JP6316193B2

JP6316193B2 - 乳がんの治療に使用されるフィトカンナビノイド

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Publication number: JP6316193B2
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Description

本発明は、乳がんの治療に使用されるフィトカンナビノイドに関する。第１の実施の形態では、本発明は、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用されるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の経口形態に関する。第２の実施の形態では、本発明は、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用されるフィトカンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）に関する。第３の実施の形態では、本発明は、乳がんの治療に使用される、又はがん転移を治療する、予防する若しくはそのリスクを低減するためのフィトカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）との組合せに関する。

乳がんは、細胞を無秩序に成長させる、乳腺細胞の成長の調節に関与する遺伝子における突然変異により発症する。通常、乳がんは小葉として知られる乳汁を産生する腺の細胞、又は乳管のいずれかにおいて発生する。より頻度の低い乳がんが間質組織において発生し得る。この間質組織には、乳房の脂肪組織及び線維性結合組織が含まれる。

乳がん細胞は時間とともに、転移として知られるプロセスにおいて、腋の下のリンパ節又は肺等の周囲組織に浸潤し得る。

乳がんのステージ、腫瘍のサイズ及びその成長速度は全て、提供される治療のタイプを決定する因子である。治療の選択肢には、腫瘍を摘出する外科手術、化学療法及びホルモン療法を含む薬剤治療、放射線療法並びに免疫療法が含まれる。

予後及び生存率は大きく異なる。５年相対生存率は、発症する乳がんのタイプに応じて９８％から２３％まで様々である。世界的には、乳がんは全てのがんの２３％を占め、乳がんの大半は女性で発症する。

特に進行形態の乳がんは、Ｈｅｒ２遺伝子のタンパク質産物の過剰発現をもたらす、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅を特徴とする。Ｈｅｒ２は「ヒト上皮成長因子受容体２」の略であり、ＥｒｂＢ−２としても知られる。

乳がんのおよそ１５％〜２０％がＨｅｒ２遺伝子の増幅を示す。この受容体は、細胞を分裂させる成長因子によって刺激される。成長因子の非存在下では、細胞は通常では成長を停止する。乳がんにおけるこの受容体の過剰発現は、治療に対する乳房腫瘍の抵抗性の増大及び疾患の再発と関連する。

化合物トラスツズマブはＨｅｒ２に対するモノクローナル抗体であり、ステージ１〜ステージ３のＨｅｒ２陽性乳がんの５年相対生存率をおよそ８７％まで改善しているが、トラスツズマブは非常に高価であり、全過程のコストがおよそ７００００ドルであるのに加え、患者のおよそ２％がその使用により顕著な心臓損傷を被る。

この療法の使用は、Ｈｅｒ２陽性腫瘍を有する患者の転帰を明らかに改善しているが、トラスツズマブに対する先天的及び後天的な抵抗性は依然として臨床的な課題である。実際に、Ｈｅｒ２陽性腫瘍の２５％しかトラスツズマブに応答せず、応答者の大部分が最終的に再発する。

カンナビノイドが種々のがん細胞株に対して抗増殖効果を有することが示されている。カンナビノイドであるＴＨＣ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤ、ＣＢＤＡ、ＣＢＧ及びＣＢＣ、並びにカンナビノイドＴＨＣ及びＣＢＤのＢＤＳを、ＤＵ−１４５（ホルモン感受性前立腺がん）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳がん）、ＣａＣｏ−２（結腸直腸がん）及びＣ６（神経膠腫細胞）を含む８つの異なる細胞株で試験した。さらに、純粋なカンナビノイドに加えて、約９５％（ｗ／ｗ）のそれぞれの主要カンナビノイドを含むＴＨＣの植物性薬剤物質（ＢＤＳ）及びＣＢＤのＢＤＳが使用された（非特許文献１）。

ＣＢＤは乳がんの幾つかの進行形態においてｉｄ−１遺伝子の発現を阻害することも示されている。使用された細胞株はＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４３６であった（非特許文献２）。

特許文献１において、McAllisterは、神経膠腫の治療におけるカンナビノイドであるＴＨＣとＣＢＤとの組合せの使用も記載している。さらに、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４３６（但し、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする細胞株ではない）によって例示されるように、乳がんの治療における使用についてＣＢＤが記載されている。神経膠腫では、この組合せは、高い比率のＴＨＣと低い比率のＣＢＤとからなるものであった（４：１ＴＨＣ：ＣＢＤ）。かかる組成物に関する問題は、高い比率のＴＨＣが精神病及び不安症等の副作用をもたらすことである。この研究は非特許文献３に更に記載されている。

本出願人自身も、特許文献２において、がんの治療におけるカンナビノイド、特にテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）との組合せの使用を記載している。特に、治療対象のがんは脳腫瘍、より具体的には神経膠腫、更により具体的には多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。

非特許文献４は、ＴＨＣが細胞周期増殖を阻害する機構を記載し、乳がんの動物モデルにおけるＴＨＣの使用を記載している。

最近では、非特許文献５が、細胞培養物、異種移植マウスを含む種々の乳がんモデル、最近ではＥｒｂＢ２陽性乳がんの遺伝子操作マウスモデルにおけるＴＨＣの抗腫瘍作用を立証しており、ＴＨＣは腫瘍周囲に注射している。

非特許文献６は、カンナビジオールがアポトーシスと自食作用との間のクロストークを調整することによって乳がん細胞においてプログラム細胞死を誘導する方法を記載している。

国際公開第２００８／１４４４７５号国際公開第２００９／１４７４３９号

Ligresti, 2006 McAllister et al. 2007 McAllister et al. 2010 Caffarel et al. (2006, 2008) Caffarel et al. 2010 Shrivastava (2011)

乳がんはこのように重大な問題であり、既存の治療の長期的な成功は限られているため、患者の予後を改善し得る代替的な治療を特定することが本発明の主目的である。

一態様では、乳がんのこのサブセットを有する患者の約２５％しか既存の最適な薬剤であるトラスツズマブに応答せず、治療者の多くが再発し、肺及びリンパ節において二次腫瘍を形成する原発性がんから転移した二次腫瘍によって死亡するため、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療を提供することが更なる目的である。

本発明の第１の態様によれば、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用されるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の経口形態が提供される。

この態様は、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用される薬物の製造、及びその治療方法自体にも及ぶ。

本発明の第２の態様によれば、Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用されるカンナビジオール（ＣＢＤ）が提供される。

本発明の第３の態様によれば、乳がんの治療に使用される、又はがん転移を治療する、予防する、若しくはそのリスクを低減するためのテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）との組合せが提供される。

この態様は、乳がんの治療に使用される、又はがん転移を治療する、予防する、若しくはそのリスクを低減するための薬物の製造、及びその治療方法自体にも及ぶ。

ＴＨＣとＣＢＤとの組合せは、リンパ節又は肺のがんを治療又は予防するためにも使用することができる。

好ましくは、ＴＨＣとＣＢＤとの組合せは、１５：１〜１：１５（ＴＨＣ：ＣＢＤ）、より好ましくは３：１〜１：１０（ＴＨＣ：ＣＢＤ）、更に最も好ましくは１：４〜１：１０（ＴＨＣ：ＣＢＤ）の比率である。

好ましくは、ＴＨＣ、ＣＢＤ又はその組み合わせは植物性薬剤物質（ＢＤＳ）の形態である。

ＴＨＣ、ＣＢＤ又はその組み合わせは治療的に許容可能な量で存在し、その量は例えば１ｍｇ〜２０００ｍｇであり得る。

ヒト等価用量（ＨＥＤ）は、以下の式を使用して評価することができる：
ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物のＫ_ｍ／ヒトのＫ_ｍ）
マウスのＫ_ｍは３であり、ヒトのＫ_ｍは３７である。

ＴＨＣ、ＣＢＤ又はその組合せは、非カンナビノイド化学療法剤を更に含み得る。

非カンナビノイド化学療法剤がモノクローナル抗体、例えばトラスツズマブであり得る。

本発明の第４の態様によれば、乳がんの治療に使用される、又はがん転移を治療する、予防する、若しくはそのリスクを低減するためのテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）との組合せを含む組成物であって、ＴＨＣとＣＢＤとの比率が３：１〜１：１０（ＴＨＣ：ＣＢＤ）である、組成物が提供される。

本明細書においては以下の用語を使用しているが、これらの用語は、以下の意味／定義を有することを意図している。

「カンナビノイド」は、エンドカンナビノイド、フィトカンナビノイド、及びエンドカンナビノイドでも又はフィトカンナビノイドでもないもの（以下「シントカンナビノイド（syntho-cannabinoids）」）を含む化合物の一群である。

「エンドカンナビノイド」は、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体の高親和性リガンドである、内因性のカンナビノイドである。

「フィトカンナビノイド」は、自然を起源とし、大麻植物中に見出すことができるカンナビノイドである。フィトカンナビノイドは、植物性薬剤物質を含む抽出物中に存在していても、単離されていても、又は合成的に生産されていてもよい。

「シントカンナビノイド」は、カンナビノイド受容体（ＣＢ１及び／又はＣＢ２）と相互作用することが可能な化合物であるが、内因的に又は大麻植物中には見出されない。例としては、ＷＩＮ５５２１２及びリモナバンが挙げられる。

「単離フィトカンナビノイド」は、大麻植物から抽出され、全ての付加的な成分、例えば第２のカンナビノイド及び微量カンナビノイド並びに非カンナビノイド画分が除去されたような程度まで精製されているフィトカンナビノイドである。

「合成カンナビノイド」は、化学合成によって生成されたカンナビノイドであり、この用語は、例えばその薬学的に許容可能な塩を形成することによって、単離フィトカンナビノイドを改質することを含む。

「植物性薬剤物質」又は「ＢＤＳ」は、植物性薬剤製品産業用指針（ドラフト指針、２０００年８月、米国保健社会福祉省、食品医薬品局、薬剤評価研究センター）（Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, August 2000, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation and Research）において、「１つ又は複数の植物、藻類又は微細真菌類由来の薬剤。ＢＤＳは、以下のプロセスのうちの１つ又は複数によって、植物性原材料から調製される：微粉砕、浸出、圧搾、水抽出、エタノール抽出、又は他の類似のプロセス。」と定義される。植物性薬剤物質は、天然供給源由来の高度に精製された又は化学的に修飾された物質を含まない。したがって、大麻の場合、大麻植物由来のＢＤＳは、高度に精製された薬局方グレードのカンナビノイドを含まない。

本発明では、ＢＤＳは、フィトカンナビノイド含有成分及び非フィトカンナビノイド含有成分という２つの成分を有すると考えられる。好ましくは、フィトカンナビノイド含有成分は、総ＢＤＳの５０％（ｗ／ｗ）超を構成するより大量の成分であり、非フィトカンナビノイド含有成分は、総ＢＤＳの５０％（ｗ／ｗ）未満を構成するより小量の成分である。

ＢＤＳ中におけるフィトカンナビノイド含有成分の量は、総抽出物の５５％を超え、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％〜８５％以上であり得る。実際の量は、使用する出発材料及び使用する抽出方法に応じて異なる可能性がある。

ＢＤＳ中における「第１のフィトカンナビノイド」は、他のフィトカンナビノイドの量より多い量で存在するフィトカンナビノイドである。好ましくは第１のフィトカンナビノイドは、総抽出物の４０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。より好ましくは第１のフィトカンナビノイドは、総抽出物の５０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。更により好ましくは第１のフィトカンナビノイドは、総抽出物の６０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。

ＢＤＳ中における第１のフィトカンナビノイドの量は、好ましくはフィトカンナビノイド含有画分の５０％を超え、更により好ましくはフィトカンナビノイド含有画分の５５％を超え、更により好ましくはフィトカンナビノイド含有画分の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％及び９５％を超える。

ＢＤＳ中における「第２のフィトカンナビノイド（複数も可）」は、顕著な割合で存在するフィトカンナビノイド（複数も可）である。好ましくは第２のフィトカンナビノイドは、総抽出物の５％（ｗ／ｗ）を超える、より好ましくは総抽出物の１０％（ｗ／ｗ）を超える、更により好ましくは総抽出物の１５％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。ＢＤＳの中には、顕著な量で存在する２つ以上の第２のフィトカンナビノイドを有するものがある。しかしながら、全てのＢＤＳが第２のフィトカンナビノイドを有する訳ではない。

ＢＤＳ中における「微量フィトカンナビノイド（複数も可）」は、第１のフィトカンナビノイド及び第２のフィトカンナビノイドを計上した際の、全てのフィトカンナビノイド成分のうちの残りと説明することができる。好ましくは微量フィトカンナビノイドは、合計で、総抽出物の５％（ｗ／ｗ）未満の量で存在し、最も好ましくは、微量フィトカンナビノイドは、総抽出物の２％（ｗ／ｗ）未満の量で存在する。

「本質的に〜からなる」という用語は、記載されるフィトカンナビノイドに限定されるものであり、この用語は、存在する可能性もある非カンナビノイド成分を除外しない。

典型的には、ＢＤＳの非フィトカンナビノイド含有成分は、テルペン、ステロール、トリグリセリド、アルカン、スクアレン、トコフェロール及びカロテノイドを含む。

これらの化合物は、単独で又はフィトカンナビノイドと組み合わせて、ＢＤＳの薬理において重要な役割を果たし得る。

「テルペン画分」が重要な場合があり、モノテルペン又はセスキテルペンのテルペン種に分類することができる。これらのテルペン成分は、カンナビノイドと同様に更に既定することができる。

ＢＤＳ中における非フィトカンナビノイド含有成分の量は、総抽出物の４５％を下回り、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％〜１５％以下であり得る。実際の量は、使用する出発材料及び使用する抽出方法に応じて異なる可能性がある。

ＢＤＳ中における「第１のモノテルペン（複数も可）」は、他のモノテルペンの量より多い量で存在するモノテルペンである。好ましくは第１のモノテルペン（複数も可）は、総テルペン含有量の２０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。より好ましくは第１のモノテルペンは、総テルペン含有量の３０％（ｗ／ｗ）を超える、更により好ましくは総テルペン含有量の４０％（ｗ／ｗ）を超える、更により好ましくは総テルペン含有量の５０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。第１のモノテルペンは好ましくはミルセン又はピネンである。幾つかの場合では２つの第１のモノテルペンが存在する場合がある。この場合、第１のモノテルペンは好ましくはピネン及び／又はミルセンである。

ＢＤＳ中における「第１のセスキテルペン」は、他の全てのセスキテルペンより多い量で存在するセスキテルペンである。好ましくは第１のセスキテルペンは、総テルペン含有量の２０％（ｗ／ｗ）を超える、更により好ましくは総テルペン含有量の３０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。第１のセスキテルペンは好ましくはカリオフィレン及び／又はフムレンである。

セスキテルペン成分は「第２のセスキテルペン」を有し得る。第２のセスキテルペンは好ましくはピネンであり、好ましくは総テルペン含有量の５％（ｗ／ｗ）を超える量で存在し、より好ましくは第２のセスキテルペンは総テルペン含有量の１０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。

第２のセスキテルペンは好ましくはフムレンであり、好ましくは総テルペン含有量の５％（ｗ／ｗ）を超える量で存在し、より好ましくは第２のセスキテルペンは総テルペン含有量の１０％（ｗ／ｗ）を超える量で存在する。

代替的には、植物性抽出物を、無カンナビノイド（zero cannabinoid）植物又はテルペン等の大麻植物で見出された１つ若しくは複数の非カンナビノイド成分から得ることができるような非カンナビノイド植物画分中に単離フィトカンナビノイド又はその合成等価体を導入することによって、調製することができる。

フィトカンナビノイドＣＢＤ及びＴＨＣの構造は、以下に示すとおりである：

フィトカンナビノイドは、カンナビノイドを抽出するために使用される方法に応じて、中性形態（脱カルボキシル化形態）又はカルボン酸形態として見出すことができる。例えば、カルボン酸形態の加熱によって、カルボン酸形態の大部分が脱カルボキシル化されて中性形態となることが知られている。

合成フィトカンナビノイドを使用する場合、この用語は、化合物、その代謝生成物又は誘導体、及びかかる化合物の薬学的に許容可能な塩を含むことを意図する。

「薬学的に許容可能な塩」という用語は、当業者には既知であるような、無機塩基又は無機酸及び有機塩基又は有機酸を含む薬学的に許容可能な非毒性の塩基又は酸から調製される塩又はエステルを表す。多くの好適な無機塩基及び有機塩基が当該技術分野において既知である。

本発明の目的上、「治療」という用語は、がん細胞の生存度及びそれらが転移する能力を低下させることを包含することを意図し、治療的に有効な量とは、この目的が達成される量である。

本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、以下で更に記載する。

ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞株がＴＨＣに感受性を有することを示す図である。ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞株がＴＨＣ及びＣＢＤに感受性を有することを示す図である。最大下濃度のＴＨＣとＣＢＤとの組合せが乳がん細胞の死を増進することを示す図である。ＴＨＣとＣＢＤとの組合せが乳がん細胞の生存度を相乗的に低下させることを示す図である。ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞株がｉｎｖｉｖｏでＴＨＣに感受性を有することを示す図である。ヒトＢＴ４７４細胞がｉｎｖｉｖｏでフィトカンナビノイドに感受性を有することを示す図である。フィトカンナビノイドがｉｎｖｉｖｏでトラスツズマブの抗腫瘍作用を改善することを示す図である。ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞が種々のＴＨＣ：ＣＢＤの比率に感受性を有することを示す図である。高度に転移性のＨｅｒ２陽性乳がん細胞がＴＨＣ及びＣＢＤに感受性を有することを示す図である。トラスツズマブ抵抗性のＨｅｒ２陽性乳がん細胞株がＴＨＣ及びＣＢＤに感受性を有することを示す図である。最大で１：９の比率でのＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、トリプルネガティブ乳がん細胞の生存度を低減することを示す図である。ＴＨＣ及びＣＢＤがトリプルネガティブ乳がん細胞の生存度を相加的に低減することを示す図である。１：９の比率でのＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳がん細胞の生存度を有意に低減することを示す図である。ＴＨＣ及びＣＢＤが、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳がん細胞の生存度を相加的に低減することを示す図である。１：９の比率でのＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、Ｈｅｒ２を過剰発現するトラスツズマブ抵抗性の乳がん細胞の生存度を低減することを示す図である。ＴＨＣ及びＣＢＤが、Ｈｅｒ２を過剰発現するトラスツズマブ抵抗性の乳がん細胞の生存度を相加的に低減することを示す図である。１：９の比率でのＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、Ｈｅｒ２を過剰発現する高度に転移性の乳がん細胞の生存度を低減することを示す図である。ＴＨＣ及びＣＢＤが、Ｈｅｒ２を過剰発現する高度に転移性の乳がん細胞の生存度を相加的に低減することを示す図である。ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞が、ｉｎｖｉｖｏで１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せに感受性を有することを示す図である。

図面の説明
図１：
ヒト起源の種々の乳がん細胞株における、ウエスタンブロット法によって決定される（Ａ）Ｈｅｒ２並びに（Ｂ）ＣＢ_１受容体及びＣＢ_２受容体の発現。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＭＣＦ−７細胞をＨｅｒ２陰性対照として使用した。Ｕ３７３−ＭＧ細胞及びジャーカット細胞を、それぞれＣＢ_１受容体発現及びＣＢ_２受容体発現の陽性対照として使用した。（Ｃ）２μＭのＳＲ１４４５２８（ＳＲ）を含む又は含まない６μＭ（ＢＴ４７４）又は３μＭ（ＳｋＢｒ３）のＴＨＣに応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定されるＢＴ４７４細胞及びＳｋＢｒ３細胞の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ビヒクル処理細胞に対して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１；ＴＨＣ処理細胞に対して、＃ｐ＜０．０５。

図２：
ＴＨＣ又はＣＢＤの濃度の増大に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定されるＳｋＢｒ３細胞（左パネル）及びＢＴ４７４細胞（右パネル）の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＝３。

図３：
単独の又は組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの指示濃度に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定されるＢＴ４７４細胞の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＝３。

図４：
ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて算出される、ＢＴ４７４細胞における５０％、７５％及び９０％の細胞死のアイソボログラム。ｎ＝３。

図５：
皮下異種移植片をＢＴ４７４細胞から作製し、動物を図に示されるように処理した。グラフは平均腫瘍体積を表す。

図６：
皮下異種移植片をＢＴ４７４細胞から作製し、動物を指示薬剤で経口処理した。グラフは平均腫瘍体積を表す。

図７：
皮下異種移植片をＢＴ４７４細胞から作製し、動物を指示薬剤で経口又はＩＰ処理した。グラフは平均腫瘍体積を表す。

図８：
単独の又は指示比率で組み合わせたＴＨＣ又はＣＢＤに応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定されるＢＴ４７４細胞の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＝４。組合せについては、最終カンナビノイド濃度をＸ軸に示す。例えば、最終濃度１μＭに対応する一連のバーでは、１：１０の比率でチャレンジした細胞には０．０９μＭのＴＨＣ及び０．９１μＭのＣＢＤを与えた。

図９：
ＴＨＣ（左パネル）又はＣＢＤ（右パネル）の濃度の増大に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定される指示細胞（詳細については方法のセクションを参照されたい）の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＝３。

図１０：
ＴＨＣ（左パネル）又はＣＢＤ（右パネル）の濃度の増大に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定される指示細胞の７２時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＝３。

図１１：
単独の又は組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの指示濃度に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の４８時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＞３。

図１２：
ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて算出される、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における有効量５０（ＥＤ５０）、有効量７５（ＥＤ７５）及び有効量９０（ＥＤ９０）についてのアイソボログラム。有効量Ｘは、Ｘ％の細胞死を誘導するカンナビノイド濃度と定義される。対応するＥＤについて得られた併用指数（ＣＩ）の値を示す。ｎ＞３。

図１３：
単独の又は組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの指示濃度に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定される、がん遺伝子Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の４８時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＞３。

図１４：
ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて算出される、Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における有効量５０（ＥＤ５０）、有効量７５（ＥＤ７５）及び有効量９０（ＥＤ９０）についてのアイソボログラム。有効量Ｘは、Ｘ％の細胞死を誘導するカンナビノイド濃度と定義される。対応するＥＤについて得られた併用指数（ＣＩ）の値を示す。ｎ＞３。

図１５：
単独の又は組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの指示濃度に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定される、Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトラスツズマブ抵抗性クローンの４８時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＞３。

図１６：
ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて算出される、Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するトラスツズマブ抵抗性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のクローンにおける有効量５０（ＥＤ５０）、有効量７５（ＥＤ７５）及び有効量９０（ＥＤ９０）についてのアイソボログラム。有効量Ｘは、Ｘ％の細胞死を誘導するカンナビノイド濃度と定義される。対応するＥＤについて得られた併用指数（ＣＩ）の値を示す。ｎ＞３。

図１７：
単独の又は組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの指示濃度に応答した、ＭＴＴ比色試験によって決定される、Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の高度に転移性のクローンの４８時間の生存度。データは、１００％に設定したビヒクル処理細胞に対する％として表す。ｎ＞３。

図１８：
ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて算出される、Ｈｅｒ２を安定に過剰発現する高度に転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のクローンにおける有効量５０（ＥＤ５０）、有効量７５（ＥＤ７５）及び有効量９０（ＥＤ９０）についてのアイソボログラム。有効量Ｘは、Ｘ％の細胞死を誘導するカンナビノイド濃度と定義される。対応するＥＤについて得られた併用指数（ＣＩ）の値を示す。ｎ＞３。

図１９：皮下異種移植片をＢＴ４７４細胞から作製し、動物をこの説明に示されるように処理した（実験の詳細については方法のセクションを参照されたい）。ＴＨＣ及びＣＢＤの両方をＢＤＳ形態で投与した。グラフは平均腫瘍体積を表す。

以下の実施例は、Ｈｅｒ２陽性の乳がんにおけるカンナビノイドＴＨＣ及びＣＢＤの有効性を実証するものである。このタイプの乳がんは、非常に進行性の臨床経過を特徴とする乳房腫瘍のサブセットである。これらの腫瘍は現在、Ｈｅｒ２に対するヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブで治療されている。

実施例１：Ｈｅｒ２陽性乳がん細胞株に対するテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）のｉｎｖｉｔｒｏでの効果
材料及び方法
２つの異なるＨｅｒ２陽性ヒト乳がん細胞株（ＳｋＢｒ３及びＢＴ４７４）の生存度に対する、単独の及び組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの効果を試験した。

簡潔に述べると、細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（ＳｋＢｒ３）又はＤＭＥＭ（ＢＴ４７４）中でインキュベートした。１２時間の血清飢餓の後、細胞を種々の濃度のＴＨＣ又はＣＢＤ（又は対応するビヒクル、ＤＭＳＯ）で７２時間チャレンジした。次いで、細胞生存度を比色ＭＴＴ試験によって決定した。

組み合わせた薬剤の効果の分析を、ＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアを用いて行った。ＴＨＣとＣＢＤとの組合せが相加的又は相乗的であることを決定するために、種々の併用指数（ＣＩ）を、Chou and Talalayによるアルゴリズムを用いてＣａｌｃｕＳｙｎｖ２．０ソフトウェアで算出した。

結果
細胞株ＢＴ４７４及びＳｋＢｒ３は初めに、Ｈｅｒ２（図１Ａ）及びＣＢ_２受容体（図１Ｂ）を発現すること、並びに細胞株の生存度がＴＨＣへの曝露によって低下すること（図１Ｃ）、並びにこの効果がＣＢ_２選択的なアンタゴニストＳＲ１４４５２８によって妨げられるため、ＣＢ_２受容体の活性化によって媒介されること（図１Ｃ）が実証された。

次いで、この２つの細胞株を種々の濃度のＴＨＣ及びＣＢＤでチャレンジした。図２に示されるように、ＳｋＢｒ３細胞及びＢＴ４７４細胞の生存度が、ＴＨＣ及びＣＢＤに応答して濃度に伴って低減した。量的には、効果は両方のカンナビノイドについて実質的に同一であった。

次いで、ＢＴ４７４細胞を１：１の比率での種々の濃度のＴＨＣとＣＢＤとの組合せに曝露した。興味深いことに、低濃度（１μＭ未満）のカンナビノイドの組合せ（単独で投与した場合に細胞生存度に対して効果を有しない濃度）が、細胞培養物の生存度を有意に低くしたことが観察された（図３）。

以下の表１．１に示すようなＣＩ値が得られ、全てのＣＩ値が１未満であり、これによりこれらの化合物が強い相乗効果をもたらすことが示された。

この相乗効果（synergism）は、図４に示すアイソボログラムにおいても観察することができる。このグラフは、細胞生存度を５０％（ＥＤ５０）、７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）低下させるカンナビノイド濃度を選択することによって作成した。各々のＥＤについて、ソフトウェアは、（ｉ）単剤として投与した場合にその特定の効果をもたらすＴＨＣ及びＣＢＤの濃度を結ぶ線をプロットし、（ｉｉ）かかる効果をもたらすのに必要とされる、組合せとして適用されるＴＨＣ及びＣＢＤの濃度を示す点を生成する。線が直線である場合、この２つの化合物が単純な相加効果をもたらすことを意味し、点はその線上に見られるものとする。本明細書中で実証される例では、線は下方に曲がり、点はそれより下に見られ、これにより組合せとして投与した場合に、同じ効果を得るために必要とされるカンナビノイドがより少量であることが示された。両方の観察結果から、ＴＨＣとＣＢＤとの組合せが相乗効果を有することが確認される。

結論
この結果は、低用量のＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、ヒトＨｅｒ２陽性乳がん細胞において有意な抗増殖効果を有することを実証する。

重要なことには、単独で投与した場合に必要とされるＴＨＣの用量の半分で相乗効果が達成された。この観察結果は、ＴＨＣの用量を低減し、結果として、その効力に影響を与えることなく任意の潜在的副作用を減らす又は排除する可能性があるため、乳房腫瘍に対するカンナビノイドベースの療法の開発にとって重要な意味を有し得る。

これらのデータは、非常に進行性の臨床経過、従来の標的療法に対する応答性の低下、及び高い再発頻度を特徴とする乳房腫瘍のサブセットであるＨｅｒ２陽性乳がんの管理のためのカンナビノイドベースの療法の使用について強力な証拠を提供する。

実施例２：Ｈｅｒ２陽性乳がん細胞株に対するテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）のｉｎｖｉｔｒｏでの効果
材料及び方法
異所性異種移植片を、５×１０^６個のヒトＢＴ４７４細胞（Ｈｅｒ２陽性ヒト乳がん細胞）の皮下注射によって作製した。動物を１１個の実験群に分け（８動物／群）、腫瘍が２００ｍｍ^３に達した時点で、４週間にわたって以下の表２．１に詳述されるように処理した。

種々の投与経路を、ＴＨＣ、ＣＢＤ及びトラスツズマブの種々の組合せとともに試験した。

カンナビノイドＴＨＣ及びＣＢＤは、植物性薬剤物質（ＢＤＳ）の形態であり、主要なカンナビノイドは他のカンナビノイド成分及び非カンナビノイド画分とともに存在する。

ＴＨＣ及びＣＢＤのＢＤＳにおける種々のカンナビノイドの相対量を以下の表２．２に示す。プラス又はマイナス２５％（ｗ／ｗ）の変動が、使用される抽出方法に応じてＢＤＳ成分で生じ得ることを理解されたい。

この期間中、外部キャリパーを用いて腫瘍を定期的に測定し、それらの体積を（４π／３）×（幅／２）^２×（長さ／２）として算出した。

結果
ＴＨＣの経口投与は、腫瘍成長を有意に低減し、興味深いことに、この投与経路はＩＰ投与よりも有効であった（図５）。

この結果は、このモデルにおけるＣＢＤの重要な抗腫瘍効果も明らかに示している（図６）。加えて、１：１の比率でのＴＨＣとＣＢＤとの組合せは、単独の各々のカンナビノイドよりも大きな効果を有していた（図６）。

ＴＨＣ及びＣＢＤの両方が、トラスツズマブの抗腫瘍作用を、特に組み合わせて投与した場合に改善することが可能であった（図７）。最良の抗腫瘍応答は、トラスツズマブを含まない高用量のＴＨＣとＣＢＤとの組合せによって得られた（図７）。

結論
これらのデータから、ヒトＨｅｒ２陽性がん細胞がｉｎｖｉｖｏでフィトカンナビノイドに感受性を有することが実証される。実際に、ＴＨＣとＣＢＤとの組合せは、標準的治療のトラスツズマブよりも有効であり、進行型の乳がんの治療におけるこれらのカンナビノイドの積極的な適用につながる。

実施例３：Ｈｅｒ２陽性乳がん細胞株に対する種々の比率のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）のｉｎｖｉｖｏでの効果
ＣＢＤは乳がんにおいて顕著な抗腫瘍特性を有することが示されている。この化合物が非常に安全なプロファイルを有することから、併用治療において精神活性化合物ＴＨＣの割合を減少させることができるかを決定するために実験を行った。

材料及び方法
ＢＴ４７４細胞の生存度に対する、単独の及び種々の比率で組み合わせたＴＨＣ及びＣＢＤの効果を調査した。

細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中でインキュベートした。１２時間の血清飢餓の後、細胞を表３．１に記載されるように７２時間チャレンジした。次いで、細胞生存度を比色ＭＴＴ試験によって決定した。

結果
これらのデータから、ＴＨＣの割合が１：１０と低いＴＨＣとＣＢＤとの組合せが、細胞生存度を低下させるのに１：１の比率のものより有効であったことが示される（図８）。

結論
ヒトＨｅｒ２陽性がん細胞は、細胞培養物及びｉｎｖｉｖｏの両方においてフィトカンナビノイドに感受性を有する。ＴＨＣの比率を１：１０（ＴＨＣ：ＣＢＤ）まで低下させることが、カンナビノイドの組合せの有効性においていかなる差異も生じなかったことは注目に値する。

このように、比率を変えた（ratioed）ＴＨＣとＣＢＤとの組合せは、たとえあったとしても、ごく僅かな副作用で進行形態の乳がんの治療に使用することができる。

実施例４：トラスツズマブ抵抗性の乳がん細胞株に対するテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）の効果
材料及び方法
Ｈｅｒ２を異所的に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（２３１−Ｈｅｒ２）、２３１−Ｈｅｒ２の高転移型（２３１−Ｍｅｔ）、及び３つの異なるトラスツズマブ抵抗性の２３１−Ｈｅｒ２由来細胞株（ＴｒＲ１、ＴｒＲ２及びＴｒＲ３）という、一連のＨｅｒ２陽性ヒト乳がん細胞株の生存度に対するＴＨＣ及びＣＢＤの効果を試験した。

細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中でインキュベートした。１２時間の血清飢餓の後、細胞を種々の濃度のＴＨＣ又はＣＢＤ（又は対応するビヒクル、ＤＭＳＯ）で７２時間チャレンジした。次いで、細胞生存度を比色ＭＴＴ試験によって決定した。

結果
図９に示されるように、高度に転移性の２３１−Ｈｅｒ２細胞株の生存度は、ＴＨＣ又はＣＢＤの濃度の増大に応答して低下し、ＩＣ_５０値は両方の化合物で実質的に同一であった。

類似の研究をトラスツズマブ抵抗性の細胞を用いて行ったが、結果は類似していた。これらの細胞株の生存度は、フィトカンナビノイドに応答して濃度依存的に低下した（図１０）。

結論
まとめると、これらの結果から、これらの細胞が何らかの分子変化を受け、極めて進行性（高度に転移性又はトラスツズマブ抵抗性）となったとしても、フィトカンナビノイドは依然として、これらの細胞の生存度及び転移能力を低下させるのに有効な作用物質であることが示唆される。

実施例５：トラスツズマブ抵抗性の乳がん細胞株に対するテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）との組合せの効果
材料及び方法
先の実施例から、１：９のＴＨＣ：ＣＢＤが、ｉｎｖｉｔｒｏでのＢＴ４７４細胞の生存度を低下させるのに１：１の比率のものと同じくらい有効であることが実証される。ｉｎｖｉｖｏでのＢＴ４７４細胞における１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せの効果を実証するこのデータは本実施例において提示される。加えて、トラスツズマブ抵抗性及び高度に転移性の、Ｈｅｒ２を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するかかる組合せのｉｎｖｉｔｒｏでの効果も実証される。

Ｈｅｒ２陽性がん細胞に対する１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せのｉｎｖｉｔｒｏでの効果を、対応する図面の説明で指示されるカンナビノイド濃度で以下の細胞株をチャレンジすることによって実証した。
ＦＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ（Ｈｅｒ２を過剰発現しない）ヒト乳がん細胞株
２３１−Ｈｅｒ２Ｈｅｒ２を安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
２３１−Ｈｅｒ２−Ｍｅｔ高度に転移性の２３１−Ｈｅｒ２由来細胞株
２３１−Ｈｅｒ２−ＴｒＲトラスツズマブ抵抗性の２３１−Ｈｅｒ２由来細胞株

細胞をカンナビノイドの存在下で４８時間インキュベートし、細胞生存度をＭＴＴ比色試験によって評価した。

ヒトＨｅｒ２陽性乳がんに対する種々のＴＨＣ：ＣＢＤの比率のｉｎｖｉｖｏでの効果を研究するために、免疫不全雌性マウスにおいて、５×１０^６個のＢＴ４７４細胞を皮下注射することによって異所性異種移植片を作製した。動物を７つの実験群（８動物／群）に分け、腫瘍が２００ｍｍ^３に達した時点で（通常は、がん細胞注射の４０日後）、以下の表に指示されるように処理を開始した。

外部キャリパーを用いて腫瘍を定期的に測定し、体積を（４π／３）×（幅／２）^２×（長さ／２）として算出した。

結果
先の実施例から、ＴＨＣが総カンナビノイド濃度の僅か１０分の１に過ぎないＴＨＣ：ＣＢＤの組合せが、がん遺伝子Ｈｅｒ２を天然に過剰発現するヒト乳がん細胞（ＢＴ４７４細胞）の生存度を低減するのに、１：１の比率のものと同じくらい有効であることが実証された。

本実施例は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来細胞株を用いる類似の実験を実証するものである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ｉｎｖｉｖｏで腫瘍及び転移を形成するそれらの能力のために、乳がん研究において広く使用されている。しかしながら、この細胞株はＨｅｒ２を発現しない。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＨｅｒ２陽性乳がんモデルへと変換するために、Ｈｅｒ２を安定にトランスフェクトした２３１細胞（２３１−Ｈｅｒ２）及びそれらに由来する２つのクローン（一方はトラスツズマブ治療に対する抵抗性を示し（２３１−Ｈｅｒ２−ＴｒＲ）、他方は転移能が増大している（２３１−Ｈｅｒ２−Ｍｅｔ））を使用した。

図１１から、トリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＴＨＣ及びＣＢＤの両方に感受性を有することが実証される。図１１から示唆され、図１２において実証されるように、１：１の割合でのこの２つのフィトカンナビノイドの組合せは相加的効果を有する。ＴＨＣの割合を１：９の比率にまで低下させた場合に、類似の効果が察された（図１１及び図１２）。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＨｅｒ２がん遺伝子の過剰発現は、フィトカンナビノイドに対する応答性を変更しなかった（図１３及び図１４）。したがって、これらの細胞の生存度は、ＴＨＣ及びＣＢＤ単独の濃度の増大に応答して減少し、１：１及び１：９の組合せの両方が同じ相加的効果を有していた（図１３及び図１４）。

トラスツズマブ抵抗性（図１５及び図１６）及び高度に転移性（図１７及び図１８）のＨｅｒ２陽性細胞は、単独の又は組み合わせたフィトカンナビノイドに応答して、細胞生存度の点でそれらの対照（２３１−Ｈｅｒ２）として働く。２３１細胞株及び２３１−Ｈｅｒ２細胞株については、１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの比率が１：１の組合せと同じくらい有効であった（図１５〜図１８）。

Ｈｅｒ２陽性細胞に対するｉｎｖｉｖｏでのフィトカンナビノイドの組合せの効果も調査した。ＢＴ４７４皮下異種移植片は、ＴＨＣ−ＢＤＳ及びＣＢＤ−ＢＤＳ単独に応答して成長が減少した（図１９）。１：１の比率でのこの２つのカンナビノイドの組合せは、化合物単独と同じ効果をもたらす。興味深いことに、１：９の組合せが最も強い抗腫瘍応答を誘導した（図１９）。

結論
これらのデータから、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び２３１−Ｈｅｒ２細胞がＴＨＣ及びＣＢＤ単独に対して等しく感受性を有すること、１：１のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せが２３１細胞及び２３１−Ｈｅｒ２細胞に対してｉｎｖｉｔｒｏで相加的効果を有すること、並びに１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せが、細胞生存度を低下させるのに１：１の組合せと同じように有効であることが実証される。

分子変化を受け、高度に進行性となっても、トラスツズマブ抵抗性及び高度に転移性のＨｅｒ２陽性細胞は、上の実施例において記載されるように、フィトカンナビノイドに対して応答するそれらの能力を保持する。

１：９のＴＨＣ：ＣＢＤの組合せが、ＢＴ４７４異種移植片の成長を減少させるのに１：１の組合せよりも有効であることも実証される。

Claims

Ｈｅｒ２遺伝子の過剰発現を特徴とする進行性乳がんの治療に使用されるための医薬組成物であって、
カンナビジオール（ＣＢＤ）を含有し、且つテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を含有しない、医薬組成物。
前記ＣＢＤが植物性薬剤物質（ＢＤＳ）の形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＣＢＤが１ｍｇ〜２０００ｍｇの近似量で存在する、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
非カンナビノイド化学療法剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記非カンナビノイド化学療法剤がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記非カンナビノイド化学療法剤がトラスツズマブである、請求項５に記載の医薬組成物。