内であることが好ましい。
測定液中の細胞の沈降は、測定液の撹拌終了直後から始まり、細胞の密度の時間変化率は時間の経過とともに小さくなる傾向にある。したがって、撹拌終了直後に１回目の測定を行い、撹拌終了後１２０秒以内に２回目の測定を行うことによって、細胞の密度の時間変化量を高精度に検出することができる。

上記発明においては、前記第１の時刻と前記第２の時刻との時間間隔は、１０秒以上１２０秒以下であることが好ましい。
このようにすることで、細胞の密度の時間変化量の検出精度と作業効率とを両立することができる。２回の測定の時間間隔が１０秒未満である場合には、細胞の密度の時間変化量が小さ過ぎて検体を正確に評価できない可能性がある。一方、２回の測定の時間間隔を１２０秒よりも長く確保したとしても、得られる細胞の密度の時間変化量のそれ以上の増大を期待できない。

本発明によれば、細胞以外の物質が含まれている検体についても、十分な細胞を含む検査に適切な検体であるか否かを評価することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る検体評価方法を示すフローチャートである。 図１の測定工程および再測定工程で使用される分光光度計の概要図である。 本発明の参考実施形態に係る検体評価方法を示すフローチャートである。 図３の測定工程および再測定工程で使用される明視野光学顕微鏡の概要図である。 本発明の実施例において測定された、サンプルＡおよび対照サンプルの波長４００，６００，８００ｎｍにおける吸光度の時間変化量を示すグラフである。 サンプルＡおよび対照サンプルの、波長６００ｎｍにおける吸光度の時間変化の詳細を示すグラフである。 本発明の実施例において使用した（ａ）サンプルＡおよび（ｂ）対照サンプルから作成したスライド標本の光学顕微鏡画像である。 参考実施例で取得されたサンプルＡの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 参考実施例で取得されたサンプルＢの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 参考実施例で取得されたサンプルＣの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 参考実施例で取得されたサンプルＤの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 参考実施例で取得されたサンプルＥの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 参考実施例で取得された対照サンプルの（ａ）０秒および（ｂ）６０秒における明視野画像と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の明視野画像から生成した差分画像である。 サンプルＡの（ａ）０秒、（ｂ）１０秒、（ｃ）３０秒および（ｄ）６０秒における明視野画像である。 図８から図１３の差分画像から抽出した変化領域の画素の数Δｐｉｘｅｌを示す図表である。 サンプルＣ，Ｄ，Ｅの細胞密度（縦軸）とΔｐｉｘｅｌ（横軸）との関係を示すグラフである。 参考実施例において使用した（ａ）サンプルＡ、（ｂ）サンプルＢおよび（ｃ）対照サンプルから作成したスライド標本の光学顕微鏡画像である。

（本発明の一実施形態）
以下に、本発明の一実施形態に係る検体評価方法について図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る検体評価方法は、図１に示されるように、検体に含まれる細胞を測定液Ｘ中に均一に分散させる撹拌工程ＳＡ１と、測定液Ｘの濁度を測定する測定工程ＳＡ２と、該測定工程ＳＡ２の後に時間間隔を空けて測定液Ｘの濁度を再度測定する再測定工程ＳＡ３と、測定工程ＳＡ２と再測定工程ＳＡ３とで得られた濁度の差分を算出する変化算出工程ＳＡ４と、得られた濁度の差分に基づいて、検体が検査に適しているか否かを評価する評価工程ＳＡ５，ＳＡ６，ＳＡ７とを含んでいる。

本実施形態で使用する検体は、例えば、前立腺等の生体組織から、２５ゲージの穿刺針を用いた細胞吸引（ＦＮＡ：ｆｉｎｅ−ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によって採取した組織の一部である。

撹拌工程ＳＡ１においては、検体を加えた測定液Ｘを撹拌することによって、検体に含まれている細胞を均一に測定液Ｘ中に分散させる。測定液Ｘは、測定工程ＳＡ２および再測定工程ＳＡ３における吸光度測定の測定結果に影響を与えないように、無色透明なもの、例えば生理食塩水が好ましい。

次に、測定工程ＳＡ２において、図２に示されるように、一般的な生物学研究で使用されている分光光度計１０を用いて測定液Ｘの濁度を測定する。分光光度計１０は、光源２と、該光源２から測定試料である測定液Ｘに照射される測定光Ｉｉｎおよび測定試料を透過した測定光Ｉｉｎの透過光Ｉｏｕｔを検出する光検出器３とを備えている。

測定液Ｘの濁度は、測定液Ｘ中の細胞の密度に正比例し、測定液Ｘ中の細胞の密度は、細胞が吸収を示す波長λｃｅｌｌにおける測定液Ｘの吸光度に正比例する。したがって、波長λｃｅｌｌにおける測定液Ｘの吸光度を測定することによって、測定液Ｘの濁度および細胞の密度を得ることができる。測定光Ｉｉｎの波長λｃｅｌｌは、３２０ｎｍから１１００ｎｍの範囲内であり、より好ましくは、可視域の４００ｎｍから８００ｎｍの範囲内である。

ここで、測定容器１内の測定液Ｘの液面Ｘ’から所定の深さ位置に測定光Ｉｉｎを水平に照射することによって、測定液Ｘの吸光度を測定する。所定の深さ位置は測定液Ｘの液面Ｘ’近傍に設定され、測定液Ｘの液面Ｘ’近傍の上層部の吸光度が測定される。測定容器１としては、分光測定において一般に使用されるキュベットのような、光学的に透明な材料からなるものが使用される。

次に、再測定工程ＳＡ３において、測定工程ＳＡ２と同一の測定条件で測定液Ｘの同一の深さ位置の濁度を測定する。すなわち、測定容器１内の測定液Ｘの、測定工程Ｓ１と同一の深さ位置に、測定工程ＳＡ１と同一の波長λｃｅｌｌの測定光Ｉｉｎを水平に照射することによって、測定液Ｘの上層部の吸光度を測定する。

ここで、測定工程ＳＡ２および再測定工程ＳＡ３においては、測定液Ｘを静置した状態で吸光度測定を行う。静置状態において、測定液Ｘ中の細胞は時間の経過と共に沈降するので、測定液Ｘの上層部における細胞の密度は時間の経過と共に減少し、濁度も減少する。したがって、再測定工程ＳＡ３において得られる吸光度Ａｂｓ２は、測定工程ＳＡ２において得られる吸光度Ａｂｓ１よりも小さくなる。

測定工程ＳＡ２における１回目の濁度の測定時刻（第１の時刻）Ｔ１は、撹拌工程Ｓ１において測定液Ｘの撹拌を終了した直後であることが好ましい。また、再測定工程ＳＡ３における２回目の濁度の測定時刻（第２の時刻）Ｔ２は、撹拌工程Ｓ１において測定液Ｘの撹拌を終了した時刻から１２０秒以内であることが好ましい。さらに、測定時刻Ｔ１と測定時刻Ｔ２との時間間隔は、１０秒以上１２０秒以下であることが好ましい。

次の変化算出工程ＳＡ４および評価工程ＳＡ５，ＳＡ６，ＳＡ７は、例えば、分光光度計１０に接続されたコンピュータのような情報処理装置が、取得された吸光度Ａｂｓ１，Ａｂｓ２を分光光度計１０から受信し、受信した吸光度Ａｂｓ１，Ａｂｓ２を演算処理することによって実行される。

変化算出工程ＳＡ４においては、測定工程ＳＡ２において得られた吸光度Ａｂｓ１と、再測定工程ＳＡ３において得られた吸光度Ａｂｓ２との差分ΔＡｂｓ＝｜Ａｂｓ１−Ａｂｓ２｜（以下、単にΔＡｂｓと言う。）を算出する。ΔＡｂｓは、測定液Ｘの上層部における細胞の密度の時間変化量に相当し、測定液Ｘ全体に含まれる細胞の数に正比例する。

評価工程ＳＡ５，ＳＡ６，ＳＡ７においては、ΔＡｂｓを所定の閾値Ｔｈと比較し（ステップＳＡ５）、ΔＡｂｓが所定の閾値Ｔｈ以上である場合には（ステップＳＡ５のＹＥＳ）、検査に必要な数の細胞が検体に含まれており、当該検体は検査に適していると評価する（ステップＳＡ６）。一方、ΔＡｂｓが所定の閾値Ｔｈ未満である場合には（ステップＳＡ５のＮＯ）、検体に含まれる細胞の数は検査には足らず、検体は検査に適していないと評価する（ステップＳＡ７）。所定の閾値Ｔｈは、検体を供する検査に必要な細胞の数に基づいて設定される。検査は、組織診断や細胞診断を行う病理検査であってもよく、比色法や免疫酵素法による標的タンパク質の測定、または、遺伝子検査であってもよい。

ここで、液中の粒子の沈降速度について説明する。
液中の粒子には、鉛直方向下向きの重力と、鉛直方向上向きの、浮力および液体から受ける抵抗力との和が作用する。液中の粒子は、はじめは加速しながら沈降し、重量と、浮力および抵抗力の和とが釣り合った後には一定速度で沈降するようになる。この一定速度を終末沈降速度と言い、一般に粒子の沈降速度とは終末沈降速度を意味する。終末沈降速度Ｖは、下式（１）に示されるストークスの式から導かれる。

一例として、粒子の密度ρ_ｓを１．１とすると、直径１００μｍの粒子の終末沈降速度Ｖは３．３ｃｍ／分であり、直径１０μｍの粒子の終末沈降速度Ｖは０．３３ｃｍ／分である。すなわち、大きな粒子ほど速く沈降する。
生体から採取した検体には、細胞以外にも様々な他の生体物質、例えば血液成分や組織成分が含まれるが、細胞の直径は他の生体物質の直径に比べてはるかに大きい。特に、検体に含まれる細胞は大きな凝集塊を形成していることが多い。したがって、測定液Ｘ中において、細胞の沈降速度に比べて他の生体物質の沈降速度は無視できる程に極めて小さい。

測定工程ＳＡ２および再測定工程ＳＡ３において測定される各吸光度Ａｂｓ１，Ａｂｓ２には、細胞由来の吸光度に加えて、他の生体物質由来の吸光度も含まれる。ただし、上述のように他の生体物質の沈降速度は極めて小さく、測定時刻Ｔ１と測定時刻Ｔ２とにおいて測定される他の生体物質由来の吸光度は同じである。したがって、ΔＡｂｓにおいて、他の生体物質由来の吸光度は除去され、正味の細胞の吸光度の時間変化量がΔＡｂｓとして検出される。すなわち、ΔＡｂｓを算出することによって、測定液Ｘ中に他の生体物質が含まれていたとしても、測定液Ｘ中の細胞の正確な数を推定することができる。これにより、検体に含まれる細胞の正確な数を推定し、検体が検査に適しているか否かを正確に評価することができる。

本実施形態においては、測定液Ｘのうち液面Ｘ’近傍の上層部において濁度を測定することとしたが、濁度の測定位置はこれに限定されるものではなく、任意の深さ位置でよい。特に、測定容器１の底面Ｘ”近傍の下層部において濁度を測定することが好ましい。

測定液Ｘ中の細胞の密度の単位時間当たりの変化量は、測定液Ｘの液面’および底面Ｘ”において最大となる。ただし、測定容器１の底面Ｘ”においては、細胞密度が時間経過と共に増加する。したがって、測定液Ｘの液面’または底面Ｘ”において吸光度を測定することによって、より大きなΔＡｂｓが得られ、細胞の密度の時間変化量を精度良く検出することができる。

（参考実施形態）
次に、本発明の参考実施形態に係る検体評価方法について図３および図４を参照して説明する。
本実施形態に係る検体評価方法は、図３に示されるように、撹拌工程ＳＢ１と、測定液の画像を取得する撮影工程（測定工程）ＳＢ２と、該撮影工程ＳＢ２の後に時間間隔を空けて測定液の画像を再度取得する再撮影工程（再測定工程）ＳＢ３と、撮影工程ＳＢ２と再撮影工程ＳＢ３とで得られた２つの画像の差分画像を生成する変化算出工程ＳＢ４と、得られた差分画像に基づいて、検体が検査に適しているか否かを評価する評価工程ＳＢ５とを含んでいる。

撹拌工程ＳＢ１は、本発明の一実施形態において説明した撹拌工程ＳＡ１と同じである。
撮影工程ＳＢ２において、図４に示されるように、一般的な明視野顕微鏡２０を用いて測定容器１’の底面Ｘ”における測定液Ｘの画像を取得する。明視野顕微鏡２０は、測定容器１’を載置するステージ４と、該ステージ４上の標本を観察する対物レンズ５と、該対物レンズ５によって取得された標本の像を撮影する撮像素子６とを備えている。対物レンズ５の倍率は、２倍から２０倍程度が好ましい。測定容器１’としては、細胞の測定において一般に使用されるマイクロプレートのような、光学的に透明な材料からなるものが使用される。

次に、再撮影工程ＳＢ３において、測定容器１’の底面Ｘ”における、撮影工程ＳＢ２と同じ撮影範囲の測定液Ｘの画像を取得する。測定液Ｘ中の細胞は時間の経過と共に底面Ｘ”上に沈降するので、再撮影工程ＳＢ３において取得された第２の画像には、撮影工程ＳＢ２において取得された第１の画像よりも多くの細胞の像が含まれる。

次の変化算出工程ＳＢ４および評価工程ＳＢ５，ＳＢ６，ＳＢ７は、例えば、明視野顕微鏡２０に接続されたコンピュータのような情報処理装置が、取得された第１の画像および第２の画像を明視野顕微鏡２０から受信し、内蔵されている画像処理用のソフトウェアによって２つの画像を処理することによって実行される。

変化算出工程ＳＢ４においては、まず、撮影工程ＳＢ２において取得された第１の画像と再撮影工程ＳＢ３において取得された第２の画像との差分画像を生成する。具体的には、第１の画像の各画素の画素値と、第２の画像の各画素の画素値との差分を算出し、算出された差分の絶対値をその画素の画素値とする差分画像を生成する。これより、第１の画像と第２の画像との間で変化している変化領域、すなわち、第２の画像には存在するが第１の画像には存在しない細胞が抽出される。抽出された変化領域は、大きな画素値を有する明るい領域として、それ以外の領域（以下、「無変化領域」という。）は略ゼロの画素値を有する暗い領域として、それぞれ差分画像において表示される。

次に、変化領域を構成する画素の数Δｐｉｘｅｌ（差分。以下、単に「Δｐｉｘｅｌ」という。）を算出する。Δｐｉｘｅｌは、測定容器１’の底面Ｘ”上における細胞の密度の時間変化量に相当し、測定液Ｘ全体に含まれる細胞の総に正比例する。変化領域と無変化領域とをより明確に区別できるように、差分画像に２値化処理を施して変化領域を白または黒で、無変化領域を黒または白でそれぞれ表示してもよい。

評価工程ＳＢ５，ＳＢ６，ＳＢ７においては、変化算出工程ＳＢ４において得られたΔｐｉｘｅｌを所定の閾値Ｔｈ’と比較する（ステップＳＢ５）。そして、Δｐｉｘｅｌが所定の閾値Ｔｈ’以上である場合には（ステップＳＢ５のＹＥＳ）、検査に必要な数の細胞が検体に含まれており、当該検体は検査に適していると評価する（ステップＳＢ６）。一方、Δｐｉｘｅｌが所定の閾値Ｔｈ’未満である場合には（ステップＳＢ５のＮＯ）、検体に含まれる細胞の数は検査には足らず、検体は検査に適していないと評価する（ステップＳＢ７）。ここで、所定の閾値Ｔｈ’は、検体を供する検査に必要な細胞の数に基づいて設定される。検査は、組織診断や細胞診断を行う病理検査であってもよく、比色法や免疫酵素法による標的タンパク質の測定、または、遺伝子検査であってもよい。

ここで、撮影工程ＳＢ２および再撮影工程ＳＢ３において取得される各画像には、細胞に加えて、他の生体物質も含まれる。ただし、上述のように他の生体物質の沈降速度は極めて小さいため、第１の画像と第２の画像との間の、生体物質に由来する変化は無視できる程に小さい。したがって、差分画像から得られるΔｐｉｘｅｌは、正味の細胞の密度の時間変化量に相当する。この差分Δｐｉｘｅｌを算出することによって、検体に含まれる細胞の正確な数を推定し、検体が検査に適しているか否かを正確に評価することができる。

（実施例）
次に、上述した本発明の一実施形態に係る検体評価方法の実施例について説明する。
本実施例においては、ＦＮＡによって採取した検体を使用した。ＦＮＡでは、三方活栓によって互いに接続された２３ゲージの静脈注射針とシリンジとを使用した。具体的には、トリ肝臓に静脈注射針を穿刺し、シリンジで吸引することによって検体を採取した。
採取された検体を生理食塩水（測定液）に加え、生理食塩水を十分に撹拌することによって、サンプルＡを調製した。次に、３００μＬのサンプルＡを９６穴プレート（べクトン ディッキンソン社製、カタログＮｏ．３５１１７２）に分注した。

次に、プレートリーダ（コロナ電機、ＳＨ−８１００）を用いて、波長４００ｎｍ、６００ｎｍ、および８００ｎｍにおける、サンプルＡの上層部の吸光度を測定した（測定工程、再測定工程）。ここで、ウェル内のサンプルＡをピペッティングによって５秒間撹拌し（撹拌工程）、撹拌終了直後（０秒）に１回目の吸光度の測定を行い（測定工程）、その後に１０秒間隔で１８０秒まで測定を行った（再測定工程）。そして、０秒と１８０秒とにおける吸光度の差分ΔＡｂｓを算出した（変化算出工程）。
トリ全血（コスモ・バイオ、１２０７５５０５）を生理食塩水で１０倍に希釈した、細胞を含まない対照サンプルも調製した。対照サンプルについても、サンプルＡと同じ方法で吸光度の測定を行った。

図５は、サンプルＡおよび対照サンプルの各測定波長におけるΔＡｂｓを示している。サンプルＡでは、全ての測定波長４００，６００，８００ｎｍにおいて、明らかな吸光度の減少が確認された。一方、細胞を含まない対照サンプルでは、有意な吸光度の減少は確認されなかった。この結果から、サンプルＡの吸光度の減少は細胞に由来するものであり、血液成分を含むサンプルＡについても、細胞の有無および細胞数と相関するΔＡｂｓを得られることが確認された。

図６は、代表して波長６００ｎｍにおけるサンプルＡおよび対照サンプルの吸光度の、０秒から１８０秒までの時間変化を示したものである。図６において、サンプルＡの吸光度は、撹拌終了直後から直ちに減少し、約１２０秒以降は横ばいとなった。一方、対照サンプルでは、吸光度の有意な時間変化は認められなかった。本例においては、例えば、波長６００ｎｍにおける吸光度を０秒と６０秒とで測定し、ΔＡｂｓに対する所定の閾値Ｔｈを０．０４に設定することによって、検体に十分な数の細胞が含まれているか否かを評価することができる。

図７（ａ），（ｂ）は、サンプルＡおよび対照サンプルをスライドガラスに滴下して作成したスライド標本であり、細胞をパパニコウロ染色した標本の画像である。図７（ａ）に示されるように、サンプルＡのスライド標本には、多くの細胞が観察された。一方、図７（ｂ）に示されるように、対照サンプルのスライド標本には、全く細胞が確認されなかった。

（参考実施例）
次に、上述した参考実施形態に係る検体評価方法の実施例について説明する。
本実施例においては、サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを使用した。サンプルＡは、実施例１のサンプルＡと同じである。サンプルＢは、２３ゲージの静脈注射針に代えて２６ゲージの静脈注射針を使用して採取した検体を用いたことを除いて、サンプルＡと同様に調製した。サンプルＣは、培養細胞（Ａ５４９細胞株）を生理食塩水に懸濁した細胞懸濁液であり、細胞密度を１．３３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。サンプルＤは、サンプルＣの細胞懸濁液を１０倍（１．３３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に希釈することによって調製した。サンプルＥは、サンプルＣの細胞懸濁液を１００倍（１．３３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に希釈することによって調製した。本実施例においては、対照サンプルとして、生理食塩水を使用した。

サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの各々について、３００μＬを９６穴マイクロプレート（べクトン ディッキンソン社製、カタログＮｏ．３５１１７２）に分注した。次に、サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥを収容したマイクロプレートの底面を倒立型の光学顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫ Ｘ４１）で観察しながら、マイクロピペットと用いてウェルの中のサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥを撹拌し（撹拌工程）、撹拌終了直後（０秒）にデジタルカメラ（オリンパス社製、ＤＰ２１）によって１回目の撮影を行い（撮影工程）、６０秒後に再撮影を行った（再撮影工程）。サンプルＡについては、さらに１０秒後および３０秒後にも撮影を行った。

次に、画像処理用のソフトウェアを使用して、０秒および６０秒における２枚の画像から、変化領域が白、無変化領域が黒となるように２値化した差分画像を作成した。次に、差分画像の画素値のヒストグラムから、白い領域を構成する画素の数Δｐｉｘｅｌを得た（変化算出工程）。

図８から図１３は、サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅおよび対照サンプルの、０秒（各図の（ａ）参照。）および６０秒（各図の（ｂ）参照。）における画像と、差分画像（各図の（ｃ）参照。）とを示している。図８および図９に示されるように、検体の採取に太い静脈注射針を使用したサンプルＡは、細い静脈注射針を使用したサンプルＢに比べて多くの細胞を含み、サンプルＡの差分画像における変化領域（白い領域）の総面積は、サンプルＢのそれよりも大きかった。さらに、サンプルＡは、背景が赤いことから多くの血液を含むことが確認された。図１０から図１２に示されるように、サンプルＣ，Ｄ，Ｅに含まれる細胞の数が多い程、差分画像における変化領域の総面積が大きかった。図１３に示されるように、対照サンプルの差分画像には、変化領域がほぼ存在しなかった。これらの結果から、サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅに含まれる細胞の数と、Δｐｉｘｅｌとの間には、正の相関関係が存在することが確認された。

図１４（ａ）から（ｄ）は、サンプルＡの０秒、１０秒、３０秒および６０秒における画像を示している。図１４（ｂ）に示されるように、細胞の凝集塊の、測定容器の底面への沈降は速く、撹拌を終了してから１０秒後には既に多くの凝集塊が底面上に観察された。
図１５は、サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅおよび対照サンプルの差分画像から得たΔｐｉｘｅｌを示している。

図１６は、細胞密度が既知であるサンプルＣ，Ｄ，Ｅおよび対照サンプルについて、細胞密度とΔｐｉｘｅｌとの関係をプロットしたグラフである。図１６に示されるように、Δｐｉｘｅｌは、細胞密度に対して正比例することが確認された。図１６のグラフを用いて、サンプルＡ，Ｂの各Δｐｉｘｅｌから、サンプルＡの細胞密度は７１９９８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、サンプルＢの細胞密度は８５５１ｃｅｌｌｓ／ｍＬとそれぞれ見積ることができた。

本例においては、例えば、撹拌終了後、０秒と６０秒とに画像を取得し、Δｐｉｘｅｌに対する所定の閾値Ｔｈ’を、細胞密度５０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに相当する１４０２１に設定することによって、検体に十分な数の細胞が含まれているか否かを評価することができる。

図１７（ａ），（ｂ），（ｃ）は、サンプルＡ，Ｂおよび対照サンプルのスライド標本であり、細胞をパパニコウロ染色した標本の画像である。図１７（ａ），（ｂ）に示されるように、サンプルＡ，Ｂのスライド標本には多くの細胞が観察され、サンプルＡの方が、サンプルＢよりも多くの細胞を含むことが確認された。一方、図１７（ｃ）に示されるように、対照サンプルのスライド標本には、全く細胞が確認されなかった。

１ 測定容器
２ 光源
３ 検出器
４ ステージ
５ 対物レンズ
６ 撮像素子
１０ 分光光度計
２０ 明視野顕微鏡
Ｘ 測定液
ＳＡ１，ＳＢ１ 撹拌工程
ＳＡ２ 測定工程
ＳＡ３ 再測定工程
ＳＢ２ 撮影工程（測定工程）
ＳＢ３ 再撮影工程（再測定工程）
ＳＡ４，ＳＢ４ 変化算出工程
ＳＡ５，ＳＡ６，ＳＡ７，ＳＢ５，ＳＢ６，ＳＢ７ 評価工程

Claims (5)

1. 生体から採取された検体を含む測定液を撹拌することによって、前記検体に含まれる細胞を前記測定液中に均一に分散させる撹拌工程と、
   該撹拌工程における撹拌終了後、前記測定液の所定の深さ位置における濁度を第１の時刻において測定する測定工程と、
   前記第１の時刻から時間間隔を空けた第２の時刻において、前記測定液の前記所定の深さ位置における濁度を再度測定する再測定工程と、
   前記測定工程において測定された濁度と前記再測定工程で測定された濁度との差分を算出する変化算出工程と、
   前記変化算出工程において算出された濁度の差分に基づいて前記細胞の数を推定し、前記検体の良否を評価する評価工程とを含む検体評価方法。
2. 前記所定の深さ位置が、測定容器に収容された前記測定液の底面もしくはその近傍、または、液面もしくはその近傍である請求項１に記載の検体評価方法。
3. 前記第１の時刻は、前記撹拌工程における撹拌終了直後である請求項１または請求項２に記載の検体評価方法。
4. 前記第２の時刻は、前記撹拌工程における撹拌終了から１２０秒以内である請求項１から請求項３のいずれかに記載の検体評価方法。
5. 前記第１の時刻と前記第２の時刻との時間間隔は、１０秒以上１２０秒以下である請求項１から請求項４のいずれかに記載の検体評価方法。

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