JP6321673B2 - 放射線と組み合わせて使用するための放射線増感剤化合物 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年12月20日に提出された米国特許仮出願第61/797,983号に対する優先権の利益を主張し、内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
1つの態様によれば、下記の一般式I:
Aは、芳香族コアを表し;Ra及びRbの少なくとも1つは、本明細書に定義されるような電子移動(electron transfer)プロモーターであり;そしてRcの少なくとも1つは、本明細書に定義されるような脱離基である]を有する、放射線と組み合わせて有用である放射線増感剤化合物が提供される。
X及びYは独立して、C−R3又はNであり;
R3は、H、OH、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリールであり;
R1及びR2は独立して、H、OH、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、又は脱離基であり;ここでR1及びR2の少なくとも1つは脱離基であり、ここで、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロシクリル、及びヘテロアリール部分の個々は任意に置換される]を有する化合物又はその医薬的に許容できる塩が提供される。
本明細書において使用される場合、「放射線増感剤化合物」(radiosensitizer compound)とは、イオン化放射線により治療できる癌及び他の疾患の治療において放射線療法を増強するために使用され得る、本明細書に定義されるような非白金含有化合物を言及する。用語「化合物」(compound)、「分子」(molecule)及び「剤」(agent)は、本明細書においては、交換可能的に使用され得る。
一般式I、II及びIIIの個々において、分子のコアは、1つのアリール又はヘテロアリール環(単環式)から成るか、又は複数の環(多環式)から成る、共役された環系、又は芳香族環系である。いくつかの場合、芳香族コアは、それぞれ、二環式又は三環式を形成するために2又は3個の縮合環を含むことができる。芳香族環系は、電子移動プロモーター、例えば前水和化された電子との反応を介して得られるNH2基により過渡的に安定化された電子を、脱離基の部位に輸送することができる。分子の一時的アニオンが形成される場合、それは脱離基、例えば安定アニオンの損失を急速に引き起こし、そして高い反応性の中性ラジカルを生成することができる。
本発明の開示の放射線増感剤化合物は、芳香環系に結合される1又は2以上の電子移動プロモーター(例えば、式I又はIIにおけるRa及びRbの1つ又は両者、及び式IIIにおける−NH2)を含む。「電子移動プロモーター」(electron transfer promoter)とは、本明細書において使用される場合、前水和化された電子の取り込み、及び一時的安定化を助ける電子又は官能基である。次に、電子は芳香族環系を介して輸送され、環炭素電子と脱離基との間の結合の切断を引き起こす。脱離基が環から切断されると、得られた中性ラジカルはDNAと高い反応性であり、DNA損傷及び癌細胞の死滅を引き起こす。従って、電子移動プロモーター、好ましくは、互いに近接した2つの電子移動プロモーターは、放射線増感剤分子を活性化し、放射線分解の間、生成される前水和化電子と共に、より反応性にすると思われる。
本発明の開示の放射線増感剤化合物は、芳香族環系に結合される1又は2以上の脱離基(例えば、式I、II又はIIIにおけるR1及びR2の1つ又は両者)を含む。追加の脱離基はまた、芳香環上での置換基として提供され得る。複数の脱離基が存在する場合、脱離基は同じであっても又は異なっていても良い。いくつかの実施態様によれば、脱離基は同じである。分子上での強い脱離基の存在は、放射線分解の間、特に脱離基が電子移動プロモーターに対して操作可能的に位置する(例えば、1,2又は3個の環原子内に)場合、生成される前水和化電子と分子との反応性を増強することができる。
式I、II又はIIIの実施態様によれば、炭素原子は、特にことわらない限り、置換されなくても又は置換されても良い。
本発明の開示のいくつかの典型的非制限的放射線増感化合物が下記に示される:
原子又は分子の電子親和性(EA)は一般的に、電子が負のイオンを形成するために、中性原子又は分子に付加される場合のエネルギー変化として定義される:
X+e-+エネルギー。
本発明の開示の放射線増感剤化合物は、放射性標識され得、すなわち前記化合物は、天然において通常見出される、原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を含む1又は2以上の原子を含むことができる。水素、炭素、リン、フッ素及び塩素の典型的な放射性同位体は、それぞれ、3H、14C、32P、35S、43F及び36Clを包含する。放射性標識された化合物は一般的に、当業者に良く知られている方法により調製され得る。いくつかの場合、そのような放射性標識された化合物は、一般的合成方法を実施し、そして非放射性標識された試薬を、容易に入手できる放射性標識された試薬により置換することにより調製され得る。
次の良く知られた化学用語は、特にことわらない限り、次の一般的意味を有する。
本明細書に開示される放射線増感剤化合物は、対象への投与のために適切な、医薬組成物に、又は種々の医薬剤形の1つに存在することができる。本発明の開示の放射線増感剤化合物を含んで成る医薬組成物及び剤形は、イオン化放射線の効果を増強するために有用である。
放射線増感剤化合物及びそれを含む医薬組成物は、何れかの適切な投与経路により投与され得る。例えば、放射線増感剤化合物は、局所的に(例えば、腫瘍中に)、局部的に(例えば、体腔内に)、又は全身的に(例えば、血管、例えば静脈又は動脈中に)、投与される。
放射線増感剤化合物又は組成物は、当業者(例えば、臨床医)により適当と認められる任意の治療レジメに従って投与され得る。
放射線療法又は放射線治療は、一般的に、悪性細胞を制御するか又は死滅するための、癌治療の一部としてイオン化放射線の医学的使用である。イオン化放射線は、原子又は分子から電子を放出し、それによりそれをイオン化するために、十分な運動エネルギーを個々に担持する粒子から構成される放射線である。イオン化放射線源は、外部放射線源、例えばX放射線(X線)、ガンマ放射線(γ線)、ベータ放射線(β線)、中性又は荷電粒子ビーム、オージェ電子源、内部放射線源(近接照射療法又は密封線源放射線療法)、及び放射性同位体源(全身性放射性同位体療法又は非密封源放射線療法)を包含することができる。本明細書に開示される放射線増感剤化合物は、その化合物と反応できる電子を提供する任意の適切なイオン化放射線源と組み合わせて使用され得る。
イオン化放射線の投与量は、臨床放射線療法での使用のために知られているそれらの投与量であろう。例えば、X−線は、1.8〜2.0Gyの毎日の用量で5〜6週間、週5日、分割して投与され得るであろう。通常、分割された合計用量は、45〜60Gyの範囲であろう。単一の大用量は、例えば5〜10Gyが、放射線療法の過程の一部として投与され得る。単一用量が、手術中に投与され得る。多分割放射線療法が使用され得、それにより少量のX−線が、一定の時間にわたって、例えば数日間にわたって0.1Gy/時間で規則的に投与される。放射性同位体についての投与量範囲は広く変化し、そして同位体の半減期、放出される放射線の強度及びタイプ、及び細胞による取り組みに依存する。
インビトロ又はインビボでイオン化放射線と組み合わせて、本発明の開示の非白金系放射線増感剤化合物と癌細胞の接触が、化合物自体は使用可能な用量内で実質的に非毒性であるが、放射線療法の増強された効力、すなわち相乗効果を提供することが、本明細書に示されている。さらに、イオン化放射線とのその組み合わせは、放射線毒性を誘発しない(すなわち、放射線用量とは無関係である)。従って、本明細書に開示される放射線増感剤化合物は、放射線療法により治療可能な障害、例えば癌についての新規の併用療法を提供する。従って、その併用療法は、本明細書に開示されるような放射線増感化合物、及びイオン化放射線を包含する化学放射線療法併用法である。
本明細書に開示される併用療法は、癌と診断された個体に対して典型的には投与される。しかしながら、いくつかの場合、併用療法は、癌の臨床学的徴候をまだ示していないが、しかし癌を発症する危険性を有する個体に投与され得る。この目的に向けて、本出願はまた、癌を発症する危険性を予防するか又は低減するための方法も開示する。本明細書に開示される併用療法はまた、再発を治療するか、又は寛解を延長するためにも使用され得る。本明細書に開示される併用療法はまた、放射線療法により治療可能な他の障害、例えば非悪性状態、例えば三叉神経痛、聴神経腫、重度の甲状腺眼症、翼状片、色素性絨毛結節性滑膜炎の治療、及びケロイド瘢痕成長、血管再狭窄、及び異所性骨化の予防のためにも使用され得る。
本明細書に開示される併用療法は、単独の療法として管理されるか、又は1又は2以上の追加の療法、例えば手術又は薬剤療法と一緒に使用され得る。例えば、追加の療法は、一次腫瘍を除去するための手術、又は治療剤、例えば抗生物質、抗炎症剤又は抗癌剤を包含する癌療法であり得る。抗癌剤は、例えば従来の化学療法剤、及び分子標的化治療剤、生物学的療法剤、及び放射線療法剤を包含することができる。本発明の開示の併用療法と組合して使用される抗癌剤は、当業者に知られている何れかの種類から選択される剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド及びテルペノイド(例えば、タキサン)、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ホルモン療法、分子標的薬剤、及び同様のものを包含する。一般的に、そのような抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ビンカアルカロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、又は免疫抑制性マクロライドである。選択される追加の剤は、併用療法の有効性を有意に低めるか、又は所望しない有毒な副作用を増強するよう、本発明の開示の併用療法を有意に妨害すべきではないことが理解されるであろう。
本明細書に開示される放射線増感化合物は、例えば放射線療法を増強するために、イオン化放射線との組み合わせにおいて有用である。
別の態様によれば、イオン化放射線と組み合わせて使用するための本明細書に開示されるような放射線増感剤化合物に関するキット及び市販用パッケージが提供される。いくつかの実施態様によれば、イオン化放射線と組み合わせて使用するための説明書と共に、本明細書に開示されるような放射線増感剤化合物を含んで成るキット又は市販用パッケージが提供される。いくつかの実施態様によれば、説明書は、癌の治療においてイオン化放射線と組み合わせて使用するためである。
本発明者は最近、放射線療法と組み合わせたシスプラチンの作用の分子機構を推定した[lu 2007; 2010]。シスプラチンは良く知られたDNA−攻撃剤であるが、作用のその正確な分子機構は、最近解決されるまで、分かりにくいままであった[lu 2007]。フェムト秒時間−分解レーザー分光法(fs−TRLS)の使用を通じて、シスプラチンは、放射線療法において生成される弱く結合された前水和化電子(epre -)との解離性電子移動(DET)反応のための非常に効果的分子であることが実証されている:
epre - + RSC → ラジカル → DNA損傷/細胞死滅。
純水中、及びイオン化放射線(X−線照射)下での化合物Bの存在下でのプラスミドDNAに対する損傷が、実施例2に概略されるように、アガロースゲル電気泳動により試験された。図3及び4は、放射線誘発されたDNA損傷、すなわち二本鎖切断(DSB)の収率が化合物Bの存在により有意に増強されたことを示す。DSBは、細胞に対して特に致死性である。
シスプラチン又はRSC単独でのインビトロ毒性を、実施例3に概略されるように、ヒト(皮膚)正常細胞(GM05757)において調査した。GM05757細胞系は、癌研究において、特に新規の放射線増感剤の試験においてヒト正常細胞として広く使用されてきた[Choudhuryら,2009]。図5は、正常細胞が約10μMの測定されたIC50(この時点で、細胞生存率は、未処理の細胞に関して、50%である)で、用量依存的態様でシスプラチンにより効果的に死滅されたことを示し、このことは、シスプラチンが実際、高い毒性であることを確認した。対照的に、図6〜9にプロットされた結果は、本発明の開示されたRSC、すなわち化合物A、B、C及びDが、200μMまでの用量で、正常細胞に対して実質的に毒性を有さなかったことを示す。従って、それらのRCSは、ヒト患者において、重金属(Pt)系化学療法剤(シスプラチン)とは、対照的に、ほとんどか又は全く有毒な副作用を誘発しないことが予測される。細胞の生存性が、最も通常使用される細胞生存性アッセイの1つであるMTTアッセイにより測定される。この方法は、代謝的活性細胞(生存細胞)による不溶性ホルマザンへのMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の変換を包含する。可溶化剤を用いて、ホルマザンを溶解し、そしてその吸光度を測定し、生存する細胞数を表示する。これは、長期的規模で、細胞生存性を測定するクローン形成アッセイに比べて、必要とされる薬剤処理時間、及び総プロトコル時間の観点から迅速である十分に確率された定量的方法である。
イオン化放射線(X線)と組み合わせたシスプラチン又はRSCのインビトロ毒性を、実施例4に概略されるように、ヒト正常細胞(GM05757)において調査した。図10は、種々の濃度のシスプラチン、続く0〜10Gy 225keV X線照射による12時間の処置の後、ヒト正常細胞(GM05757)の細胞生存率を示す。96ウェルプレート中の細胞の生存性を、照射の12日後、MTTにより測定した。この結果は、正常細胞生存性が放射線量とは無関係であったことを示す。これは、化学療法薬剤として高い毒性であるのにもかかわらず、シスプラチンは、放射線毒性を実質的に引き起こさなかったことを確証する。従って、シスプラチンは、診療所で放射線増感剤として使用されてきた[Roseら,1999]。興味深いことには、図11〜13は、イオン化放射線により誘発される毒性を示さない、RSCと類似する観察を示す。この結果は、開示されるRSCが癌の放射線療法について放射線増感剤として実質的に使用され得ることを示唆する。
イオン化放射線(X線)と組み合わせたRSCのインビトロ放射線増感効果を、実施例5に概略されるようにして、シスプラチン感受性ヒト子宮頸癌細胞系(HeLa又はME−180)、シスプラチン耐性ヒト卵巣癌(NIH:OVCAR−3、HTB−161)及びヒト肺癌(A549)細胞系において調査した。図14〜21は、種々の濃度のRSCによる12時間の処置、続く種々の用量の225kev X−線照射の後、種々のヒト癌細胞の細胞生存率を示す。それらの結果は、化合物A、B、C及びDが放射線用量依存性態様で及び相乗的に放射線により癌細胞の死滅を増強したことを示す。RSCによるX線に対する癌細胞の放射線感受性の有意な増強が明白に観察された。例えば、約20%の癌細胞(ME−180)が、任意のRSCの存在下で50Gy X−線照射の後、生存し、ところが初期のすべての癌細胞は、約100μMの化合物B又はDの存在下で、50Gyで死滅され、このことは、ヒト正常細胞に対して毒性を示さなかったことを示す。
全体的な薬物毒性を、実施例6に概略されるようにして、生存アッセイ及び体重測定により、生後6〜8週のSCIDマウスにおいて試験し、そして急性薬物毒性を、次のパラメーターにより測定した:血液採取及び組織学。肝毒性(ALT、ALP、AST)、腎毒性(血液BUN、クレアチニン)及び電解質(Na、K、等)を、HPLC−質量分析により分析した。臨床学的に使用される放射線増感剤としてのシスプラチンに関して、シスプラチンは、約10mg/kgの典型的用量で週当たり1度、マウスへの腹腔内(IP)注射により投与され、これはシスプラチンのLD50(=13.5m/kg)以下であることが、文献に報告されている。本試験においては、典型的なRSCとしての化合物Bが、インビトロ細胞系実験で観察される非毒性のために、0.5及び7mg/kgで10日間、毎日、IP注射により意図的に投与された。マウスが、任意の物理的毒性について観察された。試験の最後で、腸、肝臓及び腎臓毒性を評価するために、全体の臓器を採取した。血液をまた採取した。図22は、マウスの生存率が100%であり、すなわち化合物Bが非毒性であり、そしてマウス生存性に対して影響を及ぼさなかったことを示す。図23はまた、時間でのマウスの体重には影響せず、すなわち化合物Bは物理的毒性を示さなかったことを示す。さらに、図24〜26にプロットされる結果は、最高用量(10日×7mg/kg/日=70mg/kg)で与えられる化合物Bが、観察できる急性毒性、すなわち肝毒性、腎毒性及び電解質の変化も誘発しなかったことを示す。
代表的RSC、すなわち化合物BのSCIDマウスにおける薬物動態学(PK)及び薬力学(PD)を、実施例7に概略されるようにして試験した。血液サンプルを、前記化合物を0〜7mg/kgでマウスにIP注射した後、種々の時点でマウスの伏在静脈から集め、そして次に、HPLC−質量分析を用いて分析した。最初に、血液中で有意なレベルの化合物Bが検出された。第2に、図27は、最高濃度の化合物Bがi.p.注射の約20分後で観察され、そして約3時間で、ほぼゼロに低下したことを示す。(腫瘍)組織で化合物Bが最大濃度に達するには長い時間がかかることが予測される。図27における観察された結果は、化合物Bが数時間以内に身体から良く排出され得ることを示し、このことは、化合物Bが卓越した薬物動態学(PK)及び薬力学(PD)を有することを示唆する。
化合物B及びX線照射の組み合わせのインビボ放射線増感(例えば、抗癌)効果が、実質8に概略されるようにして、ヒト子宮頸癌(ME−180)の異種移植片マウス腫瘍モデルにおいて調べられた。X線照射と化合物Bとの組み合わせは、図28に示される腫瘍(体積)成長曲線、図29における腫瘍成長の写真、及び図30に示される腫瘍体積及びMRIイメージから見られるように、腫瘍モデルにおける放射線又は化合物単独での処置に比較して、腫瘍成長の抑制を有意に増強した。それらの結果のすべては、イオン化放射線と化合物Bとの組み合わせが、マウスにおける腫瘍の有意な収縮をもたらしたことを示す。単一用量(7mg/kg)の化合物B及び15Gyの有意な放射線量が用いられ、そして化合物Bが最小の全体的及び急性毒性を有する場合、それらの結果は、複数の分割放射線療法(例えば、分割処置当たり7mg/kg及び4Gyの5分割用量)に外挿され、結果的に、治療効果の増強における最大の相乗効果が達成され得ることが予測される。
実施例1.epre -と放射線増感剤化合物(RSC)とのDET反応のフェムト秒レーザー分光観察
フェムト秒(fs)時間−分解レーザー分光(fs−TRLS)は、分子反応のリアルタイム観察のための最も多機能的で且つ強力な技法である。それは、反応が実際起こる時間尺度のままである短い期間(フェムト秒(fs)=10-15秒)のレザーフラッシュを用いる。epre -と新規放射線増感剤とのDET反応を、fs−TRLSにより研究した[Lu,2007;2010]。後者に関しては、手短には、我々のfsレーザー増幅器システム(Spectra-Physics, Spitfire)は、500Hzの反復速度で100〜120fsのパルス幅を有するレーザーパルスを生成した。322nmでの強ポンプパルスを用いて、epre -を生成するためにイオン化する、より高いエネルギー状態のH2O*へのH2O分子の二光子励起によりイオン化放射線をシミュレートし;一定の遅延で来る333nmでのプローブパルスを用いて、一過性アニオン吸光度を検出することによりepre -とのDET反応をモニターした。
新規放射線増感剤(例えば、化合物D)のDEA反応の代表的fs−TRLS観察が図2に示されている。その結果は、epre -との化合物DのDET反応が、ヨードデオキシウリジン(IdU)のその反応よりもより強かったことを示す。後者は、ハロピリミジン間で最も強いDET反応を有した[Lu,2010]。この観察は、開示される化合物が有能な放射線増感剤であることを示す。
本発明の開示される化合物における(モノ−又はジ−)ハロゲン及びジアミノ基の存在は、イオン化放射線下で水の放射線分解において生成される主要基であるepre -とのDET反応を実際、増強することができる。
2.1.材料及び方法
Barnstead Nanopure 水システムから新たに得られた、> 18.2 MΩ/cm 及びTOC<1 ppmの抵抗率を有する、生命科学のための超純水を用いた。ジブロモ−ジアミノ−ベンゼン(ジブロモ−フェニレンジアミン、化合物B)を、TCI−Americaから入手し、そして他の化学物質及び緩衝剤組成物はSigma-Aldrichから入手した。プラスミドDNA [pGEM 3Zf(-), 3197 kbp]は、E.コリJM109から抽出し、そしてQIAprep Kit (Qiagen)を用いて精製した。
fs−TRLS測定のためのものと同一である、322nmでのポンプビームを用いて、DNA溶液における水の二光子励起を介してラジカルを生成した。レーザービームを、200μlの緩衝溶液中、3.0μgのDNAを含む石英セルに焦点を合わせた。前記溶液を、照射の間、攪拌し、サンプル全体に均等なDNA損傷を生成した。96ngのDNAに相当するアリコートを、ゲル電気泳動のために種々の照射時間でサンプル細胞から除いた。すべてのアリコートを、標準のアガロースゲル電気泳動、すなわちTAEランニング緩衝液中、1%中性TAEアガロースゲル上で分析した。ゲルを、0.5μg/mlの臭化エチジウムにより前もって染色した。ゲルのイメージが、FluorChem imaging station (Alpha Innotech)で撮影され、そして種々のトポロジー的形、例えば閉じた円形の超らせん形(SC、損傷されていないDNA)、開放円形(C、SSB)及び線形(L、DSB)を示す。それらは、AlphaEase FCソフトウェアにより定量化された。
図3及び4に示されるように、開示される化合物は実際、DNA二本鎖切断をもたらした。前記開示される化合物は、DNA損傷を引き起こす高い効力を有する。
イオン化放射線下での水の放射線分解において生成される主要基であるepre -との強いDET反応のために、(モノ−又はジ−)ハロゲン及びジアミノ基から成る本開示の化合物は実際、DNA損傷の誘発においてそれらの効力を増強した。
3.1.材料及び方法
3.1.1.化学物質及び試薬:
ヒト皮膚二倍体線維芽細胞(GM05757細胞系)を直接、Coriell Cell Repositoryから入手した。ウシ胎児血清(FBS)を、Hyclone Laboratories (UT, USA)から入手した。GM05757正常細胞を、10%FBS、100単位/mlのペニシリンG及び100μg/mlのストレプトマイシン(Hyclone)により補充されたMEM(Hyclone)下で培養した。細胞を、5%CO2を含む、保湿雰囲気下で、37℃で維持した。
細胞生存性に対するRSCの放射線増感効果を、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイにより決定した。細胞を、96−ウェルプレートにおいて24時間、培養した(5×103個の細胞/ウェル)。培養培地を、新鮮な培養培地により交換し、そして薬物濃度を変えることにより、72時間インキュベートした。次に、細胞生存性のMTTアッセイを実施した。手短には、1.2mMのMTT(Sigma)(すなわち、PBS中、12mMのMTT原液10μlを添加する)を含むフェノールレッドを有さない100μlの新規培地を、各ウェルに添加し、そして4時間インキュベートした。次に、培地を除き、そしてホルマザン結晶を、100μl/ウェルのDMSOにより可溶化した(又は他方では、100μl/ウェルのSDSにより可溶化し、そしてさらに4時間インキュベートした)。生存画分を、生存細胞の数に正比例する、Multiskan Spectrum UV/Visマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific)を用いて、540nm(SDS可溶化のためには570nm)での吸光度を測定することに決定した。
ヒト正常細胞に対するRSCの毒性を試験するために、標準のMTTアッセイを用いて、そしてシスプラチンを参照として用いた。ヒト正常細胞(GM05757)を、種々の薬物の濃度(シスプラチンについて0〜50μM及び化合物A/B/C/Dについて0〜200μM)で処理した。結果は、図5〜9に示される。最初に、シスプラチンが、約10μMの測定されたIC50を伴って、≦30μMの低濃度でさえ、重度の毒性を示すことが、図5から明白に見出される。この結果は、抗癌剤としてのシスプラチンが実際、高い毒性であることを確証する。対照的に、本発明の開示されるRSC、すなわち化合物A、B、C及びDは、200μMの非常に高い濃度でさえ正常細胞に対して実質的に毒性を有さないことが、図6〜9に明白に示されている。それらの結果は、重金属(Pt)系化学療法薬物(シスプラチン)とRSCとの間のコントラスト差を示している。従って、それらのRSC分子は、動物及びヒト患者において全く無いか又は最少の系統的毒性副作用を誘発することが予測される。
本発明者が仮定したように、還元性細胞内環境の欠如のために正常細胞は、高い酸化性である本発明の化合物への低い親和性を有する。従って、RSCは、正常細胞に対して、全く無いか又は低い毒性を示す。開示される化合物は、ヒト正常細胞に対して高い親和性を有し、そして高い毒性である、臨床的に使用されるシスプラチンとは対照的である。従って、それらのRSCは、卓越した抗癌剤である可能性を有する。
4.1.1.化学物質及び試薬:
シスプラチン、ジクロロ−ジアミノ−ベンゼン(化合物A)、ブロモ−ジアミノ−ベンゼン(化合物D)、インスリン、及び3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を、Sigma-Aldrichから入手した。ジブロモ−ジアミノ−ベンゼン(ジブロモ−フェニレンジアミン、化合物B)を、TCI−Americから入手した。ジヨード−ジアミノベンゼン(化合物C)を、本願発明者等の実験室で合成し、精製し、そして結晶化し、そしてその構造及び純度を、NMR及び質量分析により試験した。MEM及びウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンG及びストレプトマイシンを、Hyclone Laboratorics (UT, USA)から入手した。シスプラチンの原液を、超純水又は塩溶液において新たに調製し、そして化合物A、B、C、Dの原液を純粋エタノールにおいて調製し、ここでエタノールの最終濃度は、細胞に処理した場合、≦1%であった。
ヒト皮膚二倍体線維芽細胞(GM05757細胞系)を直接、Coriell Cell Repositoryから入手した。ウシ胎児血清(FBS)を、Hyclone Laboratories (UT, USA)から入手した。GM05757正常細胞を、10%FBS、100単位/mlのペニシリンG及び100μg/mlのストレプトマイシン(Hyclone)により補充されたMEM(Hyclone)下で培養した。細胞を、5%CO2を含む、保湿雰囲気下で、37℃で維持した。
細胞生存性に対するRSCの放射線増感効果を、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイにより決定した。細胞を、96−ウェルプレートにおいて24時間、培養した(5×103個の細胞/ウェル)。培養培地を、新鮮な培養培地により交換し、そして薬物濃度を変えることにより、12時間インキュベートした。次に、細胞を、種々のX−線用量を伴って、2Gy/分の線量率で、225kV X−線(PRECISION X-RAD IR 225)により照射した。照射の後、細胞を12日間インキュベートした。次に、細胞生存性のMTTアッセイを実施した。手短には、1.2mMのMTT(Sigma)(すなわち、PBS中、12mMのMTT原液10μlを添加する)を含むフェノールレッドを有さない100μlの新規培地を、各ウェルに添加し、そして4時間インキュベートした。次に、培地を除き、そしてホルマザン結晶を、100μl/ウェルのDMSOにより可溶化した(又は他方では、100μl/ウェルのSDSにより可溶化し、そしてさらに4時間インキュベートした)。生存画分を、生存細胞の数に正比例する、Multiskan Spectrum UV/Visマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific)を用いて、540nm(SDS可溶化のためには570nm)での吸光度を測定することに決定した。
イオン化放射線(X線)と組み合わせたシスプラチン及びRSCのインビトロ毒性を、ヒト正常細胞(GM05757)において調べた。図10は、種々の濃度のシスプラチンによる12時間の処置、続く0−10Gy 225keV X−線照射による処置の後、ヒト正常細胞(GM05757)の細胞生存率を示す。96−ウェルプレートにおける細胞の生存性を、照射の12日後、MTTにより測定した。その結果は、正常細胞生存性が照射量とは無関係であることを示す。これは、化学療法薬物として高い毒性であるにもかかわらず、シスプラチンは放射線毒性を実質的に誘発しなかったことを確証する。従って、シスプラチンは、診療所での放射線増感剤として使用されて来た[Roseら,1999]。興味深いことは、図11〜13は、RSCについての類似する観察を示し、すなわち、イオン化放射線と組合して誘発される毒性は観察されなかった。それらの結果は、シスプラチンのように、開示されるRSCは、診療所での癌の放射線療法のための放射線増感剤として実質的に使用され得ることを示唆する。
前述のように、開示されるRSCは、イオン化放射線の存在下及び不在下で、正常細胞に対して低い親和性及び従って、低い毒性を有する。
5.1.材料及び方法
5.1.1.化学物質及び試薬
シスプラチン、ジクロロ−ジアミノ−ベンゼン(化合物A)、ブロモ−ジアミノ−ベンゼン(化合物D)、インスリン、及び3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を、Sigma-Aldrichから入手した。ジブロモ−ジアミノ−ベンゼン(ジブロモ−フェニレンジアミン、化合物B)を、TCI−Americから入手した。ジヨード−ジアミノベンゼン(化合物C)を、本願発明者等の実験室で合成し、精製し、そして結晶化し、そしてその構造及び純度を、NMR及び質量分析により試験した。MEM及びウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンG及びストレプトマイシンを、Hyclone Laboratorics (UT, USA)から入手した。シスプラチンの原液を、超純水又は塩溶液において新たに調製し、そして化合物A、B、C、Dの原液を純粋エタノールにおいて調製し、ここでエタノールの最終濃度は、細胞に処理した場合、≦1%であった。
ヒト皮膚二倍体線維芽細胞(GM05757細胞系)を直接、Coriell Cell Repositoryから入手し、ところがヒト子宮頚癌細胞系(HeLa、ATCC#: CCL-2; 又は ME-180)、ヒト卵巣癌細胞系(NIH:OVCAR-3、ATCC#: HTB-161)及びヒト肺癌細胞系(A549, ATCC#: CCL-185(商標登録))、並びにRPMI 1640、F-12K、McCoy’s 5A及びL-15培養培地を、American Type Culture Collection (ATCC)から直接入手した。ウシ胎児血清(FBS)を、Hyclone Laboratories (UT, USA)から入手した。GM05757正常細胞及びHeLasaibouを、10%FBS、100単位/mlのペニシリンG及び100μg/mlのストレプトマイシン(Hyclone)により補充されたMEM(Hyclone)下で培養した。ME−180、NIH:OVCAR−3、A549及びMDA−MB−231細胞のための完全成長培地は、10%FBSにより補充されたATCC−処方のMaCoy’s培地、20%FBSにより補充されたRPMI1640培地、10%FBSにより補充されたF−12K培地、及び10%FBSにより補充されたL−15培地(Leiboviz)であった。細胞は、5%CO2を含む、保湿雰囲気下で、37℃で維持された。
細胞生存性に対するRSCの放射線増感効果を、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイにより決定した。細胞を、96−ウェルプレートにおいて24時間、培養した(5×103個の細胞/ウェル)。培養培地を、新鮮な培養培地により交換し、そして薬物濃度を変えることにより、12時間インキュベートした。次に、細胞を、種々のX−線用量を伴って、2Gy/分の線量率で、225kV X−線(PRECISION X-RAD IR 225)により照射した。照射の後、細胞を6日間インキュベートした。次に、細胞生存性のMTTアッセイを実施した。手短には、1.2mMのMTT(Sigma)(すなわち、PBS中、12mMのMTT原液10μlを添加する)を含むフェノールレッドを有さない100μlの新規培地を、各ウェルに添加し、そして4時間インキュベートした。次に、培地を除き、そしてホルマザン結晶を、100μl/ウェルのDMSOにより可溶化した(又は他方では、100μl/ウェルのSDSにより可溶化し、そしてさらに4時間インキュベートした)。生存画分を、生存細胞の数に正比例する、Multiskan Spectrum UV/Visマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific)を用いて、540nm(SDS可溶化のためには570nm)での吸光度を測定することに決定した。
イオン化放射線(X線)と組み合わせたRSCのインビトロ放射線増感効果を、シスプラチン感受性ヒト子宮頸癌細胞系(HeLa又はME−180)、シスプラチン耐性ヒト卵巣癌(NIH:OVCAR−3、HTB−161)及びヒト肺癌(A549)細胞系において調べた。図14〜21は、種々の濃度を有するRSCでの12時間の処置、続いて種々の用量の225KeV−X線照射による処置の後、種々のヒト細胞の細胞生存率を示す。それらの結果は、化合物A、B、C及びDが、ヒト正常細胞についての結果に対して著しく対照的に、放射線用量依存性態様で及び放射線との相乗効果で、癌細胞の死滅を増強したことを示す(図11〜13)。X−線に対する癌細胞の放射線感受性が、RSCの存在により有意に増強されることが明白に見出される。例えば、約20%の癌細胞(ME−180)が、任意のRSCの不在下での50Gy X−線照射の後、生存し、ところが初期のすべての癌細胞は、ヒト正常細胞に対しては毒性を示さなかった、約100μMの化合物B又はDの存在により50Gyで死滅させられた。
本明細書に提供されるインビトロ結果は、RSC(化合物A/B/C/D)の存在が、正常細胞でなく、腫瘍細胞を死滅せしめるイオン化放射線の有効性を増強することを示す。従って、ヒト癌患者において、RSCは放射線療法の効力を増強すること思われるが、ところがその患者においては、最少の有害な副作用を誘発するか又は全く誘発しない。
6.1.材料及びプロトコル
6.1.1.試験群
実験における次の3種の群(群当たり5匹の生後6〜8週のSCIDマウス)は、表1に示されるとおりであった:(1)対象物(5%EtOH/培地);(2)化合物B 5%EtOH中、5mg/kg/培地;及び(3)化合物B 5%EtOH中、7mg/kg/培地。化合物Bは、10日間、毎日、IP注射された。
生後6〜8週のSCIDマウスを、この試験に使用し;典型的なRSCとしての化合物Bを、5%EtOH:95%(細胞培養)培地(約1:20)に溶解した。
生後6〜8週のSCIDマウスに、個々に計量し、そして上記試験群表に概略されるように、注射濃度について体重に応じて腹腔内(IP)注射した。化合物Bを、10日間、毎日、0.5及び7mg/kgでマウス中にIP注射により投与した。注射体積は、20gのマウス当たり200μlに基づいている。皮膚表面を、70%イソプロピルアルコールにより拭き、注射部位を清浄した。
マウスにおける全体の薬物毒性を、生存性アッセイ及び体重測定により観察し、そして急性薬物毒性を、血液採取及び組織学により測定した。肝毒性(ALT、ALP、AST)、腎毒性(血液BUN、クレアチニン)及び電解質(Na、K、等)を、HPLC−質量分析により分析した。マウスを、任意の物理的毒性について観察した。血液サンプルを、薬物注射の種々の時点で伏在静脈から採取した。試験の最後で、全臓器を取り出し、腸、肝臓及び腎臓毒性を評価した。
すべての動物を、投与後、1日当たり少なくとも1度、必要であると思われる場合、それ以上、前処置及び処置の間、死亡率及び羅患率について観察した。特に、動物を、病気の徴候、例えば体重減少、食欲の変化、挙動性の変化、例えば変更された歩行、無気力及びストレスの総症状についてモニターした。
全体的薬物毒性を、生存性アッセイ及び体重測定を通して、生後6〜8週のSCIDマウスにおいて試験し、そして急性薬物毒性を、肝毒性(ALT、ALP、AST)、腎毒性(血液BUN、クレアチニン)及び電解質(Na、K、等)の測定により試験した。図22に示されるように、マウスの生存率は100%であり、すなわち化合物Bは非毒性を示し、そしてマウス生存性に対して影響を及ぼさなかった。また、図23に明確に見られるように、化合物Bは時間と共にマウスの体重に対して影響を示さず、物理的毒物性も示さなかった。興味深いことには、図24〜26にまた、明確に示されるように、マウス実験及びヒトに使用されるシスプラチンの用量のおよそ10倍である、異常に高い用量で与えられる化合物Bは、マウスにおいて、観察できる急性毒性、すなわち肝毒性、腎毒性及び電解質における変化も誘発しなかった。
図22〜26に提供されるインビボ結果は、化合物Bがマウスにおける全く無いか又は最少の毒性、全体的な薬物毒性(マウス生存性及び体重に対する影響が存在しない)、及び急性毒性(肝毒性、腎毒性及びで電解質における変化も存在しない)を示さない刺激的な観察を明確に示した。それらの結果は、ヒト正常細胞に観察されるインビトロ結果(図6〜9に示される)と良く一致する。従って、RSCとしての化合物Bは、実際、非毒性であることが証明されている。
7.1.材料及び分析
7.1.1.データ収集及び分析:
血液サンプルを、マウス中への前記化合物のIP注射後、種々の時点で伏在静脈から採取し、そして次に、HPLC−質量分析法を用いて分析した。
SCIDマウスにおける典型的なRSCとしての化合物Bの薬物動態学(PK)及び薬力学(PD)を試験した。最初に、血液中の有意なレベルの化合物Bを検出した。第2に、図27に明白に示されるように、最高濃度の化合物Bが、i.p.注射の約20分で観察され、そして約3時間で、ほぼゼロに低下した。化合物Bが(腫瘍)組織で最大濃度に達するには長い時間を要すると思われる。観察される結果は、化合物Bが数時間以内に身体から良く排出され得ることを示し、このことは、化合物Bが卓越した薬物動態学及び薬力学を有することを示唆する。
8.1.材料及びプロトコル
8.1.1.試験群
実験における次の4群は、表2に示される通りである:(1)対照物(5%EtOH/培地);(2)15Gy X−線照射;(3)5%EtOH中、7mg/kgでの化合物B/培地;及び(4)5%EtOH中、7mg/kgでの化合物B/培地+15Gy X−線照射。
ME―180(ヒト子宮頸癌)細胞を、10%FBSにより補充されたATCC−処方のMcCoy’s5A培地において培養した。フラスコ中の細胞を、5%CO2を含む保湿雰囲気下で、37℃で維持した。細胞をPBSですすぎ、フラスコの底から離すためにトリプシン処理し、新鮮な増殖培地と共に混合し、そして遠心分離し、上清液を除いた。細胞を、接種のための適切な濃度まで、新鮮な培地により再懸濁した。注射体積は、動物当たり50μl(1×106個の細胞)であった。
ME−180腫瘍細胞を、27ゲージ針を用いて、50μlの体積で雌SCIDマウス(生後6〜8週)の左腓腹筋中に皮下移植した。これは、ヒト子宮頸癌の皮下(SC)異種移植マウスモデルとして確立された。
上記試験群表に概略されるように、マウスを個々に計量し、そして注射濃度について体重に応じて腹腔内注射した。注射体積は、20gのマウス当たり200μlに基づく。皮膚表面を、70%イソプロピルアルコールにより拭き、注射部位を清浄した。放射線を、X−rad225標的化照射器を用いて、腫瘍に与えた。
腫瘍サイズを、ノギス及びマイクロMRIを用いて、時間の関数として測定し、治療に関連した腫瘍増殖遅延を評価した。動物をまた、腫瘍測定の時間で計量した。マウスにおける腫瘍は、終了前、最大1000mm3に増殖した。
すべての動物を、投与後、1日当たり少なくとも1度、必要であると思われる場合、それ以上、前処置及び処置の間、死亡率及び羅患率について観察した。特に、動物を、病気の徴候、例えば体重減少、食欲の変化、挙動性の変化、例えば、変更された歩行、無気力及びストレスの総症状についてモニターした。
化合物B及びX−線照射を組み合わせたインビボ放射線増感(例えば、抗癌)効果を、ヒト子宮頸癌(ME−180)の異種移植マウス腫瘍モデルにおいて調べた。図28〜30に示されるように、前記腫瘍モデルにおける放射線又は化合物単独のみでの治療に比較して、X−線照射と化合物Bとの組み合わせは、腫瘍増殖の抑制を優位に増強したことが明白に見出される。この結果は、イオン化放射線と組合しての化合物Bが21日目まで、非常に有意な腫瘍増殖の遅延をもたらしたことを示す。単一用量(7mg/kg)の化合物及び15Gyの単一放射線用量が本実験において使用され、そして化合物Bが観察される全く無いか又は最少の全体的及び急性毒性を有する場合、それらの結果は複数の分割放射線療法に外挿され得(例えば、全治療過程について5×7mg/kg及び5×4Gyによる5分割用量が適用され得る)、結果的に治療効果の増強において最大の相乗効果が達成され得たことが予測される。
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Claims (17)
- 下記一般式III:
X及びYは独立して、C−H又はNであり;
R1及びR2の少なくとも1つはハロゲンであり、他方はハロゲン又はHである]
を有する化合物、又はその医薬的に許容できる塩を含む、放射線増感剤として使用するための医薬組成物。 - 1以上の医薬的に許容できる担体又は希釈剤を更に含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ハロゲンが、Cl、Br又はIから成る群から選択される、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が、下記構造式:
- 前記化合物が、下記構造式:
- 疾患の治療において放射線療法と組み合わせて使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が癌である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、精巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、頭部癌、頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、子宮体癌、膵臓癌、カポジ肉腫、副腎癌、白血病、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、子宮癌、皮膚癌、口腔癌、脳癌、脊髄癌、胆嚢癌、肉腫、癌腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫、及び胚細胞腫瘍から成る群から選択される、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、子宮頸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、頭頸部癌、又は膵臓癌である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、イオン化放射線によって治療できる非悪性疾患であり、前記非悪性疾患が、三叉神経痛、聴神経腫、重度の甲状腺眼症、翼状片、色素性絨毛結節性滑膜炎、ケロイド瘢痕成長、血管再狭窄、及び異所性骨化を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記組成物、及び前記イオン化放射線が、連続的に又は同時に投与される、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が、放射線標識されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が、3H、14C、32P、35S、43F、及び36Clから成る群から選択される1つ以上の原子で放射線標識される、請求項12に記載の医薬組成物。
- 腸内投与用、又は非経口投与用に製剤化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 経口投与用に製剤化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 静脈内投与用に製剤化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記組成物とイオン化放射線との組み合わせ療法が、さらに1つ以上の追加の癌療法を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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